CN118986834A - 一种含有外泌体的美白抗衰组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种含有外泌体的美白抗衰组合物及其制备方法，属于化妆品技术领域。将茯苓、人参、甘草、铁皮石斛水提醇沉制得中药多糖，与藻胆蛋白、铜盐形成复合物，负载与牛奶外泌体中，制得负载复合物的牛奶外泌体；将槲皮素、非瑟素和人参皂苷Rg1形成混合共晶，制备成纳米乳，与负载复合物的牛奶外泌体混合制备得到含有外泌体的美白抗衰组合物。本发明制得的含有外泌体的美白抗衰组合物具有较好的美白、抗衰、抗氧化的效果，透皮吸收效果好，具有可以改善微循环，促进皮肤新陈代谢，美白皮肤，促进皮肤弹性，延缓皮肤衰老，去除面部色斑瘢痕的作用。

Description

一种含有外泌体的美白抗衰组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种含有外泌体的美白抗衰组合物及其制备方法。
背景技术
随着社会的发展，以及人民对美好生活的向往和追求，爱美变成一个越来越重要的生活追求目标，使得人们对皮肤衰老认识越来越深刻。衰老的皮肤对美观的影响主要是皮肤干燥无光泽，粗糙、干裂、皱纹、松弛及下垂，以及脂褐质、老年斑明显增加。于是各种化妆品和药物被广泛使用，但是目前保持皮肤抗衰老以及美白的药物或化妆品也是千奇百种，其效果也是各不相同。
外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30nm-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中。外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，外泌体可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。外泌体在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用。外泌体不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
干细胞外泌体里面含有丰富的细胞因子，比如VEGF、FGF等，可以参与皮肤组织修复与再生的各个过程，通过促进皮肤细胞的增殖迁移，促进血管新生，调节免疫反应来促进创伤愈合与皮肤组织再生，对皮肤组织的修复和抗衰老等有显著效果。近年来干细胞及相关组分在皮肤抗衰和提拉紧致等方面的应用也是研究的热点。但是目前一般的制备方法制备得到的外泌体制剂，其保持皮肤紧致和抗衰除皱等效果较差，而且容易引起过敏或免疫排斥反应。
发明内容
本发明的目的在于提出一种含有外泌体的美白抗衰组合物及其制备方法，具有较好的美白、抗衰、抗氧化的效果，透皮吸收效果好，具有可以改善微循环，促进皮肤新陈代谢，美白皮肤，促进皮肤弹性，延缓皮肤衰老，去除面部色斑瘢痕的作用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种含有外泌体的美白抗衰组合物的制备方法，将茯苓、人参、甘草、铁皮石斛水提醇沉制得中药多糖，与藻胆蛋白、铜盐形成复合物，负载与牛奶外泌体中，制得负载复合物的牛奶外泌体；将槲皮素、非瑟素和人参皂苷Rg1形成混合共晶，制备成纳米乳，与负载复合物的牛奶外泌体混合制备得到含有外泌体的美白抗衰组合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1. 中药多糖的制备：将茯苓、人参、甘草、铁皮石斛洗净，切片，混合，加入水中，加热至沸腾提取，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇沉淀，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，干粉加入水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液透析，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将藻胆蛋白加入水中，加入NHS和EDC，搅拌活化，加入中药多糖和铜盐，搅拌反应，透析，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将中药多糖-藻胆蛋白复合物和牛奶外泌体溶于PBS溶液中，孵育，透析，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将槲皮素溶于丙酮，得到溶液1，将非瑟素溶于乙醇，得到溶液2，将人参皂苷Rg1溶于水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3混合均匀，挥发，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 纳米乳的制备：将大豆卵磷脂、吐温、司盘、甘油、1,3-丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合均匀，滴加蒸馏水，然后加入混合共晶，搅拌混合，制得纳米乳；
S7. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将负载复合物的牛奶外泌体、纳米乳混合均匀，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述茯苓、人参、甘草、铁皮石斛的质量比为2-3:1-2:4-5:2-3，所述加热至沸腾提取的时间为3-5h。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述干粉、水的质量比为1:5-10，所述透析采用的透析袋孔径为10-30kDa，透析时间为12-24h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述藻胆蛋白、NHS、EDC、中药多糖和铜盐的质量比为10:3-4:2-3:6-8:0.5-1，所述搅拌活化的时间为20-30min，所述搅拌反应的时间为12-15h，所述透析采用的透析袋孔径为30-50kDa，透析时间为12-24h，所述铜盐为氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述中药多糖-藻胆蛋白复合物、牛奶外泌体的质量比为2-3:10，所述孵育的条件为3-5℃，孵育3-5h，所述透析采用的透析袋孔径为40-90kDa，透析时间为24-36h，所述吐温选择吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、吐温-85中的至少一种，所述司盘选自司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80、司盘-85中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述槲皮素、非瑟素、人参皂苷Rg1的质量比为1-2:0.5-1:0.2-0.4。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述大豆卵磷脂、吐温、司盘、甘油、1,3-丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、蒸馏水、混合共晶的质量比为3-5:0.5-1:0.5-1:2-3:1-2:1-2:50-70:1-2。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述负载复合物的牛奶外泌体、纳米乳的质量比为2-3:10。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的含有外泌体的美白抗衰组合物。
本发明具有如下有益效果：
中药茯苓、人参、甘草、铁皮石斛含有丰富的多糖组分，具有改善皮肤的新陈代谢，延缓皮肤衰老，去除面部色斑瘢痕的效果，藻胆蛋白是藻类中的一类重要的蛋白质，具有抗氧化和抗衰老特性，且安全稳定，将两者偶联形成复合物，并且螯合铜离子，铜离子能够促进胶原蛋白的生成，帮助皮肤愈合伤口，并增加皮肤弹性，从而使得制得的中药多糖-藻胆蛋白复合物可以改善微循环，促进皮肤新陈代谢，美白皮肤，促进皮肤弹性，延缓皮肤衰老，去除面部色斑瘢痕的作用。
牛奶是一种组成高度复杂的生物体液，含有大量具有生物活性分子的外泌体，牛奶外泌体（mEXO）产量高，且可通过内体途径被动靶向将中药多糖-藻胆蛋白复合物输送至黑色素体内部，起到抑制酪氨酸酶和抑制黑色素生成的作用，因此，制得负载复合物的牛奶外泌体可以一方面通过mEXO对皮肤进行修复及美白，同时，还能促进皮肤弹性，提高抗衰老性能。
槲皮素可抑制衰老细胞生存所需的关键转录节点，减少衰老细胞数量和相关细胞因子水平，达到抗衰老目的。非瑟素具有较强的抗衰老活性可调节多途径清除衰老细胞，如PI3K/Akt和NF-κB通路。但是，槲皮素和非瑟素不溶于水，对其应用于化妆品带来了极大的限制。人参皂苷既可抑制自由基的产生，也可直接对抗自由基对组织及细胞的损伤作用，或直接清除自由基，还可增强机体本身抗氧化系统的功能，从多个环节阻断自由基的损伤作用，人参通过提高体内及皮肤表皮细胞内超氧化物歧化酶的活性，来加强活性氧化自由基的消除，阻止体内有害物质的产生，改善机体的代谢，减少或消除已经产生并积滞于体内的脂褐质，人参还具有抗紫外线护肤的功能。因此，本发明制备了三种组分的混合共晶，一方面提高了其水溶解性，提高了其生物利用率，以及促进其透皮吸收能量，另一方面，三者协同作用，能够明显提高制得的混合共晶的美白、抗衰、抗氧化的效果。
另外，本发明将混合共晶制备成纳米乳，为由油、水、乳化剂和助乳化剂形成的粒径小于100 nm，外观澄清透明的热力学稳定体系，大大提高了产物的透皮吸收效果，增加了透皮吸收量，从而对皮肤的改善作用得到明显的提高。
本发明制得的含有外泌体的美白抗衰组合物具有较好的美白、抗衰、抗氧化的效果，透皮吸收效果好，具有可以改善微循环，促进皮肤新陈代谢，美白皮肤，促进皮肤弹性，延缓皮肤衰老，去除面部色斑瘢痕的作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
牛奶外泌体的分离和收集：将生牛乳进行梯度离心（2000×g离心30min，10000×g离心30min）去除细胞碎片，将上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，去除杂质；再将滤液以100000×g离心70min，弃上清，用干净的100μL的DPBS（不含钙、镁离子的‌磷酸盐缓冲液）反复吹打离心管底部，冷冻干燥，得到牛奶外泌体（mEXO）。
实施例1
本实施例提供一种含有外泌体的美白抗衰组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1. 中药多糖的制备：将2g茯苓、1g人参、4g甘草、2g铁皮石斛洗净，切片，混合，加入5倍质量的水中，加热至沸腾提取3h，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀1h，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，将10g干粉加入50mL水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液采用孔径为10kDa的透析袋透析24h，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入3gNHS和2g EDC，搅拌活化20min，加入6g中药多糖和0.5g氯化铜，搅拌反应12h，采用孔径为30kDa的透析袋透析24h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将2g中药多糖-藻胆蛋白复合物和10g牛奶外泌体溶于500mL PBS溶液中，3℃，孵育3h，采用孔径为40kDa的透析袋透析36h，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将1g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.5g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.2g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发2d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 纳米乳的制备：将3g大豆卵磷脂、0.5g吐温-40、0.5g司盘-40、2g甘油、1g 1,3-丙二醇、1g肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合10min，滴加50mL蒸馏水，然后加入1g混合共晶，搅拌混合30min，制得纳米乳；
S7. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将2g负载复合物的牛奶外泌体、10g纳米乳搅拌混合15min，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
实施例2
本实施例提供一种含有外泌体的美白抗衰组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1. 中药多糖的制备：将3g茯苓、2g人参、5g甘草、3g铁皮石斛洗净，切片，混合，加入5倍质量的水中，加热至沸腾提取5h，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀1h，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，将10g干粉加入100mL水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液采用孔径为30kDa的透析袋透析12h，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入4gNHS和3g EDC，搅拌活化30min，加入8g中药多糖和1g硫酸铜，搅拌反应15h，采用孔径为50kDa的透析袋透析12h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将3g中药多糖-藻胆蛋白复合物和10g牛奶外泌体溶于500mL PBS溶液中，5℃，孵育5h，采用孔径为90kDa的透析袋透析24h，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将2g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将1g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.4g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 纳米乳的制备：将5g大豆卵磷脂、1g吐温-60、1g司盘-60、3g甘油、2g 1,3-丙二醇、2g肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合10min，滴加70mL蒸馏水，然后加入2g混合共晶，搅拌混合30min，制得纳米乳；
S7. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将3g负载复合物的牛奶外泌体、10g纳米乳搅拌混合15min，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
实施例3
本实施例提供一种含有外泌体的美白抗衰组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1. 中药多糖的制备：将2.5g茯苓、1.5g人参、4.5g甘草、2.5g铁皮石斛洗净，切片，混合，加入5倍质量的水中，加热至沸腾提取4h，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀1h，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，将10g干粉加入70mL水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液采用孔径为20kDa的透析袋透析16h，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入3.5gNHS和2.5g EDC，搅拌活化25min，加入7g中药多糖和0.7g硝酸铜，搅拌反应13h，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将2.5g中药多糖-藻胆蛋白复合物和10g牛奶外泌体溶于500mL PBS溶液中，4℃，孵育4h，采用孔径为55kDa的透析袋透析30h，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将1.5g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.7g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.3g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 纳米乳的制备：将4g大豆卵磷脂、0.7g吐温-85、0.7g司盘-85、2.5g甘油、1.5g1,3-丙二醇、1.5g肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合10min，滴加60mL蒸馏水，然后加入1.5g混合共晶，搅拌混合30min，制得纳米乳；
S7. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将2.5g负载复合物的牛奶外泌体、10g纳米乳搅拌混合15min，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加藻胆蛋白。
具体如下：
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将17g中药多糖和0.7g硝酸铜，搅拌反应10min，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得中药多糖复合物。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加中药多糖。
具体如下：
S3. 藻胆蛋白复合物的制备：将17g藻胆蛋白加入500mL水中，加入0.7g硝酸铜，搅拌反应10min，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得藻胆蛋白复合物。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加硝酸铜。
具体如下：
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入3.5gNHS和2.5g EDC，搅拌活化25min，加入7g中药多糖，搅拌反应13h，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1. 中药多糖的制备：将2.5g茯苓、1.5g人参、4.5g甘草、2.5g铁皮石斛洗净，切片，混合，加入5倍质量的水中，加热至沸腾提取4h，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀1h，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，将10g干粉加入70mL水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液采用孔径为20kDa的透析袋透析16h，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入3.5gNHS和2.5g EDC，搅拌活化25min，加入7g中药多糖和0.7g硝酸铜，搅拌反应13h，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 混合共晶的制备：将1.5g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.7g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.3g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S5. 纳米乳的制备：将4g大豆卵磷脂、0.7g吐温-85、0.7g司盘-85、2.5g甘油、1.5g1,3-丙二醇、1.5g肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合10min，滴加60mL蒸馏水，然后加入1.5g混合共晶，搅拌混合30min，制得纳米乳；
S6. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将2.5g中药多糖-藻胆蛋白复合物、10g纳米乳搅拌混合15min，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加槲皮素。
具体如下：
S5. 混合共晶的制备：将0.7g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.3g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加非瑟素。
具体如下：
S5. 混合共晶的制备：将1.5g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.3g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加人参皂苷Rg1。
具体如下：
S5. 混合共晶的制备：将1.5g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.7g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将溶液1、溶液2搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6。
具体如下：
S1. 中药多糖的制备：将2.5g茯苓、1.5g人参、4.5g甘草、2.5g铁皮石斛洗净，切片，混合，加入5倍质量的水中，加热至沸腾提取4h，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀1h，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，将10g干粉加入70mL水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液采用孔径为20kDa的透析袋透析16h，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将10g藻胆蛋白加入500mL水中，加入3.5gNHS和2.5g EDC，搅拌活化25min，加入7g中药多糖和0.7g硝酸铜，搅拌反应13h，采用孔径为40kDa的透析袋透析16h，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将2.5g中药多糖-藻胆蛋白复合物和10g牛奶外泌体溶于500mL PBS溶液中，4℃，孵育4h，采用孔径为55kDa的透析袋透析30h，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将1.5g槲皮素溶于100mL丙酮，得到溶液1，将0.7g非瑟素溶于100mL乙醇，得到溶液2，将0.3g人参皂苷Rg1溶于100mL水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3搅拌混合5min，挥发3d，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将2.5g负载复合物的牛奶外泌体、10g混合共晶搅拌混合15min，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
测试例1 抗氧化性能测试
将实施例1-3或对比例1-8制得的含有外泌体的美白抗衰组合物用水稀释100倍，制得待测液。以维生素C（1mg/mL）作为对照。
1、清除DPPH自由基能力测定实验
将1mL待测液加1mL浓度为0.2mmol/L的DPPH，室温下静置30min后，在517nm波长处测吸光度变化。
DPPH清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%
式中:Ai为1mL的DPPH+1mL待测液的吸光度；Aj为1mL溶剂+1mL待测液的吸光度；A0为1mLDPPH+1mL溶剂（水）的吸光度
2、清除超氧阴离子自由基实验
取2mL的50mmol/L pH=8.2的Tris-HCl缓冲液，与0.91mL H2O，40μL待测液，混均后加入40μL浓度为10mmol/L的邻苯三酚溶液，记录其在320nm波长处的吸光度。计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。
超氧阴离子自由基清除率(%)=(△A0-△A)/△A0×100%
式中:△A0为空白溶液的吸光度随时间的变化；△A为待测液溶液的吸光度随时间的变化。
结果见表1。
表1
组别 DPPH清除率(%) 超氧阴离子自由基清除率(%)
维生素C 75.2 62.9
实施例1 89.4 93.5
实施例2 88.7 92.9
实施例3 90.2 94.7
对比例1 85.2 88.9
对比例2 82.7 85.4
对比例3 88.6 92.1
对比例4 83.9 86.4
对比例5 86.2 90.1
对比例6 84.3 87.2
对比例7 85.5 88.6
对比例8 88.9 91.7
由上表可知，本发明实施例1-3制得的含有外泌体的美白抗衰组合物具有较好的抗氧化活性。
测试例2 酪氨酸酶抑制测试
将实施例1-3或对比例1-8制得的含有外泌体的美白抗衰组合物用水稀释100倍，制得样品溶液。以熊果苷（1mg/mL）作为对照。
在各试管中分别加入磷酸缓冲液(pH6．8，0．1mol/L)、样品液、酪氨酸溶液（10mmol/L），置于37℃水浴10min，然后加入酪氨酸酶（100U/mL）溶液，再于37℃水浴中反应10min，在475nm下测吸光度值。实验体系见表2。
C1为空白对照，C2用于空白调零，T1为样品管，T2用于样品调零。
表2（单位：mL）
试剂 C1 C2 T1 T2
PBS 2 2.5 1 1.5
样品溶液 0 0 1 1
L-酪氨酸 1 1 1 1
酪氨酸酶 0.5 0 0.5 0
酪氨酸酶抑制率(%)=(AC1－AT1)/AC1×100%
式中:AC1为空白对照组的吸光度值；AT1为样品组的吸光度值。
结果见表3。
表3
组别 酪氨酸酶抑制率(%)
熊果苷 85.5
实施例1 90.1
实施例2 90.9
实施例3 91.4
对比例1 84.9
对比例2 81.2
对比例3 83.7
对比例4 80.1
对比例5 82.2
对比例6 81.5
对比例7 83.0
对比例8 87.8
由上表可知，本发明实施例1-3制得的含有外泌体的美白抗衰组合物具有较好的酪氨酸酶抑制活性。
测试例3
选择志愿者120人，年龄在25-45岁，随机分为实施例1-3组、对比例1-8组、空白组，每组10人。经测试者判定面部/眼部有明显纹路，或有明显法令纹，且为敏感肌的受试者作为测试对象。受试者每天早、晚各使用一次实施例1-3或对比例1-8制得的含有外泌体的美白抗衰组合物，每次1mL，于使用前、使用第14天时，在温度（21±1）℃，湿度50%±10%的条件下，进行相关项目的仪器测试。
1、皮肤含水量及经皮水分流失量
采用AF200型皮肤水分流失测定仪测量脸部经皮水分流失量（TEWL），综合评估样品对人体皮肤的修护功效。
2、皮肤红色度（A值）
采用VISIA2010型面部图像分析仪，测量脸部A值，综合评估样品对人体皮肤的舒缓功效。
3、皮肤紧致度F4、弹性R2
采用CutometerdualMPA580型皮肤弹性测试仪，测量脸部紧致度F4值、弹性R2值，评估对人体皮肤的紧致功效。
结果见表4。
表4
组别 TEWL变化率（%） A值变化率（%） F4变化率（%） R2变化率（%）
实施例1 -20.41 -2.21 -18.25 6.82
实施例2 -21.13 -2.19 -18.13 6.95
实施例3 -21.49 -2.27 -18.97 7.04
对比例1 -16.51 -2.01 -16.78 5.56
对比例2 -18.25 -1.82 -15.22 6.02
对比例3 -19.22 -2.15 -15.86 6.10
对比例4 -14.92 -1.74 -14.28 5.10
对比例5 -16.75 -1.82 -15.24 5.62
对比例6 -15.21 -1.57 -13.92 5.31
对比例7 -15.92 -1.62 -14.27 5.49
对比例8 -14.21 -1.54 -13.88 5.05
由上表可知，本发明实施例1-3制得的含有外泌体的美白抗衰组合物对皮肤有很好的修复、抗衰、增加皮肤弹性、保湿的效果。
4、安全性评估
受试者使用样品14d后，进行问卷调查，采用打分形式评价是否出现刺激、过敏等不良反应：
0分，无不良反应；1分，轻微刺激或过敏；2分，中轻度刺激或过敏；3分，中度刺激或过敏；4分，中重度刺激或过敏；5分，严重刺激。仅在所有受试者均评价0分的情况下，才可认为样品温和不刺激，可适用于敏感肌。
结果见表5。
表5
组别 安全性评分
实施例1 1.02
实施例2 0.99
实施例3 0.97
对比例1 1.22
对比例2 1.31
对比例3 1.19
对比例4 1.44
对比例5 1.39
对比例6 1.52
对比例7 1.55
对比例8 1.78
由上表可知，本发明实施例1-3制得的含有外泌体的美白抗衰组合物对皮肤没有明显的刺激。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有外泌体的美白抗衰组合物的制备方法，其特征在于，将茯苓、人参、甘草、铁皮石斛水提醇沉制得中药多糖，与藻胆蛋白、铜盐形成复合物，负载与牛奶外泌体中，制得负载复合物的牛奶外泌体；将槲皮素、非瑟素和人参皂苷Rg1形成混合共晶，制备成纳米乳，与负载复合物的牛奶外泌体混合制备得到含有外泌体的美白抗衰组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 中药多糖的制备：将茯苓、人参、甘草、铁皮石斛洗净，切片，混合，加入水中，加热至沸腾提取，冷却至室温，过滤，滤液中加入乙醇沉淀，过滤，洗涤，干燥，制得中药多糖；
S2. 藻胆蛋白的提取：将螺旋藻干燥，粉碎，干粉加入水中，液氮冷却，室温融化，过滤，滤液透析，透析液冷冻干燥，制得藻胆蛋白；
S3. 中药多糖-藻胆蛋白复合物的制备：将藻胆蛋白加入水中，加入NHS和EDC，搅拌活化，加入中药多糖和铜盐，搅拌反应，透析，冷冻干燥，制得中药多糖-藻胆蛋白复合物；
S4. 负载复合物的牛奶外泌体的制备：将中药多糖-藻胆蛋白复合物和牛奶外泌体溶于PBS溶液中，孵育，透析，透析液冷冻干燥，制得负载复合物的牛奶外泌体；
S5. 混合共晶的制备：将槲皮素溶于丙酮，得到溶液1，将非瑟素溶于乙醇，得到溶液2，将人参皂苷Rg1溶于水，得到溶液3，将溶液1、溶液2、溶液3混合均匀，挥发，得到共晶，过滤，洗涤，干燥，制得混合共晶；
S6. 纳米乳的制备：将大豆卵磷脂、吐温、司盘、甘油、1,3-丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯搅拌混合均匀，滴加蒸馏水，然后加入混合共晶，搅拌混合，制得纳米乳；
S7. 含有外泌体的美白抗衰组合物的制备：将负载复合物的牛奶外泌体、纳米乳混合均匀，制得含有外泌体的美白抗衰组合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述茯苓、人参、甘草、铁皮石斛的质量比为2-3:1-2:4-5:2-3，所述加热至沸腾提取的时间为3-5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述干粉、水的质量比为1:5-10，所述透析采用的透析袋孔径为10-30kDa，透析时间为12-24h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述藻胆蛋白、NHS、EDC、中药多糖和铜盐的质量比为10:3-4:2-3:6-8:0.5-1，所述搅拌活化的时间为20-30min，所述搅拌反应的时间为12-15h，所述透析采用的透析袋孔径为30-50kDa，透析时间为12-24h，所述铜盐为氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述中药多糖-藻胆蛋白复合物、牛奶外泌体的质量比为2-3:10，所述孵育的条件为3-5℃，孵育3-5h，所述透析采用的透析袋孔径为40-90kDa，透析时间为24-36h，所述吐温选择吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、吐温-85中的至少一种，所述司盘选自司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80、司盘-85中的至少一种。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述槲皮素、非瑟素、人参皂苷Rg1的质量比为1-2:0.5-1:0.2-0.4。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述大豆卵磷脂、吐温、司盘、甘油、1,3-丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、蒸馏水、混合共晶的质量比为3-5:0.5-1:0.5-1:2-3:1-2:1-2:50-70:1-2。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述负载复合物的牛奶外泌体、纳米乳的质量比为2-3:10。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的含有外泌体的美白抗衰组合物。
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Patentee after: Jilin Cangshe Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

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