CN118326059A - 用于确定大肠杆菌dna含量的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本说明书实施例提供了一种用于确定大肠杆菌DNA含量的试剂盒及方法。所述试剂盒可以包括：如SEQ ID NO:1所示的探针；如SEQ ID NO:2所示的正向引物；如SEQ ID NO:3所示的反向引物；以及数字PCR检测试剂。所述方法包括使用所述试剂盒按照预设扩增程序，对所述样本中提取到的DNA进行扩增，并基于扩增结果确定所述样本中的大肠杆菌的DNA含量，其中，所述预设扩增程序包括退火步骤，所述退火步骤中退火温度为57℃‑59℃。
Description
交叉引用
本发明要求2023年1月12日提交的申请号为202310041915.6的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于确定大肠杆菌DNA含量的试剂盒及方法。
背景技术
生物制品是指应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的生物活性制剂，包括疫苗、抗原抗体、细胞因子、酶等。随着生物医药技术的飞速发展，生物制品在医疗健康等领域发挥越来越重要的作用。生物制品中影响较大的污染物之一为DNA杂质。DNA杂质多来源于宿主细胞或者微生物污染。存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能对生物制品的各种应用产生较大的影响。因此，本领域对生物制品的质量及其中存在的DNA的含量检测提出了更高的要求，尤其是低浓度的DNA残留检测。其中，大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)是自然界中的一种常见微生物，其经常被用作生物工程中的重要工具，如作为宿主细胞。大肠杆菌DNA也是生物制品中一种常见的杂质。因此，期望提供一种用于检测大肠杆菌DNA的具有高灵敏度和准确度的试剂盒及方法。
发明内容
根据本说明书的一个方面，通过一个或多个实施例提供了一种用于确定样本中大肠杆菌DNA含量的试剂盒。所述试剂盒包括：如SEQ ID NO:1所示的探针；如SEQ ID NO:2所示的正向引物；如SEQ ID NO:3所示的反向引物；以及数字PCR检测试剂。
根据本说明书的一个方面，通过一个或多个实施例提供了一种确定样本中大肠杆菌DNA含量的方法。所述方法包括：使用如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，通过数字PCR技术，按照预设扩增程序，对所述样本中提取到的DNA进行扩增；以及基于扩增结果，确定所述样本中的大肠杆菌的DNA含量。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1A示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和100nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1B示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和200nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1C示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和250nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1D示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和300nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1E示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和400nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1F示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和500nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1G示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和600nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图1H示出了根据本说明书一些实施例中使用浓度为900nM的引物和700nM探针的情况下的荧光信号检测结果；
图2A示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为57℃时的荧光信号检测结果；
图2B示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为58℃时的荧光信号检测结果；
图2C示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为59℃时的荧光信号检测结果；
图2D示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为60℃时的荧光信号检测结果；
图2E示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为61℃时的荧光信号检测结果；
图2F示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为62℃时的荧光信号检测结果；
图3A示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.002ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为58℃时的荧光信号检测结果；
图3B示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.002ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为59℃时的荧光信号检测结果；
图4A示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.01ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为58℃时的荧光信号检测结果；
图4B示出了根据本说明书一些实施例中当投入0.01ng大肠杆菌国家标准品进行PCR并且退火温度设置为59℃时的荧光信号检测结果；
图5A-5B示出了根据本说明书一些实施例中超纯水样本经数字PCR反应后的荧光信号检测结果；
图5C-5D示出了根据本说明书一些实施例中含有藤黄微球菌的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果；
图5E-5F示出了根据本说明书一些实施例中含有腐生葡萄球菌的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果；
图5G-5H示出了根据本说明书一些实施例中含有大肠杆菌的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果；
图6A示出了根据本说明书一些实施例中当样本中大肠杆菌的浓度为1×104拷贝数/μL时的荧光信号检测结果；
图6B示出了根据本说明书一些实施例中当样本中大肠杆菌的浓度为1×103拷贝数/μL时的荧光信号检测结果；
图6C示出了根据本说明书一些实施例中当样本中大肠杆菌的浓度为1×102拷贝数/μL时的荧光信号检测结果；
图6D示出了根据本说明书一些实施例中当样本中大肠杆菌的浓度为1×101拷贝数/μL时的荧光信号检测结果；
图7为根据本说明书一些实施例所示的含有大肠杆菌DH5α的DNA的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
应当理解，本文使用的“装置”、“单元”是用于区分不同级别的不同组件、元件或部分的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换该词语。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法也可能包含其它的步骤或元素。
术语“约”和“左右”可描述在某个值的一定取值范围内，例如加上或减去该值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％等。例如，术语“约10mL”可以包括9mL至11mL。
本说明书基于数字PCR(digital polymerase chain reaction)平台，提供了用于大肠杆菌基因组DNA含量分析的试剂盒及方法，研究结果为生物制品DNA检测，尤其是DNA残留检测提供了新方法，为生物制品质量和安全提供了更好的技术支撑。仅作为示例，本发明所提供的用于确定样本中大肠杆菌含量的试剂盒和方法可以在数字PCR平台上实现，例如QuantStudio 3D数字PCR平台。
本说明书的一方面提供了一种用于确定样本中大肠杆菌DNA含量的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒是专用于数字PCR技术的试剂盒。所述大肠杆菌DNA可以指大肠杆菌基因组DNA。
在一些实施例中，所述试剂盒包括：序列为CGGTGCTGCGACGGCGGAGT(SEQ ID NO:1)的探针；序列为GAAAGTAACACCAGCGTGCG(SEQ ID NO:2)的正向引物；序列为CCAATGCATTAACGCTGGCA(SEQ ID NO:3)的反向引物；以及数字PCR检测试剂。例如，所述数字PCR检测试剂可以包括数字PCR预混液。所述试剂盒还可以包括一些其他组件，例如用于进行数字PCR的芯片、芯片盖、刷头、封油等。
在一些实施例中，所述正向引物、反向引物与探针的终浓度比例为9:9:(1-7)。
在一些实施例中，所述正向引物与反向引物的终浓度均为900nmol/L(nM)，所述探针的终浓度为100nM-700nM。
在一些实施例中，所述探针中有荧光标记。所述荧光标记可以是采用各种常见的荧光染料制备的，如FAM、HEX、VIC等。
下表1示出了示例性的用于确定样本中大肠杆菌DNA含量所用到的仪器及试剂盒：
表1仪器及试剂盒的主要组成
其中，所述上游引物、下游引物和探针在整个反应体系中的终浓度可以是9:9:2。例如，所述上游引物、下游引物和探针的终浓度可以分别是：900nM、900nM、200nM。
本发明提供的试剂盒及检测方法灵敏度高，不依赖于标准品，可直接进行定量，并且可检测的浓度范围较广。在一些实施例中，所述试剂盒的检出下限为5拷贝数/μL。在一些实施例中，所述试剂盒适合检测的范围至少包括浓度为0.5×101-1×105拷贝数/μL的大肠杆菌DNA。
本发明的另一方面提供了一种确定样本中大肠杆菌DNA含量的方法。所述方法包括使用前述试剂盒，通过数字PCR技术，按照预设扩增程序，对所述样本中提取到的DNA进行扩增；基于扩增结果，确定所述样本中的大肠杆菌的DNA含量。
数字PCR是一种基于单分子扩增的绝对定量方法。数字PCR的流程主要包括通过液滴或芯片平台，将待检测核酸分子进行物理分隔。这样可增加核酸分子的检出率，同时也将PCR抑制剂(例如蛋白酶K、酚、EDTA等)进行了稀释，减少PCR抑制剂对扩增的影响。根据每个物理分隔是否含有荧光信号，可以进行计数，从而检测样本中大肠杆菌DNA的绝对含量。
在一些实施例中，所述预设扩增程序包括退火步骤。本发明对于适宜于本试剂盒的退火温度进行了优化。在检测样本中的大肠杆菌DNA含量，尤其是微量大肠杆菌DNA含量时，所述退火温度优选为57℃-59℃。在一些实施例中，所述退火温度优选地为约57℃、约58℃或约59℃。在一些实施例中，所述退火温度更优选地为约58℃。所述优选的退火温度具有较高的扩增效率，且对应的扩增结果中阳性信号与阴性信号也更容易区分，是更适合于前述试剂盒的退火温度。
仅作为示例，所述预设扩增程序包括：
(1)在96℃下反应10min；
(2)在58℃下反应2min，加热至98℃并维持30s，循环N次；
(3)在58℃下反应2min；
(4)降温至10℃，结束。
在一些实施例中，可以根据实际需要调节循环次数N。此处N为正整数。仅作为示例，N的取值范围可以是35-40之间，例如39。
本说明书提出的用于确定样本中大肠杆菌DNA含量的试剂盒及方法，可能带来的有益效果包括但不限于：(1)所述试剂盒中探针和引物的终浓度是通过优化得到的，并且所述方法中退火步骤采用的退火温度也是经优化得到，能够提高扩增效率，并且更好地区分扩增后荧光信号中的阳性和阴性结果，从而提高检测效率和准确度；(2)灵敏度高，能准确检测样本中的微量大肠杆菌DNA的浓度，其中最低检出浓度为约5拷贝数/μL；(3)适用范围广，不仅可以检测样本中的微量大肠杆菌DNA的浓度，也可用于检测样本中相对较高的大肠杆菌DNA的浓度，其中最高检出浓度≥10000拷贝数/μL；(4)采用绝对定量，通过终点定量法对扩增结果中的荧光信号计数，并使用泊松分布校正，准确性高，并且不需要标准曲线，减少反应数和标准曲线带来的误差；(5)和传统的荧光定量PCR法相比，耐受样本中所含的PCR抑制剂、蛋白质、有机试剂等的影响，检测结果更加准确。
实施例
下述实施例1-8中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例1-8中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例1-8中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1-8中所使用的仪器、试剂及菌种材料如下表2所示：
表2仪器和试剂
| 仪器和试剂名称 | 型号/货号 | 购买机构或生产厂家 |
| 数字PCR仪器系统 | A29154 | Thermo Fisher |
| Qubit 4.0 | Qubit 4.0 | Thermo Fisher |
| QuantStudio数字PCR检测试剂 | A26316 | Thermo Fisher |
| 基因组DNA提取试剂盒 | 9765 | TaKaRa |
| 大肠杆菌DNA含量测定国家标准品 | 270027 | 中国食品药品检定研究院 |
| 藤黄微球菌DNA | BNCC245563 | 北纳生物 |
| 腐生葡萄球菌DNA | BNCC266291 | 北纳生物 |
| 大肠杆菌DH5α | 9057 | TaKaRa |
实施例1引物和探针浓度
引物和探针序列
大肠杆菌基因组残留检测试剂盒的引物和探针序列如表3所示，引物和探针分别购自南京金斯瑞生物科技有限公司和赛默飞世尔科技公司，探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。其中E.coli-F为正向引物，E.coli-R为反向引物，E.coli-Probe为探针。
表3引物和探针序列
按照表4所示配制数字PCR反应液，其中上下游引物E.coli-F和E.coli-R的终浓度分别为900nM，E.coli-Probe探针的终浓度分别为100nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM。PCR扩增程序为96℃，10min；(60℃，2min；98℃，30sec)39个循环；60℃，2min；10℃，结束。使用芯片阅读仪读取FAM信号，分析探针浓度对信号分布的影响。试剂盒中使用FAM探针标记大肠杆菌基因组DNA，数字PCR结果的二维图分为两个象限：FAM阳性区和阴性区，根据阴性对照和阳性对照的信号分布划分FAM阳性区和阴性区。其中FAM阳性区散点数＞3个，则表示含有FAM阳性信号，即含有大肠杆菌基因组DNA的扩增信号，FAM阳性区散点数≤3个，则表示没有FAM阳性信号，或者低于检测限。阴性区表示没有FAM荧光信号，即没有大肠杆菌基因组DNA扩增信号。在图1A-图4B、图5G-图5H、图6A-6D以及图7中，颜色较深的点代表阳性区中的阳性扩增信号，颜色较浅的点代表阴性区中的阴性信号。
结果如图1A-1H所示，均有大肠杆菌基因组DNA信号检出，且阳性和阴性信号均能明显区分。本发明对于基于数字PCR技术检测大肠杆菌DNA含量所使用的探针、正向引物和反向引物的浓度进行了研究，结果表明，当正向引物、反向引物及探针的浓度比例为9:9:(1-7)时，能检出明显的阳性扩增信号，便于对大肠杆菌DNA含量进行准确的定量分析。
表4数字PCR反应液配制表
实施例2 退火温度的优化
按照表5配制数字PCR反应液，制备芯片，扩增程序为96℃，10min；(60℃，2min；98℃，30s)39个循环；60℃，2min；10℃，结束。其中设置不同的退火温度进行数字PCR反应。使用芯片阅读仪读取芯片信号，分析退火温度对信号分布的影响。
表5数字PCR反应液配制表
投入0.006ng大肠杆菌国家标准品进行数字PCR反应，退火温度分别设置为57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃。如图2A-2F所示，退火温度在57℃、58℃、59℃时，具有较高的扩增信号。如图3A-3B所示，投入0.002ng大肠杆菌国家标准品进行数字PCR反应，退火温度分别设置为58℃、59℃。退火温度在58℃时，阳性信号和阴性信号区分较明显。如图4A-4B所示，投入0.01ng大肠杆菌国家标准品进行数字PCR反应，退火温度分别设置为58℃、59℃。退火温度在58℃时，阳性信号和阴性信号区分较明显，且扩增信号也相对较高，说明58℃为更优选的退火温度。因此后续实施例中选择58℃作为退火温度。
实施例3检测方法
大肠杆菌基因组DNA提取
使用基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体操作如下：
收集大肠杆菌培养液，12000rpm离心2min，弃上清；
加入180μL Buffer GL、20μL蛋白酶K、10μL RNase A(10mg/mL)，充分吸打混匀，56℃温浴120分钟；
加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，充分吹打混匀；
将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心2min，弃滤液；
加入500μL Buffer WA至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
加入700μL Buffer WB(使用前请确认Buffer WB中已加入指定体积的100％乙醇)至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；注意加入Buffer WB时沿Spin Column管壁四周加入，有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐份；
加入700μL Buffer WB至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟；
将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200μL的灭菌水，室温静置5分钟；注意提前将灭菌水加热至65℃使用有助于提高洗脱效率；
12000rpm离心2分钟洗脱DNA，收集DNA溶液。
大肠杆菌基因组DNA浓度检测
使用Qubit4.0荧光计对大肠杆菌DNA的浓度进行检测。
配制数字PCR反应体系，具体组成如表6所示：
表6大肠杆菌基因组DNA数字PCR反应体系
打开芯片上样仪的开关，至芯片上样仪指示灯常绿表示仪器完成预热；
将芯片、刷头、芯片盖正确放置于芯片上样仪的对应位置；
取14.5μL数字PCR反应体系加入刷头的加样孔中，注意将PCR反应液从移液器打出时勿按压移液器的第二档，避免引入气泡；按压芯片上样仪上表面的黑色加载按键，PCR反应液会均匀的涂抹于芯片上，指示灯常亮表示完成反应液加载过程；
使用封油注射器从芯片上空悬空滴加10-15滴封油，以封油正好覆盖芯片表面为宜；
翻转仪器臂使芯片盖接触芯片，紧密按压至少15秒，将仪器臂放回原位；
取出芯片，封油注射器与芯片成45度，从芯片加油孔缓慢加入封油，至加油孔气泡比加油孔稍大(直径＜2-3mm)为止；
取下芯片盖背面的覆膜，紧密按压芯片盖5秒保证密封。
芯片放置于PCR仪上进行PCR反应，反应条件如表7所示，PCR升降温速度设置为2℃/s；
表7大肠杆菌基因组DNA检测扩增程序
读取荧光信号：PCR反应结束后，终止PCR程序，待PCR仪的温度恢复室温后，从PCR仪中取出芯片。将芯片正确放入芯片阅读仪中，仪器自动读取芯片中的荧光信号。
结果分析和判定：将芯片的读取结果文件传输至数据处理服务器，服务器直接进行结果的读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光强度的差异，服务器根据荧光分布计算出大肠杆菌基因组DNA的拷贝数。
实施例4特异性分析
使用本发明试剂盒和检测方法分别检测大肠杆菌基因组DNA和阴性样本，使用的阴性样本包括无核酸模板的超纯水样本和无大肠杆菌基因组DNA的样本。其中大肠杆菌阳性样本是购买的大肠杆菌国家参考品，藤黄微球菌基因组DNA和腐生葡萄球菌基因组DNA是购买的DNA样本。每个样本均做2个重复，进行数字PCR反应，分析是否有非特异性反应。
结果如表8所示，阴性样本的FAM阳性信号散点数均在3个或3个以下，检测结果低于检测限，阴性样本均无阳性检出。在大肠杆菌样本中均检出阳性。说明本发明的试剂盒及检测方法具有良好的特异性。图5A-5H分别是阴性样本和阳性样本的检测二维图。其中，图5A-5B示出了根据本说明书一些实施例中超纯水样本经数字PCR反应后的荧光信号检测结果；图5C-5D示出了根据本说明书一些实施例中含有藤黄微球菌基因组DNA样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果；图5E-5F示出了根据本说明书一些实施例中含有腐生葡萄球菌DNA的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果；图5G-5H示出了根据本说明书一些实施例中含有大肠杆菌DNA的样本经数字PCR扩增后的荧光信号检测结果。
表8特异性检测结果
| 样本 | 拷贝数 | FAM+信号散点数 |
| H2O | 1.07445 | 1 |
| H2O | 1.1455 | 1 |
| 藤黄微球菌 | 1.20205 | 1 |
| 藤黄微球菌 | 1.1716 | 1 |
| 腐生葡萄球菌 | 3.538 | 3 |
| 腐生葡萄球菌 | 3.77 | 3 |
| 大肠杆菌 | 645.29 | 582 |
| 大肠杆菌 | 618.77 | 544 |
实施例5灵敏度分析
将大肠杆菌国家参考品进行梯度稀释，使用1×105拷贝数/μL、1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL、0.5×101拷贝数/μL作为灵敏度参考品，每个样本均做2个重复。每个梯度取1μL，使用本发明试剂盒和检测方法进行数字PCR检测，分析试剂盒所能检测到的最低限。
结果如表9所示，本发明试剂盒及检测方法能够准确检测到0.5×101拷贝数/μL的大肠杆菌基因组DNA；并且，本发明的试剂盒及检测方法能够准确检测出1×105拷贝数/μL的大肠杆菌基因组DNA。这说明本发明提供的试剂盒及检测方法灵敏度高且不依赖于标准品，可直接进行定量，并且可检测的浓度范围较广，至少可以用于检测浓度为0.5×101-1×105拷贝数/μL的大肠杆菌基因组DNA。
表9灵敏度检测结果
实施例6准确性分析
稀释大肠杆菌国家标准品，使用1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL作为准确性标准品，每个样本均做7个重复。每个梯度取1μL样本，使用本发明试剂盒和检测方法进行数字PCR分析。
结果如表10所示，特定浓度下的大肠杆菌参考品的检测值与理论值均比较接近，说明本发明试剂盒及检测方法具有非常好的准确性。图6A-6D分别是对1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL进行检测的二维图。
表10准确性检测结果
实施例7重复性分析
稀释大肠杆菌国家标准品，使用1×104拷贝数/μL作为重复性参考品，取1μL进行检测，使用本发明试剂盒及检测方法进行数字PCR分析，做7个重复。
大肠杆菌国家标准品的检测值如表11所示，通过计算得出检测平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV，CV＝SD/平均值*100％)，该检测的检测值与理论值比较接近、变异系数较小，说明本发明试剂盒及检测方法具有非常好的重复性。
表11重复性分析
实施例8大肠杆菌基因组DNA检测
复苏大肠杆菌DH5α并培养
取出DH5α置于冰上融化；
加入900μL LB培养基，混匀后，置于37℃摇床震荡培养1小时；
转移至培养管中继续培养12-16小时。
大肠杆菌基因组DNA提取
收集大肠杆菌培养液，按照实施例4提取DH5α基因组DNA。
基因组DNA定量
基因组DNA浓度检测方法同实施例4。
数字PCR检测
配制数字PCR反应液，加入1μL大肠杆菌基因组DNA，进行数字PCR检测，该样本的检测结果如图7所示，有大肠杆菌DH5α基因组DNA信号检出，且阳性和阴性信号均能明显区分，说明该试剂盒可检测出DH5α的基因组DNA。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于确定样本中大肠杆菌DNA含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
如SEQ ID NO:1所示的探针；
如SEQ ID NO:2所示的正向引物；
如SEQ ID NO:3所示的反向引物；以及
数字PCR检测试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物、反向引物与探针的终浓度比例为9:9:(1-7)。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物与反向引物的终浓度均为900nM，所述探针的浓度为100-700nM。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检出下限为5拷贝数/μL。
5.一种确定样本中大肠杆菌DNA含量的方法，其特征在于，所述方法包括：
使用如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，通过数字PCR技术，按照预设扩增程序，对所述样本中提取到的DNA进行扩增；以及
基于扩增结果，确定所述样本中的大肠杆菌的DNA含量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述预设扩增程序包括退火步骤，所述退火步骤中退火温度为57℃-59℃。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述退火温度为57℃、58℃或59℃。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述退火温度为58℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述预设扩增程序包括：
96℃，10min；
58℃，2min，98℃，30s，循环N次；
58℃，2min；
10℃，结束。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，N为39。
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