CN118460753A - 用于诊断结核分枝杆菌感染的核酸标志物的检测剂及其应用 - Google Patents

用于诊断结核分枝杆菌感染的核酸标志物的检测剂及其应用 Download PDF

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高卓
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Abstract

本公开大体涉及临床检测技术领域，具体而言，涉及用于诊断结核分枝杆菌感染的核酸标志物的检测剂及其应用。本发明意外发现SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的核酸区段可用作等温扩增反应检测诊断结核分枝杆菌感染的新型分子标志物。这两个区段相比传统技术所公开的检测常用区段，与等温扩增反应技术具有非常好的适配性，可应用于制备用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂中。

Description

用于诊断结核分枝杆菌感染的核酸标志物的检测剂及其应用
技术领域
本公开大体涉及临床检测技术领域，具体而言，涉及用于诊断结核分枝杆菌感染的核酸标志物的检测剂及其应用。
背景技术
结核病的病原体是结核分枝杆菌，主要包含人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌和鼠结核分枝杆菌；其可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官的结核病，尤以肺结核最常见。
结核病诊断技术方面的研发势头强劲，主要覆盖结核病筛查、结核潜伏感染检测和耐药结核病诊断等领域。结核诊断根据其预期用途可以分成四类：结核分枝杆菌（MTB）检测试剂、药敏检测试剂、MTB+药敏检测试剂（双功能）、菌种鉴定试剂。目前肺结核诊断技术平台众多如酶联免疫法、荧光PCR法、胶体金法、分枝杆菌培养等等，从检测技术来看结核病的细菌学和免疫学检测技术的检测时间长、敏感度或特异度欠佳、无法区分活性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染等，在一定程度上制约了结核病的早期诊断和治疗。随着医学科学技术的不断发展，分子生物学检测技术在结核病早期诊断辅助方面受到广泛重视和应用。
目前国内外获批的结核分枝杆菌分子生物学检测产品主要是基于荧光定量PCR技术，例如赛沛的Xpert MTB/RIF系列等产品。但是，这些分子生物学检测技术存在平台要求高、操作复杂、设备昂贵等限制因素，在基层医疗机构的普及存在障碍。针对以上不足，需要建立一种更适合于基层，现场检测的结核分枝杆菌检测技术。
等温扩增联合可精确识别单碱基差异的CRISPR检测技术，保证检测的高特异性，实现结核病核酸检测的前移和下移，从而使检测更加方便快捷。这一方案将极大地提高结核病的早期诊断和监测效率，有望成为基层和现场结核病防控工作的重要技术支撑。目前，用于检测结核分枝杆菌复合群的分子检测方法主要以PCR为主，包括变性、退火和延伸三个步骤。然而，等温扩增是一种在恒定温度下通过特定酶的作用实现模板扩增的方法。值得注意的是，并非所有适合PCR检测的扩增区段和标志物都适合等温扩增。因此，本公开的研究主要是为了发现适用于高灵敏结核分枝杆菌复合群检测的标志物，这些标志物不仅适合PCR检测体系，更适合等温扩增体系。本公开希望通过开发相关试剂盒，实现结核分枝杆菌检测技术的升级和推广，从而为疾病检测技术的发展做出贡献。
发明内容
本公开涵盖如下技术方案：
本公开的第一方面涉及核酸标志物的检测剂在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒中的应用；
其中，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示，所述检测剂用于通过等温扩增反应检测生物样本中的所述核酸标志物。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂包括靶向所述核酸标志物的引物和/或探针。
可选的，如上所述的应用，所述等温扩增反应是重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
可选的，如上所述的应用，所述试剂或试剂盒中包含链置换DNA聚合酶和/或重组酶系统。
可选的，如上所述的应用，所述试剂或试剂盒还包含等温扩增反应产物检测剂，以确定结核分枝杆菌的存在与否
可选的，如上所述的应用，所述等温扩增反应产物检测剂包括CRISPR-Cas检测系统、用于检测DNA双链的染料和/或辅助剂、用于与所述等温扩增反应产物杂交的荧光探针、pH显色试剂中的至少一种。
可选的，如上所述的应用，所述CRISPR-Cas包括以下中的一种或多种：CRISPR-Cas12检测系统、CRISPR-Cas13检测系统、以及具有与Cas12和/或Cas13的旁路切割活性类似的Cas检测系统。
可选的，如上所述的应用，所述试剂或试剂盒中的至少一种组分是固体，所述固体包括冻干微球、冻干饼、冻干粉、依赖于固体介质存在的斑点中的至少一种。
可选的，如上所述的应用，所述生物样本选自舌拭子、痰液、唾液、血清、血浆、血液、尿液、粘液、汗液、眼泪或其他眼部液体、耳部液体、水疱、疮、胃液、胃汁、肺泡灌洗液、粪便、胰液或汁、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、精液、乳汁、脊髓液、液体骨髓和淋巴液中的一种或多种。
本公开的第二方面涉及为第一方面中所定义的试剂或试剂盒。
本公开的第三方面涉及一种检测样品中结核分枝杆菌的方法，其包括：
a) 从样品中获得分离的核酸；b) 使用等温扩增反应扩增所述核酸中潜在的核酸标志物；其中所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示；并c)检测所述核酸标志物的存在。
可选的，如上所述的方法，所述等温扩增反应包括重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
可选的，如上所述的方法，c)中检测的方法选自CRISPR-Cas法、荧光法、侧流免疫色谱法中的至少一种。
本公开的第四方面涉及核酸标志物在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒的应用，其特征在于，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示。
本公开的发明人意外发现SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的核酸区段可用作等温扩增反应检测诊断结核分枝杆菌感染的新型分子标志物。这两个区段来自结核分枝杆菌的IS6110基因，相比传统技术所公开的检测常用区段，与等温扩增反应技术具有非常好的适配性，可应用于制备用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂中。采用本发明的分子标志物开发诊断结核分枝杆菌感染的制剂，用于诊断结核分枝杆菌感染，具有更灵敏、方便、快捷、特异性高、廉价的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本公开具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本公开的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开一个实施例所提供的痰液样本中不同检测区段的检测灵敏度（层析法）检测结果；
图2为本公开一个实施例所提供的舌拭子样本中不同检测区段的检测灵敏度（层析法）检测结果；
图3为本公开一个实施例所提供的痰液样本中不同检测区段的检测灵敏度（荧光法）检测结果；
图4为本公开一个实施例所提供的舌拭子样本中不同检测区段的检测灵敏度（荧光法）检测结果；
图5为本公开一个实施例所提供的痰液样本中不同检测区段的检测灵敏度（RAA荧光法）检测结果；
图6为本公开一个实施例所提供的舌拭子样本中不同检测区段的检测灵敏度（RAA荧光法）检测结果；
图7为本公开一个实施例所提供的痰液样本中不同检测区段的检测灵敏度（LAMP荧光法）检测结果；
图8为本公开一个实施例所提供的舌拭子样本中不同检测区段的检测灵敏度（LAMP荧光法）检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本公开实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本公开。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本公开进行多种修改和变化而不背离本公开的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本公开的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本公开所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本公开的教导。本公开中在本公开的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本公开。
在本公开中，除非另有说明，否则本公开中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本公开中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
本公开所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本公开中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本公开中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本公开中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
如本公开使用，“约”某个值或参数包括(和描述)针对值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本公开中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。
如本公开使用，除非另外表明，单数形式的冠词“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代物。
本公开中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本公开中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本公开中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本公开保护范围的限制。本公开中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本公开中涉及的“水”，各自独立地可以为蒸馏水、纯化水、过滤水、去离子水等；各自独立地优选为无核酸水，更各自独立地优选无核酸酶的水。
本公开使用的术语“引物”或“引物序列”是指杂交到靶向DNA模板以产生靶向DNA:引物杂交体并引发DNA合成反应的直链低聚核苷酸。凭经验确定引物长度的上限和下限。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下与靶向核酸杂交时形成稳定双链体所需要的最小长度。非常短的引物(通常小于3个核苷酸长)在这样的杂交条件下并不会与靶向核酸形成热力学稳定的双链体。上限常通过在除了靶向核酸中的预定核酸序列以外的区域中双链体形成的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约3个核苷酸长至约40个核苷酸长的范围内。所述引物可为RNA低聚核苷酸、DNA低聚核苷酸或嵌合序列。本发明所用引物优选是适用于等温扩增反应的引物。
本公开使用的dNTP混合物是指混合物脱氧核糖核苷三磷酸酯，其中N为包含A、C、G或T/U中的任一种的随机核苷酸。
本公开使用的术语“反应温度”是指在扩增反应期间维持的温度。本公开的实施方案包括等温扩增反应，其中所述反应的温度是恒定的。整个等温扩增反应在反应温度下实现，例如用于使用GenomiPhi的等温扩增反应的反应温度为约30℃。所述反应温度随变化条件而变，包括但不限于使用不同的聚合酶、引物或模板的尺寸、使用另外的盐或稳定剂。对于RPA/RAA/RDA技术，合适的反应温度优选为约25°C~40°C，优选35°C~40°C，更优选37°C；对于LAMP技术，合适的反应温度优选为约60°C~65°C。
在本公开提及的所有文献都在本公开中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本公开的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本公开涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本公开中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本公开中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本公开中，但以能够实施本公开为限。应当理解，当引用内容与本公开中的描述相冲突时，以本公开为准或者适应性地根据本公开的描述进行修正。
本公开第一方面首先涉及核酸标志物的检测剂在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒中的应用；
其中，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示，所述检测剂用于通过等温扩增反应检测生物样本中的所述核酸标志物。
本公开经过严谨的实验，在满足相关设计原则的前提下，随机设计了多种适用于等温扩增反应的引物和/或探针，它们覆盖了SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示核酸序列，以验证了它们作为诊断结核分枝杆菌感染标志物使用的可靠性。
在本公开中，若无特别声明，根据本领域技术人员的一般理解，“核酸标志物”、“靶向核酸”、“标志物”、“标志物基因”、“生化标志物”、“结核病标志物”或“结核分枝杆菌标志物”是指“SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示核酸”的全长核苷酸序列，或天然存在的变体，或全长序列及变体的片段，特别是可被检测并确定具体序列的片段；它们的含义根据语境可以互换。其具体指要用作分析受试者生物样本的靶向核酸。
所述检测剂所扩增的靶向DNA长度优选地包含SEQ ID NO：1序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120个连续的核苷酸；和/或，优选地包含SEQ ID NO：2序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180或181个连续的核苷酸。
在本公开中，术语“生物样本”、“样本”等是指动物样本；可以来自动物（优选至少包括哺乳动物，例如灵长类动物，包括人）的组织或器官、组织裂解液；细胞(在受试者体内、直接取自受试者、或保持在培养物中的或来自培养细胞系的细胞)、细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物；含有一种或多种衍生自细胞、细胞材料或病毒材料(例如多肽或核酸)的分子的溶液；或含有天然或非天然存在的核酸的溶液，其被或可以如本公开所述进行测定。在一些实施方式中，样本中含有核酸。样本也可以是含有一种或多种细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物，包括但不限于细胞、核或无细胞核酸。特别地，本公开的生物样本优选来自体液，体液包括来自动物的液体、半固体、充气液体、液体-气体混合物等。此类体液可包括但不限于舌拭子、痰液、唾液、血清、血浆、血液、尿液、粘液、汗液、眼泪或其他眼部液体、耳部液体、水疱、疮、胃液、胃汁、肺泡灌洗液、粪便、胰液或汁、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、精液、乳汁、脊髓液、液体骨髓和淋巴液中的一种或多种。生物样本也可以是法医样品或古代样品。本公开优选的生物样本选自舌拭子和痰液。
在一些实施方式中，所述检测剂包括靶向所述核酸标志物的引物和/或探针。
“靶向所述核酸标志物的引物和/或探针”是指能够靶向扩增所述核酸标志物的引物，和/或靶向结合所述核酸标志物的探针。本公开使用的术语“靶向扩增”是指扩增靶向核酸的过程。靶向核酸充当DNA扩增反应中的模板。核酸标志物的一部分或靶向核酸的整个区域可在DNA扩增反应中通过DNA聚合酶扩增以生成扩增产物或扩增子。扩增子可包括所述靶向核酸的多个复制体或与所述靶向核酸互补的序列的多个复制体。所述靶向核酸可以自生物样本。分离的所述核酸标志物可分散在溶液中或可固定在例如斑渍、阵列、载玻片、微量滴定板、珠粒或ELISA板的固体载体上。
引物和探针可以是经过修饰的，修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述探针标记有可检测的信号物质。在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）。
Lewis (1992, Genetic Engineering News 12: 1-9)以及Abramson和Myers(1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 41-47)的文章是扩增技术的良好全面综述。该技术主要基于：扩增过程中需要多个循环的技术或在单一温度下进行的技术。在单一温度下进行的技术（被称为等温技术）的扩增过程的主要方面是在单一温度进行。与PCR过程（其中加热反应产物以分离两条链，这样的话其他引物可以结合模板以重复上述过程）不同，等温技术依赖于链置换聚合酶以便分离/置换双链的两条链和再拷贝模板。区分等温技术的关键点是使用的方法以便起始重复的过程。
广义的等温技术可以被再分成以下方法：依赖于引物的置换以起始重复的模板拷贝（以下举例说明，HDA（解旋酶依赖性扩增），核酸外切酶依赖性扩增(EP1866434)，重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导扩增法(RAA)、新型重组酶依赖型扩增（RDA，参见中国专利CN202010344702.7）、环介导的扩增(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、多重置换扩增(MDA）、交叉引物扩增技术(CPA)）的方法和依赖于单引物分子的持续再使用或从头合成(以下举例说明，SDA（链置换扩增和基于核酸的扩增(NASBA和TMA)）的方法。
作为较为优选的方案，本公开中，所述等温扩增反应是重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述试剂或试剂盒中包含链置换DNA聚合酶和/或重组酶系统。
用于本公开方法的聚合酶优选的是那些具有链置换活性的那些聚合酶。这种活性是一些DNA聚合酶的公知特性(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 第2版)。DNA聚合酶的特性，尤其是其中一些的链置换活性，由Kornberg和Baker等详细给出，DNA Replication, 第2版, 第113-225页, Freeman, N.Y.(1992)。链置换不是所有DNA聚合酶共有的特性，因为其中一些(例如T4 DNA聚合酶)不能单独实现链置换。在这些情况下可以通过添加聚合酶辅助蛋白实现链置换。最初大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段显示链置换活性(Masamune and Richardson, 1971, J. Biol.Chem. 246: 2692-2701)，其赋予该酶从双链DNA裂解位点的3' OH末端起始核酸复制的能力。这种链置换活性还显示于热稳定的DNA聚合酶诸如Tli DNA聚合酶(Kong et al.,1993. J. Biol. Chem. 268: 1965-1975)。在这种情况下还显示该酶的突变形式不具有核酸外切酶5'-3'活性，这具有更高的链置换能力。对于T7 DNA聚合酶(Lechner et al.,1983. J. Biol. Chem. 258: 11174-11184)和HIV逆转录酶(Huber et al., 1989, J.Biol. Chem. 264: 4669-4678)也显示了这种链置换活性。作为示例性的链置换DNA聚合酶选自phi29 DNA聚合酶、BsuDNA聚合酶和SauDNA聚合酶中的至少一种。
合适的聚合酶包括polI或polI片段或变体，诸如来自大肠杆菌(E. Coli)、枯草芽孢杆菌(Bacilus bubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacilus stearothermophilus)的那些或T7聚合酶。同样的可以使用诸如针对噬菌体T4描述的聚合酶全酶复合物。优选的聚合酶是klenow，exo-，T7聚合酶或BST phi29或枯草杆菌的pol-I或全酶。也可以选用BsuDNA聚合酶或SauDNA聚合酶。在一些实施方案尤其是使用下游元件或反向互补的情况下，优选的聚合酶不具有与大肠杆菌polI的Klenow片段一样的强链置换活性。在其他实施方案中，聚合酶的强链置换活性可能是优势。
当重组酶用于链插入步骤的情况下，所述系统可能要求能量来源。这些酶的大多数利用ATP作为能量来源，但是因为ATP整理(collate)酶活性必需的镁离子，因此有利的提供另外的ATP再生系统而不是提高ATP的浓度。ATP再生系统优选包含ATP以及ATP再生体系所用试剂。在一些实施方式中，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述链置换DNA聚合酶是适用于环介导等温扩增技术的链置换DNA聚合酶。适用于LAMP的链置换DNA聚合酶是本领域所公知的，常见的诸如EquiPhi29、BstDNA聚合酶、和BsmDNA 聚合酶。LAMP的反应体系还可以包含dNTP、Mg2+、甜菜碱等组分中的至少一种。
各种重组酶系统是本领域技术人员已知的，已经被广泛的综述过(例如Piero R.Bianco et al. Frontiers in Bioscience 3, d570-603, 1998, 570)。任意重组酶系统都可用于本公开的方法，用于核酸双链插入的重组酶的详细应用是本领域技术人员已知的(Kodadek T et. Al., JBC 264,1989;and Liu J, JBC Na Qian1, 281, 26308–26319,2006)。
重组酶系统可包括源自酵母、细菌噬菌体或哺乳动物或其他真核生物的成分。重组酶系统可以是嗜温或嗜热的。例如，重组酶可以源自肌病毒科噬菌体。肌病毒科噬菌体可以是，例如，T4、T2、T6、Rb69、Aehl、KVP40、不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rbl4、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌噬菌体nt-1、phi-1、Rbl6、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3、或噬菌体LZ2。在优选的实施方案中，可以使用T4重组酶UvsX。也可以使用真核生物的Rad系统或大肠杆菌的recA-Reco系统或其他原核系统。一般地，RPA的重组酶来源于T4噬菌体，例如Escherichia phage phT4A噬菌体；RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。
通常重组酶将按照5'-3'方向在单链寡核苷酸上聚合。如本公开所述的本公开涉及这类重组酶。但是，重组酶可以按照3'-5'方向聚合，这类重组酶也可用于本公开的方法。在这种情况下并参考所述成分的方向性，应用反向。
重组酶辅助蛋白可以包括在所述系统中，在一些实施方式中，所述重组酶系统包含能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(例如gp32)和重组酶加载剂(例如UvsY)。在优选的实施方案中，重组酶系统包括T4 gp32，UvsX和UvsY。其中所述重组酶加载剂用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行。
重组酶(例如UvsX)，以及重组酶加载剂(例如UvsY)和单链DNA结合蛋白(例如gp32)，可以各是来自相同或不同肌病毒科噬菌体来源的天然、杂合或突变的蛋白。天然蛋白可以是蛋白的野生型或天然变体。突变蛋白(也称为遗传改造的蛋白)是在N端、C端或内部(N端和C端之间)具有天然或人为的突变诸如插入、缺失、取代或其组合的天然蛋白。杂合蛋白（也称为嵌合蛋白）包括来自至少两种不同生物体的序列。例如，杂合UvsX蛋白可以包含来自一个物种(例如，T4)的氨基酸，但还包含来自另一个物种(例如，T6)的DNA结合环。杂合蛋白可以包含与天然蛋白相比提高的特性。所述提高的特性可以是增加的或更快的扩增速率，或降低的或更可控的扩增速率。
其他用于增强重组酶系统效率的成分也可以包含在本公开的试剂或试剂盒中，例如pH调节剂、dNTP、分子拥挤剂、DTT、DMSO、甜菜碱、脯氨酸、去污剂以及水中的一种或多种。
本公开使用的术语“分子拥挤剂”是指改变在溶液中的其他分子的性质的试剂或分子。分子拥挤剂的实例包括但不限于血清白蛋白（诸如BSA和/或HSA）、葡聚糖个聚乙二醇(PEG)中的至少一种。通常，所述分子拥挤剂具有高分子量或在包含其他分子的溶液中产生拥挤环境的大体积结构。所述分子拥挤剂减小在溶液中的其他分子可用的溶剂的体积，其造成分子拥挤。所述分子拥挤可改变反应的速率或平衡常数。在一个或多个实施方案中，在所述扩增反应中使用的分子拥挤剂选自血清白蛋白、PEG、菲可(Ficoll)、胶质、海藻糖及其组合。在一个实施方案中，所述分子拥挤剂包括各种分子量分布的BSA和/或PEG。在一个实施方案中，所述分子拥挤剂选自PEG 400、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000及其组合。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含等温扩增反应产物检测剂，以确定结核分枝杆菌的存在与否。
等温扩增反应产物的检测方法可以依赖或不依赖核酸的扩增。如本公开所用，术语“等温扩增反应产物检测剂”是指在本公开所提供的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2所示核酸的检测剂所产生的等温扩增产物的基础之上，进一步对扩增产物进行检测以增加结核分枝杆菌诊断的准确性、特异性和/或检测的便利性。
等温扩增反应产物检测剂可以基于确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法，包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、将DNA转录为RNA后进行检测、结构特异性裂解测定(例如，INVADER测定，(Hologic,Inc.)并且描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000),以及US 2009/0253142，其各自出于所有目的全文以引用的方式并入本公开)；酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其全文以引用的方式并入本公开)；以上所述的聚合酶链反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其全文以引用的方式并入本公开)；滚环式复制(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其全文以引用的方式并入本公开)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其全文以引用的方式并入本公开)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其全文以引用的方式并入本公开)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其全文以引用的方式并入本公开)；环状探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其全文以引用的方式并入本公开)；DadeBehring信号扩增方法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其全文以引用的方式并入本公开)；连接酶链反应(例如，BaranayProc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其全文以引用的方式并入本公开)；以及本公开所优选的CRISPR-Cas12检测系统。
在一些优选的实施方式中，所述等温扩增反应产物检测剂包括CRISPR-Cas检测系统、用于检测DNA双链的染料和/或辅助剂、用于与所述等温扩增反应产物杂交的荧光探针、pH显色试剂中的至少一种。
依据检测核酸分子类型，CRISPR/Cas技术核酸检测可分为DNA（CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas12识别DNA序列）和RNA（CRISPR/Cas13识别RNA序列）检测。进一步的，所述CRISPR-Cas包括以下中的一种或多种：CRISPR-Cas12检测系统、CRISPR-Cas13检测系统、以及具有与Cas12和/或Cas13的旁路切割活性类似的Cas检测系统。其中CRISPR-Cas12检测系统优选CRISPR-Cas12a检测系统，CRISPR-Cas13检测系统优选CRISPR-Cas13a检测系统。
用于检测DNA双链的染料和/或辅助剂是惯常与LAMP技术联用的组分。所述染料可选自SYBR Green I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的至少一种。所述辅助剂可选自甜菜碱、L-脯氨酸、DTT、DMSO、土温20、NP40中的至少一种。
试剂或试剂盒内的组分可以以溶液、固体或试纸条的形式被包装。在一些优选的实施方式中，所述试剂或试剂盒中的至少一种组分是固体，所述固体包括冻干微球、冻干饼、冻干粉、依赖于固体介质存在的斑点中的至少一种。因此，可以以冻干形式提供核酸扩增（以及优选的核酸检测）所需的组分，特别是各种酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分等。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始核酸扩增（以及优选的核酸检测）过程。
本公开还提供试剂盒，其为如上所述应用中所提及的试剂或试剂盒。
本公开的试剂盒包含检测剂，所述检测剂用于通过等温扩增反应检测生物样本中的核酸标志物，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示。特别的，包含核酸标志物的检测剂（引物和/或探针），以及等温扩增反应产物检测剂（特别是CRISPR-Cas检测系统）中的至少一项。
本公开中术语“试剂盒”可指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），其包括如本公开所述的检测剂。试剂盒可进一步包括在本公开中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
本公开还提供一种结核分枝杆菌诊断装置，其包括一个或多个独立模块，至少一个独立模块包含如上所述的试剂或试剂盒、或其组分。
其中，诊断装置中模块和试剂盒可以分别独立包装，或者试剂盒中的至少部分组分（引物、探针、反应缓冲液、酶等）预先填装于所述核酸检测装置中。所述核酸检测装置通常是利于核酸检测的，例如防止检测过程中造成污染、加快检测速度（例如同时检测多个样本）、利于检测过程中试剂盒中的组分的保存等，或者以其他方式提高检测的便利性和/或准确性。这些诊断装置的采用一般是本领域技术人员所惯用的，示例性的诊断装置包括CN202010571470.9、CN202021162806.8、CN202010769972.2、CN202021585862.2以及CN202210062076.1中所记载的装置的任意一项或多项。
在一些实施方式中，所述独立模块包括一个或多个容纳单元，所述容纳单元设置有核酸标志物扩增系统和/或检测系统。
在一些实施方式中，至少一个容纳单元包含所述试剂或试剂盒中的至少部分组分。
根据本公开的再一方面，还涉及一种检测样品中结核分枝杆菌的方法，其包括：
a) 从样品中获得分离的核酸；b) 使用等温扩增反应扩增所述核酸中潜在的核酸标志物；其中所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示；并c)检测所述核酸标志物的存在。
在一些实施方式中，所述等温扩增反应包括重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
在一些实施方式中，c)中检测的方法选自CRISPR-Cas法、荧光法、侧流免疫色谱法中的至少一种。
在一些实施方式中，步骤c)通过等温扩增反应产物检测剂进行检测。
在一些实施方式中，所述靶向核酸为环境样本或生物样本。
环境样本可以为来自公共场所或私人场所、室内或室外的样本（如空气、土壤、水等）。公共场所例如医院、学校、汽车站、火车站、航空站等场所。
在一些实施方式中，所述方法用于诊断结核分枝杆菌感染。
在一些实施方式中，核酸标志物、等温扩增反应、等温扩增反应产物检测剂中至少一项的含义如第一方面所描述。
下面将结合实施例对本公开的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本公开中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1 用于诊断结核分枝杆菌感染的新型分子标志物
IS6110是常用的结核分枝杆菌检测基因，本公开提供2个用于诊断结核分枝杆菌感染的新型分子标志物，分子标志物序列分别对应区段1、区段2所示：
区段1从IS6110基因的第544个碱基开始，延伸至第663个碱基，具体序列如下：
GCGATGGCGAACTCAAGGAGCACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCG（SEQ ID NO：1）
区段2从IS6110基因的第1090个碱基开始，延伸至第1270个碱基，具体序列如下：
AAGCTCCTATGACAATGCACTAGCCGAGACGATCAACGGCCTATACAAGACCGAGCTGATCAAACCCGGCAAGCCCTGGCGGTCCATCGAGGATGTCGAGTTGGCCACCGCGCGCTGGGTCGACTGGTTCAACCATCGCCGCCTCTACCAGTACTGCGGCGACGTCCCGCCGGTCGAACTC（SEQ ID NO：2）
作为比较，列出现有技术常用的IS6110的分子标志物为区段3、和区段4：
区段3见于圣湘生物的中国专利CN202311778526.8、CN201310009018.3记载。其为中区段，从IS6110基因的第665个碱基开始，延伸至第870个碱基，具体序列如下：
CGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCGTCCAGCGCCGCTTCGGACCACCAGCACCTAACCGGCTGTGGGTAGCAGACCTCACCTATGTGTCGACCTGGGCAGGGTTCGCCTACGTGGCCTTTGTCACCGACG（SEQ ID NO：3）
区段4见于赛沛文献(The New Xpert MTB/RIF Ultra: Improving Detection ofMycobacterium tuberculosis and Resistance to Rifampin in an Assay Suitablefor Point-of-Care Testing. mBio. 2017 Aug 29;8(4):e00812-17. doi: 10.1128/mBio.00812-17. PMID: 28851844; PMCID: PMC5574709.）中的检测区段。从IS6110基因的第1010个碱基开始，延伸至第1120个碱基，具体序列如下：
AGGGGATCTCAGTACACATCGATCCGGTTCAGCGAGCGGCTCGCCGAGGCAGGCATCCAACCGTCGGTCGGAGCGGTCGGAAGCTCCTATGACAATGCACTAGCCGAGACG（SEQ ID NO：4）
实施例2新型分子标志物诊断效果——基于PCR检测技术
本实施例采用PCR检测技术、基于不同的样本类型（血浆样本、舌拭子样本、痰液样本和肺泡灌洗液），进行本公开所提供的标志物与常见的现有标志物在结核分枝杆菌感染诊断效果的对比。
本实施例的实验流程及方法，具体如下文所示。
1.样本收集
1.1血浆收集：使用EDTA采血管采集全血，室温1小时内离心分离得到血浆。离心条件：1500g，10分钟，吸取上清，再次离心：12000g，离心10分钟，吸取上清，即为分离得到的血浆，样本量2mL。
1.2舌拭子样本收集：伸出舌头，并保持住，用拭子置于舌背处，沿脸颊按压并滚动拭子约10s（7-8次滚动收集），将拭子存放于保存管中。
1.3痰液样本收集：患者清晨起床后用清水反复漱口，以减少正常菌群的污染，用力自气管咳出第一口痰于无菌采样管内。痰液样量2mL。
1.4支气管肺泡灌洗术采集法：按操作规程，以支气管镜向局部肺泡内注入无菌生理盐
水，负压回收灌洗液于无菌采样管内。肺泡灌洗液样本量2mL 。
2.样本处理
2.1血浆/舌拭子/肺泡灌洗液/痰液样本处理：使用江苏为真核酸提取纯化试剂对样本进行提取。
3.核酸检测
（1）PCR引物探针
以下为针对各检测区段设计的检测引物、探针的详细信息如表1所示：
表1 不同检测引物、探针序列
（2）PCR反应体系
表2 PCR反应体系
（3）PCR反应程序
95℃ 5min预变性，95℃ 10 s，60℃ 30 s 50个循环，40℃ 20s。
4.临床样本检测
收集60例有临床诊断信息的肺结核患者/非肺结核患者，收集4种不同类型样本（血浆样本、舌拭子样本、痰液样本和肺泡灌洗液）。
5.不同区段的PCR检测结果
表3 不同检测区段的检测结果
表4 不同检测区段的PCR检测结果分析
根据表4的检测数据分析结果显示，IS6110在区段1和区段2的PCR检测效果与现有技术报告的区段3和区段4的PCR检测效果在不同样本类型上表现一致。
实施例3 新型分子标志物诊断效果——基于等温扩增+CRISPR检测技术
在本实施例中，基于等温扩增联合CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas13a检测技术，评估区段1-区段4的分析性能（采用质控品）和临床性能（采用临床样本）。
1. 前处理
质控品：国参S2-S4使用实施例2中2.1的提取试剂盒进行提取；
其中，国参是从中国食品药品检定研究院购买的结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品，此国参的【批准文号】（2010）国生参字 0042 号，批号：230030-202205，检测国参的最低检出量参考品。具体规格如下：
检测对象：结核分枝杆菌（CMCC 93009）单细胞悬液；
S2规格:100个菌/mL；
S3规格:10个菌/mL；
S4规格:1个菌/mL。
临床样本：收集各20例肺结核患者和非肺结核患者的痰液标本及舌拭子样本，样本提取使用实施例2中1.2-1.3操作步骤。
2. 标志物检测
4个区段分别依据引物设计和crRNA设计原则，每个区段分别采用10对RAA反应体系进行RAA和CRISPR荧光法和层析法检测。其中引物位置随机，以使得每组10对引物能够覆盖整个区段。
（1）反应体系
CRISPR检测体系如下表5-1和表5-2所示
表5-1 CRISPR-Cas12a检测体系
表5-2 CRISPR-Cas13a检测体系
CRISPR检测引物如下表5-3至表5-10所示
表5-3 CRISPR-Cas12a检测引物（区段1）
表5-4 CRISPR-Cas12a检测引物（区段2）
表5-5 CRISPR-Cas12a检测引物（区段3）
表5-6 CRISPR-Cas12a检测引物（区段4）
表5-7 CRISPR-Cas13a检测引物（区段1）
表5-8 CRISPR-Cas13a检测引物（区段2）
表5-9 CRISPR-Cas13a检测引物（区段3）
表5-10 CRISPR-Cas13a检测引物（区段4）
（2）反应程序：
将上述产物进行混匀离心后置于37℃水浴锅进行反应后，分别取50μL进行荧光CRISPR检测和消线法试纸条检测，试纸条和等温扩增试剂购买于上海良润。
3. 试验结果
表6 IS6110不同区段的RAA-CRISPR-Cas13a质控品和样本检测结果（层析法）
表7 IS6110不同区段的RAA-CRISPR-Cas12a质控品和样本检测结果（荧光法）
4.结果分析
表8 基于RAA-CRISPR层析法和荧光法的4个检测区段分析性能对比
根据TB-CRISPR-Cas12a荧光法和TB-CRISPR-Cas13a层析法检测结果显示，检测区段1和2在肺结核痰液和舌拭子样本中表现出较高的阳性检出率稳定在75%-95%，明显优于其他检测区段，具体详图1-图4。这表明检测区段1和区段2是等温扩增检测更优的标志物，具有更优异的检测性能和准确性。
实施例4新型分子标志物诊断效果--基于RAA荧光法技术
本实施例构建了基于RAA荧光法的IS6110检测体系，通过分别对实施例1中4个区段，每个区段依据引物设计原则，分别设计10个检测体系，进行体系性能测试。
1.试验方法
采集经过有临床确诊信息的肺结核痰液样本和舌拭子样本各25例，健康人舌拭子25例和非肺结核患者痰液25例。按照实施例2的方法进行样本的提取，采用RAA荧光法进行检测。
2.检测方法
（1）反应体系和引物序列
反应体系如表9-1所示
表9-1 RAA-荧光法反应体系
引物序列序列如表9-2至所示
表9-2 RAA-荧光法引物（区段1）
表9-3 RAA-荧光法引物（区段2）
表9-4 RAA-荧光法引物（区段3）
表9-5 RAA-荧光法引物（区段4）
（2）反应程序：42℃ 1min30个循环，最后4℃降温2min。
3.检测结果
检测结果如表10、图5-图6所示。根据图5-图6的检测结果可知，RAA荧光检测，在25例舌拭子和痰液样本中检测区段1和2检测效果均较优。
（1）4个检测区段分析性能对比
表10 基于RAA荧光法的4个检测区段分析性能对比
（2）4个检测区段临床性能对比结果如图5-图6所示。
实施例5新型分子标志物诊断效果——基于LAMP技术
本实施例构建了基于LAMP扩增的IS6110荧光法检测体系，具体过程如下所示。
1.LAMP扩增所需引物序列依据引物设计原则，分别进行4个不同区段的体系设计。
表11-1 LAMP反应引物（区段1）
表11-2 LAMP反应引物（区段2）
表11-3 LAMP反应引物（区段3）
表11-4 LAMP反应引物（区段4）
2.检测方法
（1）LAMP反应混合液按照表11-5所示配置。
表11-5 LAMP反应体系
（2）配置完成后置于：65°C反应30min。
3、检测结果
（1）LAMP荧光检测结果如表12和表13、图7-图8所示。
表12 LAMP荧光质控品和样本检测结果
表13 基于LAMP荧光法的4个检测区段分析性能对比
根据表12-表13和图7-图8的检测结果可知：LAMP扩增荧光检测区段1和检测区段2的检测效果较优检测国参灵敏度较优，在痰液和舌拭子样本中检测灵敏度≥87%，远远优于检测区段3和检测区段4。
以上在实施例2-5中，本公开发现在检测质控品以及检测配对痰液和舌拭子样本中，IS6110基因的检测区段1和检测区段2显示出明显更高的检测灵敏度，远优于传统技术所报道的检测区段3和4。这表明我们的检测方法在准确性和可靠性方面具有显著的优势，并为TB诊断提供了更为可靠的选择。
实施例6一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒（等温扩增-CRISPR）
1.新型分子标志物试剂盒
将新型分子标志物-区段1和区段2，按照实施例3构建的等温扩增、CRISPR检测体系，建立了一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒（CRISPR荧光法）；再结合一体化密封装置和冻干技术（CN 114058489 A/CN 116103377 B /CN 116496869 A），建立了一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒（CRISPR层析法）。
根据实施例3结果可知，区段1和区段2的10个体系中9个检测体系检测限均低至国参S4(1个菌/ml)、且临床痰液样本和舌拭子样本阳性检出率均≥75%，因此各区段随机选取体系制备成试剂盒与商业化进行对比。
2.研究方法
采集具有临床诊断结果的下述样本：
（1）20例肺结核患者和10例非肺结核患者的舌拭子样本，上述30例样本分别采用上述区段1（采用表5-3体系3）和区段2（采用表5-4体系5）构建的RAA-CRISPR荧光法检测试剂盒和区段1（采用表5-3体系1）和区段2（采用表5-4体系1）RAA-CRISPR层析法检测试剂盒、以及圣湘PCR商业化试剂盒（区段3）和赛沛GeneXpert商业化试剂盒（区段4）进行检测。
（2）20例肺结核患者和10例非肺结核患者的痰液样本采用上述区段1（采用表5-3体系5）和区段2（采用表5-4体系6）、10例肺结核患者的肺泡灌洗液样本采用上述区段1（采用表5-3体系7）和区段2（采用表5-4体系9）、10例肺结核患者的血浆样本采用上述区段1（采用表5-3体系10）和区段2（采用表5-4体系8）；上述50例样本分别采用区段1和区段2构建的不同RAA-CRISPR荧光法检测试剂盒、以及圣湘PCR商业化试剂盒（区段3）和赛沛GeneXpert商业化试剂盒（区段4）进行检测。
（3）本发明中，作为阳性对照的“临床诊断结果”是指医院结合患者症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况（通常包括a-e中的几个方面）综合考虑，综合以上几个方面的检查结果，结合患者的临床表现，所做出的准确的肺结核诊断结果。
具体诊断依据诸如：a.临床症状和体征：典型的症状包括持续咳嗽超过3周、咳痰、胸痛、咯血、发热、盗汗（特别是夜间）、体重减轻等。体征方面可能有肺部啰音、胸膜摩擦音等。b.放射学检查：胸部X线或者CT扫描显示的肺部病变，如结节、浸润影、空洞等，可以支持诊断。c.痰涂片和培养：痰涂片查找结核分枝杆菌酸快染色、Ziehl-Neelsen染色或者抗酸染色。痰培养则是将痰样本培养出结核分枝杆菌，是确诊结核病最可靠的方法之一。d.痰涂片和培养：痰涂片查找结核分枝杆菌酸快染色、Ziehl-Neelsen染色或者抗酸染色。痰培养则是将痰样本培养出结核分枝杆菌，是确诊结核病最可靠的方法之一。e.分子生物学检测：如PCR（聚合酶链反应）技术，可以快速检测结核分枝杆菌DNA，有助于更快速地进行确诊。
3.检测结果
表14 舌拭子样本检测结果
表15 痰液样本检测结果
表16 肺泡灌洗液样本检测结果
表17 血浆样本检测结果
1.检测结果分析
表18 舌拭子CRISPR层析法和荧光法检测试剂盒与商品化试剂盒检出率对比
表19 痰液/肺泡灌洗液/血浆中CRISPR荧光法检测试剂盒与商品化试剂盒检出率对比
根据表14-表19分析可知：本公开建立的基于TB-CRISPR检测区段1和2的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒（CRISPR免疫层析法、荧光法），其在舌拭子样本中的检测灵敏度为85%-95%，特异性达100%，明显优于市售检测试剂盒，同样结核分枝杆菌复合群检测试剂盒（CRISPR荧光法）在痰液样本/肺泡灌洗液/血浆中也是如此。
实施例7一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒（等温扩增荧光法）
1.试剂盒
将新型分子标志物-区段1和区段2，按照实施例4、5构建的RAA和LAMP荧光检测的10个检测体系中任一检测体系，建立了用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒。
其中，国参S4的RAA荧光检测区段1采用表9-2体系3，检测区段2采用表9-3体系5，舌拭子样本RAA荧光检测区段1采用表9-2体系4，检测区段2采用表9-3体系7；
痰液样本RAA荧光检测区段1采用表9-2体系7，检测区段2采用表9-3体系10；肺泡灌洗液样本和血浆样本RAA荧光检测区段1采用表9-2体系2，检测区段2采用表9-3体系8；
国参S4的LAMP荧光检测区段1采用表11-1体系5，检测区段2采用表11-2体系7，舌拭子样本LAMP荧光检测区段1采用表11-1体系3，检测区段2采用表11-2体系9；痰液样本LAMP荧光检测区段1采用表11-1体系8，检测区段2采用表11-2体系3；肺泡灌洗液样本和血浆样本LAMP荧光检测区段1采用表11-1体系9，检测区段2采用表11-2体系1；
2.研究方法
分析性能：检测质控品（国参S4和S4等比例稀释）。
采集具有临床诊断结果的下述样本：
（1）15例肺结核患者和15例非肺结核患者的舌拭子样本（2）15例肺结核患者和15例非肺结核患者的痰液样本（3）10例肺结核患者的肺泡灌洗液样本，（4）10例肺结核患者的血浆样本；上述80例样本分别采用上述区段1和区段2构建的荧光法检测试剂盒、以及圣湘PCR商业化试剂盒（区段3）和赛沛GeneXpert商业化试剂盒（区段4）进行检测。
3.检测结果分析
（1）分析性能
表20 国参S4检测结果
（2）临床性能
表21 舌拭子中RAA和LAMP荧光样本检测结果
表22 痰液样本中RAA和LAMP荧光样本检测结果
表23 肺泡灌洗液样本中RAA和LAMP荧光样本检测结果
表24 血浆样本中RAA和LAMP荧光样本检测结果
表25 RAA和LAMP荧光样本不同检测试剂盒灵敏度对比
根据表20-表25结果显示，基于RAA和LAMP荧光检测技术，我们对检测区段1和检测区段2进行了比较，检测国参S4和S4等比稀释后均可检出，并发现在舌拭子和痰液/肺泡灌洗液/血浆样本中，我们的检测方法显示出明显优于市售试剂盒的检测灵敏度。
具体的，结果显示本发明中的RAA和LAMP荧光法检测试剂盒在S4等比稀释后也能稳定检出0.5个菌/ml的参考品，而市售的试剂盒并不能达到这个标准，其灵敏度明显低于我们的试剂盒。在15例舌拭子样本中，我们的试剂盒的灵敏度达到了87%-93%，超过了市售的赛沛GeneXpert检测和圣湘PCR检测试剂盒，分别为67%和60%。在其他样本类型中也是一样，如痰液样本（93% VS 87% VS 80%）、肺泡灌洗液（80% VS 70% VS 70%）和血浆样本（70%-80% VS 60% VS 60%），我们的试剂盒都表现出更高的灵敏度和可靠性。这些结果表明，我们的试剂盒为结核病的早期诊断和治疗提供了强大的工具。
实施例8 采用其他等温扩增方法验证区段1和区段2的临床检测可用性
1.研究方法
将新型分子标志物-区段1和区段2，采用高灵敏的滚环扩增技术(HiRCA)、多重置换扩增(MDA）交叉引物扩增技术(CPA)）方法，依旧根据引物设计原则设计不同方法的检测体系，检测具有具有临床诊断结果的下述样本：
（1）20例肺结核患者和20例非肺结核患者的舌拭子样本（2）20例肺结核患者和20例非肺结核患者的痰液样本，样本提取使用实施例2中1.2-1.3操作步骤。
2. 检测结果分析
表26 区段1和2的不同检测方法（HiRCA/MDA/CPA法）临床样本检测性能汇总
根据表26可知，20例舌拭子和20例痰液样本中，区段1和2的不同检测方法（HiRCA/MDA/CPA法）检测灵敏度在85%-95%，特异性100%。我们的结果表明，在不同的等温扩增方法下，我们的检测区段1和2均表现出较高的检测灵敏度。这意味着无论采用哪种等温扩增方法，我们都能够高效地检测到目标物质，这为我们的实验提供了更可靠和稳定的基础。
实施例9 环境样本的检验
1.研究方法
本实验采用了实施例6、7和8中的检测试剂盒，用于检测不同环境样本。检测结果与医院的实验室检测结果进行了比对，以验证区段1和区段2所组成的检测试剂盒在检测环境样本中的有效性。
2.结果分析
表27 不同恒温检测方法检测环境样本结果汇总
根据表27结果表明，本实施例中的恒温检测方法的区段1和区段2 形成的检测试剂盒不仅适用于人源性拭子或痰液等体液样本的检测，还适用于不同环境样本中结核分枝杆菌的检测，因此其适用性更加广泛。
以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本公开的保护范围。因此，本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (17)

1.核酸标志物的检测剂在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒中的应用；
其中，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示，所述检测剂用于通过等温扩增反应检测生物样本中的所述核酸标志物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂包括靶向所述核酸标志物的引物和/或探针。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述等温扩增反应是重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒中包含链置换DNA聚合酶和/或重组酶系统。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包含等温扩增反应产物检测剂，以确定结核分枝杆菌的存在与否。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述等温扩增反应产物检测剂包括CRISPR-Cas检测系统、用于检测DNA双链的染料和/或辅助剂、用于与所述等温扩增反应产物杂交的荧光探针、pH显色试剂中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述CRISPR-Cas包括以下中的一种或多种：CRISPR-Cas12检测系统、CRISPR-Cas13检测系统、以及具有与Cas12和/或Cas13的旁路切割活性类似的Cas检测系统。
8.根据权利要求1-4、6、7任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒中的至少一种组分是固体，所述固体包括冻干微球、冻干饼、冻干粉、依赖于固体介质存在的斑点中的至少一种。
9.根据权利要求1-4、6、7任一项所述的应用，其特征在于，所述生物样本选自舌拭子、痰液、唾液、血清、血浆、血液、尿液、粘液、汗液、眼泪或其他眼部液体、耳部液体、水疱、疮、胃液、胃汁、肺泡灌洗液、粪便、胰液或汁、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、精液、乳汁、脊髓液、液体骨髓和淋巴液中的一种或多种。
10.试剂或试剂盒，其特征在于，其为权利要求1-9任意一项中所定义的试剂或试剂盒。
11.结核分枝杆菌诊断装置，其特征在于，所述诊断装置包括一个或多个独立模块，至少一个独立模块包含权利要求10所述的试剂或试剂盒、或其组分。
12.根据权利要求11所述的诊断装置，其特征在于，所述独立模块包括一个或多个容纳单元，所述容纳单元设置有核酸标志物扩增系统和/或检测系统。
13.根据权利要求12所述的诊断装置，其特征在于，至少一个容纳单元包含所述试剂或试剂盒中的至少部分组分。
14.一种检测样品中结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括：
a) 从样品中获得分离的核酸；b) 使用等温扩增反应扩增所述核酸中潜在的核酸标志物；其中所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示；并c)检测所述核酸标志物的存在。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应包括重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、滚环扩增技术、多重置换扩增、交叉引物扩增、重组酶介导扩增法、新型重组酶依赖型扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增中的一种或多种。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，c)中检测的方法选自CRISPR-Cas法、荧光法、侧流免疫色谱法中的至少一种。
17. 核酸标志物在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒的应用，其特征在于，所述核酸标志物的序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示。
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