CN112533694A - 监测固相逐步寡核苷酸合成的方法与系统 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及通过在表面上的多个位置进行测量来监测基底表面上的固相反应的方法。所述表面的性质基于所采取的测量来确定。基于确定的所述性质，确定所述固相反应的程度。这种方法可以通过使用椭偏仪并测量所述固相反应前后的表面厚度变化来实现。

Description

监测固相逐步寡核苷酸合成的方法与系统
交叉引用
本申请要求于2018年5月29日提交的美国临时专利申请号62/677,187的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
背景技术
固相合成是在组合化学中用于在短时间内在基底表面上简化合成大量分子的一种方法。固相合成的每个循环可以重复一组步骤以生成分子文库。合成的分子可以包括多肽、寡糖和寡核苷酸。固相合成可以涉及树脂的使用，该树脂是不溶的、聚合物基材料。该树脂可以预官能化，以使起始结构单元(例如单个氨基酸、单糖或核酸)可以容易结合。随后的每个结构单元可以受到保护；一旦添加至树脂上，该结构单元可以脱保护并用下一个所期望的结构单元处理。一旦合成了所期望的全长分子，就可以将其从树脂上裂解下来。例如，使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)保护基进行固相合成的肽已被用于从肽链的羰基侧(C-末端)至氨基侧(N-末端)合成肽。
高密度DNA微阵列已被广泛应用于一系列基因组序列分析，包括突变和多态性(SNP基因分型)、细胞遗传学(拷贝数)、核蛋白质组学、基因表达谱的检测和分析和转录组分析。
一种用于制造超高密度DNA微阵列的方法将原位合成与光刻半导体制造方法相结合，以在基底上提供具有高密度DNA序列的阵列。光刻方法可产生不完整或截短的探针序列的群体，这伴随着合成完整的期望或预期长度的探针序列(“全长”探针)。此类截短的探针序列的存在会对阵列性能产生不利影响，例如，在杂交反应中导致不良的信噪比(SNR)。光刻方法允许在3’至5’方向进行有效的寡核苷酸合成，合成探针的3’末端与固体支持体结合(5’向上的微阵列)。
发明内容
可能需要监测固相合成的每个步骤的程度，以确定预期的反应是否已在基底表面的正确位置发生。此外，需要在所述固相合成的每个步骤确定均匀性，以便可以改善整体结果或可以在逐步合成中及早发现问题，以节省劳力和/或成本。
在固相合成过程中，如果可能，需要实时监测添加每个嵌段的质量，并且在反应位点进行定性或定量。因此，需要监测原位固相聚合物合成的方法。特别地，非常需要在线监测工具来检测寡核苷酸或肽的光刻图案化合成过程中的合成问题。
一方面，本公开内容提供了一种监测基底表面上的固相反应的方法，包括：(a)在所述表面的第一反应之前，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第一测量；(b)在所述表面的所述第一反应之后，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第二测量；以及(c)基于所述第一测量和所述第二测量确定所述表面上的所述第一反应的第一质量。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括：(d)在所述表面上进行第二反应；(e)在所述表面的所述第二反应之后，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第三测量；以及(f)基于所述第二测量和所述第三测量确定所述表面上的所述第二反应的第二质量。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应用于聚合物、多肽、寡糖或寡核苷酸的合成。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应用于所述多肽的合成。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应用于所述寡糖的合成。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应用于所述寡核苷酸的合成。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量是厚度。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第二测量是厚度。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量和所述第二测量由光学仪器测量。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第三测量由所述光学仪器测量。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量和所述第二测量由椭偏仪测量。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第三测量由所述椭偏仪测量。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第三测量是厚度。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应的第一质量是在所述多个位置的每个位置的第一反应的产量、在所述多个位置的每个位置的第一反应的均匀性、所述第一反应在所述多个位置的每个位置是否提供正确产物，或者所述第一反应是否在所述多个位置的每个位置进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，(c)中的确定是基于所述第一测量和所述第二测量之间的第一差异。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一差异具有优于10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第一信噪比(SNR)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一差异具有约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第一信噪比(SNR)。
在本文提供的方面的一些实施方案中，(f)中的确定是基于所述第二测量和所述第三测量之间的第二差异。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第二差异具有优于10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第二信噪比(SNR)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第二差异具有约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第二信噪比(SNR)。
在本文提供的方面的一些实施方案中，可以通过使用不同波长的激光源来改善所述第一SNR。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述基底是硅(Si)或石英(Qz)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应使用二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学或光化学。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第二反应使用所述二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学或光化学。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应使用二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应使用光化学。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应使用相同的合成程序。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应使用不同的合成程序。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第二反应的第二质量是在所述多个位置的每个位置的第二反应的产量、在所述多个位置的每个位置的第二反应的均匀性、所述第二反应在所述多个位置的每个位置是否提供正确产物，或者所述第二反应是否在所述多个位置的每个位置进行。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应基于所述第一质量和/或所述第二质量终止。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述固相反应基于所述第一质量和/或所述第二质量继续。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量与所述表面所述固相反应在线进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量在所述表面所述固相反应的原位进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量与所述表面所述固相反应实时进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述椭偏仪是成像椭偏仪。在本文提供的方面的一些实施方案中，可以通过使用不同波长的激光源来改善所述第二SNR。在本文提供的方面的一些实施方案中，可以通过改变所述椭偏仪的波长、入射角、源带宽来改善所述第一SNR和/或所述第二SNR。
通过下文的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域的技术人员来说将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的示例性实施方案。技术人员将会认识到，本公开内容能够实现其他不同的实施方案，并且其能够修改各个明显方面的若干细节，所有这些都不偏离本公开内容。因此，附图和说明应被视为本质上是示例性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的全部出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。
附图说明
本发明的新颖特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，附图中：
图1示出了当逐步添加十个核苷酸时的厚度测量。
图2示出了当逐步添加十二个核苷酸时的厚度测量。
图3示出了当逐步添加十二个核苷酸时的另一厚度测量。
图4示出了当逐步添加二十个核苷酸时的厚度测量。
图5示出了根据分辨率测试模式添加核苷酸时的厚度测量。
图6示出了根据分辨率测试模式添加核苷酸时的另一厚度测量。
图7示出了根据分辨率测试模式添加核苷酸时的又一厚度测量。
图8示出了根据分辨率测试模式将核苷酸添加至石英晶片时的厚度测量。
图9示出了根据分辨率测试模式将核苷酸添加至石英晶片时的另一厚度测量。
具体实施方式
DNA寡核苷酸微阵列已经在商业规模上通过使用以下方法在芯片基底上直接原位合成来制造：光刻法(参见Pawloski等人，“Photolithographic synthesis of high-density DNA probe arrays:Challenges and opportunities；”Journal of VacuumScience&Technology B:Microelectronics and Nanometer Structures2007,25:253)、喷墨打印(LeProust等人，“Synthesis of high-quality libraries of long(150mer)oligonucleotides by a novel depurination controlled process；”NucleicAcids.Res.2010,38(8):2522-2540)或电化学(Liu等人，“Integrated microfluidicbiochips for DNA microarray analysis；”Expert Rev of Mol Diagn 2006,6:253–261)，所有这些通过引用并入本文。另参见，Pease等人(1994)“Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis；”Proc Natl Acad Sci US A 91:5022–5026.；Singh-Gasson等人“Maskless fabrication of light-directedoligonucleotide:microarrays using a digital micromirror array；”NatureBiotechnology1999，17，974-978；Hughes等人(2001)“Expression profiling usingmicroarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer；”NatBiotechnol 19:342–347；Lausted等人(2004)“POSaM:a fast flexible open-sourceinkjet oligonucleotide synthesizer and microarrayer；”Genome Biol 5:R58；以及Gunderson等人“Decoding Randomly Ordered DNA Arrays；”Genome Res.2004.14，870-877；所有这些通过引用并入本文。
定制的微细加工策略可以伴随这样的风险，即制造过程的每个部分都可以需要新的工具或工艺来完成当前的工作。这可需要实时(real-time)、原位(in-situ)或在线(in-line)过程监测器，这对于制造高附加值的制品可能极为重要。到目前为止，用于固相合成分子(包括多肽、寡糖和寡核苷酸)过程的实时、原位和/或在线质量控制(QC)的方法有限。因此，需要开发用于固相合成过程的实时、原位和/或在线质量控制(QC)。
寡核苷酸的合成通常可以通过沿3’至5’方向添加单体，使用标准的3’-亚磷酰胺试剂和固相合成方案来进行(例如，M.Egli等人编辑，“Current Protocols in NucleicAcid Chemistry”John Wiley&Sons)。合成也在3’至5’方向进行(固相寡核苷酸在5’到3’方向合成虽然可行，但效率和经济性要低得多，从而降低了产量和产品纯度)。但是，所得探针可以在3’末端连接到基底，并且在合成过程中出现的任何截短的序列杂质都会保留在支持体上，这在光刻合成的情况下可能是一个特殊的问题(J.Forman等人，Molecular Modelingof Nucleic Acids，第13章，第221页，American Chemical Society(1998)和G.McGall等人，J.Am.Chem.Soc.119:5081-5090(1997))。主要杂质是由不完整的单体偶联以及其次脱嘌呤反应产生的截短的部分长度序列。尽管具有上述限制，但光刻合成是制造超高密度DNA阵列的极具吸引力的方法，因为它能够实现每cm2超过1000万个阵列序列(A.R.Pawloski等人，J Vac Sci Technol B 2007，25,2537-46)，并且在制造环境中具有很高的可扩展性。因此，需要对固相合成进行在线监测。
多个探针可以位于固体基底上的一个或多个可寻址区域(斑点、位置等)中，在本文中通常称为“像素”。在一些情况下，固体基底包含至少约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000具有探针的像素。在一些情况下，固体基底包含至多约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000，10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000具有探针的像素。在一些情况下，固体基底包含约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000，10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000具有探针的像素。
在一些情况下，具有不包含探针的像素会很有用。此类像素可以充当控制点，以提高测量质量，例如，通过使用与斑点的结合来估计和校正非特异性结合。在一些情况下，可以控制探针的密度以促进探针的附接或增强探针的随后检测。
在一些实例中，具有冗余像素是有用的，该冗余像素具有与另一像素相同的探针序列，但是在物理上可能与该其他像素不相邻或不邻近。由这样的探针阵列获取的数据可能不太容易受到非理想状态的制造和测量误差的影响。
在一些情况下，除了掺入到靶标中的标记外，标记还附接在像素内的探针上。在这样的系统中，捕获的靶标可能会导致两个标签在像素中彼此紧密邻近。如前所述，特定标记之间的相互作用可以产生独特的可检测信号。例如，当靶标和探针上的标记分别是可以参与荧光共振能量转移(FRET)现象的荧光供体和受体部分时，可以检测到FRET信号增强或信号猝灭。
在本发明的一个方面，提供了用于寡核苷酸、寡糖或肽合成的实时、原位和/或在线过程监测的方法。为了简化方法的描述，在实例中可以使用寡核苷酸合成。用于实时、原位和/或在线过程监控的相同QC方法可用于监测其他聚合物合成，包括多肽和寡糖的合成。
在一些情况下，通过实验，我们发现椭圆偏光法可用于在分子合成完成之前的选定阶段或时间监测单嵌段单元与表面上生长的一个或多个分子链的附接(通过化学键形成，例如共价键形成)。可以用在线兼容技术如椭圆偏光法监测单嵌段单元(例如核苷酸或氨基酸(在肽合成的情况下)单元)的逐步添加。这种监测方法可以提供灵敏度和速度，以监测分子的固相合成，而无需标记单元(例如，将标记(荧光标记或其他标记)放在添加至最终产物的最后一个单嵌段单元上)，或使用质谱法确定合成最终阶段的中间阶段的分子量，或靠生长链(例如，寡核苷酸链)的动量接触。
在一些情况下，成像椭偏仪(例如，来自Accurion(德国哥廷根)的椭偏仪)在确定表面的物理和光学特性时，可以在灵敏度、准确性、精度和速度之间进行权衡。这可以使其成为对固相合成过程进行实时、原位或在线监测的合适选择。例如，在寡核苷酸合成的情况下，使用椭偏仪测量单个碱基的信噪比(SNR)可以优于10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。图像的SNR可以计算为在给定邻域上的平均像素值与像素值的标准偏差的比率。使用成像椭偏仪不仅可以确定碱基是否附接在生长链上，还可以确定正确的碱基是否以正确的浓度附接并附接在正确的位置。在选定的时间范围内，例如少于20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分钟，可以通过成像椭偏仪测量基底(例如，晶片)上的多个位置(例如，10、9、8、7、6、5或4个位置)。这样做可以提供均匀性和足够精度的准确叠加，以支持高分辨率光刻，并且可以在合成期间以及在固相合成接近结束或结束时应用昂贵的劳动和其他测定之前，确定合成过程中的问题。固相合成的硅(Si)和石英(Qz)基底均可使用椭偏仪进行分析，以监测合成过程。
可以使用椭圆偏光法以足够的速度和精度来监测固态合成，并尽可能减少或消除样品的干扰，从而进行实时、原位或在线监测。光学技术可用于在线监测方案，因为光子可能以非常有限的方式干扰样品。
椭圆偏光法可以具有非接触的优点，并且可以与表面上的非价键合的电子相互作用。这可能是解释为什么椭圆偏光法对样本的干扰最小的原因之一。光谱椭圆偏光法可以使用其常见形式的旋转补偿器技术。它可以是快速且灵敏的，并且由于在许多波长下的曲线拟合，可以提供对测试材料性质的准确读数。然而，固相合成过程可以是与空间相关的，例如，表面的不同位置可以具有不同长度的分子生长链，或者在表面上具有控制点(或空白点)，这些控制点不附接分子，也不附接控制分子，等等。因此，用大量入射光束很难进行监测(因此受到限制)。
然而，在线过程监测更注重精度而不是准确性。因此，即使该方法可以在确定的材料性质上失去一些准确性，成像椭偏仪也可以具有价值，它不仅可以监测被放置的物体，而且还监测被放置的位置。精度与准确性之间的权衡可以为在线监测固相合成提供更好的技术。
实施例1：使用椭偏仪监测使用DMT-T的寡核苷酸合成
在这个实验中，使用JA Woollamα-SE椭偏仪和Si晶片作为基底，使用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团将单个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)逐步放置在基底上十(10)个碱基，并测量晶片周围的5个位置。图1示出了在晶片上放置10个T，并且在晶片上的5个不同点添加每个碱基后，使用椭圆偏光法测量厚度。曲线之间的偏移可以是由于明显的氧化物变化造成的。然而，每个点的每个曲线的斜率可以相同。添加第一碱基和其他碱基之间在添加厚度方面的差异尚不清楚。
如图1所示，增加的厚度可以与每个增加的碱基(T)相关或跟踪每个增加的碱基(T)，从而支持椭圆偏光法可以具有监测单个碱基向生长的寡核苷酸添加的灵敏度。可以看出，图1中的每条曲线都是彼此跟踪的，从而表明即使单点测量也可以合理精确，并且曲线之间的偏移可能是由于氧化膜的变化造成的。这可能是重要的一点，因为可以在先前测量的确切位置建立测量的背景，或者将测量的背景并置，使得氧化物变化不影响测量。从图1可以看出，可以用DMT化学法在晶片上制备polyT10链。所确定的测量结果可用于估计通过DMT-T工艺合成的polyT16链的厚度约为5.38nm(如用Woollam椭偏仪测量)。
实施例2：使用椭偏仪监测使用Photo-T的寡核苷酸合成
所公开的方法可以确定固相合成工艺的改进或劣化。在该实验中，使用Photo-T向Si晶片添加十二(12)个photo-T，并且在每次添加photo-T后，采集3个不同的位置的厚度。在合成过程中，当对photo-T去保护时，将一半的Si晶片暴露于1800mJ/cm2的辐射，而另一半Si晶片暴露于3600mJ/cm2的辐射。
图2和图3分别示出了1800mJ/cm2剂量辐射和3600mJ/cm2剂量辐射的厚度测量。同样，曲线的偏移可能来自氧化物变化，但趋势可能与DMT-T实验中相同。在3600mJ/cm2剂量下，厚度曲线的斜率在统计上可以低于1800mJ/cm2剂量下的厚度曲线的斜率。厚度曲线斜率的这种差异可以与其他测量结果一致。与较低剂量相比，较高剂量可在统计上为每层提供更少的信号。这可以通过这些辐射剂量的半衰期和/或在不同剂量下的光损伤来解释。使用photo-T时，Si晶片上的厚度曲线斜率总体上低于使用DMT-T时，Si晶片上的厚度曲线斜率。这可以与使用photo-T时比使用DMT-T时每层产量较低一致。这可以解释为，与DMT-T工艺相比，Photo-T工艺具有较低的耦合产量。但这也可以通过photo-T工艺的硅烷产量较低(后来称为“填充因子”较低)来解释。有趣的是，在图2和图3中的第7层在统计上可以高于每条线上的其他点。在添加此层时，操作人员午休，并且添加第7层的反应时间比其他任何层的添加都长。这可以表明所公开的用于固相合成的监测技术的精度。
实施例3：使用另一椭偏仪监测使用DMT-T的寡核苷酸合成
为了进一步证明椭圆偏光法在固相合成中的应用，使用DMT-T工艺在Si晶片上合成了20T，并通过不同的椭偏仪、Radtech椭偏仪和不同的操作人员进行测量。每次添加DMT-T后，在9个不同的位置进行测量。图4示出了结果。如图4所示，添加每个T可获得约0.265nm/层。尽管实施例3中的厚度的绝对测量可与实施例1中的不同，但绝对测量的差异可以是由于拟合光学模型的差异所致。然而，结论仍然是相同的，如单调递增测量所证明的椭偏仪可以很灵敏，并能够在线检测寡核苷酸阵列的制造。
根据实施例1-3，旋转补偿椭偏仪可以提供足够的灵敏度来检测单个碱基的添加。然而，由于对α-SE椭偏仪的机器要求，使用α-SE椭偏仪所应用的技术可能有些慢，并且可能会为保留QC放弃每个晶片的很大面积。因此，进一步评估具有自动平台的成像椭偏仪。
实施例4：使用成像椭偏仪监测寡核苷酸合成
在该实验中，将四个DMT-T放置在Si晶片上。随后，将单个Photo-T添加至表面上四个T的末端。然后，使用具有20μm“棋盘”图案的掩膜对最后的Photo-T进行基于实验室的曝光。因此，最大对比度只能是单个碱基减去DMT组的厚度。图5示出了使用20μm“棋盘”分辨率测试图案成像后该实验的结果。在该实验中，测量可以在约10s的测量内提供约15:1的SNR。由于不同的椭偏仪的配置，可以获得其他SNR。图5和图6示出了该实验的结果。从Accurion成像椭偏仪nanofilm_ep4获得图像。图5示出了分辨率测试图案和在分辨率测试图案的线上的厚度测量。在使用的条件下，最后添加的T的厚度可以估计为约0.47nm。在图5中观察到的随机“凸点”可能仍然无法解释，但它们可能是突出物，而不是凹坑。图6示出了同一实验在分辨率测试图案的另一条线上的放大图像，其中厚度显示为灰度值。如图6所示，信号可以是约50，而噪声的标准偏差可以是约3.5。
实施例5：使用成像椭偏仪监测另一寡核苷酸合成
在实施例5中，成像椭偏仪似乎足够灵敏，以确定是否应用了碱基，并且甚至可能足够灵敏到确定其是否可以为正确的碱基。在这种情况下，如实验4中使用Photo-T并使Photo-T曝光那样来使用4个DMT-T，但没有进行耦合步骤。图7示出了该实验的结果。如预期的那样，暴露区域显示出约0.3nm的“厚度”损失，这是可以检测到的。
实施例1-5中示出的所有样品均在Si晶片的65nm氧化物上，该Si晶片由于可以反射并且光滑，可以是用于椭圆偏光法的基底。
实施例6：在不同波长的石英基底上使用椭偏仪
为了测试这种监测过程是否也可以在石英(QZ)基底上进行，在具有抗反射涂层的Qz晶片上进行类似的实验。发现Qz上的对比度降低了信噪比。图8示出了使用Xe源和滤光片在510nm处在Qz上获得的棋盘图案。左侧是晶片中心，在这里图案可能看起来一致。右侧是晶片边缘，那里可能有“岛”。该激光源可被认为是很弱的，因此噪声可能很高。然而，图8证明了所公开的方法在Qz上测量样品的能力，并且这种类型的监测工具可以在过程的早期识别出缺陷。图8示出了该实验的结果。在石英上的SNR可能较低，但同样图8示出了单个碱基检测是可能的。可以使用不同的激光源，488nm激光来增加对比度。
实施例7：合成后验证的演示
该公开方法的能力可以在在线监测中示出。图9可演示合成后验证。正方形的交错线图案中的每个正方形代表添加的碱基掩膜层。前12个被添加为一层，后12个在其下面没有层。因此，对于交错的24正方形特征，左侧的12个比右侧的12个更亮(例外的可能是第3层，它只有一个碱基)。由于所有的正方形都被表示出来，因此所有碱基可以显示都正确地添加至该晶片上。该图像是在401nm LED去保护后完成的。
图9还指出了在Qz上可能比在Si上更显著的一个问题：碱基添加的块度。对于该实验的晶片，“块度”问题更多地发生在边缘而非基底中心。这也可以通过测定结果看出。尽管如此，诸如此类的信号仍可用于过程控制，在制造过程的早期阶段进行根本原因调查，从而可以节省时间和金钱。
如上所述，图9示出了来自生产线的实际晶片，其具有12个或24个交错的正方形，每个正方形来自不同的掩膜层，用于确保在每层添加了碱基。在该图像中，在去保护后拍摄，使用了401nm入射波长的LED。在24正方形图案中，左侧的12个的厚度为2个碱基(将一个碱基添加至单层的所有12个中，然后每层的每个位置各一个)，而右侧的12个仅为每层一个碱基。这可以验证在每层都添加了一个碱基。事实上，在具有足够的SNR的情况下，可以验证耦合是否进行良好。当椭偏仪工具足够灵敏到区分波长不干扰光刻的碱基，并且在固相合成的不同步骤之间进行足够快的测量时，可以在线添加每个碱基后进行这种类型的测量。
如上所述，所讨论的工具EP4可以执行在线监测。如果选择不具有聚焦的整个视场，而只能集中delta或psi之一，那么在受保护的寡核苷酸上，EPE可以在约8s内在648nmLED的单个碱基上显示约7:1的SNR。然后，在自动化阶段，可以在约1分钟的总分析时间内查看每个晶片的多个点。更长的成像时间(每个点至多约1分钟)可以提供更好的SNR或更宽的视场结果，这取决于是否对整个视场成像，或者使用什么物镜、使用的激光源以及是否可以对像素进行合并。这可能意味着对于给定的基底、波长、入射角、源带宽等都可能与分析时间和产生的SNR相关。因此，重要的因素可以包括：在工具(或带有多个滤光镜的灯以达到相似结果)放置多个波长的能力、具有可以改变其入射角的工具、可以轻易地改变物镜的工具以及甚至具有高通量源的工具(如激光器)，使得可以使用高放大倍率物镜，并且在调零过程中仍能在检测器上获得合理的信号。以上所有考虑都可以帮助优化感兴趣的测量。因此，最佳工具应具有多种特征，以对各种测量问题实现最佳结果。
成像椭圆偏光法还有其他优点。如上所述，可以在同一帧中将背景与样本并置，这样可以节省时间并提高测量精度，但不占用芯片任何额外的QC空间。点源椭圆偏光法的扫描阶段也可以做到这一点，但要花大量的时间来解决样品、源、光学器件、电子器件以及阶段稳定性问题等，但如果需要进行每层类型的测量，最终会增加晶片的循环时间。其次，可以测量晶片上的真实覆盖层，因为可以精确地测量晶片周围的位置，而该位置正是通过前一层添加了一个碱基。另一个应用可能是在固相合成过程中及早检测晶片上的问题。
总之，提供了用于在线监测图案化寡核苷酸合成的方法。在一些实施方案中，该方法包括测量每个碱基或每几个碱基，如1、2、3、4或5个碱基(或层)，以使用椭圆偏光法检测合成或其他异常。成像椭圆偏光法可以是一些实施方案。可以提供使该方法在生产环境中实用的各种方法，并在上面的实例中进行了描述。
如本文所用，术语“寡核苷酸”通常是指核苷酸链。在一些情况下，寡核苷酸的长度小于200个残基，例如，在15至100个核苷酸之间。寡核苷酸可以包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个碱基。寡核苷酸可以为约3至约5个碱基、约1至约50个碱基、约8至约12个碱基、约15至约25个碱基、约25至约35个碱基、约35至约45个碱基或约45至约55个碱基。寡核苷酸(也被称为“寡核苷酸(oligo)”)可以是任何类型的寡核苷酸(例如，引物)。寡核苷酸可包含天然核苷酸、非天然核苷酸或其组合。
如本文所用，术语“约”通常是指指定量的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用，当描述两个受试者之间的相对值、相对量或相对程度时，术语“基本上”通常是指彼此的值、量或程度的80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％或110％之内。
除非另有说明，否则本文使用的开放性术语，例如，“包含”、“含有”、“包括”、“具有”等是指包括。
如本文所用，术语“固定”通常是指在两个反应性基团之间形成共价键。例如，反应性基团的聚合是固定的一种形式。当两个原子分别来自两个反应性基团时，两个原子(如碳原子和碳原子、碳原子和杂原子以及杂原子和杂原子)之间的共价键的形成是固定的一个实例。
如本文所用，术语“基底”或“固体基底”通常指包含非生物、合成、无生命、平面、球形或平坦表面的物质、结构、表面、材料、装置或组合物。基底可以包括，例如但不限于半导体、合成金属、合成半导体、绝缘体和掺杂剂；金属、合金、元素、化合物和矿物；合成、切割、蚀刻、光刻、印刷、机加工和微加工的载玻片、器件、结构和表面；工业聚合物、塑料、薄膜；硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；木材、纸张、纸板、棉花、羊毛、布、织造和非织造纤维、材料和织物；纳米结构和微观结构。基底可包含固定基质，例如但不限于不溶性物质、固相、表面、层、涂层、织造或非织造纤维、基质、晶体、膜、不溶性聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容或生物可侵蚀或生物可降解的聚合物或基质、微粒或纳米颗粒。其它实例可包括，例如但不限于单分子层、双分子层、商用膜、树脂、基质、纤维、分离介质、色谱载体、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠、微球、纳米球、硅、砷化镓、有机和无机金属、半导体、绝缘体、微观结构和纳米结构。微观结构和纳米结构可包括但不限于微型化、纳米级和超分子探针、针尖、棒、钉、塞、杆、套、线、丝和管。基底可以例如以一种或多种颗粒、股线、沉淀物、凝胶、片、管、球、容器、毛细管、垫、切片、膜、板、载玻片或半导体集成芯片的形式存在。基底可以是平坦的或者可以具有另外的表面构造。例如，基底可以包含在其上发生合成或沉积的凸起或凹陷区域。在一些实例中，基底可以包含不同3-D形状和/或高度的凸起或凹陷区域。在一些实例中，基底可以包括多个特征。在一些实例中，基底可以包括地形图案，并且地形可以包括一组槽、一组杆、一组柱、一组孔或其组合。在一些情况下，可以由至少两种不同的材料形成地形图案，例如，覆盖有光致抗蚀剂层的硅芯片或覆盖有水凝胶的石英芯片等。在一些实例中，基底可以包含基本上相同的3D形状和/或高度的凸起或凹陷区域。在一些实例中，可以选择基底以提供适当的光吸收特性。例如，基底可以是聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃(例如，受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氧化铟锡(ITO)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅、半导体集成电路(IC)芯片的顶部介电层或各种凝胶或聚合物中的任何一种，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚环烯烃或其组合。
基底可以包含聚合物涂层或凝胶，如聚丙烯酰胺凝胶或PDMS凝胶。凝胶和涂层可以另外包含用于改变其物理化学性质例如疏水性的组分。例如，聚丙烯酰胺凝胶或涂层可以在其聚合物结构中包含改性的丙烯酰胺单体，如乙氧基化的丙烯酰胺单体、磷酰胆碱丙烯酰胺单体、甜菜碱丙烯酰胺单体和其组合。
如本文所用，术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的聚合物。一个核酸可以包括一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的亚基。一个核苷酸可以包括A、C、G、T或U或其变体。一个核苷酸可以包括可以掺入一个正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补A、C、G、T或U特异的任何其他亚基，或与嘌呤(即A或G或其变体)或嘧啶(即C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。亚基可以使单个核酸碱基或碱基组(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或尿嘧啶对应物)被拆解。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可以是单链或双链的。
本文所用，术语“相邻(adjacent)”或“相邻(adjacent to)”包括“邻近(nextto)”、“毗连(adjoining)”和“邻接(abutting)”。在一个实例中，当第一位置与第二位置直接接触并且共享公共边界，并且两个位置之间没有空间时，第一位置与第二位置相邻。在某些情况下，相邻不是对角线相邻。
如本文所用，术语“测序”通常是指确定一种或多种多核苷酸中核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核酸分子，包括其变体或衍生物(如单链DNA)。测序可通过现有的各种系统进行，所述系统例如但不限于，
Figure BDA0002923832570000171
Pacific Biosciences
Figure BDA0002923832570000172
Oxford
Figure BDA0002923832570000173
或LifeTechnologies
Figure BDA0002923832570000174
的测序系统。替代地或附加地，也可采用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来进行测序。此类系统可提供多个由系统从受试者提供的样品生成的、与受试者(例如，人)的遗传信息相对应的原始遗传数据。在一些实例中，此类系统提供了测序读段(在本文中也称为“读段”)。一个读段可包括与已测序的核酸分子序列相对应的一串核酸碱基。在某些情况下，本文提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。
本文所用的术语“核酸序列”或“核苷酸序列”通常是指具有给定核苷酸序列的核酸分子，其中可期望知道所述核苷酸的存在或数量。核苷酸序列可以包括核糖核酸(RNA)或DNA，或衍生自RNA或DNA的序列。核苷酸序列的实例是对应于天然或合成RNA或DNA(包括基因组DNA和信使RNA)的序列。序列的长度可以是可以被扩增成核酸扩增产物或扩增子的任何长度，例如，长度为最高达约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000或大于10,000个核苷酸，或长度为至少约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000或10,000个核苷酸。
如本文所用，术语“水凝胶”通常是指其中溶胀剂为水的凝胶。术语“凝胶”是指由流体通过其体积而膨胀的非流体的胶体网络或聚合物网络。术语“溶胀剂”是用于溶胀凝胶或网络的流体。例如，水可以是水凝胶的溶胀剂。本公开内容的水凝胶可以通过一种或多种丙烯酰胺官能化的单体的聚合来制备。例如，丙烯酰胺尾也可以键合到基底例如石英片的表面上。然后，当将含有丙烯酰胺单体的溶液与与丙烯酰胺尾键合的表面接触。然后，可以使倾倒的溶液进行丙烯酰胺单体和丙烯酰胺尾的聚合，从而可以形成水凝胶。在一些情况下，本公开内容的水凝胶包含聚丙烯酰胺。在一些情况下，本公开内容的水凝胶包含交叉内衬(crossed lined)的聚丙烯酰胺。在一些情况下，本公开内容的水凝胶包含重量约占0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的聚丙烯酰胺。在一些情况下，可通过将丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺结合而获得水凝胶。聚合反应可以由引发剂自由基引发。水凝胶可通过在自由基引发剂的存在下，将丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺以150:1至1000:1的摩尔比结合而获得。亚甲基双丙烯酰胺可以提供聚合物链之间的交联，并且可以改变摩尔比以提供水凝胶的各种交联密度。可以改变获得水凝胶的条件。过硫酸铵(AMPS)可以用作聚合反应的引发剂。
如本文所用，光核苷亚磷酰胺或photoamidite，包括photo-T，可以是核苷类似物/试剂，其包含(i)核苷上例如5’羟基上的光敏保护基团，和(ii)3’羟基上的亚磷酰胺部分，如下所示：
Figure BDA0002923832570000191
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H、烷基、烷氧基或芳基，或R1、R2和R3中的任何两个与其键合的原子一起形成具有带有硝基的苯环的稠环。
R4为H、烷基或芳基；
m为0或1；
n为0或1；
B为受保护的核酸杂环碱基：Apg、Cpg、Gpg、T、U；
A为腺嘌呤；
C为胞嘧啶；
G为鸟嘌呤；
T为胸腺嘧啶；
U为尿嘧啶；和
pg独立地为杂环碱基A、C、G、T或U的环外氮原子上的一个或多个保护基团。
虽然本文已经显示和描述了本发明优选的实施方案，但是对于本领域技术人员而言显然这些实施方案仅仅是作为示例提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的前提下将会想到大量的变化、改变和替换。应当理解，在本发明的实践中可以使用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，由此覆盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (38)

1.一种监测基底表面上的固相反应的方法，包括：
(a)在所述表面的第一反应之前，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第一测量；
(b)在所述表面的所述第一反应之后，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第二测量；以及
(c)基于所述第一测量和所述第二测量确定所述表面上的所述第一反应的第一质量。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
(d)在所述表面上进行第二反应；
(e)在所述表面的所述第二反应之后，对所述表面的多个位置处的表面性质进行第三测量；以及
(f)基于所述第二测量和所述第三测量确定所述表面上的所述第二反应的第二质量。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述固相反应用于聚合物、多肽、寡糖或寡核苷酸的合成。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相反应用于所述多肽的合成。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相反应用于所述寡糖的合成。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相反应用于所述寡核苷酸的合成。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一测量是厚度。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二测量是厚度。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一测量和所述第二测量由光学仪器测量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第三测量由所述光学仪器测量。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一测量和所述第二测量由椭偏仪测量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第三测量由所述椭偏仪测量。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述第三测量是厚度。
14.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一反应的第一质量是在所述多个位置的每个位置的第一反应的产量、在所述多个位置的每个位置的第一反应的均匀性、所述第一反应在所述多个位置的每个位置是否提供正确产物，或者所述第一反应是否在所述多个位置的每个位置进行。
15.根据权利要求1所述的方法，其中(c)中的确定是基于所述第一测量和所述第二测量之间的第一差异。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一差异具有优于10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第一信噪比(SNR)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一差异具有约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第一信噪比(SNR)。
18.根据权利要求2所述的方法，其中(f)中的确定是基于所述第二测量和所述第三测量之间的第二差异。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二差异具有优于10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第二信噪比(SNR)。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二差异具有约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1的第二信噪比(SNR)。
21.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中可以通过使用不同波长的激光源来改善所述第一SNR。
22.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基底是硅(Si)或石英(Qz)。
23.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一反应使用二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学或光化学。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二反应使用所述二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学或光化学。
25.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一反应和所述第二反应使用二甲氧基三苯甲基(DMT)相关的化学。
26.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一反应和所述第二反应使用光化学。
27.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一反应和所述第二反应使用相同的合成程序。
28.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一反应和所述第二反应使用不同的合成程序。
29.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二反应的第二质量是在所述多个位置的每个位置的第二反应的产量、在所述多个位置的每个位置的第二反应的均匀性、所述第二反应在所述多个位置的每个位置是否提供正确产物，或者所述第二反应是否在所述多个位置的每个位置进行。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述固相反应基于所述第一质量和/或所述第二质量终止。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述固相反应基于所述第一质量和/或所述第二质量继续。
32.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量与所述表面所述固相反应在线进行。
33.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量在所述表面所述固相反应的原位进行。
34.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述第一测量、所述第二测量和/或所述第三测量与所述表面所述固相反应实时进行。
35.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述椭偏仪是成像椭偏仪。
36.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中可以通过使用不同波长的激光源来改善所述第二SNR。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中可以通过改变所述椭偏仪的波长、入射角、源带宽来改善所述第一SNR和/或所述第二SNR。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，进一步包括：在进行所述第二测量之前进行所述第一反应。
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