CN119177321B - 基于纳米孔测序的猪流行性腹泻病毒全基因组扩增引物和方法 - Google Patents

基于纳米孔测序的猪流行性腹泻病毒全基因组扩增引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒全基因组的扩增引物和方法。猪流行性腹泻病毒的检测引物组包括60对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1~120所示。本发明提供的检测引物组可以实现对猪流行性腹泻病毒的较均匀覆盖，在纳米孔测序中，实现了基因组100％区域覆盖。本发明提供的猪流行性腹泻病毒全基因组的测序片段制备方法简便易操作，扩增效果好，且纳米孔测序具有边测序边实时分析的优势，可以大大缩短检测时间，能快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒的感染，同时得到其全基因组序列，获得的基因组序列能为病毒溯源、病原变异追踪、新型毒株识别和预警等提供科学依据。

Description

基于纳米孔测序的猪流行性腹泻病毒全基因组扩增引物和 方法
技术领域
本发明涉及动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于纳米孔测序的猪流行性腹泻病毒全基因组的扩增引物和方法。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性、传染性胃肠道疾病，临床上可导致猪只严重腹泻、呕吐和脱水，并且对十日龄以内的仔猪致死率高达100％，给生猪养殖行业均造成了巨大经济损失和生产困难。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种有囊膜包被的单股正链RNA病毒，属于α-冠状病毒；分为G1和G2两个亚型，最先发现和流行是以PEDV CV777为代表的G1亚型毒株。然而自2010年10月以来，一种高致病性G2b变异株开始爆发和流行，对养猪行业造成了严重的损害。
生产中PED可感染各种年龄的猪群并发病，对10日龄以内的仔猪危害最大，致死率高达100％。此病各种季节均有发生，多发于冬春季。PEDV毒株变异快速，对PEDV感染进行快速鉴别诊断，并获得其基因组信息，能为病毒早发现、早控制、溯源提供依据，尽可能减小其对养猪业带来的经济损失。目前，对于病毒检测方法主要有病毒分离培养、免疫学检测及核酸检测，但上述三种方法均不能获得病毒的完整基因组序列，无法解析病毒基因组特征。虽然一代和二代测序均可以获得病毒基因组全长，但一代测序需对扩增片段独立测序，较为通量较低，且费时费力。二代测序虽然通量较高，但通常和宿主基因组同时测序，且需要对短序列进行组装，易于出错。另外由于二代测序平台通常通量太高，也不适合实时检测。纳米孔测序具有实时、便携、长读长、高通量等特点，可实现现场实时快速检测；然而，目前尚无针对纳米孔测序优势设计的PEDV的测序技术。因此，目前仍亟需一种基于三代纳米孔测序的猪流行性腹泻病毒全基因组测序技术。
发明内容
本发明设计了PEDV全基因组长PCR扩增特异性引物，并进一步提供一种纳米孔测序的PEDV实时检测方法，充分发挥纳米孔测序在病原检测中实时、便携、长读长、高通量等优势。该检测方法可快速鉴别诊断不同基因型PEDV的感染，同时得到其全基因组序列，获得的全基因组序列可为病原变异监控及分子流行病学研究提供信息。
为达到上述发明目的，本发明所采如下技术方案为：
一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的检测引物组，所述检测引物组包括60对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～120所示。
另一方面，本发明提供上述检测引物组在制备检测猪流行性腹泻病毒的产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。
另一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂，包括上述检测引物组。
进一步地，所述检测试剂包括第一引物组和第二引物组，其中，第一引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～60所示；第二引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.61～120所示。
另一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，包括上述检测引物组。
进一步地，所述检测试剂盒包括第一引物组和第二引物组，其中，第一引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～60所示；第二引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.61～120所示。
另一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒测序片段的制备方法，利用上述引物组对待检测样本逆转录得到的cDNA进行扩增，扩增产物经纯化得到测序片段。
进一步地，利用第一引物组和第二引物组分别对待检测样本逆转录得到的cDNA进行扩增，扩增产物经纯化得到测序片段；
其中，第一引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～60所示；第二引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.61～120所示。
进一步地，测序样本适用于二代或三代测序。
进一步地，待检测样本包括临床样本或环境样本；
优选地，临床样本包括咽拭子、鼻拭子、血液样本或肺组织细胞。
另一方面，本发明提供前述引物组、检测试剂或试剂盒在猪流行性腹泻病毒的非疾病诊断检测中的应用。
进一步地，上述检测步骤包括：
1)利用上述引物组对待检测样本逆转录得到的cDNA进行扩增，扩增产物经纯化得到测序片段。
2)利用第一引物组和第二引物组分别对待检测样本逆转录得到的cDNA进行多重PCR扩增；其中，第一引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～60所示；第二引物组包括30对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.61～120所示。
3)将两组引物的扩增产物合并，经纯化得到测序片段。
4)测序获得猪流行性腹泻病毒的基因组片段序列。
5)经与参考基因组比对和/或组装获得猪流行性腹泻病毒的基因组全长序列。
进一步地，步骤4)所述测序为二代或三代测序。
进一步地，所述猪流行性腹泻病毒的非疾病诊断检测为检测环境样本或无生命的生物个体的咽拭子、鼻拭子、血液样本。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的PEDV的全基因组序列，按照基因组位置设计得到60对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1～120所示，并优化了多重PCR的引物组合。本发明的检测方法可获取不同基因型的PEDV全基因组序列信息。引物扩增和测序结果显示覆盖较为均匀，最低深度能够达到准确检测的要求。本发明利用纳米孔测序实时、便携、长读长、高通量的优势，实现快速鉴别诊断PEDV的感染和流行；同时得到其全基因组序列，获得的基因组序列能为病毒溯源、病原变异追踪、新型毒株识别和预警等提供科学依据。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。
图1为实施G1型PEDV样本的MinION测序深度覆盖情况。
图2为实施G2型PEDV样本的MinION测序深度覆盖情况。
图3为实验例2中文献1的引物扩增产物的测序深度覆盖情况。
图4为实验例2中文献2的引物扩增产物的测序深度覆盖情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例中引物核苷酸序列如下表所示：
实施例1PEDV三代测序全基因组扩增引物设计
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的PEDV的全基因组序列，使用BioEdit等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分析，获得其保守区域，利用Primer BLAST进行引物设计和验证。为实现全基因组扩增对PEDV基因组设计了多对引物。引物信息如表1所示。该检测引物组可以实现对PEDV的较均匀覆盖，为获得更均匀有效的PEDV基因组测序样本提供良好的技术手段，在纳米孔测序和高通量测序中均取得了良好的效果。该检测引物组适于制备成检测PEDV的产品并得到广泛应用。具体地，可以为试剂或试剂盒。本发明同时保护该试剂或试剂盒，具体以上述检测引物组为引物，扩增制备PEDV全基因组的测序片段。
实施例2干扰建立纳米孔测序的PEDV实时测序方法
本实施例采用2个具有不同分支的PEDV毒株，利用本发明提供的制备方法对PEDV样本进行测序，具体流程如下：
1)核酸提取：使用博日自动化核酸抽提机抽提样本核酸，核酸抽提后需要Qubit荧光定量仪测定浓度。
2)一链cDNA合成：取8μL RNA(浓度200ng/μL)于新的0.2mL PCR管中，冰上加入2μLRTMix(TaKaRa)，轻弹混匀，瞬时离心将液体离心至管底，不要有气泡，将PCR管/板放置于冰上。置于PCR仪上按照PCR程序(25℃2min；55℃10min；95℃10min；4℃Hold)运行，4℃保存。
3)PCR多重扩增：按照管1(第一引物组)和管2(第二引物组)分为两个反应，对同一个样本采用NEB(NEW ENGLAND BioLabs)公司的High-Fidelity 2X Master Mix进行反应，条件为：98℃，30s；35个循环：98℃，15s、65℃，5min；4℃保存。
4)PCR产物纯化：将两个扩增池的产物合并到一个1.5mL的EP管中。使用0.8×体积的磁珠进行纯化，200μL新配制的70％乙醇漂洗两遍后用无核酸酶水进行洗脱纯化产物。
5)PCR产物质检：使用dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对PCR纯化后产物进行定量。
6)三代测序：采用纳米孔测序仪MinION对扩增产物混合样本进行了建库和测序。
7)分析结果：采用生物信息学方法，将平均深度200×测序片段序列比对到GenBank参考基因组，比计算每个基因组位点的覆盖深度。
实验例1
按照管1为第一引物组，管2为第二引物组，分为两个反应，其它条件按以上实验步骤进行。
结果显示，该扩增体系实现了对PEDV覆盖了基因组100％区域，并均实现了所有扩增区域>100倍的覆盖深度，MinION测序结果如图1～2所示(图1为G1亚型PEDV样本，图2为G2亚型PEDV样本)。该结果说明本技术发明的标准评估可以满足需求，为获得更均匀有效的PEDV基因组测序样本提供良好的质控。
实验例2
由于MinION测序长度较长，MinION的读长通常在1,000到10,000碱基对之间，我们尝试对已公开的扩增长度在几百到几千bp的分段扩增引物进行多重PCR和三代测序(文献1：CN106834282A；文献2：程小娜.猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株的序列分析和抗原表位表达[D].海南大学,2015.)，并与本发明进行比较。将上述两篇文献报已公开的分段扩增PEDV全基因组的引物分别分两组进行多重PCR，每组PCR产物不重叠，最终将两组PCR产物混合后测序，仅G1亚型PEDV样本测序。结果(图3、4)显示已报道的分段扩增引物组在多重PCR条件下，无论是长扩增产物还是短扩增产物，均出现某些位点覆盖度低于100，甚至为0，且整体reads覆盖极度不均匀，难以满足全基因组覆盖的要求。
以上结果表明，多重PCR结合纳米孔测序仍需要设计适当长度、适当位点的引物，且需核实的引物对组合才能达到最佳效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种猪流行性腹泻病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组分为两组，每组分别进行多重PCR，第一引物组由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.60组成，第二引物组由SEQID NO.61～SEQ ID NO.120组成。
2.权利要求1所述的检测引物组在制备检测猪流行性腹泻病毒的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
4.一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物组。
5.一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物组。
6.一种猪流行性腹泻病毒测序片段的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述的检测引物组对待检测样本逆转录得到的cDNA进行扩增，所述扩增为利用第一引物组和第二引物组分别进行多重PCR，扩增产物经纯化得到测序片段。
7.权利要求1所述的引物组、权利要求4所述的检测试剂或权利要求5所述的试剂盒在猪流行性腹泻病毒的非疾病诊断检测中的应用，其特征在于，利用权利要求6所述方法制备测序片段后经三代测序检测待测样本是否含有猪流行性腹泻病毒。
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