CN118667750A - 一种简单高效分离完整细胞核的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简单高效分离完整细胞核的方法，属于生物分离技术领域。本发明方法包括以下步骤：1)在贴壁状态下用A液破碎并去除细胞核以外的细胞结构或成分使得瓶壁上只剩下贴壁的细胞核，2)在悬液状态或贴壁状态下用B液破碎细胞核，3)离心，获得核蛋白。本发明提供的分离方法简单、快速、获得的细胞核更完整、细胞核蛋白纯度更高，整个细胞核分离、纯化过程耗时不到1.5小时，可应用于试剂盒中。
Description
技术领域
本发明属于生物分离技术领域，具体涉及一种简单高效分离完整细胞核的方法，可对细胞核或者核蛋白进行快速有效的分离，并可进一步应用于核蛋白的鉴定，例如蛋白印迹（Western blot）试验。
背景技术
在生化与分子生物学、细胞生物学和发育生物学等的研究中，对各信号通路及相关关键分子的研究至关重要。所有信号通路都涉及到信息从细胞外到细胞核内的传递，以实现对特定基因的表达调控。例如，从细胞质到细胞核的信息传递，会有特定的分子或修饰后的分子（例如磷酸化的蛋白）从细胞质中迁移到细胞核内，使得其细胞核内的浓度显著升高，从而调控后续相关基因的表达。对这些特定分子在细胞核内浓度变化的检测，是信号通路研究的重要内容和方法之一。
对特定分子在细胞核内浓度的检测，涉及到这些分子的分离和纯化，首先要实现的是细胞核和核蛋白的分离和纯化。目前，细胞核分离的常用方法主要有细胞破碎方法和提取液法两类，前者包括研磨法、超声破碎法、酸解法和酶解法等，后者使用各种表面活性剂（例如NP-40、TritonX-100、Tween20等）来破碎细胞。细胞核纯化的方法主要包括过滤法、差速离心法、不连续的渗透梯度、连续的渗透/蔗糖梯度等。其中，通过表面活性剂处理悬液状态下的细胞及细胞核是较传统的方法。
中国专利CN111518159A公开了一种贴壁细胞核蛋白的分离方法，其是基于传统方法的提取细胞核的方式，通过表面活性剂处理贴壁状态下的细胞及细胞核，以达到提高细胞核及核蛋白丰度的目的。然而，该专利提取的细胞核被细胞膜及细胞质污染，且细胞核膜被一定程度的破坏；为了使提取的细胞核更加完整、干净；提取的细胞核蛋白丰度更高，仍需对分离方法作进一步改进优化。
发明内容
针对背景技术所提“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”的缺陷及不足，本发明的目的在于提供一种简单高效分离完整细胞核及核蛋白的方法。本发明通过化学方法去除核外成分（例如整个质膜和整个胞质内容物），保留细胞核及核膜，使贴壁细胞的细胞核原位暴露，获得贴壁的细胞核及核蛋白，可用于原子力显微镜对细胞核性质的测量（如核刚度）以及核蛋白的鉴定，例如蛋白印迹（Western blot）试验。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种简单高效分离完整细胞核的方法，包括以下步骤：
1）待细胞培养贴壁铺展至容器底面积70%-80%时，吸弃培养液，用预冷的PBS清洗贴壁细胞3遍；
2）加入预冷的A液冰上处理细胞10 min；
其中，A液为用PBS配制的0.1%-2% NP-40溶液，处理之前每1 mL A液加入18 μLPMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂；
3）吸弃A液，用预冷的A液清洗细胞核3遍，得到贴壁的细胞核；
4）采用悬液状态下破碎细胞核：吹打使细胞核悬浮，低速离心，然后向沉淀中加入预冷的B液，超声破碎细胞核；
或者采用贴壁状态下破碎细胞核：先加入预冷的B液，再吹打使细胞核悬浮，转至干净的离心管中，冰上涡旋震荡处理；
其中，B液为用PBS配制的0.01%-1%去污剂溶液，处理之前每1 mL B液加入18 μLPMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂；
5）低温高速离心，收集上清，即为核蛋白。
进一步地，所述A液为用PBS配制的1% NP-40溶液，处理之前每1 mL A液加入18 μLPMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂。
进一步地，所述B液为用PBS配制的0.1% SDS溶液，处理之前每1 mL B液加入18 μLPMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂。
现有的获得贴壁细胞的细胞核的方法是细胞在贴壁状态下破碎细胞膜和细胞质，通过清洗去除细胞膜和细胞质碎片，只保留贴壁的细胞核（获得贴壁细胞核）。使贴壁状态的细胞核变为悬浮状态，破碎细胞核，获得核蛋白；或者破碎贴壁状态的细胞核，得到悬浮的核蛋白（获得核蛋白）。但是这一技术在实施过程中核膜被破坏，得到的细胞核及核蛋白不完整。
而本发明在此方法的基础上更换温和的表面活性剂，在细胞贴壁状态下用化学方法去除破碎细胞膜及细胞质，通过清洗去除细胞膜和细胞质碎片，保留包括细胞核膜在内的完整的贴壁细胞核（获得贴壁细胞核），使贴壁状态的细胞核变为悬浮状态，破碎细胞核，获得包括核膜蛋白在内的核蛋白；或者破碎贴壁状态的细胞核，得到悬浮的包括核膜蛋白在内的核蛋白（获得核蛋白）。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、更有效。通过与“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”专利比较，本发明方法更有效，充分去除了细胞质、细胞膜蛋白，保留了核膜蛋白。
2、更精准。利用原子力显微镜探测的细胞核刚度，与“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”专利比较，本发明获得的细胞核的刚度更精准。
3、更全面。分离纯化核蛋白时蛋白更全，没有小分子蛋白逃逸。
4、本方法只适合于贴壁细胞，因而本发明方法是“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”专利方法的改良或补充。
附图说明
图1为HUVECs经不同浓度NP-40处理10分钟得到的细胞核形貌。
图2为细胞核经不同浓度SDS处理后的形貌。
图3为总蛋白定量图。
图4为蛋白条带及定量图。
图5为细胞核形貌及刚度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非用于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面以细菌脂多糖（LPS）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs）诱导细胞核内磷酸化p65（即pP65）的含量升高（p65是一种重要的信号通路关键分子NF-κB的亚基，可诱导细胞粘附分子ICAM-1等基因的表达）为例，来描述本发明方法的具体实施方式。
实施例1：细胞核分离方法的验证
1）将HUVECs接种在petri dish中，在CO2培养箱中培养，待细胞铺展至约75%时，吸弃培养液，用PBS清洗贴壁细胞3遍。
2）将petri dish转移到共聚焦显微镜的载物台上。
3）拍摄图片，所拍图片为0时刻的细胞（处理前的细胞）。
4）小心吸弃petri dish中的PBS溶液，小心加入200 μL不同浓度的NP-40溶液（0.1%，0.5%，1%，2%），静置10 min。
5）再次拍摄同一位置的细胞，所拍为处理10分钟的细胞图片。
数据分析
图1为实施例1的实验数据。图1A和图1B显示，0.1%和0.5% NP-40处理10分钟细胞发生形态变化但是细胞质部分没有消失；而图1C和图1D显示，1%和2% NP-40处理10分钟后细胞的细胞膜和细胞质部分基本消失，只剩下细胞核还在原位贴壁。由于没有进行冲洗，在溶液中还悬浮着很多颗粒状的细胞破碎残余。图1说明，1% NP-40处理10分钟即可将细胞核以外的细胞成分破碎、只剩下贴壁的细胞核，验证了本发明方法的第一部分（细胞破碎、细胞核分离）的成功。
实施例2：细胞核总蛋白分离方法的验证
1）将HUVECs接种在petri dish中，在CO2培养箱中培养，待细胞铺展至约75%时，吸弃培养液，用PBS清洗贴壁细胞3遍。
2）将petri dish转移到共聚焦显微镜的载物台上。
3）小心吸弃petri dish中的PBS溶液，小心加入200 μL 1% NP-40溶液，静置10min。
4）用室温的PBS清洗贴壁细胞3遍。
5）找好特定的细胞群，用显微镜拍摄，所拍图片为0时刻的细胞。
6）吸弃培养皿内的PBS液，小心加入1 mL不同浓度（0.01%，0.1%，1%）的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，分别静置5分钟、1分钟和0.5分钟。
8）再次用显微镜拍摄同一个细胞群，所拍图片为处理后的细胞。
数据分析
图2为实施例2的实验数据。图2A显示，0.01% SDS处理5分钟细胞核基本没有发生形态变化；而图2B和图2C显示，0.1% SDS处理1分钟和1% SDS处理0.5分钟后细胞核就基本消失。图2说明，0.1% SDS处理短时间即可将细胞核破碎，验证了本发明方法的第二部分（细胞核破碎）的成功。
实施例3：细胞核及细胞核蛋白的鉴定
3.1 细胞核目标蛋白（pP65、gp210、LDLR、GAPDH）的Western blot鉴定
1. 细胞核和核蛋白分离：
1.1 本发明方法
1）将细胞铺展在6孔板中，待细胞贴壁生长至约75%时，加入脂多糖（LPS）使终浓度为1 μg/mL，在CO2培养箱内培养12小时（以未添加LPS的细胞作为对照组）。
2）从培养箱中取出培养瓶，吸弃培养液，用预冷的PBS清洗贴壁细胞3遍。
3）加入约500 μL预冷的A液（A液为用PBS配制的1% NP-40溶液，处理之前每1 mL A液加18 μL PMSF（苯甲基磺酰氟）、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂），冰上处理10分钟。
4）吸弃A液，用预冷的A液再轻轻清洗细胞核3遍（获得原位细胞核，用于后续实施例3.2 细胞核形貌及刚度的探测）。
策略1：
5）吹打，使细胞核悬浮，低温低速离心（1000×g，4℃）10 min，弃去上清。
6）向沉淀中加入100 μL预冷的B液（B液为用PBS配制的0.1% SDS溶液，处理之前每1 mL B液加18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂），超声破碎细胞核。
7）低温高速离心（16000×g，4℃）20 min，立即收集上清，即为核蛋白。
策略2：
5）加入100 μL预冷的B液（B液为用PBS配制的0.1% SDS溶液，处理之前每1 mL B液加18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂）。
6）吹打，将悬浮液转移至干净的离心管中，放置于冰上40 min，每10 min涡旋震荡30 s。
7）低温高速离心（16000×g，4℃）20 min，立即收集上清，即为核蛋白。
（本文展示策略2所收集蛋白的条带与量化）
1.2 专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”方法
1）将细胞种植在培养瓶中，待细胞贴壁铺展至约70%时，加入脂多糖（LPS）使终浓度为1 μg/mL，在CO2培养箱内培养12小时（以未添加LPS的细胞作为对照组）。
2）从培养箱中取出培养瓶，吸弃培养液，用预冷的PBS清洗贴壁细胞3遍。
3）加入约500 μL预冷的A液（A液用PBS配制的0.1% TritonX-100溶液，处理之前每1 mL A液加18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂），冰上处理10分钟。
4）吸弃A液，用预冷的A液再轻轻清洗细胞核3遍。
5）用预冷A液温和清洗和摇晃培养皿，收集细胞核于预冷的离心管中。
6）低温低速离心（1000×g，4℃）10 min，弃去上清。
7）向沉淀中加入100 μL预冷的B液（B液用PBS配制的0.1% SDS溶液，处理之前每1mL B液加18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂），以涡旋震荡仪剧烈震荡20秒，震荡3次（每次间隔10 min）。
8）低温高速离心（13000×g，4℃）20 min，立即收集上清，即为核蛋白。
2. 细胞和核蛋白分离：
使用商业化的BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），按照试剂盒产品说明书的具体步骤，进行总核蛋白的定量（使用分光光度计测量562 nm的吸光度）。
3. 按照传统的Western blot法检测目标蛋白（pP65、LDLR、gp210、GAPDH）的含量：
1）SDS-PDGE凝胶电泳：10%分离胶和5%浓缩胶，每个上样孔上样总体积、蛋白上样总量保持一致（约20 μg），电泳条件：恒压80 V，30 min，转为110 V，1.5 h。
2）转膜：使用醋酸纤维素膜（NC膜），转膜条件：恒流260 mA，4℃约2 h。
3）洗膜：转膜后，切割下含有目的条带(含LDLR、GP210、pP65、GAPDH、Histone H3和β-actin)的NC膜，分别放入孵育盒中，用TBS溶液清洗目的条带。
4）封闭：用含5%脱脂奶粉/BCA的TBS-T溶液室温封闭2 h。
5）一抗孵育：加入含封闭液（含有5%脱脂奶粉/BCA的TBS-T溶液）的一抗，4℃摇床过夜，第二天室温放置20 min。
6）二抗孵育：用TBS-T溶液清洗NC膜3次，每次10 min，加入含封闭液的二抗，室温孵育2 h。
7）显影：用TBS-T溶液清洗NC膜3次，每次10 min，用化学发光液在显影仪上进行显影。
3.2 细胞核形貌及刚度的探测
1）将样品放置于原子力显微镜载物台上，轻敲模式扫描。
2）打开软件，选择AC模式。确定针尖及样品平面，打开激光，并调整位置至针尖上，针尖位置降至距离样品50 μm。
3）寻峰，调节amplitude和set point。
4）下针，开始扫描。
5）保存数据，关机。
数据分析
图3、图4和图5为实施例3的实验数据。
图3显示，LPS刺激，本发明相较专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”方法获得的总核蛋白的含量都显著降低。**表示p值小于0.01。
图4A显示，无论是专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”还是本发明方法，LPS组的pP65的条带都比对照组（RIPA组）的条带更粗，说明LPS刺激确实能导致细胞核内pP65含量的增高；同时还显示，相比用专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”，本发明方法得到的pP65条带没有显著差异；本发明方法得到的GP210有条带，而专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”得到的GP210条带不明显，说明本发明方法相较专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”更好的保护了核膜蛋白；本发明方法得到的LDLR蛋白几乎没有条带，而专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”得到的LDLR蛋白有条带，说明本发明方法更好的去除了细胞膜蛋白。本发明方法得到的GAPDH蛋白几乎没有条带，而专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”得到的LDLR蛋白有条带，说明本专利方法更好的去除了细胞质蛋白。图4B的定量分析数据也看出，本发明方法与专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”得到的核蛋白在可以成功提取到细胞核蛋白的基础上，做到含有GP210蛋白，但几乎不含有LDLR蛋白和GAPDH，说明本发明方法可以去除细胞膜和细胞质蛋白，保留核膜蛋白，意味着可以保留更加完整且干净的细胞核。***表示p值小于0.001，****表示p值小于0.0001。
图5A显示本发明得到的细胞核表面更光滑（右），细胞膜和细胞质部分剔除的更干净。图5B显示细胞核的刚度。图5C是细胞核刚度的定量图，显示两种方法得到的细胞核的刚度存在差异，专利“一种贴壁细胞核蛋白的分离方法”得到的细胞核刚度更大，*表示p值小于0.05。
以上所描述的实施例仅表达了本发明的几种优选实施例，其描述较为具体和详细，但并不用于限制本发明。应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种变化和更改，凡在本发明的构思和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种简单高效分离完整细胞核的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）待细胞培养贴壁铺展至容器底面积70%-80%时，吸弃培养液，用预冷的PBS清洗贴壁细胞3遍；
2）加入预冷的A液冰上处理细胞10 min；
其中，A液为用PBS配制的0.1%-2% NP-40溶液，处理之前每1 mL A液加入18 μL PMSF、1μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂；
3）吸弃A液，用预冷的A液清洗细胞核3遍，得到贴壁的细胞核；
4）采用悬液状态下破碎细胞核：吹打使细胞核悬浮，低速离心，然后向沉淀中加入预冷的B液，超声破碎细胞核；
或者采用贴壁状态下破碎细胞核：先加入预冷的B液，再吹打使细胞核悬浮，转至干净的离心管中，冰上涡旋震荡处理；
其中，B液为用PBS配制的0.01%-1%去污剂溶液，处理之前每1 mL B液加入18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂；
5）低温高速离心，收集上清，即为核蛋白。
2.根据权利要求1所述的简单高效分离完整细胞核的方法，其特征在于，所述A液为用PBS配制的1% NP-40溶液，处理之前每1 mL A液加入18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的简单高效分离完整细胞核的方法，其特征在于，所述B液为用PBS配制的0.1% SDS溶液，处理之前每1 mL B液加入18 μL PMSF、1 μL蛋白质酶抑制剂、1 μL磷酸蛋白酶抑制剂。
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