CN118600111A - 一种检测II型草鱼呼肠孤病毒的RPA-CRISPR/Cas12a试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测II型草鱼呼肠孤病毒的RPA‑CRISPR/Cas12a试剂盒及其应用。所述试剂盒包含检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的crRNA和/或扩增II型草鱼呼肠孤的引物对。基于试剂盒构建一种新型II型草鱼呼肠孤病毒的检测方法；该方法操作简便，环境和设备要求低、适用于现场的草鱼出血病快速诊断方法。而且，该方法仅对GCRV‑Ⅱ有扩增反应，特异性高；对感染临床样本的检测也具有诊断灵敏度高，重复性强的特点，其中检测限可达2×10‑6fg/μL；还具备操作简便，反应快速，可以避免依赖PCR等复杂仪器等特点。本发明的方法可很好的用于目前GCRV‑Ⅱ感染病毒定量分析和临床的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，具体涉及一种检测II型草鱼呼肠孤病毒的RPA-CRISPR/Cas12a试剂盒及其应用。
背景技术
草鱼出血病的病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)，属呼肠孤病毒科刺突病毒亚科水生呼肠孤病毒属。GCRV不同分离株表现出基因组带型、基因组序列、宿主致病性、细胞敏感性等方面的明显差异。由于水生呼肠孤病毒至今尚未建立标准血清型，还无法进行血清学分型。根据基因组带型和序列差异，GCRV至少分成3个基因型，代表株分别是873(Ⅰ型)、HZO8(Ⅱ型)和104(Ⅲ型)。目前能够引起草鱼出血病、造成重大经济损失的流行毒株为基因Ⅱ型GCRV，对宿主致病性强，但对细胞敏感性较差，在已有细胞中增殖不产生明显的细胞病变。因此，GCRV-Ⅱ病毒快速诊断方法的建立,对于草鱼出血病的及早发现和有效防控具有重要的意义。
病原检测方法主要包括细胞分离培养技术，利用敏感细胞系对GCRV-Ⅱ进行分离，该类型技术由于实验操作流程耗时较长，细胞一次传代通常需要一周，影响疾病诊断的时效性，且对技术人员要求高，需要成本较高的配套仪器和研究平台，通常适用于科研级别的研究类型实验；目前诊断GCRV-Ⅱ病原的最普遍采用的是基于核酸扩增的检测方案，包括PCR扩增技术如：普通PCR技术、三重PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术、LAMP检测技术和RPA检测技术等，这些技术均可以较快速的开展病原检测，其中LAMP和RPA等技术因为不需要变温扩增仪器(如PCR仪器、定量PCR仪器)，同时可以利用颜色反应或恒温扩增仪器(如普通水浴锅、专用恒温扩增仪器等)更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。表1整理了目前已经报道的GCRV-Ⅱ的相关核酸检测技术报道。
表1
RPA法主要使用3种酶：重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成复合体，在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA解链并使引物与模板配对，然后在DNA聚合酶的作用下，生成新的DNA链。经过几十个循环后，DNA新链的数量以指数级增长。RPA法用酶的作用使双链DNA解链。因此反应条件较温和，不需要高温使模板DNA变性。RPA反应的时间也短，在30～60min就可以得到能检测到的扩增片段。重组酶介导扩增(RPA技术)相较于重组酶聚合酶扩增(RPA技术)的技术改进在于：(1)RPA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物聚合体；RPA使用的重组酶是T4 UVSX，来自于病毒。实验证明，来自于细菌和真菌的重组酶能与DNA紧密结合，使核酸体外扩增反应顺利进行。(2)RPA使用的聚合酶只具有DNA聚合酶活性，反应产物呈指数级增长；RPA的聚合酶具有链置换活性和聚合酶活性，反应产物不呈指数增长。
Cas12a可用于编辑目标DNA。该蛋白最初被称为Cpf1，由张锋团队在其2015年的cell论文中首次提出。Cas12a(Cpf1)是基因编辑酶家族的重要一员，它能够在Cas9不能作用的位置切割DNA；与crRNA以及靶标DNA形成三元复合物，该复合物就会表现出很强的“乱切”活性，可将体系中非靶标单链DNA切成几个碱基长度的“碎片”。利用这一特性，Doudna教授团队开发出一种被称为“DETECTR”(DNAEndonuclease Targeted CRISPR TransReporter)的诊断系统，该系统由CRISPR-Cas12a(Cpf1)和向导RNA、荧光报告分子及RPA(recombinase polymerase amplification)等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量DNA进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，RPA扩增目标DNA，使Cas12a(Cpf1)更容易找到并切割它，然后激活Cas12a(Cpf1)的核酸酶活性使其切割体系中的其它单链DNA(也就是荧光报告分子)，从而发出荧光。
其中利用CRISPR/Cas12a RPA技术，将样品放在恒温扩增仪中反应收集荧光信号，样品呈阳性会出现荧光曲线，样品呈阴性则不会出现荧光曲线。待收集荧光信号结束，将样品放置在蓝光板上观察有无荧光，有荧光则说明样品呈阳性，无荧光则说明样品呈阴性，反应过程有两次荧光放大，说明CRISPR/Cas12a RPA灵敏度更高。且根据GCRV-Ⅱ的靶基因序列设计特定的RPA引物进行第一次扩增，再根据引物扩增片段设计对应的crRNA序列进行第二次扩增，使得CRISPR/Cas12a RPA反应特异性更强。最后检测的全过程反应时间较短，均在一小时左右，是目前已知CRISPR/Cas12a RPA技术中检测GCRV-Ⅱ最快速的方法。
因此，本发明基于RAA-CRISPR/Cas12a构建了一种用于检测GCRV-Ⅱ的试剂盒，可以避免依赖PCR等复杂仪器的特性，并且提高检测灵敏度。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种核酸分子组合物。
本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第三方面的目的，在于提供上述核酸分子组合物和/或试剂盒的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种检测II型草鱼呼肠孤病毒的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种核酸分子组合物，包括检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的crRNA和/或扩增II型草鱼呼肠孤病毒的引物对。
所述引物对序列如以下(a)～(e)任一项所示：
(a)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
(b)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
(c)SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
(d)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
(e)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
优选地，所述引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述crRNA序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12任一项所示。
优选地，所述crRNA序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的核酸分子。
优选地，所述试剂盒还包含cas12a蛋白。
优选地，所述试剂盒还包含Cleavage Buffer、Reporter、阳性标准品、R-mix、CoreMix、MgOAc中的一种或多种。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述核酸分子组合物和/或本发明第二方面所述试剂盒在检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒和/或制备检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的产品中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的方法，包括使用本发明第一方面所述核酸分子组合物和/或本发明第二方面所述试剂盒对待测样本进行检测。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用本发明第一方面所述的引物对进行扩增，得到扩增产物；
(3)取步骤(2)所得扩增产物，添加本发明第二方面所述的cas12a蛋白和crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果。
该方法不用于疾病的诊断。
优选地，步骤(2)所述扩增条件为35～42℃反应30～60分钟。
优选地，步骤(2)所述扩增体系包括：R-mix、Core Mix、引物对、模板DNA、MgOAc。
优选的，步骤骤(2)所述扩增体系包括：约10μL R-mix(约2X)，约5μL Core Mix(约4X)，上、下游引物各约0.5μL(引物浓度均为约20μM)，约2μL DNA，约2μLMgOAc。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测条件为35～42℃反应30～60分钟。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测体系包括Cleavage Buffer、reporter、Cas12a蛋白、crRNA、扩增产物。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测体系约2μLCleavage Buffer(约10X)，约0.6μL Reporter(约4μM)，约1μL Cas12a protein(约1μM)，约1μL crRNA(Cas12a)(约1μM)，约10.4μL Nuclease-free H2 O，约5μL步骤(2)的扩增产物。
术语“约”在一些实施例中涵盖具体量±20％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±10％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±5％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±1％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±0.5％的变化，而在一些实施例中涵盖具体量±0.1％的变化，因为这些变化适于进行所公开的方法。
本发明的有益效果是：
本发明设计并筛选了II型草鱼呼肠孤病毒的扩增引物以及crRNA序列，提出了基于RAA-CRISPR-Cas12a系统构建一种新型II型草鱼呼肠孤病毒的检测方法；该方法操作简便，环境和设备要求低、适用于现场的草鱼出血病快速诊断方法。而且，该方法仅对GCRV-Ⅱ有扩增反应，与GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅲ、草鱼其他病毒病原体以及草鱼共生鱼体常见感染细菌均无交叉反应，特异性高；对感染临床样本的检测也具有诊断灵敏度高，重复性强的特点，其中检测限可达2×10-6fg/μL；还具备操作简便，反应快速，可以避免依赖PCR等复杂仪器等特点。因此本发明的方法可很好的用于目前GCRV-Ⅱ感染病毒定量分析和临床的快速检测；更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。
附图说明
图1为GCRV-Ⅱ-RPA引物筛选结果；以GCRV-Ⅱ阳性DNA为模板，且分别用设计好五条引物进行PCR扩增；其中M：DL2000 DNA marker；1、2、3、4、5为筛选引物序号，P为阳性对照，N为阴性对照。
图2为crRNA筛选结果。
图3为GCRV-ⅡRPA-Cas12a灵敏度试验结果。
图4为GCRV-ⅡRPA-Cas12a特异性试验结果。
图5为RPA-Cas12a和PCR方法对草鱼样本中的GCRV-Ⅱ的检测结果；其中一扩是指第一轮PCR扩增电泳结果显示，样品1、5、8、9、10、12未扩增出任何条带，样品2、3、4、6、7、11、13、14在408bp位置有特异性条带；二扩是指第二轮PCR扩增电泳结果显示，样品1、5、8、9、10、12未扩增出任何条带，样品2、3、、4、6、7、11、13、14在363bp位置有特异性条带。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明联合RPA扩增技术和CRISPR/Cas12a系统，建立了一套用于检测GCRV-Ⅱ病毒的系统。
实施例1
1 材料与方法
1.1 试剂仪器
RPA核酸扩增试剂(基础型)(S001ZC)，杭州众测生物科技有限公司；CRISPR/Cas12a DNA检测试剂盒(D-F-CAS12-2S)，深圳易致生物科技有限公司；pMDTM19-T VectorCloning Kit，r Taq聚合酶，TaKaRa(大连宝生物)公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(GelExtraction Kit)，omega BIO-TEK。核酸分析仪(Nanodrop ONE),Thermo；Deaou-308C恒温荧光PCR仪，广州迪澳生物科技有限公司。
1.2引物及crRNA设计
本研究根据GCRV-ⅡS6片段保守序列设计引物和crRNA，寡核苷酸(引物和crRNAs)的工业合成是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。具体信息见表2和表3。
表2GCRV-ⅡRPA引物
表3 GCRV-ⅡRPA crRNA
| Name | Sequence 5’–3’ |
| GCRV-ⅡcrRNA1-1 | UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCGACGUACUUCUUAAGGGC(SEQ ID NO.11) |
| GCRV-ⅡcrRNA1-2 | UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGAGUUCAGUGCCUAC(SEQ ID NO.12) |
| GCRV-ⅡcrRNA2-1 | UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGGACGAAAACCUACCAGUG(SEQ ID NO.13) |
| GCRV-ⅡcrRNA2-2 | UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGUCCCAAAAUCUAAGUAAGC(SEQ ID NO.14) |
1.3引物筛选
以GCRV-Ⅱ阳性DNA为模板，进行RPA-AGE检测反应。将25μL A Buffer，13.5μLNuclease-free H2O，RPA上、下游引物各2μL(引物浓度均为10μM)混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中，然后加入5μL待测DNA样本，最后向检测单元管盖上加入2.5μL的BBuffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，低速离心10秒；将检测单元管放入39℃恒温扩增仪中孵育30min。反应结束后，加入50μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提液进行纯化，充分混匀后12000rpm/min离心5min，取上清进行电泳检测。
结果如图1所示，根据琼脂糖凝胶电泳中条带的灰度，筛选到了1对效果较好的引物F1/R1，扩增产物可以在227bp产生明亮条带。
1.4标准品模板的制备
以GCRV-Ⅱ阳性样品的DNA为模板，对靶基因序列进行常规PCR扩增获取目的产物，用pMD19-T载体在DH5α中克隆，克隆片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。目的产物的克隆经扩大培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。用核酸分析仪测定重组质粒DNA浓度为89ng/μL，拷贝数为1.24×1011copies/μL DNA，将该重组质粒作为本实验标准品原液，-20℃保存。
1.5RPA-CRISPR/Cas12a检测GCRV-Ⅱ
RPA-CRISPR/Cas12a第一步扩增反应体系如下：
10μL R-mix(2X)，5μL Core Mix(4X)，RPA上、下游引物各0.5μL(引物浓度均为20μM)，2μL DNA，最后加入2μL MgOAc混匀。轻弹数次混匀，稍微离心。37℃孵育30分钟反应结束。
RPA-CRISPR/Cas12a第二步检测反应体系如下：
2μLCleavage Buffer(10X)，0.6μL信号探针Reporter(4μM)，1μL Cas12a protein(1μM)，1μL crRNA(Cas12a)(1μM)，10.4μL Nuclease-free H2O，最后加入5μLRPA-CRISPR/Cas12a第一步扩增产物。
轻弹数次混匀，稍微离心(避免涡旋剧烈震荡)，重复3次，将反应管放置于恒温反应器中，37℃条件下反应30min。
1.6crRNA筛选
以质粒为模板，采用1.5中RPA-Cas12a检测方法，分别对4组crRNA进行筛选，通过扩增曲线的荧光值及起峰时间，选择最优的crRNA引物组。
根据RPA-CRISPR/Cas12a荧光曲线产生的时间和荧光强度，筛选到了1条效果较好的crRNA1-2，可以在2min左右产生扩增曲线，比其他crRNA更早，而且30min内产生的荧光强度最高。因此，后续实验均选用crRNA1-2进行，其序列为5′-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGAGUUCAGUGCCUAC-3′。
1.7RPA-Cas12a分析灵敏度试验
将阳性质粒稀释为106-100copies/reaction 7个浓度。采用1.5中RPA-Cas12a检测方法，以稀释后的各浓度阳性质粒及无RNA酶水为模板，通过扩增曲线确定该方法的检测灵敏度。
以7个梯度稀释(106 -100copies/reaction)的阳性质控品及无核酸酶水为模板进行RPA-Cas12a检测。结果如图3所示，106-101copies/reaction 6个质粒浓度为模板的检测反应荧光值之间均能检出，而且荧光强度均显著高于101copy/reaction为模板的反应。因此，本研究建立的RPA-Cas12a方法的检测限为100copies/reaction(2×10-6fg/μL)。
1.8 RPA-Cas12a分析特异性试验
选取临床样本WSSV阳性cDNA、CyHV-2阳性cDNA、GCRV-Ⅱ阳性cDNA、GCRV-Ⅰ阳性cDNA、EHP阳性cDNA、DIV1阳性cDNA、IHHNV阳性cDNA、SVCV阳性cDNA为扩增模板，以无核酸酶水为阴性对照，采用1.5中RPA-Cas12a检测方法，分析本研究方法的检测特异性。
RPA-Cas12a的分析特异性试验检测结果如图4所示，仅GCRV-Ⅱ样品出现扩增曲线，空白对照(无核酸酶水)、CyHV-2，GCRV-Ⅰ，WSSV，EHP，DVI1，IHHNV，GCRV-Ⅰ，SVCV样品均未出现扩增，表明本RPA-Cas12a检测体系能特异性扩增检测出GCRV-Ⅱ中的靶序列，而不与其他病原体的核酸发生交叉反应，说明本检测方法特异性好，未出现假阳性。
1.9RPA-Cas12a方法对实际样本的检测
实际样本由珠江水产研究所提供，提取样本基因组DNA，然后采用1.5中的RPA-Cas12a体系及SCT7023-2021中PCR法进行检测，同时进行实际样本的检测，比较2种方法的检测一致性。
使用以上建立的GCRV-ⅡRPA-Cas12a方法检测临床样本，如图5显示，检测14个2023年江西和广东的专项监测样本，结果显示有8个阳性样品。同时，使用《SCT7023-2021草鱼出血病监测技术规范》行标PCR检测两批样本，结果显示，RPA-Cas12a检测全部为阳性的8个样本，行标PCR检测全部也为阳性，样品RPA-Cas12a和行标PCR检测结果阳性符合率为100％，阴性符合率也为100％。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种核酸分子组合物，包括检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的crRNA和/或扩增II型草鱼呼肠孤病毒的引物对。
2.根据权利要求1所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述引物对序列如以下(a)～(e)任一项所示：
(a)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
(b)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
(c)SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
(d)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
(e)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
优选地，所述引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述crRNA序列如SEQ IDNO.11～12任一项所示；优选的，所述crRNA序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的核酸分子组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含cas12a蛋白。
6.权利要求1～3任一项所述核酸分子组合物在检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒和/或制备检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的产品中的应用。
7.权利要求4～5任一项所述试剂盒在检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒和/或制备检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的产品中的应用。
8.一种检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的方法，包括使用权利要求4～5任一项所述试剂盒对待测样本进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用所述的引物对进行扩增，得到扩增产物；
(3)取步骤(2)所得扩增产物，添加所述的cas12a蛋白和crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果；
该方法不用于疾病的诊断。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增条件和步骤(3)所述反应条件均为35～42℃、30～60分钟。
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