CN1184327C - 厌氧菌的一种快速检测方法 - Google Patents

Abstract

厌氧菌的一种快速检测方法，涉及一种厌氧菌感染的诊断方法。其具体步骤为：标本的预处理，标本的固相微萃取(SPME)，气相色谱分析，由检测出的厌氧菌代谢产生的挥发性短链脂肪酸成分峰，诊断出厌氧菌的存在。采用本发明，标本采集无特殊要求，标本保送无特殊条件要求及时间限制，不需培养，可以快速检测出患者是否感染有厌氧菌，检测时间仅需30～40分钟。本发明不受正常寄居菌的影响，检测阳性率高，检测可靠。不仅可用于厌氧菌的检测，而且可用于病情监测，对厌氧菌感染性疾病的诊治有很高价值。

Description

厌氧菌的一种快速检测方法

技术领域  本发明涉及一种厌氧菌的检测方法，具体地为用常规采样，不经培养，可直接快速检测的方法。

背景技术  厌氧菌是一类只能在无氧或低氧分压、低氧化还原电位(Eh)、含有一定CO₂环境中才能生长的细菌，它只能从无氧酵解中获得能量。厌氧菌的种类十分复杂，有30多个属、数百种，随厌氧培养、分离、鉴定技术的快速发展，还在不断发现新种。临床上感染致病常见的厌氧菌有10个属30多种。

厌氧菌作为正常菌群广泛存在于人体皮肤深部和腔道深部黏膜表面。口、咽腔和肠道是人体内最大的厌氧菌的“储菌库”，是由于各种原因引起的菌群失调、机体免疫功能下降或细菌易位导致感染，它是一种十分常见的条件致病菌。临床标本的厌氧菌分离率国外报告为51～78％，国内为30～67％。所以，不做厌氧菌诊断几乎将遗漏掉50％以上的病原菌。很多厌氧菌对临床常用抗菌药物(如磺胺类、氨基糖甙类、大环内酯类、喹诺酮类和许多头孢类药物)不敏感。所以，不做厌氧菌诊断将导致病情延误和药物浪费。

目前厌氧菌感染的诊断方法包括有以下几种——

1、细菌学诊断

是一经典方法。它的诊断步骤应包括三级——(1)临床标本原代厌氧培养+G⁺染色厌氧菌初步诊断；(2)分离厌氧培养+G⁺染色+某些生化实验；(3)分离厌氧培养+特殊生化实验和气-液相色谱对其终末代谢产物进行分析。临床检测基本上停留于一级。为了保证诊断可靠性，下述每一个环节都应充分保障：

(1)标本的采集：凡可能被正常菌群污染的标本，，如咳痰、纤支镜吸出的痰、一般纤支镜细胞刷取的分泌物、支气管-肺灌洗液、流出的脓、鼻-口-咽-肛-阴道-窦道拭子、中段尿或导尿、胃-肠内容物等，均无送检价值，即90％以上的临床常规采样标本不能用来进行厌氧菌的细菌学诊断。以临床最为常见的下呼吸道厌氧菌感染为例，要求标本采用肺穿刺、环甲膜穿刺、带特殊保护套的纤支镜细胞刷取的分泌物或气管切开抽取物作标本，这不仅对患者带来痛苦、风险，而且还需要一定的设施条件，故不可能广泛普及开展。

(2)标本保送：标本采集后应尽量不接触空气。因在空气中暴露可能引起兼性厌氧菌过度生长或标本干燥，而影响厌氧菌的生存，甚至造成死亡。通常采用方法为：或注射器抽取后针头橡皮封堵，在20～30min内送检；或立即穿刺注入特制的密封的，预先充满纯N₂的无氧密封小瓶中，组织标本置入特制的厌氧袋或罐在1～2h内送检；或床边立即接种。这不仅需要特殊装置，而且稍有不慎即将会出现假阴性，临床上难以达到要求。

(3)厌氧培养：采用低氧化还原电位培养基(要求新鲜配制)和严格无氧环境(70％N₂+20％CO₂+10％H₂)。经常采用的是“厌氧罐”、“生物(厌氧袋)袋”、“厌氧室或厌氧手套箱”，即需要特殊的装置。原代培养至少2～3天，排除诊断则需2周。诊断周期长，易贻误病的治疗。

从上述可知，对于绝大多数厌氧菌感染的诊断无论从标本采样、标本保送及厌氧培养都相当不易，所以，国内大多数医院都没有将其列为常规检测。

2、免疫学检查

荧光抗体染色法、酶联免疫组化法等都已成功应用于厌氧菌感染的诊断，其与细菌学诊断符合率很高。但它们专属性高，不同的厌氧菌要求不同的诊断盒，厌氧菌的科、属、种如此之多，给配制带来一定难度，故临床实用价值不大。

3、厌氧菌的分子生物学诊断

DNA探针、基因扩增(PCR)技术也用于厌氧菌诊断研究。与免疫学检测原因相同，其临床实用价值不大。

4、厌氧菌特殊代谢产物检测

厌氧菌代谢产生多种挥发或不挥发性短链脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、乳酸、琥珀酸等。不同属、种的厌氧菌产酸谱不同，以前主要用于厌氧菌属、种鉴定。少数需氧菌也可产生乙酸、丙酸和乳酸，但不产生其他短链脂肪酸，特别是丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、琥珀酸。上述短链脂肪酸可以直接或衍生化后进行气相色谱(GC)分析诊断。采用气相色谱分析方法：对量大的标本(如胸-腹水、胆总管引流液等)直接采用有机溶剂(如乙醚、氯仿)反复萃取并浓缩后，或进一步衍生化处理(如甲酯化)后进行气相色谱分析；对量小的标本(如支气管-肺分泌物、抽取的少量脓液等)先行短程(1～3天)厌氧培养，然后将培养基采用有机溶剂反复萃取、浓缩并进一步衍生化处理(如甲酯化)后，再进行气相色谱分析，若分析出有相当浓度的多种短链脂肪酸，特别是异丁酸、戊酸、异戊酸、琥珀酸，即可判断其为厌氧菌感染。由于这方法(1)标本前采用处理采用有机溶剂反复萃取、浓缩并进行衍生化处理，故仍嫌烦琐，而且因采用了大量有机溶剂萃取、浓缩会造成污染环境；(2)采用定量诊断标准，可是有机溶剂萃取、浓缩过程中短链脂肪酸亦将随溶剂一起挥发，从定量的角度看，它的回收率不符合要求，重复性差；(3)临床绝大多数标本是小量的，仍需预先厌氧培养。鉴于上述原因，其临床应用价值不大，所以并未真正用于临床。

20世纪90年代发展起来的固相微萃取(SPME)技术远比液相萃取法简便、快捷、选择性好、萃取效率高，并且无污染。SPME+色谱分析技术已广泛应用于环境、食品、海关毒品和少数药品的监测，迄今尚无临床应用报告。

发明内容  本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种对标本无任何要求，用常规采样，不经培养，可通过厌氧菌代谢产生的多种特征性挥发性短链脂肪酸的存在，快速检测出厌氧菌的检测方法。

本发明的目的的实现方式为，厌氧菌的一种快速检测方法，其具体步骤为：

1)标本的预处理：

(1)液体标本直接加饱和氯化钠成饱和溶液后盐析，

(2)痰、脓粘稠标本，加浓度为2～10％盐酸+次氯酸或酶震荡消化数分钟，充分溶解后，再加饱和氯化钠盐析，盐酸∶次氯酸＝1∶2～6，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶，

(3)组织块固体标本，先剪碎研磨成匀浆，再加2～10％盐酸+次氯酸或酶震荡消化成溶液，后加饱和氯化钠盐析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶，

2)标本的固相微萃取：萃取针头采用有聚乙烯乙二醇/二乙烯苯、聚乙烯乙二醇/阴离子树脂或聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯复合涂层的针头，萃取方式采用密封瓶离取样液面1公分左右顶空萃取法，萃取1分钟以上，或液中萃取5分钟以上，

3)相色谱分析：

色谱柱——弹性石英毛细管色谱柱或填充柱，固定相为聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应物，简称FFAP，

载气——N₂，

检测器——氢火焰检测器或热导池类检测器，

汽化室温度——200～250℃，

脱附时间——5～10以上秒，

柱温——90～150℃下恒温，为理想分离各成分峰，或在60～220℃分二阶或多阶程序升温，

灵敏度——10^2～3mV.mL/mg，输出衰减倍数1/1～8，

4)检测：采用定性检测，以明确、清晰检出以下成分峰为阳性，即有厌氧菌，

(1)明确、清晰检出有异丁酸、戊酸、异戊酸峰中之一者，

(2)明确、清晰检出有乙酸、丙酸及另外一种短链脂肪酸峰中之一者，

(3)明确、清晰检出有二种非异丁酸、戊酸、异戊酸、乙酸、丙酸的短链脂肪峰者。

本发明的萃取采用图1中所示的固相萃取装置，图中1为萃取头，2为手柄。采用顶空萃取时，为提高阳性率，宜在超声震荡、加温或搅拌下进行。

由于正常寄居与感染灶的厌氧菌密度及繁殖-代谢率有很大差异，口-咽腔-皮肤表面正常寄居的厌氧菌密度及繁殖-代谢率低，正常产生的短链脂肪酸量远远低于感染灶，本发明选择国产气相色谱仪SP-520型或其他型号的国产、进口气相色谱仪，其灵敏度足以在测出临床各种标本中的各种短链脂肪酸时不受正常菌群污染的的影响，所以，临床感染标本的固相微萃取+气相色谱分析SPME+GC检测，不必忧虑正常寄居菌群的污染，又由于SPME+GC检测的是厌氧菌代谢产物而非活菌，所以采用本发明，对标本采集无特殊要求，标本保送无特殊条件要求及时间限制，不需培养。

采用本发明方法对含有10^-5的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、异己酸、庚酸的混合标准短链脂肪酸溶液进行检测，采用顶空超声震荡下萃取1分钟，脱附10秒，60～200℃二阶程序升温，大口径弹性石英毛细管FFAP色谱柱，检测结果(见图2)，图中的A、P、IB、B、IV、V、C、IC、E峰即为上述各短链脂肪酸的峰，可见本发明确实能检测出厌氧菌代谢产生的挥发性短链脂肪酸。

用上述同样的方法对临床常见的需氧菌，金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、链球菌、奈瑟氏菌、李斯特杆菌、志贺氏痢疾杆菌、沙门氏菌、埃希氏痢疾杆菌、枸橼酸杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、产碱杆菌、不动杆菌、摩根氏菌、嗜血流感杆菌、铜绿假单胞杆菌、莫拉氏菌、放线菌、诺卡氏菌等19属47种52株；临床常见的厌氧菌，有类杆菌、普氏菌、梭杆菌、韦荣氏菌、消化链球菌、消化球菌、优杆菌、梭状芽孢杆菌、纤毛菌、放线菌10属23种的标准菌株的培养液进行检测。结果显示：需氧菌培养液中仅金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单苞杆菌、普通变形杆菌、枯草杆菌、放线菌、摩根氏杆菌的培养液可以检出微量的乙酸及丙酸(见图4)，全部需氧菌培养液均未检出除乙酸、丙酸外的其他挥发性短链脂肪酸；而全部厌氧菌的培养液中均清晰、明确检出有多种挥发性短链脂肪酸，特别是异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸等(见图3)。检测结果与权威的“厌氧菌实验手册”(VPI)基本一致(见表1)。

表1 临床常见的厌氧菌标准菌株培养液中短链脂肪酸的GC分析结果

标准菌株             乙醚萃取/GC     SPME/GC           VPI

脆弱类杆菌           A、p、ib、iv    A、p、ib、iv      A、p、ib、iv

口腔类杆菌           A、p、iv        A、p、ib、iv      A、p、iv

产黑梭杆菌           A、p、iv        A、p、B、IV       A、p、IV

普通类杆菌           p               A、p、IV          A、p、IB、IV

产气梭杆菌           A、B            A、B、IV          A、IV

消化链球菌           A、P、iv        A、P、IB、iv      a、p、ib、b、iv、ic

厌氧球菌             a、B            A、ib、B、        A、ib、b

韦荣氏球菌           A、p、iv        A、p、IV          a、p、iv

多形类杆菌           p、iv           A、p、IV          A、p、ib、iv

肉毒杆菌             A、P、b         A、P、B、IV       A、ib、P、IV

破伤风杆菌           A、p、b         A、P、B           A、P、B

注：A-乙酸、P-丙酸、IB-异丁酸、B-丁酸、IV-异戊酸、V-戊酸、C-己酸、IC-异己酸、E-庚酸；小写字母表示为微量成分。

由上可见需氧菌对本发明无影响。

采用本发明方法对临床220例下呼吸道感染住院患者(老年患者155例；中青年患者65例)采集的晨痰进行了检测，其中108例老年患者、28例中青年患者检测有厌氧菌，其厌氧菌感染率分别为69.68％和43.08％，与文献报告相似，但它的检测时间仅需30～40分钟。对其中80例患者的晨痰、嗽口水同步进行厌氧培养、溶剂萃取+色谱GC、气相色谱SPME/GC检测，结果——痰培养的阳性率100％、嗽口水培养的阳性率97.5％(见图5)；痰的溶剂萃取+GC阳性率18.75％；痰的SPME/GC检测阳性率63.75％，嗽口水的检测阳性率为0％(见表2)。

表2 80例下呼吸道感染患者同步进行 痰和嗽口水 厌氧菌培养、乙醚萃取/GC、SPME/GC检测结果

检测方法	咳痰标本例数	含嗽水
			阳性  阴性  阳性率	阳性  阴性  阳性率
	厌氧培养	80    0     100％			78    2     97.5％
乙醚萃取/GC			15    65    18.75％	0     80    0％
	SPME/GC	51    29    63.75％			0     80    0％

这表明，普通采集的痰厌氧培养存在很高的假阳性率，故不能用于厌氧菌检测；痰的直接溶剂萃取+GC阳性率太低，此法也不能用于厌氧菌检测；痰的SPME/GC检测阳性率高，并不受正常寄居菌的影响，由此可见本发明检测价值高。

采用本发明方法对临床20例用广谱强效抗生素治疗效果差的下呼吸道感染住院患者，对采集的晨痰进行了检测，17例检出合并有厌氧菌(见图6)，患者加用替硝唑治疗后病情显著缓解，SPME/GC监测表明检出的短链脂肪酸的种类及峰面积随病情缓解而减少(小)，甚至消失(见图7)。这不仅表明本发明检测可靠，而且可用于病情监测，对厌氧菌感染性疾病的诊治有很高价值。

采用本发明方法对其他怀疑有厌氧菌的标本，包括感染性腹水、胸水、胆总管引流液、阑尾炎穿孔的脓、瘘管的脓、脓肿抽出的脓、烧伤感染的脓液、尿液等进行了检测，也均可成功检出。

采用本发明，标本采集无特殊要求，标本保送无特殊条件要求及时间限制，不需培养，能快检测出速患者是否感染有厌氧菌，检测时间仅需30～40分钟。本发明不受正常寄居菌的影响，检测阳性率高，检测可靠。不仅可用于厌氧菌的检测，而且可用于病情监测。

附图说明

图1  固相萃取装置结构示意图

图2  混合标准短链脂肪酸溶液色谱图

图3  厌氧菌标准菌株色谱图

图4  需氧菌标准菌株色谱图

图5  同一厌氧菌感染患者的嗽口水色谱图

图6  同一厌氧菌感染患者晨咳痰的色谱图

图7  同一厌氧菌感染患者经抗厌氧菌治疗后的晨咳痰的色谱图

Claims (2)

1、厌氧菌的一种快速检测方法，其特征在于其具体步骤为：

1)标本的预处理：

(1)液体标本直接加饱和氯化钠成饱和溶液后盐析，

(2)痰、脓粘稠标本，加浓度为2～10％的盐酸+次氯酸或酶震荡消化数分钟，充分溶解后，再加饱和氯化钠盐析，盐酸∶次氯酸＝1∶2～6，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶，

(3)组织块固体标本，先剪碎研磨成匀浆，再加2～10％盐酸+次氯酸或酶震荡消化成溶液，后加饱和氯化钠盐析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶，

2)标本的固相微萃取：萃取针头采用有聚乙烯乙二醇/二乙烯苯、聚乙烯乙二醇/阴离子树脂或聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯复合涂层的针头，萃取方式采用密封瓶离取样液面1公分左右顶空萃取法，萃取1分钟以上，或液中萃取5分钟以上，

3)相色谱分析：

色谱柱——弹性石英毛细管色谱柱或填充柱，固定相为聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应物，简称FFAP，

载气——N₂，

检测器——氢火焰检测器或热导池类检测器，

汽化室温度——200～250℃，

脱附时间——5～10以上秒，

柱温——90～150℃下恒温，为理想分离各成分峰，或在60～220℃分二阶或多阶程序升温，

灵敏度——10^2～3mV.mL/mg，输出衰减倍数1/1～8，

4)检测：采用定性检测，以明确、清晰检出以下成分峰为阳性，即有厌氧菌

(1)明确、清晰检出有异丁酸、戊酸、异戊酸峰中之一者，

(2)明确、清晰检出有乙酸、丙酸及另外一种短链脂肪酸峰中之一者，

(3)明确、清晰检出有二种非异丁酸、戊酸、异戊酸、乙酸、丙酸的短链脂肪峰者。

2、根据权利要求1所述的厌氧菌的一种快速检测方法，其特征在于顶空萃取在超声震荡、加温或搅拌下进行。

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