CN106119395A - 炭疽、布病、结核三重pcr检测的引物对及试剂盒 - Google Patents

炭疽、布病、结核三重pcr检测的引物对及试剂盒 Download PDF

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郭慧琳
贺泂杰
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Abstract

本发明提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，为序列表中SEQ ID No.4‑9。本发明还提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的试剂盒。本发明建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。

Description

炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒
技术领域
本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(BruceUosis．简称布病)又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热。是由布鲁氏菌 (Brucella，简称布氏菌)侵入机体，引起传染变态反应的人畜共患传染病。布鲁氏菌感染后主要造成动物生殖系统的损害：在雌性动物中，导致流产，繁殖生育能力下降：在雄性动物中，导致睾丸炎和附睾炎．并常常发展为不育症。布鲁氏菌为兼性细胞内寄生菌，持续性感染是常见的。病原体通过生殖系统和乳腺分泌液排出体外。人是终末宿主。常表现为持续性感染，间歇性流感样症状，称为“波浪热”。临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。我国对布病的研究起步比较晚，20世纪50年代中期才开始对布病进行有计划有组织地调查研究。我国科技工作者经过几十年的努力，查清了布病在国内的分布，并且认识到布病在我国的严峻形势。
目前布病检测主要分为病原分离培养和血清学实验。细菌学操作复杂，首先要收集病料，制备特定及选择性培养基，然后进行接种培养，3d后才能鉴定结果，由于细菌学操作所需时间长，检测结果误差大。布鲁氏菌病的血清学诊断方法种类较多，现在我国常用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFI)等血清学方法，但这些血清学方法有的特异性和灵敏性不高，有的操作繁琐。RBPT方法主要用于初筛，由于其特异性不高，受试验温度和凝集时间相对较短的影响，不易准确判定结果，故对RBPT阳性者，还必须经SAT或CFI检测为阳性才能最终判定为阳性。SAT是我国布氏杆菌病诊断的法定方法，但是该法操作繁杂、费时，不适于现场采用。CFF由于条件要求高，基层兽医站难以采用。
结核分枝杆菌主要分为人型、 牛型、 禽型和非洲型，牛型分枝杆菌可以感染人，结核病牛是人类结核病的重要传染源。牛结核病是由抗酸、生长缓慢、非光产色的牛结核分枝杆菌引起的动物和人的一种慢性细菌性疾病。该病呈世界性分布，在很多国家仍然是牛和其它家畜以及某些野生动物的主要传染病，而且能够传播给人类，给人类带来健康问题。该病常常通过空气传播，也可以通过摄食污染的饲料、饮水等而经消化道感染后，形成结节状肉芽肿称为结核。特征性结核病变最常见于肺、咽喉、支气管、纵隔淋巴结，病变也常见于肠系膜淋巴结、肝、脾、浆膜及其它器官。在家畜中，牛最易感染结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛。世界动物卫生组织(OIE)将牛结核病列为B类动物疫病。
我国目前常用的诊断方法是结核菌素皮内变态反应（PPD）。该方法存在着极强的非特异性，PPD的质量和剂量、结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，这些不同因素均给基层的净化工作带来困难，而且在实际工作中，用于诊断牛结核病并不十分理想。
炭疽( anthrax ) 是由炭疽杆菌( bacil lus anthracis ) 所致的一种人畜共患传染病。兽类炭疽以急性、热性、败血性为主要发病特点, 以天然孔出血、血液呈煤焦油样凝固不良、皮下及浆膜下结缔组织出血性浸润、脾脏显著肿大为主要病变特征；而人炭疽则以皮肤疹疱、溃疡、坏死、焦痂和周围组织广泛水肿为主要临床表现特点。
炭疽的诊断分为细菌学检测和血清学检测，细菌学检测包括直接染色镜检和细菌分离，细菌学检测操作复杂，费时费力存在一定的生物安全风险。血清学检测有AsCOli 氏反应，用加热抽提待检炭疽菌体多糖抗原与已知抗体进行的沉淀试验，适用各种病料，方法简便，应用较广，但该反应的特异性不高，敏感性也较差。酶联免疫吸附试验(ELISA) 主要用于检验被检血清中的特异性抗毒素抗体。此法具有高度的特异性，快速，可重复性强；缺点是试验中需用相当多量的提纯抗原f一次试验约45 mg ，而且目前尚无商品诊断盒，因而只限在一些专门的实验室进行。
PCR(多聚酶联反应)技术是一项体外酶促扩增DNA新技术，具有特异性和敏感性高，操作简便，快速高效等特点，已广泛用于畜禽传染病和遗传病诊断，生物工程等方面。PCR技术已用于各种疫病的诊断及各种菌属和种的PCR特异性鉴定，它的发展方便了不宜培养且生长缓慢的细菌研究。用PCR技术可以特异地检测到很少量的病原菌，结果表明PCR的应用能够更准确的鉴别感染动物且可能取代常规检查法。
多重PCR是一种特殊PCR 形式,是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。可快速检测鉴别多种病原体,在临床多种病原体混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值,同时该方法快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好。
发明内容
本发明提供了炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒。本发明建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。
本发明提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，所述引物对包括：
（1）结核杆菌上游引物：5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3，
下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3；
（2）布病上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3，
下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3；
（3）炭疽上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3，
下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3。
（4）与（1）-（3）中任一引物互补的核苷酸序列。
本发明还提供炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对。
作为优选，在50μl反应体系中，所述引物对为6μl，每条引物各为1μl。
作为优选，所述试剂盒包括DNA模板，所述DNA模板为使用提取试剂对鼻拭子进行DNA提取后的提取产物。
作为优选，所述试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。
本发明还提供上述引物对在制备炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒中的应用。
本发明在采样时只用采集鼻腔棉拭子，相比于传统的采集发病动物血清和组织样本有较低的生物安全风险，能够较好的避免兽医工作人员感染上述人兽共患病。在检测时生物安全风险也较低，可以在生物安全2级实验室内完成，而相对的病原微生物的分离鉴定则需要在生物安全3级实验室内完成。
本发明建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为不同病原菌提取的DNA用本发明的引物进行PCR扩增后，反应产物电泳结果；
图2为本发明的引物的敏感性试验结果；
图3为本发明的引物的特异性试验结果；
图4为本发明的引物的临床验证试验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明根据GenBank中登录的炭疽杆菌、牛布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌的基因序列，按照引物设计原则要求和多重PCR的实际要求设计并合成引物。
1.设计并合成引物：
1）结核杆菌是根据插入片段IS6110设计的引物，引物序列为上游引物5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3单插入片段PCR产物长度为129bp，具体扩增序列如下：
tggtagaggcggcgatggttgaaccagtcgacccagcgcgcggtggccaactcgacatcctcgatggaccgccagggcttgccgggtttgatcagctcggtcttgtataggccgttgatcgtctcggct
2）布病是根据BM21基因设计的引物。引物序列为上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3单位PCR产物长度为255bp，具体扩增序列如下：
Ttacaaggaagcgggcgtgctgaaataatccctcaatgatcggttcctgatatcttattccgaattgaagggtgacattgcggcagctcgttatgcgcgctgctgcgctcccgttttccagagcggttccggttagaacggaatcgttggaaccgctctatctctttgtttttacgcattatccgacgcaaaaccgtttcacgcttttgctggaaatgctctagcctattgaaatgcacgaccggcaaagtggag
3）炭疽是根据炭疽杆菌质粒PXO1设计的引物。PCR产物长度为329bp。引物序列为：上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3，具体扩增序列如下：
Tagaaaggcggatagcggcggttaatcctagtgatccattagaaacgactaaaccggatatgacattaaaagaagcccttaaaatagcatttggatttaacgaaccgaatggaaacttacaatatcaagggaaagacataaccgaatttgattttaatttcgatcaacaaacatctcaaaatatcaagaatcagttagcggaattaaacgcaactaacatatatactgtattagataaaatcaaattaaatgcaaaaatgaatattttaataagagataaacgttttcattatgatagaaataacatagcagttggggcggatgagtca
2.PCR扩增
将上述引物放入同一扩增体系中实现三种疫病的多重PCR检测，体系组分如下：
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 6.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为上述3对引物，上下游引物各1μL（浓度为10μM）。
10×Multi Hotstart Buffer 包含200mM Tris-Cl(pH 9.0)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4。
DNA模板 为使用提取试剂对样品（如鼻拭子）进行DNA提取后的提取产物。
将放入模版后的反应体系放入PCR仪，反应条件如下：
PCR反应循环条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。反应完成后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测反应结果，产物-20℃保存。
通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，电泳结果在129pb出现条带时，该样品结核病核酸检测阳性。电泳结果在255pb出现条带时，该样品布病核酸检测阳性。电泳结果在329pb出现条带时，该样品炭疽病核酸检测阳性。
实施例1
本发明的检测方法分为提取、扩增和电泳三步骤
1、DNA模板的提取
提取可采用市面上的任何提取试剂盒，下面以生工生物的一管式口腔试子DNA抽提试剂盒为例。
（1）口腔试子取样后，室温放置10min，使表面液体挥发，然后放入1.5ml离心管中；
（2）加入200μL Qlysis-S Reagent 和20μL Proteinase K 室温放置2min，震荡混匀5min；
（3）将口腔试子上的溶液全部挤压留在1.5ml离心管中，弃掉口腔试子；
（4）室温放置5min，95℃水浴3min；
（5）水浴后向离心管中加入200μL Buffer NST ，震荡混匀；
（6）12000rpm室温离心5min；
（7）取上清液为模版直接用于PCR检测。
2、PCR扩增
扩增时按下述配置除DNA模板外的反应体系，并向体系中加入5μL DNA模版然后放入PCR仪扩增。
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 6.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为上述3对引物，上下游引物各1μL（浓度为10μM）。
反应条件为：
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火 20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。
取PCR反应产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测电泳结果在129pb出现条带时，该样品结核病核酸检测阳性。电泳结果在255pb出现条带时，该样品布病核酸检测阳性。电泳结果在329pb出现条带时，该样品炭疽病核酸检测阳性。
实施例2 本发明的检测方法的验证试验
1、DNA模板的提取
取灭活的结核杆菌、布病杆菌液和炭疽杆菌菌液各100μL，使用一管式口腔试子DNA抽提试剂盒提取阳性DNA，-70℃保存备用。具体如下：
（1）将上述100μL菌液放入1.5ml离心管中；
（2）加入200μL Qlysis-S Reagent 和20μL Proteinase K 室温放置2min，震荡混匀5min；
（3）将口腔试子上的溶液全部挤压留在1.5ml离心管中，弃掉口腔试子；
（4）室温放置5min，95℃水浴3min；
（5）水浴后向离心管中加入200μL Buffer NST ，震荡混匀；
（6）12000rpm室温离心5min；
取上清液为模版直接用于PCR检测。
2、单个引物扩增
扩增时按下述配置除DNA模板外的反应体系，并向体系中加入步骤1制备的5μL阳性菌液提取后的产物然后放入PCR仪扩增。
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 4.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为每种阳性菌液分别只放入针对该病的一对引物，上下游引物各2μL（浓度为10μM）。
反应条件为：
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火 20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。
3、电泳
取PCR反应产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测电泳结果。如图1所示：从左向右4个电泳通道分别加入的是结核阳性DNA扩增产物、布病阳性DNA扩增产物、2000pbMarker、炭疽阳性DNA扩增产物。
电泳结果显示结核阳性DNA扩增产物在129pb出现条带，布病阳性DNA扩增产物在255pb出现条带，炭疽阳性DNA扩增产物在329pb出现条带，与预期大小相当(见图1) , 将PCR产物纯化回收后,连接到pMD18-T载体中克隆、转化、测序, 序列分析表明，所克隆的目的DNA 片段大小为牛结核杆菌约129 bp，布鲁氏菌约255bp，炭疽杆菌约329bp，与参照的牛结核杆菌、布鲁氏菌和炭疽杆菌核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.2%和99.0%以上，证明PCR产物为预期扩增的目的 DNA 片段。
实施例3 本发明的检测方法的敏感性试验
首先用分光光度计测得标准阳性结核DNA的浓度为322ng/μL，布病DNA浓度为345 ng/μL，炭疽DNA浓度为313 ng/μL，再将其分别进行10倍倍比稀释，再进行PCR方法扩增，最后得到结果显示该方法的敏感性可达322fg/μL、345fg/μL和313fg/μL以下。具体方法如下：
PCR扩增
扩增时按下述配置除DNA模板外的反应体系，并向体系中加入5μLDNA模版然后放入PCR仪扩增。
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 6.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为上述3对引物，上下游引物各1μL（浓度为10μM）。
反应条件为：
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火 20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7 min。
取PCR反应产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测电泳结果，结果显示该方法的敏感性可达322fg/μL、345fg/μL和313fg/μL以下。
实施例4 本发明的检测方法的特异性试验
以结核DNA、布病DNA、炭疽DNA、沙门、巴氏以及链球菌混合作为模板进行PCR扩增，布病、结核、炭疽均能扩增出相应条带，其他未能检测到相应条带，证实了PCR扩增的特异性。具体方法如下：
1、提取
取灭活的结核杆菌、布病杆菌液、炭疽杆菌菌液、巴氏杆菌菌液、沙门杆菌菌液和链球菌菌液，随机2个或3个进行混合，然后使用一管式口腔试子DNA抽提试剂盒提取阳性DNA，-70℃保存备用。
（1）将上述混合好的菌液取100μL放入1.5ml离心管中；
（2）加入200μL Qlysis-S Reagent 和20μL Proteinase K 室温放置2min，震荡混匀5min；
（3）将口腔试子上的溶液全部挤压留在1.5ml离心管中，弃掉口腔试子；
（4）室温放置5min，95℃水浴3min；
（5）水浴后向离心管中加入200μL Buffer NST ，震荡混匀；
（6）12000rpm室温离心5min；
（7）取上清液为模版直接用于PCR检测。
2、单个引物扩增
扩增时按下述配置除DNA模板外的反应体系，并向体系中加入5μL阳性混合菌液提取后的产物然后放入PCR仪扩增。
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 4.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为每种阳性菌液分别只放入针对该病的一对引物，上下游引物各2μL（浓度为10μM）。
反应条件为：
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火 20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7 min。
3、电泳
取PCR反应产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测电泳结果。如图3所示：A代表结核杆菌；B代表布病杆菌；C代表沙门杆菌；D代表巴氏杆菌；E代表链球菌；F代表炭疽杆菌。ABF表示结核、布病和炭疽3种菌液混合，CD表示沙门杆菌和巴氏杆菌2种菌液混合，以此类推。结果显示布病结核炭疽均能扩增出相应条带，其他未能检测到相应条带，证实了本发明PCR扩增的特异性。
实施例5 本发明的检测方法的临床验证试验
对甘肃某流产率异常偏高的牛场随机采样18份鼻腔试子，和5份PPD检测和γ-干扰素ELISA检测均为阳性牛的鼻腔试子进行PCR检测。
1、DNA模板的提取
提取可采用市面上的任何提取试剂盒，下面以生工生物的一管式口腔试子DNA抽提试剂盒为例。
（1）鼻腔腔试子取样后，室温放置10min，使表面液体挥发，然后放入1.5ml离心管中；
（2）加入200μL Qlysis-S Reagent 和20μL Proteinase K 室温放置2min，震荡混匀5min；
（3）将口腔试子上的溶液全部挤压留在1.5ml离心管中，弃掉口腔试子；
（4）室温放置5min，95℃水浴3min；
（5）水浴后向离心管中加入200μL Buffer NST ，震荡混匀；
（6）12000rpm室温离心5min；
（7）取上清液为模版直接用于PCR检测。
2、PCR扩增
扩增时按下述配置除DNA模板外的反应体系，并向体系中加入5μL DNA模版然后放入PCR仪扩增。
DNA模板 5.0μL
引物混合液（10μM） 6.0μL
10×Multi Hotstart Buffer 5.0μL
Super Pure dNtps(2mM each) 12.5μL
Multi Hotstart DNA Polymerase 1μL
ddH2O 补足至50μL。
引物混合液成分为上述3对引物，上下游引物各1μL（浓度为10μM）。
反应条件为：
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火 20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7 min。
取PCR反应产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测电泳结果。如图4所示：共25个电泳通道从左到右分别是2000pbMarker、阳性对照、流产率高牛场鼻腔试子样品1-18号、PPD检测阳性牛1-5号。结果显示：流产率异常偏高牛场18份样品种2份样品布病核酸检测阳性，5份PPD检测和γ-干扰素ELISA检测均为阳性牛4份结核病核酸检测阳性，其中有一份布病核酸检测也是阳性。
对比试验：用现有的世纪元亨公司生产的布病PCR试剂盒对上述18例进行试验，检验本发明方法的准确性，试验结果与上述结果完全相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃省动物疫病预防控制中心
<120> 炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggtagaggc ggcgatggtt gaaccagtcg acccagcgcg cggtggccaa ctcgacatcc 60
tcgatggacc gccagggctt gccgggtttg atcagctcgg tcttgtatag gccgttgatc 120
gtctcggct 129
<210> 2
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttacaaggaa gcgggcgtgc tgaaataatc cctcaatgat cggttcctga tatcttattc 60
cgaattgaag ggtgacattg cggcagctcg ttatgcgcgc tgctgcgctc ccgttttcca 120
gagcggttcc ggttagaacg gaatcgttgg aaccgctcta tctctttgtt tttacgcatt 180
atccgacgca aaaccgtttc acgcttttgc tggaaatgct ctagcctatt gaaatgcacg 240
accggcaaag tggag 255
<210> 3
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagaaaggcg gatagcggcg gttaatccta gtgatccatt agaaacgact aaaccggata 60
tgacattaaa agaagccctt aaaatagcat ttggatttaa cgaaccgaat ggaaacttac 120
aatatcaagg gaaagacata accgaatttg attttaattt cgatcaacaa acatctcaaa 180
atatcaagaa tcagttagcg gaattaaacg caactaacat atatactgta ttagataaaa 240
tcaaattaaa tgcaaaaatg aatattttaa taagagataa acgttttcat tatgatagaa 300
ataacatagc agttggggcg gatgagtca 329
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggtagaggc ggcgatggtt ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agccgagacg atcaacggcc ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttacaaggaa gcgggcgtgc tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctccactttg ccggtcgtgc at 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagaaaggcg gatagcggcg gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgactcatcc gccccaactg ct 22

Claims (6)

1.炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，其特征在于：所述引物对包括：
（1）结核杆菌上游引物：5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3，
下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3；
（2）布病上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3，
下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3；
（3）炭疽上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3，
下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3；
（4）与（1）-（3）中任一引物互补的核苷酸序列。
2.炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：在50μl反应体系中，所述引物对为6μl，每条引物各为1μl。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括DNA模板，所述DNA模板为使用提取试剂对鼻拭子进行DNA提取后的提取产物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。
6.权利要求1所述的引物对在制备炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒中的应用。
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