CN1187440C - 分离鉴定纯化异养硝化微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从不同土壤及经自养氨氧化细菌培养基选择性培养过程中分离鉴定纯化具有硝化活性的异养微生物的方法，该方法通过营养琼脂平板分离和格利斯试剂显色等步骤可从环境中分离鉴定纯化大量异养硝化微生物，该方法重复性好，分离的菌株代表性强，并能再现土壤或分离样本的微生物原位状况。

Description

分离鉴定纯化异养硝化微生物的方法

发明所属领域：

本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及一种分离鉴定纯化具有硝化活性的异养细菌的方法。

背景技术：

氮素是所有生命必需的营养元素，也是全球生态系统物质循环的重要组成部分。使用氮肥已经成为农作物特别是粮食作物高产、增产的主要手段。大量氮肥的施用在大幅度提高作物产量的同时也带来了严重的环境问题：如饮用水硝酸盐积累的不断增长、湖泊等封闭半封闭水域的富营养化、NH₄ ⁺-NH₃进入水体危害鱼贝类等水产资源、温室气体N₂O的排放加剧了大气温室效应和对臭氧层的破坏等。提高氮素利用率、降低氮肥损失及其对环境的不良影响已经成为目前农业生产面临的一个巨大挑战。同时，氮素形态转化又与污水污泥脱氮效率脱氮工艺的改良提高、水体富营养化的解决密切相关。

硝化作用，一般是指微生物将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-，继而NO₂ ^-再氧化为NO₃ ^-，或者由于微生物作用导致氧化态N增多的过程。它是自然界氮素循环的重要组成部分，在陆地包括农田、水域、沉积物等生态系统中均可广泛的发生，对于农业生产、环境保护等都具有重要意义。如农田N素去向的调控、水体富营养化的生物防治、污水污泥的生物处理等。除了传统上认为的自养硝化细菌以外，目前已发现大量异养微生物如真菌、细菌和放线菌等也可以进行硝化作用。为了有效的调控，监测和评价硝化作用，对参与硝化作用的异养微生物的种类、数量进行确认，并进行代表菌株的分离活性鉴别显得十分重要和必要，具有重要的理论和应用价值。

Winogradsky认为硝化作用不能在肉汤中发生，硝化细菌特别是铵盐氧化细菌只能在无机盐中运用特异性的化能自养方式生活。根本不能在营养明胶或营养琼脂平板上生长。据此柯赫发明的营养平板技术仅仅成为检验“自养硝化细菌”纯度的辅助工具，而从不用以分离硝化细菌。对于自养硝化细菌的计数MPN法是过去和目前应用最为普遍的计数方法。优点是容易应用，简单，对检测样品中不同的属都有效。缺点表现在1)测定结果常常偏低，原因是培养基或生长条件未能使硝化细菌生长到足以检测的数量，或稀释过程中没有充分分散；2)培养基本身的选择性；3)固有的统计缺陷，精确性低；4)培养时间长。上世纪70年代以来，研究者运用血清学方法并结合显微示踪开发了荧光抗体(FA，Fluorescent Antibody)技术。但硝化细菌纯培养分离的困难和抗体的高度专一性是这项技术面临的最大制约。与FA技术相比，近年来开发的利用PCR技术进行硝化细菌的计数具有一定的优越性。但从现有结果看，单独运用PCR，对人为混进在灭菌土中的纯株检出率低于FA和MPN，与MPN联用(PCR-MPN)后检出率才有所提高(Degrange，Appl.Environ.Microbiol.，1995，198：201-208)，这项技术的完善和广泛应用尚需时日。因此，开发一种简单、高效、检出率高的计数分离方法显得十分重要。

Quastel和Scholefield等对传统的硝化作用自养细菌发生说提出了质疑，并以丙酮酸肟为唯一碳氮源，采用土柱渗滤进行选择性加富培养，获得了具有产生NO2-能力的异养菌株(Quastel等，Nature(London)，1950，166：940-942；Quastel等，Biochem.J.，1952，51：278-284)。后来的研究者多采用相似的方法进行异养硝化活性菌株的分离。目前常用的培养基质有：丙酮酸肟(Jensen，J.Gen.Microbiol.，1951，5：360-368；Doxtader和Alexander，Soil Sci.Soc.Amer.Proc.，1966，30：351-355)、乙酰胺(Verstraete等，J.Bacteriol.，1972，110：955-961；Rho，Can.J.Microbiol.，1985，32：243-247)、β-丙氨酸(Stroo等，Appl.Environ.Microbiol.，1986，52：1107-1111；Brierley，Soil Biol.Biochem.，2001，33：1403-1409)及其它一些有机物如肟、吡啶(Uma，Can.J.Microbiol.，1997，43：595-598)等。这种分离方法的缺点是样品前处理比较繁琐，耗时费力；重复性差，分离的菌株单一且缺乏代表性，不能再现土壤或分离样本的微生物原位状况。

Eylar和Schmidt(Eylar等，J.Gen.Microbiol.，1959，20：473-481)以葡萄糖-酵母膏-蛋白胨琼脂平板对12种具有硝化能力和10种具有不同物理化学性质的土壤进行异养硝化微生物的分离，并以液体纯培养下的氨氧化能力，即以亚硝酸盐和硝酸盐积累量为指标，对平板上所分离的菌株进行硝化活性的鉴别，NO₂ ^-浓度高于0.2mg N L^-1的仅占总分离物7％，NO₂ ^-浓度高于0.5mg N L^-1的仅占总分离物2％。该方法的缺陷是没有考虑培养基质对菌株硝化活性的影响，采用了不适宜的葡萄糖作为碳源导致异养硝化微生物阳性检出率偏低。其后很少有研究者采用该方法进行异养硝化微生物的分离、计数。

Papen等总结了上述各项技术在分离计数中存在的缺陷，首次提出了一种可以对具有异养硝化能力的细菌进行计数的MPN法(Papen等，Plant and soil，1998，199：123-130)。Papen将这种方法应用于德国Hglwald地区一种具有硝化潜势的酸性针叶林土壤，对区域的异养硝化微生物进行了计数，并结合牛肉膏蛋白胨琼脂平板法分离获得了具有硝化活性的异养菌株。但遗憾的是至今尚未见到该方法应用于其它类型土壤如农田土壤的研究报告，可能该方法存在地域性的局限。而且该方法较传统的MPN法手续未见明显简便，检测周期偏长。

发明技术内容：

本发明的目的是提供一种分离鉴定纯化具有硝化活性的异养微生物的方法，采用本发明的方法分离鉴定纯化具有硝化活性的异养细菌重复性好，分离的菌株多样性强且具有代表性。

一种分离鉴定纯化具有硝化活性的异养微生物的方法，它包括的步骤是：

①将待检样品涂布于PM平板；

②挑取单菌落到PM平板划线纯化；

③点滴格利斯试剂到平板菌落上；

④在一定显色时间内，格利斯试剂显红色者为待查阳性菌落；

⑤挑取待查阳性菌落重复步骤②③④再次格利斯试剂显红色者为阳性菌落；

在本发明中，待检的样品涂布到平板上采用稀释法，最常采用的是10倍稀释法。

在本发明的一个具体实例中，PM固体培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，组分是：

牛肉浸膏3克

蛋白胨  5克

琼脂  20克

蒸馏水  1000毫升

用1N氢氧化钠调培养基pH至7.0-7.2。分装在三角瓶中，灭菌，培养基冷却至56℃左右时倒平板。这种PM培养基经高压液相色谱分析，表明其中亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量：亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量低于0.2mg N L^-1，这样不会对结果构成正干扰。

本发明中所用的格利斯试剂包括分别配制存放的对氨基苯磺酸试剂和α-萘胺试剂。在本发明的具体实例中，对氨基苯磺酸试剂的配制是0.5克对氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中形成；α-萘胺试剂的配制是0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸馏水和150毫升20％的稀醋酸溶液中形成。

在本发明中，向待检菌落点滴格利斯试剂后的显色时间对结果的判断至关重要，通常显色时间在4分钟内，较好的在3分钟内，最好的在1分钟内。

采用本发明提供的分离鉴定纯化具有硝化活性的异养微生物的方法与现在所使用的方法相比，本发明的方法具有简便性，重复性好，分离的菌株多样性强且具有代表性。与Eylar方法相比，本发明提供的方法获得的硝化活性阳性菌数最高提高61.6％，最少也有24.2％。本方法较Papen等的方法更为简便，可同时完成硝化活性菌株的计数和分离，可较采用Papen等的方法时间缩短5-7天。参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版，经鉴定，这些菌株分属于节杆菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、小单孢菌属、芽孢杆菌属、动胶菌属、红球菌属、产碱杆菌属等多个属种。

在本发明中使用的各种单位，有国家标准的一律采用国家标准，无国家标准的采用行业标准。亚硝酸盐浓度为60.0mg NO₂-N L^-1，表示每升溶液中含60毫克亚硝态氮，硝酸盐含量为0.18mg N L^-1表示每升溶液中含0.18毫克硝态氮。

下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：土壤微生物研究会〖日〗编，叶维青等译，科学出版社，1983，土壤微生物实验法；许光辉等编，北京农业出版社，1986，土壤微生物分析方法手册；以及中国科学院南京土壤研究所微生物室编，科学出版社，1985，土壤微生物研究法等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1.培养基和试剂的配制

1.1 PM液体培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)配制

称3克牛肉浸膏，5克蛋白胨，溶解于1000毫升蒸馏水中形成PM液体培养基，在上述未灭菌的液体PM培养基中加入20克琼脂，形成PM固体培养基。

用1N氢氧化钠调培养基pH至7.1。分装在三角瓶中，灭菌，培养基冷却至56℃时倒平板。PM液体培养基经高压液相色谱分析，结果是亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量，亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量为0.18mg N L^-1。

1.2格利斯试剂的配制

1.2.1对氨基苯磺酸试剂(A液)：0.5克对氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用。

1.2.2α-萘胺试剂(B液)：0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸馏水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用。

1.3 NB液体培养基的配制

1.3.1无机盐溶液的配制  称取(NH₄)₂SO₄ 2.0克，NaH₂PO₄ 0.25克，K₂HPO₄ 0.75克，MgSO₄·7H₂O 0.03克，MnSO₄·H₂O 0.01克，FeSO₄·7H₂O 0.01克，溶解于1000毫升蒸馏水中，

用1M NaOH调培养基的pH值为7.1，分装在三角瓶中，灭菌。

1.3.2有机碳溶液的配制

1.3.2.1乙酸钠溶液的配制：称取27.2克三水乙酸钠溶解于1000毫升蒸馏水中形成0.20M的乙酸钠溶液，灭菌。

1.3.2.2柠檬酸钠溶液的配制：称取51.6克柠檬酸钠溶解于1000毫升蒸馏水中形成0.20M的柠檬酸钠溶液，灭菌。

使用时取无机盐溶液90份(体积比)与有机碳溶液10份混合，形成NB培养基。

实施例2从华北潮土土壤中分离异养硝化菌

2.1以华北潮土为供试土样进行了异养硝化细菌的分离、鉴别。

采样地点：河南省封丘县赵岗乡；  分类名称：中壤质黄潮土；

来源：耕层土壤，淤土；          土样处理：风干、研磨过20目筛；

2.2称取1.0克风干土于含有50毫升无菌蒸馏水的250毫升三角瓶中，90r/min摇床振荡4小时。

2.3土悬液10倍梯度稀释后涂布于PM平板，每个稀释度三个重复。28℃培养7天后，挑取单菌落到PM平板，划线纯化。镜检，证明纯度。

2.4活性菌的鉴别

将获得的经分离纯化后的异养菌株接种于PM平板，28℃培养10天，格利斯试剂直接点滴到平板，进行硝化活性确认，并以不接菌的平板作空白对照。1分钟内，格利斯试剂显色呈红色，表明有亚硝酸盐生成。重复验证，显色反应仍呈阳性，初步确认为硝化活性菌。PM培养基经高压液相色谱分析，表明其中亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量：其中亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量低于0.2mg N L^-1，不会对结果构成正干扰。

2.5液体纯培养的硝化活性验证

选取初筛时活性较强的代表性菌株进行。刮取生长于PM平板的纯菌菌苔入30毫升无菌水，使其充分分散均匀制成菌悬液。分别接种1毫升菌悬液入含不同有机物为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，每组三个重复。并以不接种的培养基作空白对照。28℃静止培养42天后，培养液4℃下5000g离心15分钟，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度。结果判断：菌种样品培养上清比色值减空白对照上清比色值的差值大于0.3mg N L^-时判为具有明显的硝化活性(表1)。结果表明供试菌株均具有较好的硝化活性。证实上述方法所分离获得阳性菌株在液体纯培养时同样具有硝化活性，证明上述方法所获结果的可靠性。

      表1各菌株的比色值(以亚硝酸盐表示，NO₂ ^--N mg L^-1)

菌株号   碳源     柠檬酸钠       乙酸钠

XY-3                0.4           1.0

WY-2                0.0           1.7

WY-19               0.7           0.3

WY-20               0.0           0.4

WY-21               0.7           0.8

WR-2                0.6           8.2

WT-1                0.3           1.9

WH-1                0.0           0.4

CK                  0.0           0.1

2.6菌种鉴定

所获得活性菌株参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版进行菌种鉴定，结果见表2。

              表2华北潮土分离的部分活性菌株的分类

种(属)名                               代表菌株

节杆菌属(Arthrobacter)                 WY-1，WR-2

欧文氏菌属(Erwinia)                    WT-1，XY-3

棒状杆菌属(Corynebacterium)            WY-19

小单孢菌属(Micromonospora)             WH-1

芽孢杆菌属(Bacillus)

短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)          WY-2，WY-21

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)   WX-2

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)       WR-8

坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)          WR-9

实施例3  不同地区不同类型土壤样本的异养硝化活性菌株的分离计数

3.1通过实施例2相同的程序和方法从我国4个地区9种不同类型的土壤样本中(表3)，分离鉴别了大量具有代表性的异养硝化活性菌株，其中硝化活性阳性菌数约占所分离培养物总数的22.2％-80.8％(表4)。而采用Eylar等的方法，硝化活性阳性菌数仅约占所分离培养物总数的3.3％-19.2％。

                  表3各土壤样本的来源

编号  采样地点    分类名称          来源               pH

1     陕西杨凌    红油土            旱地，耕层土壤     8.04

2     河南封丘    华北潮土          旱地，耕层土壤     8.48

3     河南封丘    华北潮土          水田，耕层土壤     8.24

4     江西鹰潭    第四纪红色粘土    旱地，耕层土壤     5.46

5     江西鹰潭    第四纪红色粘土    水田，耕层土壤     6.13

6     江西鹰潭    第四纪红色粘土    荒坡地，表层土壤   4.88

7     江苏常熟    乌栅土            水田，耕层土壤     7.41

8     江苏常熟    乌栅土            旱地，耕层土壤     6.41

9     江苏连云港  黄泥土            水田，耕层土壤     6.32

            表4各土壤样本的硝化活性菌数统计

编号    土壤样本    阳性菌比例(本发明)  阳性菌比例(Eylar的方法)

1  红油土，旱地            40.0％                8.3％

2  华北潮土，旱地          78.6％                17.2％

3  华北潮土，水田          62.5％                14.8％

4  第四纪红色粘土，旱地    22.2％                3.3％

5  第四纪红色粘土，水田    45.5％                9.1％

6  第四纪红色粘土，荒坡地  53.3％                10.5％

7  乌栅土，水田            80.8％                19.2％

8  乌栅土，旱地            33.3％                5.0％

9  黄泥土，水田            28.2％                4.0％

3.2参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版，经鉴定这些活性菌株分属于节杆菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、小单孢菌属、芽孢杆菌属、动胶菌属、红球菌属、产碱杆菌属等多个属种。以芽孢杆菌属为例，有多个种的菌株具有硝化活性(表5)，并已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏目录见表6。充分印证了本发明具有普适性，重复性好的优点，分离的菌株多样性强且具有代表性，且较Eylar等的方法具有明显的优越性：阳性检出率高；较Papen等的方法更为简便：并可同时完成活性菌的分离计数。

            表5芽孢杆菌属部分菌株的分类

种(属)名                                 代表菌株

芽孢杆菌属(Bacillus)

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)        B422，B217，B188

短芽孢杆菌(Bacillus brevis)              B319，B455，B606

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)     B072，B078，B189

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)         B295，B347，B508

坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)            B324，B403，B563

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)         B247，B205，B337

迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)            B204，B118，B631

腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)            B135，B305，B449

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)           B112，B278，B557

圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)       B046，B534，B604

球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)        B015，B025，B614

栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)            B609，B617，B463

蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)          B019，B059，B391

                                表6菌保目录

菌株号

B422  CGMCC NO.0554  Bacillus megaterium NBB-422     巨大芽孢杆菌

B324  CGMCC NO.0555  Bacillus firmus NBB-324         坚强芽孢杆菌

B319  CGMCC NO.0556  Bacillus brevis NBB-319         短芽孢杆菌

B295  CGMCC NO.0557  Bacillus circulans NBB-295      环状芽孢杆菌

B247  CGMCC NO.0558  Bacillus coagulans NBB-247      凝结芽孢杆菌

B204  CGMCC NO.0559  Bacillus lentus NBB-204         迟缓芽孢杆菌

B135  CGMCC NO.0560  Bacillus cereus NBB-135         腊状芽孢杆菌

B112  CGMCC NO.0561  Bacillus pumilus NBB-112        短小芽孢杆菌

B072  CGMCC NO.0562  Bacillus licheniformis NBB-072  地衣芽孢杆菌

B046  CGMCC NO.0563  Bacillus globisporus NBB-046    圆孢芽孢杆菌

B015  CGMCC NO.0564  Bacillus sphaericus NBB-015     球形芽孢杆菌

B58-3 CGMCC NO.0565  Bacillus badius NBB-58-3        栗褐芽孢杆菌

B609  CGMCC NO.0566  Bacillus subtilis NBB-609       枯草芽孢杆菌

B019  CGMCC NO.0586  Bacillus mycoides NBB-019       蕈状芽孢杆菌

实施例4 随硝化进程的异养硝化活性菌株分离计数

4.1供试土样：乌栅土      采样地点：江苏省常熟市新庄镇；来源：水田，耕层土壤；    土样处理：新鲜土；

4.2称取1.0克风干土于含有50毫升 无机铵盐培养基(配方同1.3.1)的250毫升三角瓶中，100r/min摇床振荡30分钟。后静止培养。于培养0天，24天取样进行异养硝化活性菌株的分离计数。

4.3土悬液10×梯度稀释后涂布于PM平板，每个稀释度三个重复。28℃培养7天后，挑取单菌落到PM平板，划线纯化。镜检，证明纯度。

4.4活性菌的鉴别

将获得的经分离纯化后的异养菌株接种于PM平板，28℃培养10天，格利斯试剂直接点滴到平板，进行硝化活性确认，并以不接菌的平板作空白对照。1分钟内，格利斯试剂显色呈红色，表明有亚硝酸盐生成。重复验证，显色反应仍呈阳性，初步确认为硝化活性菌。PM培养基经高压液相色谱分析，表明其中亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量：其中亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量低于0.2mg N L^-1，不会对结果构成正干扰。

4.5结果见表7，同样获得了大量具有硝化活性的异养微生物。再次证明了本发明具有普适性，重复性好的优点。

表7   随硝化进程的硝化活性菌株分离计数(供试土样：乌栅土)

培养时间    阳性菌比例           阳性菌组成(芽孢杆菌为例)

0天         33.3％            巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌

                              地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌

24天        50％              巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、

                              枯草芽孢杆菌、

4.6本发明计数方法与传统的MPN计数的比较，以乌栅土水田、红壤水田和华北潮土水田为例。结果见表8。

                   表8与传统的MPN计数的比较

培养0天		乌栅土水田	红壤水田	华北潮土水田
					MPN计数Cell/g干土	7.20×103	4.93×103	4.61×105
	平板计数cell/g干土	3.11×107	1.88×106	1.99×106
					活性菌占异养菌的比例	33.3％	46.7％	54.2％
	培养24天	MPN计数Cell/g干土	3.40×1010	2.59×1011					9.90×1012
平板计数cell/g干土					3.05×1010	4.02×1010	2.23×1012
		活性菌占异养菌的比例	50.0％	38.9％				40.0％

Claims (2)

1.一种分离鉴定纯化具有硝化活性的异养微生物的方法，它包括的步骤是：

①将待检样品10倍梯度稀释后涂布于PM平板；

②挑取单菌落到PM平板划线纯化；

③点滴格利斯试剂到平板菌落上；

④在3分钟内，格利斯试剂显红色者为待查阳性菌落；

⑤挑取待查阳性菌落重复步骤②③④再次格利斯试剂显红色者为阳性菌落；

其中PM培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，组分是：

    牛肉浸膏  3克，

    蛋白胨    5克，

    琼脂      20克，

    蒸馏水    1000毫升，

    pH7.0-7.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：格利斯试剂显色时间在1分钟内。