CN1190973A - 寡核苷酸合成的改进方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了液相合成纯化的短链寡核苷酸偶联单元如二聚体、三聚体和四聚体的改进方法,这些偶联单元适用于液相或固相合成寡核苷酸。

Description

寡核苷酸合成的改进方法

发明领域

本发明涉及寡核苷酸合成的改进方法。具体而言，本发明提供了液相合成纯化的短链寡核苷酸偶联单元如二聚体、三聚体和四聚体的改进方法，这些偶联单元适用于寡核苷酸的液相或固相合成。

发明背景

起初，利用磷酸三酯(“三酯法”)或亚磷酸酯(“亚磷酸酯法”)来进行固相寡核苷酸合成。随着相对稳定的单核苷氨基亚磷酸酯(phosphoramidite)偶联单元的发现(参见，例如，Beaucage和Caruthers，Tetra.Lett.，1981，Vol.22，1859-1862)，固相寡核苷酸合成成为切实可行和常用。典型的固相寡核苷酸合成包括重复进行四个步骤：脱保护、偶联、加帽和氧化。

标准方法包括沿5′方向逐步合成寡核苷酸。第一步(“脱保护”)中，在3′端以3′-O-基与固相载体(support)连接的增长的寡核苷酸5′端被脱保护，以提供反应活性基团(即5′-OH基)。例如，通常在吡啶中与4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)反应得到5′-ODMT，使5′-OH被保护，它在碱性条件下是稳定的，但是在酸性条件下如二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)存在下容易脱保护。

第二步(“偶联”)中，将5′-脱保护的连接于载体上的寡核苷酸与目的核苷酸单体反应，该单体预先已被转化为5′-保护的3′-氨基亚磷酸酯。例如，5′-OH可以以5′-ODMT基团形式被保护，3′-OH可以被转化为3′-氨基亚磷酸酯，如-OP(OR′)NR₂，其中R是异丙基即-CH(CH₃)₂，R′例如是-H(产生氨基亚磷酸二酯)，或-CH₃、-CH₂CH₃或β-氰乙基即-CH₂CH₂CN(产生氨基亚磷酸三酯)。单体的3′-氨基亚磷酸酯基团与增长的寡核苷酸脱保护的5′-OH反应，产生亚磷酸酯键5′-OP(OR′)O-3′。参见，例如，Caruthers，M.H.和S.L.Beaucage，美国专利号No.4415732，公布于1995年11月15日。

不是所有的增长的寡核苷酸都会与提供的单体偶联；那些没有“生”的会产生不完全寡核苷酸，因此必须从下一步合成中除去。通过第三步(“加帽”)达到这一目的，其中所有残余的-OH(即未反应的5′-OH)均被加帽，例如通过与乙酐(CH₃C(O)-O-C(O)CH₃)反应生成乙酸酯形式(5′-OC(O)CH₃)。

最后，在氧化步骤中，例如通过与碘水溶液和吡啶反应，使增长的寡核苷酸的新形成的亚磷酸酯基(即5′-OP(OR′)O-3′)转化为磷酸酯基团(即5′-OP(＝O)(OR′)O-3′)。

然后该四步法可重复进行，因为氧化后得到的寡核苷酸仍然是5′-被保护(如5′-ODMT)形式，并可用于上述第一步脱保护步骤中。

当已获得所需的寡核苷酸时，例如，可以用碱和热处理将其从固相载体上裂解下来。此步骤也可将磷酸三酯(即R′不是-H时)转化为磷酸二酯(-OP(＝O)₂O-)，并且使核苷酸碱基碱不稳定的被保护氨基脱保护。

在制备较长链的寡核苷酸中，由于合适的三酯二聚体和三聚体偶联单元的可获得性，早期的三酯法能得到较好的收率(参见，例如Hirose等，Tetra.Lett.，1978，pp.2449-2452)。但是，与仅使用核苷酸单体不同，寡核苷酸合成中的最近进展已使用核苷酸多聚体(即短链寡核苷酸)，如核苷酸二聚体氨基亚磷酸酯，由此减少所需重复次数并提高总收率、减少化学操作。参见，例如，Kumar和Poonian，J.Org.Chem.1984，Vol.49，第4905-4912页。例如，为获得寡核苷酸(dGdT)₁₀dG，可以从dG-型固相载体(如dG-CPG)开始，利用dGdT-二聚体单元(如5′-保护的-dG-dT-3′-氨基亚磷酸酯)进行10次重复操作，与此相反，从dG-型固相载体开始使用dG-和dT-单体单元(如5′-保护的-dG-3′-氨基亚磷酸酯和5′-保护的-dT-3′-氨基亚磷酸酯)进行20次重复操作。

例如，当一次偶联效率为99％(假设单体偶联和二聚体偶联效率相等)，那么20次单体偶联收率仅为(0.99)²⁰或81.8％，而10次二聚体偶联收率为(0.99)¹⁰或90.4％。若一次偶联效率为97％，那么，偶联单体和二聚体的收率分别为(0.97)²⁰＝54.4％和(0.97)¹⁰＝73.7％。单体与二聚体收率之比反映了二聚体经济合成所需的“无损失率”，例如，97％的偶联效率时，无损失率为54.4/73.7＝73.8％；也就是说，当能够以73.8％或更高收率从单体单元制备二聚体偶联单元且其它所有因素均相同时，可以更清楚地认识到基于二聚体合成的优点。

例如，理论上来看，对于20次单体偶联，可以进行20步，每步采用1000单体当量；对于相应的10次二聚体偶联，将进行10步，每步采用1000二聚体当量，其中必须从单体制备出这些二聚体，带有一些内在损失。如果仅能以80％的收率从单体合成二聚体，那么与单体偶联所需的20,000单体当量相比，可从25,000单体当量制备出所需的10,000个有用的二聚体当量。偶联效率为97％时，通过采用20,000单体当量的20个循环的单体偶联法，每1000个固相载体位点获得544个正确的寡核苷酸(即2.72×10^-5寡核苷酸/位点/单体)，而采用25,000单体当量的10个循环的二聚体偶联法，每1000位点得到737个正确的寡核苷酸(即2.95×10^-5寡核苷酸/位点/单体)。

这种“密集型”合成的成功依赖于可获得合适的二聚体-氨基亚磷酸酯。例如，可购买到所有16个二(脱氧核苷酸)二聚体(形式为N-封闭的-5′-ODMT-3′-[2-氯苯基]-2′-脱氧核苷酸基-[3′5′]-N-封闭的-[2-氯苯基]-2′-脱氧核苷-3′-[2-氰乙基]磷酸酯)。通常使用固相寡核苷酸合成法制备这些二聚体。因此，与使用单个的单体相比，使用多个合成二聚体成本相对要高。

本发明提供了液相合成短链寡核苷酸如核苷酸二聚体的改进方法，这些短链寡核苷酸能用作液相或固相寡核苷酸合成的偶联单元。

发明简述

本发明一方面提供了制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述第一片段具有至少一个活性官能团(a)ⁿ，其中n是正整数，表示第n个Y活性官能团；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述第二片段具有至少两个不同的活性官能团b^(m)和c^(p)，其中m和p是正整数，分别表示第m个Z-b和第p个Z-c活性官能团，其中每个b^(m)活性官能团与每个c^(p)活性官能团不同；(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的至少一个Y活性官能团a⁽ⁿ⁾与所述至少两个Z活性官能团b^(m)和c^(p)反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成至少一个第一键合异构体YZ-b^(m)，它保留至少一个残余的活性官能团b^(m)，以及生成至少一个不同的第二键合异构体YZ-c^(p)，它保留至少一个残余的活性官能团c^(p)；(d)使所述YZ键合异构体或其衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述的至少一个YZ-b^(m)键合异构体的所述至少一个残余的活性官能团b^(m)选择性地保持不变，所述的至少一个YZ-c^(p)键合异构体的所述至少一个残余的活性官能团c^(p)被选择性加帽。

本发明的另一方面提供了制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述的第一片段具有活性官能团a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述的第二片段具有两个不同的活性官能团b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的Y活性官能团a与所述Z活性官能团b和c反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成保留一个残余的活性官能团b的第一键合异构体YZ-b和一个不同的保留一个残余的活性官能团c的第二键合异构体YZ-c；(d)使所述YZ键合异构体或其衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述YZ-b键合异构体的所述一个残余的活性官能团b选择性地保持不变，所述YZ-c键合异构体的所述一个残余的活性官能团c被选择性加帽。

本发明的另一方面提供了制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述的第一片段具有一个活性官能团a；(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述的第二片段具有两个不同的活性官能团b和c；(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的Y活性官能团a与所述的Z活性官能团b和c反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成保留一个残余的活性官能团b的第一键合异构体YZ-b和一个不同的保留一个残余活性官能团c的第二键合异构体YZ-c；(d)使所述第一键合异构体YZ-b和所述第二键合异构体YZ-c的混合物与一种氧化剂反应，由此生成第一YZ键合异构体的衍生物YZ′-b和第二YZ键合异构体的衍生物YZ′-c；(e)使所述YZ′键合异构体衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述YZ′-b键合异构体衍生物的所述一个残余活性官能团b选择性地保持不变，所述YZ′-c键合异构体衍生物的所述一个残余的活性官能团c被选择性加帽。

核苷酸片段Y和Z可包括一个核苷，它们可以相同或不同。优选的Y活性官能团是氨基亚磷酸酯基。特别优选的Y活性官能团是式为-OP(OR′)NR₂的氨基亚磷酸酯，其中R′选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CN和-C₆H₅Cl；R选自-CH₃、-CH₂CH₃和-CH(CH₃)₂，或为氨基亚磷酸酯基二异丙基-(2-氰乙基)-氨基亚磷酸酯即-OP(OCH₂CH₂CN)N(i-Pr)₂。

优选的第一核苷酸片段Y是5′-保护的-3′-氨基亚磷酸酯核苷，特别优选的是5′-ODMT-3′-氨基亚磷酸酯核苷，尤其是5′-ODMT-3′-(二异丙基-(2-氰乙基)-氨基亚磷酸酯)鸟苷。

优选的Z活性官能团b是仲醇，优选的Z活性官能团c是伯醇。优选的第二核苷酸片段Z是5′-OH、3′-OH核苷，优选胸苷。

优选的选择性加帽剂包括DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixylchloride，但不限于此。特别优选的选择性加帽剂是DMT-Cl。

优选的氧化剂是碘水溶液和吡啶。

附图简要说明

图1是表明形成dGdT二聚体单元的偶联反应的流程图。

图2是磷酸酯二聚体C₄₈H₅₃N₈O₁₃P的¹H-NMR图谱。

图3是磷酸酯二聚体C₄₈H₅₃N₈O₁₃P的¹³C-NMR图谱。

图4是磷酸酯二聚体C₄₈H₅₃N₈O₁₃P的³¹P-NMR图谱。

图5是磷酸酯二聚体C₄₈H₅₃N₈O₁₄P的¹H-NMR图谱。

图6是磷酸酯二聚体C₄₈H₅₃N₈O₁₄P的³¹P-NMR图谱。

发明详述

本发明提供了液相合成短链寡核苷酸偶联单元如核苷酸二聚体的改进方法，这些偶联单元能用于寡核苷酸合成。为在反应产物混合物中高收率生成所需的短链寡核苷酸，此改进方法利用两个选择性化学反应，(i)从反应产物混合物中可容易地分离和纯化所需产物，且(ii)反应混合物中不需要的异构体已被转化为非活性形式。

通常寡核苷酸合成的氨基亚磷酸酯法利用氨基亚磷酸酯基(即-OP(OR′)NR₂)和醇基(即-OH)之间的化学反应形成共价的亚磷酸三酯键(即-OP(OR′)O-)。许多氨基亚磷酸酯可选择性地与5′-OH反应，例如，2-氰乙基-氨基亚磷酸酯对5′-OH的选择性约超过3′-OH的选择性80％。在固相寡核苷酸合成中，这点没有什么影响，因为反应仅可使用的-OH是3′-连接载体的增长寡核苷酸的末端(脱保护的)5′-OH基。但是，在液相合成中，必须除去与3′-OH非选择性反应得到的不需要的产物和此产物之后得到的产物。

本发明的改进方法使来自非选择性偶联反应的副产物钝化并容易分离。为说明本发明的改进方法，我们可以考虑下面这个例子，从活性单体J和K液相合成通式化短链寡核苷酸J-3′-5′-K，一个核苷酸二聚体。通过在合适溶剂中，在合适的碱存在下，将呈5′-被保护的3′-氨基亚磷酸酯形式的第一核苷酸片段J与呈5′-OH，3′-OH单核苷形式的第二核苷酸片段K反应，可制备出这种二聚体。但是，由于氨基亚磷酸酯对5′-OH的选择性小于100％，该反应产生三种不同的产物：

(i)所需的J-3′-5′-K二聚体，收率相对较高；

(ii)不需要的J-3′-3′-K二聚体，收率相对低；以及

(iii)不需要的J-3′-3′-K-5′-3′-J三聚体，收率更低。

仅占产物混合物小部分的不需要的三聚体JKJ两(即5′)端被保护，不再进行随后的偶联。这样，在一般的寡核苷酸合成偶联步骤中，少量的这种5′-双重(且简并(degenerately))加帽的三聚体的存在不会产生什么问题。并且，这种双重保护(并简并保护)的三聚体的色谱性质和溶解性与单重保护的二聚体很不相同(如此保护的三聚体极性小得多)，例如通过溶剂萃取法可容易地除去此三聚体。

然而，所需的J-3′-5′-K和不需要的J-3′-3′-K二聚体(即键合异构体)均只是单重保护的(如分别为K-3′-OH和K-5′-OH)，且均具有反应活性。如果在寡核苷酸合成中采用这种混合物(例如，首先形成磷酸酯，然后将-OH基转化为氨基亚磷酸酯基)，将会得到需要的和不需要的寡核苷酸键合。因此必须分离和纯化所需要的二聚体。但是，由于所需二聚体和不需要二聚体的色谱性质和溶解性相似，所以这种纯化相当困难。

本发明的改进方法通过在不需要的短链寡核苷酸末端-OH基选择性加帽克服了这些困难。继续上面所述的例子，用5′-OH选择性加帽剂进一步处理反应混合物，以便将不需要的5′-保护的-J-3′-3′-K-5′-OH二聚体的K-5′-OH转化为双重保护的5′-保护的-J-3′-3′-K-5′-保护的二聚体，而基本上所有的所需5′-保护的-J-3′-5′-K-3′-OH二聚体未改变。这样，使不需要的J-3′-3′-K二聚体没有反应活性，且色谱性质不同于所需的单重保护的J-3′-5′-K二聚体。因此，可较容易地分离和纯化所需的二聚体，任何残余的不反应的双重保护的(或者更优选简并保护的)不需要的二聚体是不起反应的，便没有什么影响。

在一优选实施方案中，双重保护的不需要的二聚体的保护基是相同的，因此不需要的二聚体以类似于不需要三聚体的形式被“简并”加帽。这种简并加帽在寡核苷酸合成中具有实际价值。因为同样的保护基已存在于应有位置上(即上述实例中的J-5′-端)，所以已知它的化学结构和形成它所需的反应条件对所讨论的分子是温和的。

由此，本发明提供了液相合成短链寡核苷酸偶联单元的改进方法，该短链寡核苷酸偶联单元可用于长链寡核苷酸的合成中。在溶液中通过偶联两个核苷酸片段合成本发明的短链寡核苷酸；通过选择加帽，使液相偶联反应的不需要产物没有反应活性并易于分离。

这里所用的术语“液相寡核苷酸合成”是常规意义上的，用于描述一类合成方法，这类方法中增长的寡核苷酸和其组分均不被支持或者不与载体连接(被支持或与载体连接的情况是所熟知的“固相寡核苷酸合成”法)。

这里所用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”在常规意义上可交换使用，指包含两个或多个核苷的分子，每个核苷与至少另一个核苷通过核苷间键连接。本发明的寡核苷酸可以是线状的、分支的或环状，但优选线状的。这里所用的术语“短链寡核苷酸”指包含2至约16个、优选2至约8个、更优选2至约4个核苷的寡核苷酸。

这里所用的术语“核苷”是常规意义上的，通常指包含一个连接于一个核酸碱基上的“糖”部分的化合物。

这里所用的术语“糖”指单糖部分。优选糖呈环形，例如呈呋喃糖(5元环)或吡喃糖(6元环)形，但更优选呈呋喃糖形。糖可以是其对映体、非对映体或立体异构体的任何一种形式。优选糖包括戊糖和戊糖衍生物。优选戊糖是核糖。在优选的呋喃糖形式中，核糖(通常用带撇号数字表示这里的糖的碳原子)在5′-位置(即5′-OH)具有伯醇基(即羟基)，在3′-位置具有仲醇基(即3′-OH)，2′-位置具有仲醇基(即2′-OH)。优选的核糖衍生物是2′-脱氧核糖，其中以2′-H取代了2′-OH。其它优选的核糖衍生物包括2′-O-甲基核糖、2′-O-烯丙基核糖、2′-氟代核糖或2′-叠氮基核糖。优选糖包括D-核糖和2′-脱氧-D-核糖。

这里用的术语“核酸碱基”、“核苷酸碱基”和“核苷碱基”在常规意义上指嘌呤和嘧啶碱。优选的核酸碱基包括熟知的天然存在的嘌呤：腺嘌呤和鸟嘌呤；和嘧啶：胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本领域已知的核酸碱基的其它例子包括嘌呤和嘧啶类似物，如吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-戊炔基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核酸碱基的活性官能团可以是被保护的或未被保护的形式，例如，伯胺可以被保护成酰胺，如异丁酰胺或苯甲酰胺。

优选通过碱基和糖的环上原子使核酸碱基与糖部分共价连接，其中通常以无撇号数字编号核酸碱基的环上原子。对于呈环状呋喃糖形式的戊糖，核酸碱基优选连接在戊糖1′-位上。优选通过碱基的环上氮原子连接核酸碱基。对于嘧啶，优选在(N)-1-位连接；而对于嘌呤，优选在(N)-9-位连接。

优选的且熟知的由核糖和腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶形成的核苷的例子为“核糖核苷”，分别是腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷。优选的且熟知的由脱氧核糖和腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶形成的核苷例子为“脱氧核糖核苷”，分别是脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。

本发明的许多寡核苷酸通常可被认为是核苷酸多聚体，即包含核苷酸单体单元的多聚体。

这里所用的术语“核苷酸”是常规意义上的，通常指核苷的磷酸酯，即含磷酸酯基(即-OP(＝O)(OR)₂，其中R可独立地为-H、阳离子或有机基团)、糖部分和核酸碱基的化学结构部分。一组优选的核苷酸包含一个呈环状呋喃糖形式的戊糖，作为糖部分。优选在3′位或5′位形成磷酸酯。一组优选的核苷酸为那些由核糖和2′-脱氧核糖衍生的核苷酸。一组优选的核苷酸包括3′-核糖核苷酸和3′-(2′-脱氧)核糖核苷酸(更常见地简单写为3′-脱氧核糖核苷酸)。另一组优选核苷酸包括5′-核糖核苷酸和5′-(2′-脱氧)核糖核苷酸(更常见地简单写为5′-脱氧核糖核苷酸)。

这里所用的术语“核苷间键合”指连接相邻核苷的二价化学部分。优选的核苷间键合包括磷酸二酯基(即磷酸二酯键桥-OP(＝O)(OH)O-)和磷酸三酯基(即磷酸三酯键桥-OP(＝O)(OR′)O-)，其中R′是含1至20个碳的有机基团。优选的R′例子有-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CN和-C₆H₅Cl。其它优选的核苷间键合包括亚磷酸二酯基(即-OP(OH)O-)和亚磷酸三酯基(即-OP(OR′)O-)，其中R′定义同上。其它核苷间键合的例子包括膦酸酯(即-OP(＝O)(R)O-)如甲基膦酸酯，和酰胺(即-NHCO-)。

本发明寡核苷酸的核苷间键合将核苷的一个原子与相邻核苷的一个原子连接起来。一组优选的核苷间键合包括那些将一个核苷的3′-位与相邻核苷的5′-位连接起来的键合(即3′-5′键合)；将一个核苷5′-位与相邻核苷的3′-位连接起来的键(即5′-3′键合)；将一个核苷3′-位与相邻核苷3′-位连接起来的键(即3′-3′键合)；或将一个核苷5′-位与相邻核苷5′-位连接起来的键(即5′-5′键合)。

脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)是寡核苷酸的重要例子。在这两种寡核苷酸中，所有的核苷间键合均为磷酸二酯(即-OP(＝O)(OH)O-)键且均在5′-3′方向上；DNA是脱氧核糖核苷酸的聚合物，主要包括核酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，而RNA是核糖核苷酸的聚合物，主要包括核酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。按常规习惯，这里用寡核苷酸5′-端至寡核苷酸3′-端排列的核酸碱基(即分别为A、G、C和U；或dA、dG、dC和T(或dT)，其中“d”表示脱氧核糖核苷酸)来表示简单的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸及其聚合物。(注意胸苷常指“脱氧胸苷”，缩写为“dT”。)例如，dGT是由脱氧鸟苷和脱氧胸苷形成的二核苷酸，其中脱氧鸟苷5′-位是5′-OH；脱氧鸟苷3′-位通过磷酸二酯基与胸苷的5′-位相连；胸苷的3′-位是3′-OH。

这里用的术语“核苷酸片段”包括核苷单体、核苷酸单体(即核苷磷酸酯)、核苷酸聚合物(即寡核苷酸)及其衍生物。一组优选的核苷酸片段正好包含一个核苷。其它优选的核苷酸片段包含正好两个、三个、四个、六个或八个核苷。优选的核苷酸片段是线状的。核苷酸片段具有至少一个活性官能团，且可以具有一个或多个其它被保护的或者不反应的官能团。

这里所用的术语“活性官能团”是指在特定条件下可以与其它可利用官能团反应形成共价键合的官能团。优选的活性官能团的例子是羟基(即-OH)和氨基亚磷酸酯(即-OP(OR′)NR₂，其中R′且R是含1至20个碳原子的有机基团)。一组优选的氨基亚磷酸酯官能团是R′为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CN或-C₆H₄Cl且R是CH(CH₃)₂的那些官能团。

这里所用的术语“被保护的或者不反应的官能团”指在特定条件下与其它可利用官能团基本上不反应的官能团。这里所用的术语“官能团保护”在常规化学意义上指普通化学方法，利用该方法可逆地使一个官能团变为不反应的，该官能团在特定条件下(如pH、温度、辐射、溶剂等等)会具有反应活性。各种“保护”、“封闭”、“掩闭”法广泛用于有机合成，是熟知方法。例如，具有两个不同活性官能团的化合物(在特定条件下两个官能团均具反应活性)可被衍生，使一个官能团被保护，那么在特定条件下此官能团是不反应的；这样保护后，该化合物可用作反应剂，仅有一个有效的活性官能团。在所需反应(涉及其它官能团)完成之后，被保护基可“脱保护”，恢复为其原始功能。

各种保护基策略是已知。例如，在碱性条件下与某些其它官能团(如氨基亚磷酸酯)可反应的羟基(即-OH)可通过转化为合适的醚而“被保护”，在碱性条件下醚是不反应的。之后，当需要对羟基脱保护时，可用酸处理被保护的化合物。例如，可将-OH与DMT-Cl反应生成酸不稳定的-ODMT基而保护起来，例如通过用合适的酸如二氯乙酸处理可将-ODMT基脱保护。类似地，可将-NH₂与苯甲酰氯反应生成碱不稳定的酰胺C₆H₅-C(＝O)-NH-，使-NH₂以酰胺形式被保护，例如通过用合适的碱如氨水溶液处理将酰胺脱保护。

一组为核苷单体的优选核苷酸片段是所熟知的核苷：腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷和脱氧胞苷。优选这些核苷酸片段的3′-和5′-基团是活性官能团，如3′-OH和5′-OH。更优选除这些核苷酸片段的3′-和5′-活性官能团之外，所有的活性官能团均用对碱稳定的保护基保护。也可以需要将3′-和5′-官能团之一保护起来。例如，对于腺苷、脱氧腺苷、胞苷和脱氧胞苷这些片段，优选将核酸碱基的伯氨基(即-NH₂)例如与苯甲酰氯(即C₆H₅-C(＝O)-Cl，生成酰胺C₆H₅-C(＝O)-NH-)反应，以酰胺形式保护起来。类似地，对于腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷这些核糖核苷酸，优选将2′-OH以甲硅烷基醚的形式保护，例如2′-OSi(i-Pr)₃或2′-O-Si(CH₃)₂(C(CH₃)₃)或甲氧基四氢吡喃基、四氢呋喃基、2-硝基苄基或苯甲酰基。特别优选核苷酸片段胸苷，因为它既没有2′-OH，也没有核酸碱基的-NH₂。

另一组优选的核苷酸片段由那些包括例如氨基亚磷酸酯和亚磷酸酯的核苷单体所衍生的片段组成。一组优选的这种核苷酸片段是那些3′-核糖核苷和3′-脱氧核糖核苷，其中5′-OH已被保护成对碱稳定的保护性基团，如-ODMT；3′-OH已衍生为活性官能团，如氨基亚磷酸酯(即-OP(OR′)NR₂)或亚磷酸酯(即-OP(OR′)₂)。优选所有余下的活性官能团(即除3′-和5′-基团之外的)均已被上述对碱稳定的保护基保护。这类优选的核苷酸片段的例子包括N-封闭的-5′-ODMT-脱氧核苷-3′-氨基亚磷酸酯，如：N-封闭的-5′-ODMT-脱氧腺苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)氨基亚磷酸酯；5′-ODMT-脱氧鸟苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)氨基亚磷酸酯；5′-ODMT-脱氧胸苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)氨基亚磷酸酯；和N-封闭的-5′-ODMT-脱氧胞苷-3′-(2-氰乙基-N，N-二异丙基)氨基亚磷酸酯。

另一组优选的核苷酸片段由那些核苷酸单体或由核苷酸单体衍生的片段组成，更优选3′-核糖核苷酸、3′-(2′-脱氧)核糖核苷酸(即3’-脱氧核糖核苷酸)、5′-核糖核苷酸、5′-(2′-脱氧)核糖核苷酸(即5′-脱氧核糖核苷酸)，更优选3′-核糖核苷酸和3′-脱氧核糖核苷酸。

还有一组为核苷酸多聚体的优选的核苷酸片段，它们是本发明的短链寡核苷酸自身。例如前面举例中所述的二聚体J-3′-5′-K。在许多方面，这种二聚体类似一个单体，因为它具有可被保护或衍生的5′-和3′-基团。

本发明提供了液相合成短链寡核苷酸的改进方法，该方法包括步骤(a)偶联两个核苷酸片段；和(b)对不需要的产物选择性加帽。

这里用的术语“选择性的”和“选择性”涉及一类化学反应，其中可能有许多种反应产物，但是过量产生一种或几种产物。例如，等量产生两种产物A和B的化学反应是非选择性的，而产生A多于B的化学反应可以说是对A具有选择性。这里所用的术语“高度选择性的”或“高度选择性”涉及选择性化学反应，其中一种或几种所需产物占反应产物多于70％，而优选多于80％，更为优选多于90％。

用任何一种已知方法可使两个核苷酸片段Y和Z偶联，生成偶联的片段Y-Z。偶联法的例子包括氨基亚磷酸酯法、H-磷酸酯法和磷酸三酯法，均为本领域熟知的方法。

优选的偶联方法包括第一核苷酸片段的氨基亚磷酸酯基(即Y-OP(OR′)NR₂)和第二核苷酸片段的未保护醇基(即Z-OH)间的反应，形成磷酸三酯键合(即Y-OP(OR′)O-Z)。此偶联法的优点是，它具有选择性；氨基亚磷酸酯基对伯醇(即5′-OH)基比对仲醇(如3′-OH)基具有选择性。例如，2′-氰乙基-二异丙基氨基亚磷酸酯对5′-OH(伯醇)基的选择性比对3′-OH(仲醇)基的选择性约高80％。

选择性偶联法减少或消除保护Z上所有活性官能团的需要，这些活性官能团可能导致不需要的副产物。例如，当Z具有3′-OH和5′-OH(即HO-5′-Z-3′-OH)时，可选择这种偶联策略，致使通过Z-5′-OH的偶联主要生成所需产物(即Y-5′-Z-3′-OH)并仅产生少量的不需要产物(即Y-3′-Z-5′-OH)。以这种方式，不必保护Z-3′-OH。当然，正如上面所述，Y上除3′-氨基亚磷酸酯外的任何一种活性官能团(如5′-OH)也可能需要保护。

如果需要Y-3′5′-Z核苷间键合，可选择这种偶联策略，这样核苷酸片段Y的氨基亚磷酸酯基被连接于Y的3′-位。这种选择性偶联策略产生大部分所需产物(即Y-3′-5′-Z′-3′-OH)和仅少部分的不需要产物(即Y-3′-3′-Z′-5′-OH)；即两种键合异构体。注意，这些产物均可进一步与Y-3′-氨基亚磷酸酯反应生成相同的“三片段”产物Y-3′-5′-Z-3′-3′-Y。这种三片段产物是不反应的(如在碱性偶联条件下)，因为所有余下的官能团均被保护或者在偶联反应条件下均无反应活性；这种三片段产物被双重加帽。还应注意在两端存在Y-5′-保护基；因此，这种不反应的三片段产物是被“简并加帽”的。

如此获得的偶联反应产物混合物包含所需产物和不需要产物，必须将其分离。但是这些键合异构体具有基本相似的色谱性质和溶解性，且它们的分离不是无关紧要的。本发明的改进方法使不需要的产物衍生(即通过选择性加帽)，由此使得其无反应活性并容易分离。

通过将偶联产物混合物与一种合适的选择性加帽剂反应，使不需要的产物被选择加帽。例如对于含带有3′-OH的所需产物和带有5′-OH的不需要产物的反应混合物，为衍生不需要产物可将该混合物与5′-OH-选择性试剂反应。可以从使产物可分离的角度或使不需要产物无反应活性的角度或从这两个角度，或者依据其它合成或策略因素，来选择选择性加帽剂。

合适的加帽剂包括DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixyl chloride，但不限于此。优选的选择性加帽剂是合适碱和溶剂如吡啶中的DMT-Cl(即4，4′-二对甲氧三苯甲基氯)。与3′-OH比，该试剂对5′-OH是高度选择性的，生成约90％或更多的5′-ODMT，仅生成约10％或更少的3′-ODMT。这种优选的选择性加帽剂的使用可由下面偶联策略说明：(i)将第一核苷酸片段DMTO-5′-Y-3′-氨基亚磷酸酯和第二核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH偶联，产生所需的和不需要的YZ键合异构体，分别为DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-OH；(ii)含这些异构体(或其衍生物)的反应混合物进一步与选择性偶联剂吡啶中的DMT-Cl反应，主要产生未改变的所需YZ键合异构体DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和被“简并加帽”的不需要的键合异构体DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-ODMT。

这种偶联剂提供了许多重要的实用的优点。首先，偶联剂是高度选择性的；在上述说明中，仅有极少部分的所需键合异构体被简并加帽而损失掉。第二，被双重加帽的不需要的键合异构体具有明显不同的色谱性质和溶解性(它的极性比单一加帽的异构体小得多)，因此可容易地从所需键合异构体中分离出来。第三，有效选择加帽所需的DMT-Cl/吡啶反应条件对核苷酸片段和短链寡核苷酸是温和的，这一点是已知的，因为该试剂已被广泛用来对核苷、核苷酸和寡核苷酸5′-OH进行选择性加帽和保护。第四，污染所需键合异构体的任何一种被简并加帽的不需要键合异构体无足轻重：在它可能作为污染物存在的大多数寡核苷酸合成步骤中(如偶联)它是不反应的。

所需键合异构体(即短链寡核苷酸)可进一步被衍生，生成适用于固相或液相寡核苷酸合成的反应单元(即偶联片段)。例如，对于通过氨基亚磷酸酯反应被偶联的且具有亚磷酸三酯核苷间键的键合异构体来说，可以用已知方法将该异构体氧化，生成磷酸三酯。可任选地或另外，可将该键合异构体衍生以具有其它活性官能团如氨基亚磷酸酯基，致使其用作液相或固相寡核苷酸合成中的偶联片段。为说明这种方法，考虑下面的策略：

(i)偶联：将第一核苷酸片段DMTO-5′-Y-3′-氨基亚磷酸酯与第二核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH偶联，主要生成所需的和不需要的YZ(亚磷酸酯)键合异构体，分别为DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-OH；

(ii)氧化：所需的YZ(亚磷酸酯)键合异构体DMTO-5′-Y-3′-亚磷酸酯-5′-Z-3′-OH和不需要的YZ(亚磷酸酯)键合异构体DMTO-5′-Y-3′-亚磷酸酯-3′-Z-5′-OH通过熟知方法进一步与一种氧化剂如碘和吡啶水溶液反应，生成所需的YZ(磷酸酯)键合异构体DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-5′-Z-3′-OH和不需要的YZ(磷酸酯)键合异构体DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-3′-Z-5′-OH；

(iii)选择性加帽：含有这些磷酸酯键合异构体的混合物进一步与5’-OH选择性试剂即吡啶中的DMT-Cl反应，生成主要为未改变的所需YZ键合异构体DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH和被“简并加帽”的不需要的YZ键合异构体DMTO-5′-Y-3′-3′-Z-5′-ODMT。

(iv)(任选)衍生：使用熟知方法，将所需YZ(磷酸酯)键合异构体DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OH进一步与衍生试剂如2-氰乙基-N，  N-二异丙基氯氨基亚磷酸酯(CEDICPA)或双(二异丙基氨基)氰乙基亚磷酸酯(BDIACEP)反应，生成所需的氨基亚磷酸酯DMTO-5′-Y-3′-5′-Z-3′-OP(OR′)NR₂，其中R′是-CH₂CH₂CN，R是-CH(CH₃)₂。

在选择性加帽之后的任何时候，例如通过熟知的溶剂萃取法或色谱法可分离和纯化该所需键合异构体。在一些如下所述的例子中，可以不必或不需分离和纯化所需键合异构体，因为在主要相关条件下，不需要的键合异构体和三片段产物是无反应活性的。

在本发明方法的某些实施方案中，可优选在“氧化”步骤之前进行“选择性加帽”步骤。

例如，对于这种具有亚磷酸二酯型核苷酸间键合的亚磷酸酯连接的二聚体，选择选择性加帽剂，对5′-OH选择性均大于3′-OH和亚磷酸酯基。优选的选择性加帽剂包括封闭的甲硅烷基化剂和酰化剂，最优选叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷和三异丙基氯硅烷。

在采用DMT-Cl/吡啶作为选择性加帽剂的优选实施方案中，氧化步骤在选择性加帽步骤之前，以减少选择性加帽步骤中产生的副反应(例如，DMT阳离子和亚磷酸酯的磷原子间的亲核反应)。但是，在其它实施方案中，可优选对亚磷酸酯键合异构体进行选择性加帽，随后再进行氧化步骤，生成(被选择加帽的)磷酸酯键合异构体。由此，在其它优选实施方案中，按以下顺序进行上面的步骤：(i)偶联；(ii)选择性加帽；(iii)氧化；和(iv)(任选)衍生。

在本发明其它实施方案中，可仅仅需要进行以下步骤(i)偶联；(ii)氧化；和(iii)选择性加帽。例如，随后的分离和纯化会提供所需的键合异构体DMTO-5′-Y-3′-磷酸酯-5′-Z-3′-OH，它本身是本发明的核苷酸片段；通过5′-ODMT基的脱保护，它可被表示为HO-5′-W-3′-OH，直接类似于上述的核苷酸片段HO-5′-Z-3′-OH。

步骤(iv)的产物本身是本发明的核苷酸片段；它可被表示为DMTO-5′-W-3′-OP(OR′)NR₂，直接类似于上述核苷酸片段Y-3′-OP(OR′)NR₂。如此制备的步骤(iv)的产物能以基本类似于单体反应性片段的使用方式用于一般的固相或液相寡核苷酸合成中。

或者，在本发明中可使用步骤(iv)的产物来合成较长的“短链寡核苷酸偶联单元”。例如，使用本发明方法，可以由活性单体J和K开始，产生并分离出所需的JK-二聚体；将JK-二聚体的一半衍生，得到反应活性的JK二聚体(如JK-氨基亚磷酸酯)；再次使用本发明方法，使剩余的JK-二聚体与JK-氨基亚磷酸酯反应，以产生并分离出所需的JK JK-四聚体；衍生JK JK-四聚体的一半，得到反应活性的JKJK-四聚体(如JK JK-氨基亚磷酸酯)；再次使用本发明方法，使剩余的JK JK-四聚体与JK JK-氨基亚磷酸酯反应，以产生并分离出所需的JK JK JK JK-八聚体，如此进行下去。注意，在产生氨基亚磷酸酯的衍生步骤中，被简并加帽的不需要的键合异构体是不反应的；因此，该产物混合物的这一半不必进行纯化。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请在此插入引作参考文献，正如每篇单独的出版物或专利申请被特定地单独引作参考一样。

实施例1：dGdT氨基亚磷酸酯二聚体偶联单元的制备

A.dG与dT的偶联

所有玻璃器皿在使用前均通过真空下加热被干燥，反应在氩气中进行。未保护的胸苷5′-OH-dT-3′-OH作为化合物(1)(4.87g，20.1mmol，Aldich)溶于无水DMF(60ml，Aldrich)中，真空下将该溶液蒸馏至40ml体积，以干燥反应混合物。冷却至室温后，加入化合物(2)5′-ODMT-dG-3′-氰乙基氨基亚磷酸酯(7.36g，8.76mmol，Cruchem)。在该氨基亚磷酸酯溶解后，在快速搅拌下滴加四唑的乙腈溶液(0.45M，39ml，18mmol，Millipore ActivatorSolution)40分钟。就5′-ODMT-dG-3′-氰乙基氨基亚磷酸酯/四唑混合物而言，薄层色谱(TLC)(二氧化硅，乙酸乙酯)表明完全反应。

含一半体积反应混合物的试样被移去用于亚磷酸酯二聚体的分离。该试样在室温下被汽提以除去大量乙腈。在快速搅拌下，00C时将该所得溶液(18.5g)滴加入新制备的碳酸氢钠水溶液(0.3M，250ml)和乙酸乙酯(50ml)的混合物中。由于亚磷酸酯二聚体在乙酸乙酯中具有部分溶解性，形成了胶质固体。向该混合物中加入硅藻土512(^TM10g)和己烷(^TM100ml)，滤出固体并用水和己烷洗涤。该固体用二氯甲烷(150ml)提取，滤液被干燥(用硫酸钠)、过滤，并被汽提成泡沫形玻璃(4.48g，4.57g，52％)。TLC分析(二氧化硅，10％EtOH/CHCl₃)表明在R_f＝0.21和0.29处有两个主要产物，在R_f＝0.43处有极微量的第三个产物(三聚体？)。在室温条件下，发现亚磷酸酯二聚体是稳定的(至少达几个月)。

通过液相色谱分离这两个主要产物的努力没有成功。在利用硅胶柱(57×300mm，55-105微米，目录号WAT050041)的WatersDeltaPrep上对该粗制三酯(4.28g)进行色谱分离。使用线性梯度为40分钟内0-10％甲醇的二氯甲烷溶液，50ml/min流速，在45分钟时以宽峰形式洗脱出1％的等份试样。然后，使用线性梯度为40分钟内5-10％甲醇的二氯甲烷溶液，50mL/min流速，对残余产物进行色谱；再次在45分钟以宽峰洗脱出产物。将由TLC测定的最纯净级分合并，并汽提为泡沫玻璃(1.08g，25％)，为含3′-5′和3′-3′异构体(2.11g，50％)的混合级分。

B.氧化dG-亚磷酸酯-dT成为dG-磷酸酯-dT

用标准氧化剂溶液(0.05MI₂)一滴滴处理反应混合物的残余物，直至溶液中持续存在黄色(75ml，3.8mmol)。立即在真空下室温时从混合物中汽提乙腈，除去过量的碘。将得到的无色溶液快速搅拌下滴加入新制备的含硫代硫酸钠(^TM100mg)的碳酸氢钠水溶液(0.5M，200ml)中。滤出粗制固体，重新溶于二氯甲烷(100ml)中，干燥(用硫酸钠)并汽提为泡沫玻璃(4.25g，4.26mmol，收率49％)。TLC分析(二氧化硅，20％EtOH/CHCl₃)表明在R_f＝0.44和0.50处有两个主要产物，在R_f＝0.60处存在极少量的第三个产物(三聚体？)。由于外来的DCl，通过在CDCl₃中数小时内DMT基团的失去，磷酸酯二聚体分解；它对酸(脱三苯甲基作用)和碱(除去氰乙基)均不稳定。

粗制磷酸三酯在硅胶60(230g，Baxter C4582-87)上进行急骤层析，先以10％乙醇/氯仿(1L)洗脱，然后再以20％乙醇/氯仿(1L)洗脱。将最纯净的级分合并，并汽提为泡沫玻璃(820mg，19％)，为含3′-5′和3′-3′异构体(1.05g，25％)的级分。

为进一步鉴别两个主要产物，对单独合成的3′-5′和3′-3′偶联异构体进行关联色谱。利用T-5′-CPG的15微摩尔柱(500A，72微摩尔/g，Glen Research)在MilliGen8750上制备3′-3′偶联标准物。使用标准方法进行与dG-酰亚胺(amidite)的单一偶联。已被偶联的CPG与浓氨水溶液(1ml)混合，在室温下放置5天，通过薄棉纸塞(tissue paper plug)过滤，用水洗涤(2×1ml)，并在氮气流下浓缩。按相似方法制备出3′-5′偶联标准物。使用T-3′-CPG的15μmol柱(1000A，31μmol/gm，Glen Research)，在1.5ml浓氨水中55OC下水解16小时。用柱纯化获得的最纯净(23.4mg)和混合(13.Smg)级分，通过类似的水解作用，制备出相关标准物。通过对粗制、经汽提的亚磷酸酯反应溶液进行氧化和水解，制备出产物比率样品。

在Vydac C-18柱(目录号218 TP5415)上分析样品，流速1.00ml/min，25分钟内梯度为从缓冲液B(5％缓冲液A的乙腈溶液)中95％缓冲液A(0.1M乙酸三乙铵的水溶液)至50％缓冲液A。在20.0分钟时洗脱水解的3′-5′标准物，与水解的下面流动的(主要)二聚体一起洗脱。在20.5分钟时洗脱水解的3′-3′标准物，与水解的上面流动的(少量)二聚体一起洗脱。

C.不需要的3′-3′键合异构体的简并加帽

将磷酸三酯柱纯化的混合级分(1.04g，1.04mmol)溶于吡啶(10mL)中，并在真空下汽提(至^TM7ml)以使该混合物干燥。在快速搅拌下，立即加入DMT-Cl(232g，0.69mmol，Aldrich，室温氩气流下搅拌该混合物2小时。再加入DMT-Cl(30mg，0.09mmol)，且在室温下搅拌该混合物一昼夜。将该混合物在稀释的碳酸氢钠水溶液(^TM50ml)中淬灭，并用二氯甲烷(3×^TM10ml)萃取。萃取液通过硅胶塞(^TM4g)过滤，除去低R_f杂质，并汽提为稀油。用乙酸乙酯(10ml)洗脱硅胶塞，油被洗脱液吸收，并加入快速搅拌的10％乙酸乙酯/己烷(50ml)中。过滤沉淀，并用少量己烷洗涤，干燥，得白色固体(670mg，64％)，正如由极小的高Rf点所测定的，其仅含微量的3′-3′二聚体。

Claims (16)

1.一种制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：

(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述第一片段具有至少一个活性官能团a⁽ⁿ⁾，其中n是正整数，表示第n个Y活性官能团；

(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述第二片段具有至少两个不同的活性官能团b^(m)和c^(p)，其中m和p是正整数，分别表示第m个Z-b和第p个Z-c活性官能团，其中每个b^(m)活性官能团与每个c^(p)活性官能团不同；

(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的至少一个Y活性官能团a⁽ⁿ⁾与所述的至少两个Z活性官能团b^(m)和c^(p)反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成至少一个第一键合异构体YZ-b^(m)，它保留至少一个残余的活性官能团b^(m)，以及生成至少一个不同的第二键合异构体YZ-c^(p)，它保留至少一个残余的活性官能团c^(p)；

(d)使所述YZ键合异构体或其衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述的至少一个YZ-b^(m)键合异构体的所述至少一个残余活性官能团b^(m)选择性地保持不变，所述的至少一个YZ-c^(p)键合异构体的所述至少一个残余活性官能团c^(p)被选择性加帽。

2.一种制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：

(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述第一片段具有一个活性官能团a；

(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述第二片段具有两个不同的活性官能团b和c；

(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的Y活性官能团a与所述Z活性官能团b和c反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成一种保留一个残余的活性官能团b的第一键合异构体YZ-b和一种不同的保留一个残余活性官能团c的第二键合异构体YZ-c；

(d)使所述YZ键合异构体或其衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述YZ-b键合异构体的所述一个残余活性官能团b选择性地保持不变，所述YZ-c键合异构体的所述一个残余活性官能团c被选择性加帽。

3.一种制备偶联寡核苷酸YZ的方法，包括步骤：

(a)提供大量相同的第一核苷酸片段Y，每个所述的第一片段具有一个活性官能团a；

(b)提供大量相同的第二核苷酸片段Z，每个所述的第二片段具有两个不同的活性官能团b和c；

(c)使所述第一片段和第二片段在一定条件下反应，从而所述的Y活性官能团a与所述的Z活性官能团b和c反应，形成连接Y和Z的核苷间共价键合，由此生成一种保留一个残余活性官能团b的第一键合异构体YZ-b和一种不同的保留一个残余活性官能团c的第二键合异构体YZ-c；

(d)使所述第一键合异构体YZ-b和所述第二键合异构体YZ-c的混合物与一种氧化剂反应，由此生成第一YZ键合异构体的衍生物YZ′-b和第二YZ键合异构体的衍生物YZ′-c；

(e)使所述YZ′键合异构体衍生物的混合物与选择性加帽剂反应，从而所述YZ′-b键合异构体衍生物的所述一个残余活性官能团b选择性地保持不变，所述YZ′-c键合异构体衍生物的所述一个残余活性官能团c被选择性加帽。

4.权利要求3的方法，其中所述核苷酸片段Y和Z每个都包含单一核苷，它们可以相同或不同。

5.权利要求4的方法，其中所述Y活性官能团是氨基亚磷酸酯基。

6.权利要求5的方法，其中所述Y活性官能团是式为-OP(OR′)NR₂的氨基亚磷酸酯，这里R′选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CN和-C₆H₅Cl；R选自-CH₃，-CH₂CH₃和-CH(CH₃)₂。

7.权利要求6的方法，其中所述Y活性官能团是二异丙基-(2-氰乙基)-氨基亚磷酸酯-OP(OCH₂CH₂CN)N(i-Pr)₂。

8.权利要求7的方法，其中所述第一核苷酸片段Y是5′-保护的-3′-氨基亚磷酸酯核苷。

9.权利要求8的方法，其中所述的第一核苷酸片段Y是5′-ODMT-3′-氨基亚磷酸酯核苷。

10.权利要求9的方法，其中所述第一核苷酸片段是5′-ODMT-3′-(二异丙基-(2-氰乙基)-氨基亚磷酸酯)鸟苷。

11.权利要求10的方法，其中所述的Z活性官能团b是仲醇，所述Z活性官能团c是伯醇。

12.权利要求11的方法，其中所述第二核苷酸片段Z是5′-OH，3′-OH核苷。

13.权利要求12的方法，其中所述第二核苷酸片段Z是胸苷。

14.权利要求1的方法，其中所述选择性加帽剂选自DMT-Cl、MMT-Cl、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、新戊酰氯和pixyl chloride。

15.权利要求14的方法，其中所述选择性加帽剂是DMT-Cl。

16.权利要求15的方法，其中所述氧化剂是碘水溶液和吡啶。

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