CN118652790A - 利用食酸戴尔福特菌r25制备甲基硒酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物学及硒污染环境修复技术领域，提供利用食酸戴尔福特菌R25制备甲基硒酸的方法。菌株R25能够将亚硒酸盐高效还原为单质硒，以及将亚硒酸盐和单质硒等高效转化为挥发态硒，并建立了利用菌株R25将水体中的亚硒酸盐和单质硒转化为挥发态硒从而去除的方法，同时可以将挥发态的硒转化为甲基硒酸。本发明提供的菌株R25以及利用菌株R25制备甲基硒酸的方法，可用于硒污染环境的生物修复以及硒的回收和资源化利用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学及硒污染环境修复技术领域，具体地说，涉及利用食酸戴尔福特菌R25制备甲基硒酸的方法。
背景技术
硒(Selenium)是人和动物所必需的微量元素，其安全摄入范围狭窄。缺硒会降低人体免疫力，严重缺乏甚至会引起克山病、大骨节病等多种疾病，而过量摄入硒也存在中毒风险。水体和土壤等环境中硒含量过高会对生物体造成毒害作用，并随着食物链富集放大，从而给整个生态系统和人类健康带来风险。
矿业开采、金属冶炼以及硒产品加工等工业活动会排放出高浓度的含硒废水，这些含硒废水需要处理后排放以减少对环境的污染。目前对硒污染废水的处理包括物理、化学和生物方法。其中物理和化学方法的工序复杂、工程量大、成本高且易造成二次污染。而生物处理法成本低廉、环境友好，可以同时处理多种污染物。目前已报道多种微生物可以通过硒的还原和甲基化过程将硒酸盐[Se(VI)]和亚硒酸盐[Se(Ⅳ)]转化为挥发性硒化合物，如二甲基硒(DMSe)、二甲基二硒醚(DMDSe)、二甲基硒基硫化物(DMSeS)、硒化氢(H2Se)和甲基硒醇(MeSeH)等(Kagami,Narita et al.2013)。利用硒挥发微生物能够将环境中污染的硒去除，并通过收集挥发态硒化合物实现硒的回收利用。研究发现，MeSeCys(硒甲基硒代半胱氨酸)、MSA(甲基硒酸)等硒化合物具有抗癌活性，其中，甲基硒酸(MSA，methylseleninicacid)在抗肿瘤方面十分优异，具有选择性细胞毒性，适宜浓度的MSA可以诱导肿瘤细胞内质网应激甚至死亡，而不影响正常细胞的生存(Varlamova and Turovsky 2021)。
戴尔福特菌属于丛毛单胞菌科，能够用于对微囊藻毒素(周洁,闫海et al.2006)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)(Liu,Xu et al.2018)、十二烷基硫酸钠(SDS)(Yilmaz andIcgen 2014)以及全氟和多氟烷基化合物(Harris,Coon et al.2022)等污染物进行生物修复。目前尚未有关于戴尔福特菌产生挥发态硒进行硒生物修复和硒资源循环利用的报道。利用戴尔福特菌将废水中的硒化合物转化为挥发态硒，然后用尾气捕获装置将挥发态硒回收，并再加工为硒产品，不仅实现了硒污染废水的处理，还有利于硒资源的回收再利用。
发明内容
本发明的目的是提供一株能够合成挥发硒的戴尔福特菌R25及其应用。
本发明的另一目的是提供利用食酸戴尔福特菌R25制备甲基硒酸的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株从高硒环境土壤中分离纯化获得的食酸戴尔福特菌，分类命名为戴尔福特菌Delftiasp.R25，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.25434，保藏日期2022年7月29日。
第二方面，本发明提供含有所述戴尔福特菌的菌剂。
第三方面，本发明提供一种生物合成挥发态硒的方法，所述方法包括：将所述戴尔福特菌接入含硒的培养基中进行培养；
其中，培养基中的硒为无机硒和/或单质硒。
所述无机硒包括亚硒酸盐，如亚硒酸钠。
当培养基中的硒为亚硒酸钠时，
液体培养基中亚硒酸钠的浓度为1-100mM(以硒计)；
固体培养基中亚硒酸钠的浓度为1-100mM(以硒计)。
当培养基中的硒为单质硒时，
液体培养基中单质硒的浓度为1-300mM(以硒计)；
固体培养基中单质硒的浓度为1-300mM(以硒计)。
本发明中，所述挥发态硒包括但不限于DMSeO2(二甲基硒酮)、DMDSe(二甲基二硒醚)、DMDSSe(二甲基硒基二硫化物)和DMDSeS(二甲基二硒基硫化物)。
第四方面，本发明提供所述戴尔福特菌在硒污染水体和土壤的生物修复中的应用。
具体地，将所述戴尔福特菌或其菌剂与硒污染水体和土壤接触，使其中的无机硒和/或单质硒转化为挥发态硒，以实现生物去除硒的目的。
进一步地，所述应用还包括回收所述挥发态硒的步骤。
第五方面，本发明提供一种利用食酸戴尔福特菌R25制备甲基硒酸的方法，利用所述方法获得的挥发态硒与浓硝酸接触，发生氧化反应，从反应产物中收集甲基硒酸。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的食酸戴尔福特菌R25能够将亚硒酸盐高效还原为单质硒，以及将亚硒酸盐和单质硒等高效转化为挥发态硒，并建立了利用菌株R25将水体中的亚硒酸盐和单质硒转化为挥发态硒从而去除的方法，同时可以将挥发态的硒转化为甲基硒酸。本发明提供的菌株R25以及利用菌株R25制备甲基硒酸的方法，可用于硒污染环境的生物修复以及硒的回收和资源化利用。
附图说明
图1为本发明菌株R25的16S rRNA基因进化树。
图2为本发明菌株R25的全基因组系统发育树。
图3为本发明较佳实施例中菌株R25在含亚硒酸盐固体培养基上的生长情况。
图4为本发明较佳实施例中菌株R25在含亚硒酸盐液体培养基中的生长情况。
图5为本发明较佳实施例中菌株R25还原亚硒酸盐合成纳米硒的TEM照片。
图6为本发明较佳实施例中菌株R25在含单质硒固体培养基上的生长情况。
图7为本发明较佳实施例中菌株R25在含单质硒液体培养基中的生长情况。
图8为本发明较佳实施例中菌株R25对亚硒酸盐和纳米硒的挥发效率。
图9为本发明较佳实施例中菌株R25合成挥发硒的种类鉴定。
图10为本发明较佳实施例中菌株R25合成挥发硒的时间动力学规律。
图11为本发明较佳实施例中在模拟生物反应器中利用菌株R25去除亚硒酸盐和纳米硒的效率。
图12为本发明较佳实施例中在模拟生物反应器中菌株R25生成的挥发硒产物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1食酸戴尔福特菌R25菌株的分离鉴定
采集湖北恩施硒渔塘坝的土壤5g，加入95mL无菌生理盐水，置于25℃、150rpm的摇床恒温振荡30min，按10倍梯度稀释法将土壤悬浮液稀释101-106倍。分别取100μL每个稀释倍数菌液，均匀涂布于添加了100mM亚硒酸盐的NA平板(NA培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.3±0.1，121℃灭菌15min)，置于28℃恒温培养箱培养2天，获得亚硒酸盐耐受细菌。其中菌株R25在含亚硒酸盐的液体培养过程中，菌液先变红后红色变淡，生成的单质硒减少并产生类似大蒜的气味，表明菌株R25能够产生挥发态硒。
用细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN)提取R25菌株基因组DNA，以通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增其16S rRNA基因。将PCR产物纯化后进行测序，测序结果用DNAMAN软件拼接得到R25菌株的16S rRNA序列(SEQID NO：1)。用NCBI数据库的BLAST程序(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行核苷酸相似性比较，结果表明，菌株R25与戴尔福特属食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)IAM 12409T菌株的一致性达到了100％。使用MEGA软件采用邻接法(Kimura2-parameter模型)构建的16S rRNA基因系统发育树如图1所示，菌株R25与戴尔福特菌属分为同一支。
使用Illumina HiSeq PE150平台对R25菌株进行全基因组草图测序，得到R25菌株的基因组大小为7.09Mb、GC含量为66.54mol％，共有6401个编码基因。利用TYGS分析对R25进行基因组鉴定，得到菌株R25的全基因组系统发育树(图2)，菌株R25与DelftiaacidovoransNBRC 14950T的菌株被归为一个单系群，进一步证实R25属于食酸戴尔福特菌。
用JSpeciesWS(https：//jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#analyse)计算R25菌株与戴尔福特菌属其它物种模式菌株的基因组平均核苷酸相似度(AverageNucleotide Identity，ANI)(表1)，用GGDC Calculator 3.0(http：//ggdc.dsmz.de)计算R25菌株与戴尔福特菌属其它物种模式菌株的DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNAhybridization，Dddh)(表1)。结果表明，菌株R25与食酸戴尔福特菌DelftiaacidovoransIAM 12409T的ANI和dDDH值分别为96.9％和79.6％，均高于种的阈值(ANI>95％，dDDH>70％)，表明R25菌株属于食酸戴尔福特菌。
表1 R25与戴尔福特菌属其它物种模式菌株的ANI值和dDDH值
| 参考模式菌株 | ANIb(％) | dDDH(％)，d4 |
| Delftia acidovorans IAM 12409T | 96.9 | 79.6 |
| Delftia lacustris LMG 24775T | 93.8 | 58.5 |
| Delftia tsuruhatensis NBRC 16741T | 93.7 | 58.9 |
| Comamonas phosphati CGMCC 1.12294T | 79.5 | 25.4 |
| Comamonas terrae NBRC 106524T | 79.3 | 25.2 |
| Comamonas granuli NBRC 101663T | 76.3 | 22.5 |
根据《常见细菌鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)中的常规的微生物鉴定方法对菌株R25进行生理生化鉴定。菌株R25为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，直径在0.6-0.9μm之间，长度在1.5-2.6μm之间。在LB培养基(LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min)28℃培养2d，R25菌落直径1-2mm，呈米黄色，半透明，表面湿润，边缘圆整；兼性厌氧生长，能够还原硝酸盐，可以产生氧化酶、过氧化氢酶、脲酶，但不能产生H2S、DNA酶或精氨酸双水解酶，不能水解淀粉。菌株R25的生长抗逆性特征见表2，将R25在LB固体培养基上分别置于4℃、15℃、20℃、28℃、32℃、37℃、40℃和42℃培养箱中培养7d，表明其能在4℃-37℃生长；分别配制NaCl浓度为0-7％(w/v)的TSB液体培养基，以1％的接种量接种新鲜菌液，置于28℃、150rpm的摇床中，振荡培养7d，检测菌液的吸光度值(OD600)，确定R25能够耐受2％-5％的盐分；利用缓冲液配制不同pH(3-11)值的TSB液体培养基，按照1％的接种量分别接种新鲜的菌液，置于28℃、150rpm的摇床中，振荡培养7d，取菌液测定吸光度值(OD600)，表明菌株R25可以在pH5-11范围内生长。
表2菌株R25的生长抗逆性特征(Li,Yan et al.2015)
| 指标 | R25 | Delftia acidovorans NBRC 14950T |
| 生长温度，℃ | 4-37 | 10-45 |
| 耐盐(NaCl) | 2％-5％ | 0-3％ |
| pH耐受 | 5-11 | 6-10 |
综合系统发育分析、基因组ANI和dDDH计算结果以及生理生化特征分析，可以将菌株R25鉴定为食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)，分类命名为戴尔福特菌Delftiasp.R25，保藏编号为CGMCC No.25434。
实施例2菌株R25对亚硒酸盐的耐受和还原能力
1、菌株R25在固体培养基上对亚硒酸盐的耐受和还原能力
挑取R25单菌落接种到LB试管，28℃、150rpm摇培12h进行活化，调节OD600为0.8，作为种子液。将灭菌后的LB固体培养基冷却至60℃左右，加入过滤灭菌的亚硒酸钠溶液，轻轻振荡混匀，制备含1-300mM亚硒酸钠(以硒计)的平板。将R25种子液用无菌生理盐水按照10倍梯度进行逐级稀释后，分别取2.5μL滴加到含硒平板上，无菌风吹干后置于28℃培养48h。
菌株R25在含亚硒酸钠固体培养基上的生长情况见图3，结果显示R25能够耐受高达100mM(以硒计)的亚硒酸盐。在1-100mM浓度下，R25菌落呈现鲜红色，表明亚硒酸盐被还原合成了单质硒。
2、菌株R25在液体培养基中对亚硒酸盐的耐受和还原能力
将R25种子液按照1％接种量接种到已添加无菌亚硒酸钠溶液至终浓度为1-300mM(以硒计)的LB液体培养基，置于28℃、150rpm振荡培养48h后观察菌体生长情况。
结果见图4，菌株R25可以在含有1-100mM亚硒酸钠(以硒计)的液体培养基中生长，能够耐受高达100mM(以硒计)的亚硒酸钠。菌液呈现鲜红色，在TEM照片中(图5)观察到了大量单质硒颗粒，Na2S分光光度法测得在40mM亚硒酸钠(以硒计)条件下单质硒产量最大，达到2.05mM。由图5可知，在含有10mM亚硒酸钠的培养基中，R25菌体直径及体长都有减少，并产生了单质硒颗粒。单质硒颗粒直径在200-400nm之间，呈球形。
实施例3菌株R25对单质硒的耐受能力
1、菌株R25在固体培养基上对单质硒的耐受能力
将LB固体培养基融化完全后冷却至60℃左右，加入过滤灭菌的单质硒溶液，轻轻振荡混匀，制备含1-300mM单质硒(以硒计)的平板。将R25种子液用无菌生理盐水按照10倍梯度进行逐级稀释后，分别取2.5μL滴加到含硒平板上，无菌风吹干后置于28℃培养48h。菌株R25在含单质硒固体培养基上的生长情况见图6，结果显示R25能够耐受300mM(以硒计)以上的单质硒。
2、菌株R25在液体培养基中对单质硒的耐受能力
将R25种子液按照1％接种量接种到已添加无菌单质硒的LB液体培养基中(终浓度为1-300mM，以硒计)，置于28℃、150rpm培养箱中振荡培养48h后观察菌体生长情况。结果见图7，菌株R25可以在含有1-300mM单质硒(以硒计)的液体培养基中生长，能够耐受300mM(以硒计)以上的单质硒。
实施例4菌株R25对亚硒酸盐和单质硒的挥发效率
在装有50mL LB培养基的150mL摇瓶中接种0.5mL R25种子液以及相应体积的亚硒酸钠或单质硒母液(过滤灭菌)，使初始硒浓度分别为0.0625mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM(以硒计)，置于28℃、150rpm振荡培养96h。通过培养96h后菌液总硒的减少量计算硒的挥发率：
硒挥发率(％)＝(菌液总硒0h-菌液总硒96h)/菌液总硒0h×100％
用原子荧光光谱仪(HG-AFS)测定菌液总硒并计算硒挥发率，结果表明，接种R25培养96h后，培养基中的硒大量减少，并且在培养过程中嗅闻到浓烈的大蒜味气体，表明有挥发态硒化合物产生。在0.0625-0.25mM添加量下，R25对亚硒酸盐和单质硒两种无机硒的挥发率均达到85％以上，其中，0.25mM添加量下挥发率达到最高，亚硒酸盐和单质硒的挥发率分别为90.7％和90.3％；0.5mM添加量下，亚硒酸盐和单质硒的挥发率为49.6％和43.1％(图8)。
实施例5菌株R25合成挥发硒的鉴定
以1％的接种量将R25种子液接种到含0.5mM亚硒酸盐或0.5mM单质硒(以硒计)的3mL LB顶空瓶中，置于28℃、150rpm振荡培养。培养96h后用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对顶空气体进行硒形态鉴定，结果表明(图9)，R25将Se(IV)转化为DMSeO2(二甲基硒酮)、DMDSe(二甲基二硒醚)、DMDSSe(二甲基硒基二硫化物)和DMDSeS(二甲基二硒基硫化物)，在7.9-8.0min时也观察到了1,2,4-三硒环戊烷，而没有DMSe(二甲基硒)的产生。
实施例6菌株R25挥发硒合成的时间动力学规律
以1％的接种量将R25种子液接种到已添加无菌硒的LB培养基中(终浓度为0.5mM亚硒酸钠或0.5mM单质硒(以硒计))，置于28℃、150rpm振荡培养96h。
定时取样，用原子荧光光谱仪(HG-AFS)测定培养基中的总硒含量，通过菌液总硒的减少量计算挥发率。结果表明(图10)，0-48h，R25对Se(IV)和SeNPs的挥发较少，挥发率不到20％，在48-96h，R25对Se(IV)和SeNPs的挥发率增加一倍，分别达到40.6％，41.58％。
实施例7在模拟生物反应器中利用菌株R25去除水体中亚硒酸盐和单质硒并回收甲基硒酸
以1％的接种量将R25种子液接种到模拟生物反应器装置中。反应器中的培养基为含有0.25mMSe(IV)和0.25mMSeNPs(以硒计)的6L无菌LB培养基。实验装置的通气量为0.18m3/h，罐压0.05-0.06MPa，搅拌150rpm，在28±0.5℃发酵48h。尾气通过管路进入浓硝酸(纯硝酸)吸收液中吸收：尾气→缓冲瓶(1L)→吸收瓶①(1L装850mL浓硝酸)→吸收瓶②(1L装500mL浓硝酸)→水(1L装500mL)→排气。定时用原子荧光光谱仪(HG-AFS)测定培养基中的总硒含量，利用菌液总硒的减少量计算硒的挥发率。结果表明(图11)，菌株R25能够同步脱除Se(IV)和SeNPs，在48h时硒挥发率达到91％。
利用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪(HPLC-HG-AFS)对48h吸收瓶①中硒形态的鉴定结果表明(图12)，捕获液中的硒化合物为甲基硒酸(MSA，methylseleninicacid)，是DMDSe(二甲基二硒)的氧化产物(Winkel,Feldmann et al.2010)，收集后可进一步加工生产抗肿瘤药物。R25不生成DMSe(二甲基硒)，捕获液中二甲基氧化物(DMSeO，DMSe的氧化产物)等其他硒化合物的干扰很少，是生产抗肿瘤药物的潜力菌株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)
1.戴尔福特菌Delftiasp.R25，保藏编号为CGMCC No.25434。
2.含有权利要求1所述戴尔福特菌的菌剂。
3.生物合成挥发态硒的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述戴尔福特菌接入含硒的培养基中进行培养；
其中，培养基中的硒为无机硒和/或单质硒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机硒为亚硒酸盐。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当培养基中的硒为亚硒酸钠时，
液体培养基中亚硒酸钠的浓度为1-100mM，以硒计；
固体培养基中亚硒酸钠的浓度为1-100mM，以硒计；
当培养基中的硒为单质硒时，
液体培养基中单质硒的浓度为1-300mM，以硒计；
固体培养基中单质硒的浓度为1-300mM，以硒计。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述挥发态硒选自DMSeO2、DMDSe、DMDSSe和DMDSeS。
7.权利要求1所述戴尔福特菌在硒污染水体和土壤的生物修复中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述戴尔福特菌或其菌剂与硒污染水体和土壤接触，使其中的无机硒和/或单质硒转化为挥发态硒，以实现生物去除硒的目的。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用还包括回收所述挥发态硒的步骤。
10.利用食酸戴尔福特菌R25制备甲基硒酸的方法，其特征在于，利用权利要求3-6任一项所述方法获得的挥发态硒与浓硝酸接触，发生氧化反应，从反应产物中收集甲基硒酸。
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