NO330361B1 - Anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fjerning av en karbonylforbindelse fra blod, anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fremstilling av et medikament som forbedrer karbonylstresstilstanden i blod under hemodialyse, samt fremgangsmate for forbedring av karbonylstresstilstand. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fjerning av en karbonylforbindelse fra blod, anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fremstilling av et medikament som forbedrer karbonylstresstilstanden i blod under hemodialyse, samt fremgangsmåte for forbedring av karbonylstresstilstand.

Teknikkens stand

Hemodialyse er en vanlig behandlingsform for pasienter med kronisk nyresvikt, hvori avfallsprodukter og toksiske forbindelser i blodet fjernes ved å sette blodet i forbindelse med et dialysat via en semipermiabel membran. Sykdomstilstanden nyresvikt kan imidlertid ikke fullstendig inhiberes ved dialyse. En slik sykdomstilstand omfatter en økning av konsentrasjonen av "advanced glycation end products" (AGE) og karbonylintermediater (forløpere for AGE) hos nyresviktpasienter. AGE har blitt rapportert å modifisere proteinstruktur- og funksjon og å inngå i inntreden av dialysekomplikasjoner, for eksempel dialyseamyloidose og arteriosklerose (Makita, Z. et al., N. Engl, J, Med., 325:836-842, 1991; Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 92; 1243-1252, 1993; Miyata, T. et al., J. Clin. Invest, 93: 521-528, 1994; Miyata, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 93: 2353-2358, 1996; Horie, K. et al., J. Clin. Invest., 100: 2995-3004, 1997; Miyata, T. et al., FEBS letters, 445: 202-206, 1999). Det var nylig vist at akkumulering av karbonylintermediater som glyoksal, metylglyoksal, 3-deoksyglukoson og arabinose (såkalt karbonylstress) (Odani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 256: 89-93,1999; Niwa et al., Nephron; 69: 438-443, 1995; Miyata et al., Kidney Int., 55: 389-399, 1999; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol, 9:2349-2356, 1998) i blodplasma er en følge av et forhøyet AGE-nivå ved nyresvikt (Miyata, T. et al., J. Am. Soc. Nephrol, 9: 2349-2356, 1998 Miyata, T. et al., Kidney Int., 55: 389-399, 1999). En rekke karbonylintermediater (AGE-forløpere) er hovedsakelig avledet fra karbohydrater og lipider. (Miyata, T. et al., Kidney Int., 55: 389-399, 1999; Miyata, T. et al., Kidney Int., 54; 1290-1295, 1998; Miyata, T. et al., Kidney Int., 51: 1170-1181, 1997). Konvensjonell hemodialyse kan ikke effektivt avhjelpe dette forhøyede nivå av AGE og karbonylintermediater, nemlig "karbonylstress", hos pasienter med nyresvikt.

NO 20010931 vedrører en peritonealdialysevæske som kan anvendes i forbindelse med behandling av nyresvikt. JP 5105633 gjør kjent et glukosepreparat nyttig som en transfusjonsvæske eller som en peritonealdialysevæske. US 3793187 angår en prosess for rensing av flytende hydrokarboner inneholdende aldehyder og ketoner.

E.J. Lamb et al., Kidney International, vol. 47, nr. 6, 1995, s. 1768-1774, vedrører in v//rø-dannelse av glykeringsendeprodukter i peritonealdialysevæske. S. Fishbane et al., Kidney International, vol. 52, nr. 6, 1997, s. 1645-1650, omhandler reduksjon av plasma- apolipoprotein-B ved fjerning av sirkulerende glykeringsderivater i pasienter med uremia.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fjerning av karbonylforbindelser i blod. Foreliggende oppfinnelse tillater forebyggelse av skaden som skyldes karbonylforbindelser hos hemodialysepasienter, som er spesielt utsatt for å havne i en karbonylstresstilstand. Formålet med foreliggende oppfinnelse er å redusere skaden grunnet karbonylforbindelser så mye som mulig i hemodialysepasienter.

Først undersøkte de foreliggende oppfinnere hvordan hemodialysemembranen som anvendes ved hemodialyse påvirket mengden av karbonylforbindelser i pasientens blod. Innholdet av pentosidin i blodet, en markør for akkumulering av intermediære karbonylprodukter (dvs. karbonylstress), ble sammenlignet ved kvantifisering med høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) for alle typer av dialysemembraner som anvendes av dialysepasienter. Resultatet viste at fritt pentosidin i markant grad ble fjernet ved dialyse gjennom enhver dialysemembran, mens proteinbundet pentosidin, som utgjør hovedmengden av pentosidin i kroppen, ikke kunne fjernes effektivt ved dialyse.

En sammenligning mellom forskjellige typer dialysemembraner viste ingen forskjell i verdien for proteinbundet og fritt pentosidin for cellulosemembraner med lav gjennomstrømming, polymetylmetakrylat (PMMA)-membraner med høy gjennom-strømming og AN69, mens verdien var lavere for polysulfon (PS)-membraner med høy gjennomstrømming (p<0,01). Det var ingen forskjeller i verdiene mellom japanske og belgiske pasienter, og heller ikke mellom membraner fremstilt av forskjellige produsenter. Bytte av dialysemembranen som ble anvendt av tre pasienter fra AN69 til PS reduserte nivået av proteinbundet pentosidin, hvoretter en tilbakevending til AN69 forhøyet nivået tilbake til det opprinnelige nivå. Disse resultatene viste at polysulfonmembraner er effektive som dialysemembraner for å undertrykke dannelsen av karbonylforbindelser.

De foreliggende oppfinnere tenkte seg så anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for effektiv fjerning av karbonylforbindelser fra blod. Blodplasma fremstilt fra blod fra dialysepasienter ble inkubert med bærere til hvilke et oppfangingsmiddel for karbonylforbindelser var immobilisert, og mengden karbonylforbindelser i blodet ble kvantifisert. Resultatet viste at inkubering med bærere, til hvilke et oppfangingsmiddel for karbonylforbindelser var immobilisert i signifikant grad, reduserte mengden av karbonylforbindelser i blodet.

Basert på disse funn, fokuserte de foreliggende oppfinnere på karbonylforbindelser akkumulert i blod, og tenkte seg at fjerning av karbonylforbindelser akkumulert i blod var nødvendig for å forbedre en karbonylstresstilstand, hovedsakelig omfattende proteinmodifisering, i dialysepasienter. Oppfinnerne fant så at anvendelse av en forbindelse som hadde evnen til å fjerne eller redusere den proteinmodifiserende aktivitet av karbonylforbindelser ved kjemisk reaksjon med, eller adsorbsjon av, karbonylforbindelser var effektive for å oppnå dette mål, og fullførte således foreliggende oppfinnelse. I foreliggende oppfinnelse kalles en bærer til hvilken en foreliggende oppfinnelse med en slik funksjon har blitt immobilisert, eller forbindelsen selv, et "karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel".

Foreliggende oppfinnelse gjelder således anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fjerning av en karbonylforbindelse fra blod, hvori middelet reagerer kjemisk med, eller adsorberer karbonylforbindelsen for å fjerne karbonylforbindelsen fra blod under hemodialyse og hvori middelet er en Maillard-reaksjonsinhibitor immobilisert til en bærer som er uløselig i blod, eller omfatter en forbindelse som er uløselig i blod.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fremstilling av et medikament som forbedrer karbonylstresstilstanden i blod under hemodialyse, hvori middelet er en Maillard-reaksjonsinhibitor.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for forbedring av karbonylstresstilstand, kjennetegnet ved at den omfatter å sette pasientens blod i forbindelse med et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel i blodkretsen in vitro under hemodialyse, hvori karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet immobiliseres til en bærer som er uløselig i blod, eller omfatter en forbindelse som er uløselig i blod.

I foreliggende oppfinnelse omfatter karbonylforbindelser som skal oppfanges, for eksempel, følgende forbindelser som akkumuleres i blod hos nyresviktpasienter, sammen med oksidativt stress.

Karbonylforbindelser avledet fra karbohydrater:

• arabinose

• glyoksal

• metylglyoksal

• 3-deoksyglucoson

Karbonylforbindelse avledet fra ascorbinsyre:

• dehydroascorbinsyre

Karbonylforbindelser avledet fra lipid:

• hydroksynonenal

• malondialdehyd

• akrolein

Et foretrukket karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel i foreliggende oppfinnelse er et middel som fullstendig kan inhibere eller redusere proteinmodifi-seringsaktiviteten til alle disse karbonylforbindelsene via en kjemisk reaksjon eller en adsorpsjon. Karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter imidlertid også et middel som er effektivt for de viktigste karbonylforbindelsene blant disse. Karbonylforbindelsesoppfangingsmidler som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel følgende forbindelser: aminoguanidin (Foote, E. F. et al., Am. J. Kidney Dis., 25:420-425 (1995)). ± 2-isopropylidenhydrazono-4-oksotiazolidin-5-ylacetanilid (OPB-9195; S.

Nakamura, 1997, Diabetes 46: 895-899).

Karbonyloppfangingsmiddelet omfatter videre for eksempel følgende forbindelser, eller derivater av disse, som kan fungere som karbonylforbindelsesoppfangingsmidler.

"Derivater" angir forbindelser med én eller flere atomære eller molekylære substitusjoner i enhver posisjon, sammenlignet med utgangsforbindelsen. Ved tilkobling til bærere for å lette separasjon fra blod kan disse forbindelsene anvendes som karbonylforbindelsesoppfangingsmidler i foreliggende oppfinnelse. Dersom forbindelsen selv er uløselig i blod, kan den alternativt anvendes som karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse, uten immobilisering til bærere. (1) guanidinderivater som metylguanidin (JP-A Sho 62-142114, JP-A Sho 62-249908, JP-A Hei 1-56614, JP-A Hei 1-83059, JP-A Hei 2-156, JP-A Hei 2-765, JP-A Hei 2-42053, JP-A Hei 6-9380. Publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift 5-505189) osv.

(2) hydrazinderivater som sulfonylhydrazin osv.

(3) heterosykliske forbindelser med fem medlemmer og to nitrogenatomer for eksempel pyrazolon (JP-A Hei 6-287179), pyrazolin (JP-A Hei 10-167965), pyrazol (JP-A Hei 6-192089, JP-A Hei 6-298737, JP-A Hei 6-298738), imidazolidin (JP-A Hei 5-201993, JP-A Hei 6-135968, JP-A Hei 7-133264, JP-A Hei 10-182460), hydantoin (JP-A Hei 6-135968) osv. (4) heterosykliske forbindelser med fem medlemmer og tre nitrogenatomer, for eksempel triazol (JP-A Hei 6-192089) osv. (5) heterosykliske forbindelser med fem medlemmer og et nitrogenatom og et svovelatom, for eksempel tiazolin (JP-A Hei 10-167965), tiazol (JP-A Hei 4-9375, JP-A Hei 9-59258) tiazolidin (JP-A Hei 5-201993, JP-A Hei 3-261772, JP-A Hei 7-133264, JP-A Hei 8-157473 osv. (6) heterosykliske forbindelser med fem medlemmer og et nitrogenatom og et oksygenatom, for eksempel oxazol (JP-A Hei 9-59258) osv. (7) nitrogenholdige, heterosykliske forbindelser med seks medlemmer, for eksempel pyridin (JP-A Hei 10-158244, JP-A Hei 10-175954) og pyrimidin (Publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift 7-500811) osv. (8) nitrogenholdige, kondenserte, heterosykliske forbindelser, for eksempel indazol (JP-A Hei 6-287180), benzimidazol (JP-A Hei 6-305964), kinolin (JP-A Hei 3-161441) osv. (9) svovel- og nitrogenholdige, kondenserte, heterosykliske forbindelser som benzotiazol (JP-A Hei 6-305964) osv. (10) svovelholdige, kondenserte forbindelser som benzotiofen (JP-A Hei 7-196498) osv. (11) oksygenholdige, kondenserte, heterosykliske forbindelser som benzopyran (JP-A Hei 3-204874, JP-A Hei 4-308586) osv. (12) nitrogenholdige forbindelser som karbazoyl (JP-A Hei 2-156, JP-A Hei 2-753), karbazinsyre (JP-A Hei 2-167264), hydrazin (JP-A Hei 3-148220) osv. (13) kinoner som benzokinon (JP-A Hei 9-315960) og hydrokinon (JP-A Hei 5-9114) osv. (14) alifatiske dikarboksylsyrer (JP-A Hei 1-56614, JP-A Hei 5-310565)

(15) silikonholdige forbindelser (JP-A Sho 62-249709)

(16) organiske germaniumforbindelser (JP-A Hei 2-62885, JP-A Hei 5-255130, JP-A Hei 7-247296, JP-A Hei 8-59485) (17) flavonoider (JP-A Hei 3-240725, JP-A Hei 7-206838, JP-A Hei 9-241165, WO 94/04520) (18) alkylaminer (JP-A Hei 6-206818, JP-A Hei 9-59233, JP-A Hei 9-40626, JP-A Hei 9-124471) (19) aminosyrer (publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift 4-502611, publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift 7-503713) (20) aromatiske forbindelser som askoklorin (JP-A Hei 6-305959), benzosyre (WO 91/11997), pyrrolonaftyridinium (JP-A Hei 10-158265) osv. (21) polypeptider (publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift 7-500580)

(22) vitaminer som pyridoksamin (WO97/09981) osv.

(23) SH-gruppeholdige forbindelser som glutation, cystein, N-acetylcystein osv.

(24) SH-gruppeholdige proteiner som redusert albumin osv.

(25) tetrasykliner (JP-A Hei 6-256280)

(26) kitosaner (JP-A Hei 9-221427)

(27) tanniner (JP-A Hei 9-40519)

(28) kvaternære, ammioniumionholdige forbindelser

(29) biguanider som metformin, fenformin og buformin

(30) polymere forbindelser som ionebytteresiner

(31) uorganiske forbindelser som aktivert karbon, kiselgel, aluminiumoksid og kalsiumkarbonat.

De fleste av forbindelsene ovenfor er generelt kjente som Maillard-reaksjonsinhibitorer. Maillard-reaksjonen er en ikke-enzymatisk glykosyleringsreaksjon mellom et reduserende sukker som glukose og en aminosyre eller et protein. Ved å fokusere på fenomenet med brunfarging av en blanding bestående av aminosyre og reduserende sukker ved oppvarming rapporterte Maillard denne reaksjonen i 1912 (Maillard L.C., Compt. Rend. Soc. Biol., 72:599 (1912)). Maillard-reaksjonen inngår i brunfarging av mat, dannelse av aromatiske forbindelser og smak, og proteindenaturering under oppvarming eller lagring. Denne reaksjonen har derfor hovedsakelig blitt undersøkt innen området næringsmiddelkjemi.

I 1968 ble glykosilert hemoglobin (HbAlc), en mikrofraksjon av hemoglobin, påvist in vivo og funnet å øke i konsentrasjon hos pasienter med diabetes (Rahbar. S., Clin. Chim. Acta, 22 : 296 (1968)). Disse funnene bidro til å utløse en bølge av interesse for betydningen av Maillard-reaksjonen in vivo og deltakelse av reaksjonen ved inntreden av sykdommen hos voksne, for eksempel diabetiske komplikasjoner og arteriosklerose, så vel som i aldringsprosessen. Midler som inhiberte Maillard-reaksjonen in vivo ble grundig undersøkt, noe som førte til oppdagelsen av de ovenfor nevnte forbindelser som midler som inhiberer Maillard-reaksjonen.

Det var imidlertid ikke kjent at slike Maillard-reaksjonsinhibitorer er i stand til å forbedre karbonylstresstilstanden hos pasienter som gjennomgår peritoneal dialyse ved å fjerne karbonylforbindelser fra blodet.

Det er ingen spesielle begrensninger når det gjelder type bærer som kan anvendes for immobilisering av karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse, så lenge som bæreren er uløselig i blod og ufarlig for menneskekroppen, og også er så sikker og stabil som et materiale som direkte står i kontakt med blod må være. Nærmere bestemt omfatter slike bærere for eksempel syntetiske eller naturlig fore-kommende, organiske, polymere forbindelser, uorganiske materialer som glasskuler, kiselgel, aluminiumhydroksid og aktivert karbon, og materialer hvis overflate er belagt med polysakkarid eller syntetisk polymer.

Eksempler på bærere som omfatter en polymerforbindelse er polymetylmetakrylat, polyakrylonitrill, polysulfon, vinyl, polyolefin, fluorin, polyester, polyamid, polyimid, polyuretan, polyakryl, polystyren, polyketon, silikon, cellulose, kitosan; spesielt polysakkaride slik som agarose, cellulose, kitin, kitosan, sefarose, dekstran osv og derivater av disse, og polyester, polyvinylklorid, polystyren, polysulfon, polyeter-sulfon, polypropylen, polyvinylalkohol, polyaryletersulfon, polyakrylsyreester, polymetakrylsyreester, polykarbonat, acetylert cellulose, polyakrylonitrill, polyetylen-tereftalat, polyamid, silikonresin, fluorresin, polyuretan, polyeteruretan og polyakrylamid og derivater av disse. Disse polymere materialene kan anvendes alene eller som en kombinasjon av to eller flere typer polymerer. I det siste tilfellet immobiliseres karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet til minst én av polymerene. Det immobiliserte karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel anvendes alene eller i en kombinasjon av to eller flere typer forbindelser. Det er også mulig å tilsette et egnet modifiseringsmiddel til disse polymere materialene eller utsette dem for denaturerende behandling, for eksempel kryssbinding ved bestråling eller behandling med peroksid.

Det er ingen begrensninger når det gjelder bærerens utforming. Bæreren kan for eksempel være membranlignende, fiberlignende, kornformet, hul fiberlignende, utformet som uvevet stoff, porøst eller gjennomhullet. Bærerens kontaktareal med det peritoneale dialysat kan kontrolleres ved å variere tykkelse, overflateareal, diameter, lengde, form og/eller størrelse av bæreren.

Karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet kan immobiliseres til den ovenfor nevnte bærer ved anvendelse av kjente fremgangsmåter, for eksempel fysisk adsorpsjon, en spesifikk biokjemisk bindingsreaksjon, ionebinding, kovalent binding, transplantering osv. Om nødvendig kan en spacer innsettes mellom bæreren og karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet. Dersom karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet er toksisk, blir mengden som frigjøres et avgjørende spørsmål. Det foretrekkes således at karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet er immobilisert til bæreren via en kovalent binding, slik at mengden som frigjøres minimaliseres. Funksjonelle grupper på bæreren utnyttes for kovalent binding av karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet til denne. Den benyttede funksjonelle gruppe er for eksempel en hydroksylgruppe, en aminogruppe, en aldehyd-gruppe, en karboksylgruppe, en tiolgruppe, en silanolgruppe, en amidgruppe, en epoksy-gruppe, en suksinyliminogruppe osv., den funksjonelle gruppen er imidlertid ikke begrenset til disse gruppene. Som eksempler på kovalente bindinger kan esterbindinger, eterbindinger, aminobindinger, amidbindinger, sulfidbindinger, iminobindinger, disulfidbindinger og lignende nevnes.

Et kommersielt tilgjengelig produkt, for eksempel en polystyrenbærer med sulfonylhydrazingrupper (PS-TsNHNH2, ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.), kan anvendes som bærer for immobilisering av karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel.

Bæreren med det immobiliserte karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse kan steriliseres ved en egnet steriliseringsfremgangsmåte utvalgt blant kjente steriliseringsfremgangsmåter, avhengig av hvilken type karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel og bærer som anvendes. Steriliseringsfremgangsmåten omfatter for eksempel autoklavering, gammabestråling, gass-sterilisering osv.

Bærere med immobiliserte karbonylforbindelsesoppfangingsmidler kan settes i forbindelse med blod på forskjellige måter. Eksempler er: en fremgangsmåte hvor oppsamlet pasientblod infiseres i en blodpose fylt med bærere med immobilisert karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel og oppfanging av karbonylforbindelsene i pasientens blod, fremgangsmåten hvor blodet sirkuleres i en kolonne fylt med kuleformede bærere eller fiberformede bærere eller lignende til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel er immobilisert, osv. Ikke bare helblod, men også separert blodplasma, kan anvendes for behandlingen. Det behandlede blod kan returneres til pasienten eller, om nødvendig, lagres i en blodpose eller lignende. Det er også mulig å oppfange karbonylforbindelser som dannes og akkumulerer i blod i blodposer under lagring ved å la bærere, til hvilke karbonylforbindelsesoppfangingsmidler er immobilisert, inngå i blodposene.

Kontakten mellom blod og bærere, til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse har blitt immobilisert, kan skje i løpet av blodrensingstrinnet, innbefattet hemodialyse, blodfiltrering, blodfiltreringsdialyse, blod-adsorpsjon og blodplasmaseparasjon.

For eksempel kan både hemodialyse og oppfanging av karbonylforbindelser skje samtidig i hemodialysepasienter ved å plassere bærere til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert i hemodialysekretsen. I dette tilfellet foretrekkes det å anvende hemodialysemembranen som bærere til hvilken et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har immobilisert. Kjente typer av dialysemembraner kan anvendes som bærere. Eksempler er cellulosederivater, slik som regenerert cellulose og cellulosetriacetat, polymetylmetakrylat, polyolefin, polysulfon, polyakrylonitrill (PAN), polyamid, polyimid, polyeternylon, silikon og polyester-kopolymerer, men er ikke begrenset til disse. Som vist i eksemplene var det en reduksjon av nivået av intermediært karbonylprodukt (pentosidin) dersom polysulfon ble anvendt som dialysemembran. Blant de ovenfor nevnte dialysemembranene er det således spesielt fordelaktig å anvende en polysulfonmembran som en bærer. I stedet for å anvende dialysemembranen som bærer, kan en kolonne fylt med bærere, til hvilken et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert, faktisk plasseres i hemodialysekretsen som beskrevet ovenfor. Ved å sette en pasients blod i forbindelse med bærere til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert, oppfanges karbonylforbindelser fra blodet, deres skadevirkninger på den levende kropp fjernes, og de blir ikke-toksiske. En antikoagulant kan anvendes sammen med karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet for å forhindre blodkoagulasjon i sirkulasjonen utenfor kroppen. Slike antikoagulanter omfatter for eksempel heparin, heparin med lav molekylvekt og Futhan (Nafamostat-mesilat). Disse kan immobiliseres til bærere.

Det forventes at det kan være noen tilfeller hvor karbonylforbindelser i pasientens blod ikke fullstendig fjernes under dialysen, dersom mengden oppfangingsmiddel som anvendes i kontakt med blodet er for liten. Siden bestemmelse på forhånd av mengden karbonylforbindelser i pasientens blod er spesielt vanskelig, er det effektivt å opprettholde aktiviteten av så mange oppfangingsmidler som mulig innenfor et område som sikrer pasientens trygghet. Dosen av et oppfangingsmiddel kan justeres ved å endre mengden oppfangingsmiddel immobilisert til bæreren eller dosen av bærere til hvilke oppfangingsmiddelet har blitt immobilisert.

I tillegg til de organiske forbindelsene representert ved de ovenfor nevnte Maillard-reaksjonsinhibitorene, kan polymere forbindelser som ionebytteresin eller uorganiske forbindelser som aktivert karbon, kiselgel, aluminiumoksid og kalsiumkarbonat også anvendes som karbonylforbindelsesoppfangingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse forbindelsene, som er kjent som fyllstoffer anvendt for kromatografi, kan oppfange karbonylforbindelser grunnet deres adsorpsjonsevne. Slike forbindelser kan i seg selv fungere som bærere, og følgelig kan for eksempel en filtrator installert i en ekstrakorporal blodsirkulasjonskrets fylles med dem for bruk. En slik forbindelse kan også anvendes som et "karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel" som omfattes i middelet for forbedring av karbonylstresstilstanden ifølge foreliggende oppfinnelse. I dette tilfellet fungerer slike forbindelser selv som bærere til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert som beskrevet ovenfor. Alternativt kan et annet karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel videre immobiliseres til bærere som i seg selv har evnen til å oppfange karbonylforbindelser.

En blodrensingsinnretning av adsorpsjonstype i hvilken aktivert karbon anvendes er kjent. Denne blodrensingsinnretning av adsorbsjonstype anvendes for en supplerende fremgangsmåte forbundet med dialyse for rensing av blod ved medikamentforgiftning og hepatisk koma, samt fjerning av forskjellige intrinsiske og extrinsiske toksiner og vasoaktive forbindelser hvis konsentrasjon øker i de tidlige faser av akutt nyresvikt forbundet med multiorgansvikt. Det har imidlertid vært fullstendig ukjent at en slik blodrensingsinnretning av adsorbsjonstype er effektiv som et karbonyloppfangings-middel.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser virkningen av å endre type hemodialysemembran på pentosidinnivået i blodplasma (pmol/mg protein) i 3 pasienter. Hvert resultat er vist som en prosentverdi relativt til den tilsvarende utgangsverdi (41,8 pmol/mg protein for pasient 1 (0), 22,1 pmol/mg protein for pasient 2 (□) og 28,5 pmol/mg protein for pasient 3 (A)). Hver av de erholdte verdier er en gjennomsnittsverdi for to prøver oppsamlet 2 uker etter avsluttet dialyseperiode (i den -2. og den 0. uke med dialyse med AN69, i den 8. og 10. uke etter bytte til PS, i den 14. og 16. uke etter tilbakevending til AN69). Figur 2 viser den undertrykkende virkning på pentosidinnivået i blodplasma i dialysepasienter ved inkubering med kuler til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel er immobilisert. Figur 3 viser den karbonyloppfangende virkning av aktivert karbon i en dikarbonylforbindelsesløsning. Figur 4 viser den dikarbonylforbindelsesoppfangende virkning av aktivert karbon i et peritonealt dialysat. Figur 5 viser den undertrykkende virkning av aktivert karbon på pentosidindannelsen ved inkubering av blodplasma fra en dialysepasient ved 37 °C. Figur 6 viser fjerning av karbonylforbindelser i blodplasma fra en nyresviktpasient med aktivert karbon eller polystyrenkuler tilkoblet sulfonylhydrasin. I dette diagram viser ordinaten karbonylforbindelseskonsentrasjonen. Figur 7 viser fjerning av karbonylforbindelser i blodplasma fra en nyresviktpasient med aminoguanidin. I dette diagrammet viser ordinaten konsentrasjonen av karbonylforbindelsen. Figur 8 viser en fremgangsmåte for fremstilling av diaminoguanidinkoblet polyamid. Figur 9 viser fjerning av karbonylforbindelser i en dikarbonylforbindelsesløsning med diaminoguanidinkoblet polyamid.

Den beste måte å utføre oppfinnelsen på

Foreliggende oppfinnelse illustreres spesifikt nedenfor ved referanse til eksempler.

[Eksempel 1] Virkningen av type hemodialysemembran på pentosidinnivået i blodplasma

1. Pasienter

Belgiske pasienter (n=29) og japanske pasienter (n=97), i alt 126 pasienter (69 menn og 57 kvinner) som hadde blitt behandlet med hemodialyse 3 ganger ukentlig ble analysert. Pasientenes gjennomsnittsalder var 61,2 ± 13 (standardavvik) år. Bare to av dem led av diabetes mellitus av mild type-II. Alle pasientene hadde anvendt samme type hemodialysemembran i minst 3 måneder (nærmere bestemt hadde 2 eller 3 pasienter anvendt samme type membran i mindre enn 3 måneder, men helt siden hemodialysen ble innledet). I 26 av 29 belgiske pasienter ble dialysemembranene brukt flere ganger, mens membranene ikke ble gjenbrukt for japanske pasienter. Resultatene for residualdiurese (ml/dag), dialysemembranens overflateareal og varigheten av hemodialysen ble erholdt fra kliniske notater for hver pasient.

2. Membrantyper

Følgende hemodialysemembraner ble anvendt: høyfluks: (UF-verdi >10 ml/mmHg/t) AN69 (Hospal, Frankrike) (AN69-gruppen), høyfluks polysulfon (Fresenius, Tyskland) (PS-gruppen), høyfluks polysulfon (Asahi Medical, Japan) (APS-gruppen), høyfluks polymetylmetakrylat (Toray, Japan) (PMMA-gruppen), og lavfluks cellulose (Asahi Medical, Japan) (cellulosegruppen).

3. Blodplasmaprøver

Blodplasmaprøver ble samlet fra alle de 126 pasientene fra første hemodialyse, og deretter fra 66 pasienter ukentlig etter dialyse.

Alle prøver ble umiddelbart etter erholdelse separert ved sentrifugering. Blodplasmaprøvene ble nedfrosset ved -20 °C og analysert som følger:

4. Kvantifisering av totalmengde pentosidin og fritt pentosidin

For kvantifisering av totalmengden av pentosidin ble en prøver (50 (il) frysetørket, løst i 100 ul 6N HC1, og inkubert ved 110 °C i 16 timer under nitrogen-atmosfære, nøytralisert med 100 ul 5N NaOH og 200 ul 0,5 M fosfatbuffer (pH 7,4), filtrert gjennom et filter med porestørrelse 0,5 um og fortynnet 20 ganger med PBS. For kvantifisering av fritt pentosidin ble prøven (50 ul) blandet med et likt volum 10 % TCA og sentrifugert ved 5000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble filtrert gjennom et filter med porestørrelse 0,5 um og fortynnet 4 ganger med destillert vann.

Pentosidin i disse prøvene ble analysert ved revers fase-HPLC ved anvendelse av en Cl8 revers fasekolonne. (Waters, Tokyo, Japan) Miyata, T. et al., J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206, 1996). Eluatet ble målt med en fluorescensdetektor (RF-10A, Shimadzu) ved eksitasjons/deteksjonsbølgelende = 335/385 nm. En standardkurve ble fremstilt ved anvendelse av syntetisk pentosidin.

Nivået av proteinbundet pentosidin (pentosidin/protein) (pmol/mg protein) ble beregnet som [totalmengde pentosidin i blodplasma (pmol/ml) - fritt pentosidin (pmol/ml)]/ [proteinkonsentrasjonen i blodplasma (mg/ml)].

5. Statistisk sammenligning av pasientgrupper

De angjeldende verdiene, innbefattet kvantifisering av pentosidinnivået, er angitt som middelverdi ± standardavvik eller prosent (%). Verdiene for residual diurese ble loggtransformert. Ved enveis variansanalyse (enveis ANOVA) (med F-test) ble de enkelte resultater og pentosidinnivået sammenlignet mellom grupper av hemodialysepasienter som anvendte forskjellige dialysemembraner. Videre ble dialysemembran-gruppene sammenlignet og analysert ved anvendelse av Bonferronis t-analyse. Ved hjelp av chi 2-analysen ble graden av residual diorese sammenlignet mellom de forskjellige gruppene.

Resultatene for kryss-seksjonsanalysen blant de fem pasientgruppene er vist i tabell 1. Det var ingen signifikante aldersforbundne forskjeller mellom gruppene. Proteinnivået i blodplasma var i AN69-gruppen og cellulosegruppen. I APS-gruppen var dialysemembranens areal større, og både tiden med hemodialyse før undersøkelsen og varigheten av en enkel dialyse var lenger. Derimot var residualdiuresen høyere i PS-gruppen.

Resultater av dialyse av fem pasientgrupper med forskjellige dialysemembraner

Før dialysen var nivået av proteinbundet pentosidin og fritt pentosidin i blodplasma likt i AN69-gruppen, PMMA-gruppen og cellulosegruppen, men signifikant lavere i PS-gruppen og APS-gruppen . Det var ingen signifikant forskjell mellom PS-gruppen og APS-gruppen (tabell 2).

Pentosidinnivå før dialysen i de 5 membrangruppene

Envariansanalyse av en rekke faktorer som kan påvirke pentosidinnivået i blodplasma før dialysen tydet på at resiudaldiuresen i signifikant grad påvirket nivået av proteinbundet og fritt pentosidin, jo høyere residualdiorese, jo høyere pentosidinnivå. Ingen korrelasjon ble funnet mellom pentosidinnivået og albuminnivået i blodplasma, pasientens alder eller pasientens dialysehistorie (tabell 3). Når det gjelder polysulfon-gruppen (PS- og APS-gruppen) var pentosidinnivået før dialyse hos belgiske pasienter og japanske pasienter dialysert med polysulfonmembraner fra Fresenius eller Asahi Medical co. tilsvarende hverandre (tabell 4).

Som beskrevet ovenfor viste det seg at pentosidinnivået var lavere hos dialysepasienter som anvendte polysulfondialysemembraner enn hos dialysepasienter som anvendte andre dialysemembraner. Redusert pentosidinnivå ble observert hos pasienter dialysert med en polysulfonmembran, uavhengig av pasientens hjemland og produsenten av dialysemembranen. Selv om pasienter behandlet med dialyse med polysulfondialysemembran fra Ashahi Medical i det vesentlige var anuriske, var pentosidinnivået tilsvarende lavere. I gruppen som anvendte polysulfon fra Fresenius var det ingen endring i den statistiske signifikans av pentosidinnivåforskjellen, selv dersom pasienter med urinvolum høyere enn 300 ml/min ble eksludert.

Siden AN69 også er en membran med høy væskestrøm, og siden pentosidinnivået før dialyse ved dialyse med AN69 med høy væskestrøm og cellulose med lav væskestrøm viste tilsvarende resultater, anses det at forskjellen i pentosidinnivå er uavhengig av dialysemembranens fjerningskapasitet.

Forholdet mellom det proteinkorrigerte pentosidinnivå, eller det frie pentosidinnivå, og residualdiurese ble analysert ved lineær regresjonsanalyse. Virkningen av hver av de forklarende variabler på den avhengige variabel (proteinkorrigert pentosidinnivå og fritt pentosidinnivå) ble analysert ved variabel seleksjon - multippel regresjonsanalyse (forlengs, trinnvis multippel regresjonsanalyse). Alle analyser ble utført ved anvendelse av statistikkprogramvaren (BMDP er et varemerke tilhørende New System Professional Edition: Statistical Solutions Inc., University of California Press, Berkely, 1995). En P-verdi lavere enn 0,05 ble ansett som signifikant.

Analyseresultatet viste at dialyse membrantypen og residualdiuresen var de to eneste uavhengige determinanter for nivået av proteinbundet og fritt pentosidin (tabell 5). Tatt i betraktning det faktum at ingen av interaksjonene var signifikante, var resultatet at virkningen av residualdiurese på pentosidinnivå ikke ble påvirket av dialysemembrantypen.

6. Virkning av dialysemembran på pentosidinnivå før og etter hemodialyse

For ytterligere å analysere mekanismen som ligger bak analysemembranens virkning på pentosidinnivået før dialysen, ble pentosidinnivået før og etter dialyse bestemt for fire pasientgrupper med dialysemembraner av polysulfon med høy væskestrøm (Fresenius), AN69, PMMA, eller cellulose med lav væskestrøm (tabell 6).

Som forventet ut fra eksperimentet ovenfor, var nivået av proteinbundet pentosidin nesten uendret, og det var også uavhengig av dialysemembrantypen. Selv om bare nivået av fritt pentosidin ble redusert markant, var prosentreduksjonen, som lå mellom 76 % (AN69) og 67 % (PMMA), tilsvarende i alle grupper. Det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppene. Det viste seg således at det lavere pentosidinnivå før dialysen, som var observert hos dialysepasienter som anvendte polysulfonmembraner, ikke kunne tilskrives forskjeller i membranenes dialysekapasitet.

De foreliggende oppfinnere viste tidligere at hemodialyse i seg selv ikke påvirker det totale pentosidinnivået eller nivået av proteinbundet pentosidin (Miyata, T. et al., Kidney Int., 51: 880-887, 1997). Dette funn stemmer overens med det faktum at 95 % av pentosidin bindes til albumin og ikke kan fjernes ved dialyse Miyata, T. et al., J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206, 1996). Dette funn understøttes av resultatet erholdt i eksempler ovenfor med de fire forskjellige dialysemembrantypene. Derimot avtok mengden fritt pentosidin ved hemodialyse, og et tilsvarende fenomen ble observert for alle dialysemembranene. Dette resultat kan forventes ut fra molekylvekten til fritt pentosidin (379 Da). Det faktum at pentosidinnivået før og etter hemodialyse var likt for alle dialysemembraner tyder på at ikke bare passiv transport, men også absorpsjon av pentosidin opptrer under dialyse med polysulfon og andre dialysemembraner. Graden av absorpsjon av radioaktivt merket fritt pentosidin til cellulosemembran eller polysulfonmembran in vitro er svært lav, og i praksis var det ingen forskjell.

Det reduserte pentosidinnivå før dialysen kan således ikke forklares ved at polysulfonmembranen fremmer fjerning av pentosidin. En annen mulighet er at dialyse med polysulfonmembran gir undertrykkelse av pentosidinproduksjonen.

Som bemerket tidligere, reflekterer pentosidinnivået konsentrasjonen av karbonylintermediater avledet fra karbohydrater. Polysulfonmembranen har den spesifikke virkning på å fjerne disse karbonylforbindelsene, og den kan således ha en virkning på pentosidinproduksjonen. Alternativt er det også mulig at polysulfonmembranen reduserer det oksidative stress som antas å være forbundet med uremi Miyata, T. et al., Kidney Int., 54; 1290-1295, 1998, Miyata, T. et al., Kidney Int., 51; 1170-1181, 1997, Loughrey, CM. et al., Q. J. Med., 87: 679-683, 1994; Ueda, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 245: 785-790, 1998; Kumano, K. et al., Adv. Perit. Dial., 1992; 8: 127-130; Witko-Sarsat, V. et al., Kidney Int., 49: 1304-1313, 1996). Det er også mulig at reduksjonen i oksidativt stress undertrykker dannelsen av karbonylforbindelser, og at dannelsen av pentosidin som et resultat av dette, reduseres (Miyata, T. et al., Kidney Int., 51: 1170-1181, 1997).

7. Virkning av bytte av dialysemembran på pentosidinnivå

For å bekrefte den spesifikke pentosidinreduserende virkning av polysulfon ble en longitudinell analyse utført i tre anuripasienter behandlet over lang tid (>5 år) med

AN69-dialyse. Membranen ble byttet med en dialysemembran av polysulfon (Fresenius) med tilsvarende overflateareal i 10 uker, hvoretter membranen igjen ble endret til AN69. Prøver uttatt før dialysen ble oppsamlet annenhver uke før bytte til PS (2 prøver), under PS-dialysen (5 prøver) og 14 -16 uker etter bytte til AN69 (2 prøver).

Det ble funnet at nivået av proteinbundet pentosidin gradvis avtok for alle pasienter etter bytte til PS-dialyse, og at nivået vendte tilbake til nivået ved anvendelse av AN69 før bytte til PS etter at AN69-dialyse ble gjenopptatt (figur 1).

Reduksjonen i pentosidinnivå observert i den longitudinelle undersøkelse i pasienter, utført ved å bytte fra AN69 til PS-dialyse, er bare en tredjedel av forskjellen (10,4 sammenlignet med 3,6 pmol/mg protein) mellom PS-gruppen og AN69-gruppen observert i kryss-seksjonsundersøkelsen. Dette avvik kan skyldes det faktum at observasjonen etter overføring til PS-dialyse kun varte i 10 uker. Dersom polysulfon reduserer pentosidindannelseshastigheten, vil det være mulig å forklare det faktum at proteinbundet pentosidin avtok så langsomt. Under slike forhold kan reduksjonen i nivået av proteinbundet pentosidin være en følge av ren proteinmetabolisme. En lignende observasjon ble gjort etter vellykkede nyretransplantasjoner. I slike tilfeller var reduksjonen av proteinbundet pentosidin betydelig langsommere enn reduksjonen i blodplasma p2-mikroglobulin, noe som tyder på at reduksjonen skjer svært langsomt, og nedbrytingen av proteinbundet pentosidin er svært langsom (Miyata, T. et al., Kidney Int., 51: 880-887,1997, Hricik, DE. et al., Clin. Transplantation, 10: 568-573, 1996).

[Eksempel 2] Fjerning av karbonylforbindelser fra blod med bærere til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert

Et kryssbundet polystyrenresin med tilkoblet sulfonylhydrasingruppe (PS-TsNHNH2, ARGONAUT TECHNOLOGIES) ble anvendt som karbonylforbindelsesoppfangende kuler for å undersøke virkningen når det gjaldt fjerning av karbonylforbindelser fra blod. Blodplasma fra en dialysepasient og blodplasma tilsatt karbonylforbindelsesoppfangende kuler ble inkubert ved 37 °C for å analysere den undertrykkende virkning på pentosidindannelsen. 100 ul ble tilsatt til røret som inneholdt karbonylforbindelsesoppfangende kuler for å svelle kulene, hvoretter sterilfiltrert blodplasma fra en dialysepasient før dialyse ble tilsatt. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i en uke. Etter inkubasjonen ble kulene fjernet med et sentrifugeringsfilter med porestørrelse 0,22 nm (Milipore, UF30GV00). Deretter ble 50 ul 10 % trikloreddiksyre tilsatt til 50 ul av den kulefrie løsning, og blandingen ble sentrifugert for nedsentrifugering av proteiner. Nedsentrifugert protein ble vasket med 300 um 5 % trikloreddiksyre og så tørket. Deretter ble 100 ul 6N Hel tilsatt til proteinet og oppvarmet til 110 °C i 16 timer, hvoretter pentosidin ble kvantifisert ved HPLC (Miyata, T. et al., 1966, J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206, Miyata, T. et al., 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 93: 2353-2358).

Menden pentosidin som dannes under inkubering ved 37 °C er vist i figur 2. Det ble funnet at tilsetning av karbonylforbindelsesoppfangende kuler undertrykket dannelsen av pentosidin. I tillegg avhang undertrykkelsen av pentosidindannelsen av mengden karbonylforbindelsesoppfangende kuler som ble tilsatt.

Disse resultatene viste at karbonylforbindelser i blod kunne fjernes med bærere til hvilke karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet var immobilisert. Det ble videre vist at polysulfonmembranen er en spesielt egnet hemodialysemembran for å forbedre en karbonylstresstilstand.

[Eksempel 3] Fjerning av karbonylforbindelser fra en dikarbonylforbindelsesløsning med aktivert karbon

900 fil av en dikarbonylløsning i hvilken glyoksal, metylglyoksal, og 3-deoksyglukoson var oppløst (100 uM av hver) i PBS (-), ble tilsatt til et rør inneholdende 25 mg eller 50 mg aktivert karbon (Wako Pure Chemical Industries) og blandingen ble omristet på et roterende hjul ved romtemperatur i 19 timer. Løsningen ble så filtrert gjennom et sentrifugeringsfiltreringsrør med porestørrelse 0,22 \ im (Millipore; UFC30GV00) og konsentrasjonen av glyoksal, metylglyoksal, og 3-deoksyglukoson i filtratet ble målt ved høyy telsesvæskekromatografi.

Ved tilsetning av 900 |il av dikarbonylløsningen til 25 mg aktivert karbon ble

71 % av glyoksal, 96 % metylglyoksal og 97 % 3-dioksyglukoson oppfanget. Ved anvendelse av 50 mg aktivert karbon ble 85 % glyoksal, 98 % metylglyoksal og 98 % 3-deoksyglukoson oppfanget (figur 3).

[Eksempel 4] Fjerning av dikarbonylforbindelser fra peritonealdialysat med aktivert karbon

Siden et peritonealdialysat typisk inneholder høy konsentrasjon av glukose, dannes glukoseavledede karbonylforbindelser under sterilisering og lagring. Disse karbonylforbindelsene overføres til den levende kroppen under peritonealdialyse, noe som er en faktor som gir en karbonylstresstilstand. Virkningen av karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse, når det gjaldt fjerning av karbonylforbindelser fra en peritonealdialysevæske, ble følgelig evaluert.

900 ul av et peritonealdialysat (Baxter Ltd.; Dianeal PD-4, 1.5) ble tilsatt til et rør inneholdende 25 mg eller 50 mg aktivert karbon, og blandingen ble omrørt på et roterende hjul ved romtemperatur i 19 timer. Løsningen ble så filtrert gjennom et sentrifugeringsfiltreringsrør med porestørrelse 0,22 \ im (Millipore, UFC30GV00) og

konsentrasjonen av glyoksal, metylglyoksal og 3-deoksyglukoson i filtratet målt ved høyytelsesvæskekromatografi.

Ved tilsetning av 900 (il peritonealdialysat til 25 mg aktivert karbon ble 56 % glyoksal, 71 % metylglyoksal og 62 % 3-deoksyglukoson oppfanget. Ved tilsetning av 900 ul peritonealdialysat til 50 mg aktivert karbon ble 64 % glyoksal, 78 % metylglyoksal og 77 % 3-deoksyglukoson oppfanget (figur 4).

[Eksempel 5] Den undertrykkende virkning på pentosidindannelsen av aktivert karbon ved inkubasjon av blodplasma fra en dialysepasient ved 37 °C.

250 (il filtersterilisert blodplasma fra en dialysepasient før dialyse ble tilsatt til et rør inneholdende 12 mg aktivert karbon suspendert i PBS (-), og blandingen ble inkubert ved 37 °C i en uke. Etter inkubasjonen ble 50 (il 12 N HC1 tilsatt til 50 (il supernatant erholdt ved sentrifugering, og blandingen ble oppvarmet ved 110 °C i 16 timer for hydrolyse. Deretter ble pentosidin kvantifisert ved høyytelsesvæskekromatografi (Miyata, T. et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206, Miyata, T. et al., 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 93:2353-2358).

Mengden pentosidin dannet ved inkubasjone ved 37 °C er vist i figur 5. Ved sammenligning med kontrollen ble pentosidindannelsen udertrykt med 50 % ved tilsetning av aktivert karbon. Dette tyder på karbonylforbindelser som er forløpere til pentosidin ble adsorbert av aktivert karbon.

[Eksempel 6] Fjerning av karbonylforbindelser fra blodplasma med aktivert karbon

500 (il blodplasma fra en nyresviktpasient ble tilsatt til et rør inneholdende 20 mg eller 50 mg aktivert karbon (Wako Pure Chemical Industries), hvoretter blandingen ble omristet på et roterende hjul ved romtemperatur i 12 timer. Etter separasjon av det aktiverte karbon ved sentrifugering, ble konsentrasjonen av glyoksal og metylglyoksal i blodplasma målt ved høyytelsesvæskekromatografi.

Konsentrasjonen av glyoksal og metylglyoksal i blodplasma ble målt som følger: Først ble 300 (il 0,67 M perklorsyre tilsatt til 200 (il blodplasma, hvoretter blandingen ble omristet og sentrifugert for separasjon av supernatanten. 20 (il 1 % o-fenylendiamin og 50 (il 10 (iM 2,3-butandion (intern standard) ble tilsatt til 150 (il supernatant. Blandingen ble omristet og inkubert ved 25 °C i 1 time. Ifølge fremgangsmåten beskrevet av Ohmori et al., (Ohmori, S. et al., J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987), ble kinoksalinderivater dannet ved reaksjon mellom glyoksal, metylglyoksal, og o-fenylendiamin separert for kvantifisering ved HPLC med en revers fase-kolonne.

Resultatet er vist i figur 6. Ved tilsetning av 20 mg aktivert karbon til blodplasma, ble 58 % glyoksal og 65 % metylglyoksal oppfanget. Ved tilsetning av 50 mg aktivert karbon ble 75 % glyoksal og 80 % metylglyoksal oppfanget.

[Eksempel 7] Fjerning av karbonylforbindelser fra blodplasma med sulfonylhydrazintilkoblede polystyrenkuler (Ps-TsNHnH2)

500 fil blodplasma fra en nyresviktpasient ble tilsatt til et rør inneholdende 10 mg eller 20 mg sulfonylhydrazinkoblede polystyrenkuler, hvoretter blandingen ble omristet på et roterende hjul ved romtemperatur i 12 timer. Etter separasjon av de sulfonylhydrazintilkoblede polystyrenkulene ved sentrifugering, ble konsentrasjonen av glyoksal og metylglyoksal i blodplasma målt med høyytelsesvæskekromatografi ifølge fremgangsmåten gitt i eksempel 6. Resultatet er vist i figur 6. Ved tilsetning av 10 mg sulfonylhydrazinkoblede polystyrenkuler til blodplasma ble 45 % glyoksal og 39 % metylglyoksal oppfanget. Ved tilsetning av 20 mg sulfonylhydrazintilkoblede polystyrenkuler ble 75 % av både glyoksal og metylglyoksal oppfanget.

[Eksempel 8] Fjerning av karbonylforbindelser fra blodplasma med aminoguanidin

50 ul av en løsning i hvilken aminoguanidin (50 mM eller 100 mM) var oppløst i 0.1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,4) ble blandet med 450 ul blodplasma fra en nyresviktpasient, og den resulterende blanding ble inkubert ved romtemperatur i 12 timer. Etter 12 timer ble konsentrasjonen av glyoksal og metylglyoksal i blodplasma målt ved høy-ytelsesvæskekromatografi ifølge fremgangsmåten gitt i eksempel 6.

Resultatet er vist i figur 7. Ved en konsentrasjon av aminoguanidin i blodplasma på 5 mM ble 50 % glyoksal og 46 % metylglyoksal oppfanget. Ved en konsentrasjon av aminoguanidin på 10 mM ble 58 % glyoksal og 70 % metylglyoksal oppfanget.

[Eksempel 9] Fjerning av karbonylforbindelser med bærere til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel har blitt immobilisert.

Fjerning av karbonylforbindelser med bærere, til hvilke et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel var immobilisert, ble evaluert ved anvendelse av diaminoguanidintilkoblet polyamid. Diaminoguanidintilkoblet polyamid ble fremstilt ved å la polyamid reagere med epiklorhydrin og tilsetning av en vandig løsning av diaminoguanidin (pH 12) til dette, fulgt av inkubering ved 80 °C i tilnærmet 1 time (figur 8). Etter fullført reaksjon ble det resulterende diaminoguanidintilkoblede polyamid vasket med vann og tørket for anvendelse i de påfølgende eksperimenter.

1 ml av en dikarbonylforbindelsesløsning (glyoksal, metylglyoksal, og 3-deoksyglukoson; 1 uM av hver i PBS (pH 7.4)) ble tilsatt til et rør inneholdende 30 mg diaminoguanidintilkoblet polyamid. Blandingen ble omristet på et roterende hjul ved romtemperatur (25 °C) i 5 timer, og 100 (il av blandingen ble sentrifugert. Gjenværende glyoksal, metylglyoksal og 3-deoksyglukoson i supernatanten ble overført til derivater av disse og bestemt ved høyytelsesvæskekromatografi. Resultatet er vist i figur 9. 30 % glyoksal, 56 % metylglyoksal og 11 % 3-deoksyglukoson ble oppfanget. Ved anvendelse av diaminoguanidinfritt polyamid som negativ kontroll under de samme betingelser, kunne karbonyloppfangingen beskrevet ovenfor ikke påvises.

Resultatene beskrevet ovenfor bekreftet at karbonylforbindelsene kunne fjernes effektivt fra væsken med bærere til hvilke karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet var immobilisert.

Industriell anvendbarhet

Foreliggende oppfinnelse tillater effektiv fjerning av karbonylforbindelser fra blod. Middelet ifølge foreliggende oppfinnelse for forbedring av karbonylstresstilstand kan anvendes enkelt ved å immobilisere det til en dialysemembran for hemodialyse, eller alternativt, immobilisere det til andre bærere, og plassere det i blodstrømskretsen. Foreliggende oppfinnelse gjør det således mulig å lindre skader grunnet karbonylforbindelser (dvs. karbonylstress), som nyresviktpasienter i lang tid har lidd av.

Claims (8)

1. Anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fjerning av en karbonylforbindelse fra blod, hvori middelet reagerer kjemisk med, eller adsorberer karbonylforbindelsen for å fjerne karbonylforbindelsen fra blod under hemodialyse og hvori middelet er en Maillard-reaksjonsinhibitor immobilisert til en bærer som er uløselig i blod, eller omfatter en forbindelse som er uløselig i blod.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori bæreren er en dialysemembran.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori dialysemembranen er en polysulfonmembran.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvori Maillard-reaksjonsinhibitoren omfatter minst én forbindelse utvalgt fra gruppen som består av aminoguanidin, pyridoksamin, hydrazin, SH-gruppeholdige forbindelser og derivater av disse.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen som er uløselig i blod omfatter minst én forbindelse utvalgt fra gruppen som består av et ionebytteresin, aktivert karbon, kiselgel, aluminiumoksid og kalsiumkarbonat.

6. Anvendelse av et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel for fremstilling av et medikament som forbedrer karbonylstresstilstanden i blod under hemodialyse, hvori middelet er en Maillard-reaksjonsinhibitor.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvori Maillard-reaksjonsinhibitoren omfatter minst én forbindelse utvalgt fra gruppen som består av aminoguanidin, pyridoksamin, hydrazin, SH-gruppeholdige forbindelser og derivater av disse.

8. Fremgangsmåte for forbedring av karbonylstresstilstand, karakterisert vedat den omfatter å sette pasientens blod i forbindelse med et karbonylforbindelsesoppfangingsmiddel i blodkretsen in vitro under hemodialyse, hvori karbonylforbindelsesoppfangingsmiddelet immobiliseres til en bærer som er uløselig i blod, eller omfatter en forbindelse som er uløselig i blod.