CN118326032A - 一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合及试剂盒 - Google Patents

一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合及试剂盒，涉及体外检测技术领域，所述检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合在五种基因上游引物的5’‑端引入5个重复碱基T，减少了不同引物扩增效率的差异以及引物二聚体的形成；对探针序列中具有高SNP的碱基进行次黄嘌呤修饰，减少了扩增过程中探针序列中具有高SNP碱基的突变，从而增大了野生型和突变型基因与探针所形成的两种杂交链对应的熔解Tm值的差距，减少了漏检或基因型错判的情况，提高了基因型鉴定准确性；此外，本发明的引物和探针组合中包括五种基因的高特异性引物和探针，能同时检测5种基因的多态性，缩短了诊断时间。

Description

一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合 及试剂盒
技术领域
本发明属于体外检测领域，具体涉及检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合及试剂盒。
背景技术
系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）是一种常见的慢性自身免疫性疾病，主要发生于15~40岁女性。SLE临床表现呈多样性，发病率虽不高，但具有潜在致命性，严重影响患者特别是育龄女性的生活质量。
SLE的发病与遗传、免疫、环境、感染、药物等有关，但确切机制尚不清楚，诊断和治疗比较困难。早期诊断和易感性诊断在一定程度上有助于预防或延缓疾病的发生和发展。
目前用于筛查和诊断SLE的标志物包括抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗磷脂抗体以及补体水平等。但这些标志物在SLE的早期诊断和易感性筛查方面具有局限性，例如并非所有SLE患者都会表现出相同的抗体谱，某些抗体的阳性率不是100%，且非特异性较高，即在其他自身免疫性疾病中也可能出现这些抗体；特异性较高的抗体在SLE早期可能还未产生或浓度尚不足以被检测出来。因此，现有的技术不容易发现潜在的SLE易感人群。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合及试剂盒，旨在提供一种测试灵敏度高、准确率高、特异性好的检测试剂。
为达到上述目的，本发明提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合，包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第五组合、以及内参组合，其中：
所述第一组合包括针对rs1055141 T＞C的上游引物AF1、下游引物AR3、以及探针AP2，所述AF1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AR3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述AP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述第二组合包括针对rs13400210 C＞T上游引物BF2、下游引物BR1、以及探针BP3，所述BF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述BR1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所述BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述第三组合包括针对rs4832054 A＞G的上游引物CF2、下游引物CR2、以及探针CP1，所述CF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，所述CR2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，所述CP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
所述第四组合包括针对rs12576440 A＞G的上游引物DF4、下游引物DR1、以及探针DP2，所述DF4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，所述DR1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示，所述DP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；
所述第五组合包括针对rs11585 C＞T的上游引物EF2、下游引物ER3、以及探针EP3，所述EF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，所述ER3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示，所述EP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；
所述内参组合包括针对β-actin的上游引物FF2、下游引物FR3、以及探针FP1，所述FF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，所述FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示，所述FP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示。
本发明还提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；
所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dUTP、dGTP、DNA聚合酶、甜菜碱、UNG酶以及所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合。
在一实施方式中，在所述PCR反应液中：
所述引物和探针组合中的引物和探针的浓度均为0.05~0.5μM。
在一实施方式中，在所述PCR反应液中：
所述UNG酶的酶活为0.2U；
所述DNA聚合酶的酶活为2.5U。
在一实施方式中，所述阳性对照品包括rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs11585 C＞T、rs12576440 A＞G、以及β-actin的质粒DNA混合物。
本发明设计的特异性引物和探针组合，可检测系统性红斑狼疮关联基因多态性，在五种基因上游引物的5’-端引入5个重复碱基T，减少了不同引物扩增效率的差异和不一致性，降低了引物之间形成引物二聚体的概率，增加了引物扩增效率与特异性；对探针序列中具有高SNP的碱基进行次黄嘌呤修饰，减少了扩增过程中探针序列中具有高SNP的碱基的突变，从而增大了野生型基因和突变型基因与探针所形成的两种杂交链对应的熔解Tm值的差距，提高了野生型基因和突变型基因的区分度，减少了漏检或基因型错判的情况，提高了基因型鉴定的准确性；此外，本发明的引物和探针组合中包括五种基因的高特异性引物和探针，能同时检测5种基因的多态性，缩短了诊断时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明所提供的通过Tm值区分样本中基因杂合型别和纯合型别的示意图；
图2~5为本发明所提供的实施例2阳性对照品的检测结果图；
图6为本发明所提供的实施例2阴性对照品的检测结果图；
图7~10为本发明所提供的实施例2中待测核酸样品A的检测结果图；
图11~14为本发明所提供的实施例2中待测核酸样品B的检测结果图。
本发明目的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的慢性自身免疫性疾病，主要发生于15~40岁女性。SLE临床表现呈多样性，发病率虽不高，但具有潜在致命性，严重影响患者特别是育龄女性的生活质量。SLE的发病与遗传、免疫、环境、感染、药物等有关，但确切机制尚不清楚，诊断和治疗比较困难，寻找用于SLE筛查、诊断和病情监测的可靠标志物十分必要。
目前用于筛查和诊断SLE的标志物包括抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗磷脂抗体以及补体水平等。但这些标志物在SLE的早期诊断和易感性筛查方面具有局限性，例如并非所有SLE患者都会表现出相同的抗体谱，某些抗体的阳性率不是100%，且非特异性较高，即在其他自身免疫性疾病中也可能出现这些抗体；特异性较高的抗体在SLE早期可能还未产生或浓度尚不足以被检测出来。因此，现有的技术不容易发现潜在的SLE易感人群。
而单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）等遗传标记研究有助于发现潜在的SLE易感人群。
鉴于此，本发明提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合，包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第五组合、以及内参组合，其中：
所述第一组合包括针对rs1055141 T＞C检测位点的上游引物AF1、下游引物AR3、以及探针AP2，所述AF1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AR3的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示，所述AP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述第二组合包括针对rs13400210 C＞T检测位点上游引物BF2、下游引物BR1、以及探针BP3，所述BF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述BR1的核苷酸序列如SEQ IDNO. 5所示，所述BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述第三组合包括针对rs4832054 A＞G检测位点的上游引物CF2、下游引物CR2、以及探针CP1，所述CF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，所述CR2的核苷酸序列如SEQ IDNO. 8所示，所述CP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
所述第四组合包括针对rs12576440 A＞G检测位点的上游引物DF4、下游引物DR1、以及探针DP2，所述DF4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，所述DR1的核苷酸序列如SEQID NO. 11所示，所述DP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；
所述第五组合包括针对rs11585 C＞T检测位点的上游引物EF2、下游引物ER3、以及探针EP3，所述EF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，所述ER3的核苷酸序列如SEQ IDNO. 14所示，所述EP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；
所述内参组合包括针对β-actin的上游引物FF2、下游引物FR3、以及探针FP1，所述FF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，所述FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示，所述FP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示。
表1β-actin和5种SLE关联基因的引物和探针组合
注：加粗斜体碱基为高SNP突变碱基；
/ideoxyI/代表次黄嘌呤，次黄嘌呤用于修饰加粗斜体碱基使其称为高SNP突变碱基；
斜体未加粗碱基为引入碱基。
T细胞分化和调节异常是SLE的重要特征。SLE患者的免疫异常最突出的是T细胞和B细胞的高度活化及功能异常。在原理上，T细胞通过浸润靶组织、调节B细胞反应、促进抗体产生而在SLE发生发展中起关键作用。其中，辅助性T细胞（CD4＋T细胞）和细胞毒性T细胞（CD8＋T细胞）两种T细胞与SLE病情进展有关。CD4＋T细胞在诱导和激活其他免疫细胞以及调控自身免疫、获得性免疫反应和免疫稳态中发挥重要作用；CD8＋T细胞产生毒性颗粒，诱导细胞凋亡，正常情况下二者处于平衡状态，若二者失衡时会打乱免疫稳态和免疫系统反应，导致自身免疫紊乱。rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G分别代表了CD4和CD8基因上的三个单核苷酸多态性，其中，rs1055141 T＞C通常用来表示从参考序列的T等位基因向C等位基因发生了一次变异，即发生了一个单核苷酸多态性SNP。而CD4基因上的rs1055141 T＞C、CD8基因上的rs13400210 C＞T和rs4832054 A＞G与SLE发病有关联。需要注意的是，rs1055141 CT、rs13400210 TT以及rs4832054 AG三种基因型和rs1055141及rs13400210上的T等位基因均为SLE发病的危险因子。其中，rs13400210 TT基因型表示个体拥有两个变异的T等位基因。
CD59广泛表达于循环细胞表面，在不同细胞系中表达差异很大，其中在红细胞中表达最高，而红细胞数量庞大，故CD59分子的免疫作用更值得重视。SLE患者T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的CD59分子水平会显著降低，且CD59水平与SLE疾病活动度有关。因此，CD59分子水平的变化特点及CD59基因单核苷酸多态性SNP与SLE易感性的关联值得关注。CD59基因SNP位点rs11585、rs12576440与SLE发病有关，即CD59基因rs11585、rs12576440多态性与SLE易感性相关。需要注意的是，rs11585 TT基因型及T等位基因、rs12576440 AG基因型及G等位基因是SLE发生的危险因子，而rs11585 CC基因型及C等位基因、rs12576440 AA基因型及A等位基因是SLE发生的保护因子。易感基因型及等位基因可作为SLE易感性筛查、早期诊断和病情监测的标志物，也能为研究SLE发生发展机制和新治疗方法提供线索。
人体中染色体是两两成对的，rs1055141为一条染色上的一个基因座位点，在该位点上具有两个等位基因，其中T等位基因容易突变为C，将T成为野生型基因，将C成为突变型基因；若一条染色体的rs1055141位点发生突变，而另一条染色体的rs1055141位点不发生突变，则称为杂合子样本；若两条染色体的rs1055141位点都不突变或都突变，即两条染色体上的rs1055141位点为TT或CC，则称为纯合子样本。本发明选取rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs12576440 A＞G、rs11585 C＞T这五种与SLE发病相关的基因突变位点。
本发明根据NCBI Genebank数据库公布的人CD8和CD59基因信息，选择与SLE发病相关的检测位点rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs12576440 A＞G、rs11585 C＞T，根据各位点所在区域的基因序列特点，用Primer5.0和Oligo7.0设计高特异性的引物和探针进行多重PCR检测。同时以人类基因组上的β-actin基因做内控，监测实验有效性。
针对检测位点rs1055141 T＞C设计引物和探针的序列如SEQ ID NO. 19所示，针对rs13400210 C＞T设计引物和探针的序列如SEQ ID NO. 20所示，针对rs4832054 A＞G设计引物和探针的序列如SEQ ID NO. 21所示，针对rs12576440 A＞G设计引物和探针的序列如SEQ ID NO. 22所示，针对rs11585 C＞T设计引物和探针的序列如SEQ ID NO. 23所示。
SEQ ID NO. 19：
CAATACCACTGGACCCCAAACGCTGTTTTTCCTCGTAGGACTGCATGAAAACCTGCTCTAAAAGGCTAAAAGAAGGTCACCCATATAGAGTATCATTTTAATTGTTCTACTGAATCTCAGGCCTTTGATCTCAGCCTCTCGTTCCTCTGCAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGTTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGGTAAGGACCCAGGTTCCAAGGCCTCTGCCTCCTGGGCTGCGGGACCTTCCTGTGGTTGGCAGAGACCACCCAGAGTCCCGGCCTCCCAATGCCTGAGTTGGGGGGTTAT
SEQ ID NO. 20：
GCCAGGTGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAAGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCGGGAAGCAGAGGCTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACCCCAGCCTGGGCAACACAGTGAGGCTCTGTCTCAAAAAAAATAATAATAATAAATAAATAAAAAAGAGAAGCACAATGCTCATCTCTGACTCTGGCCCGTCTCTTCCAGTTTCATCTTATTCCCACCTAAAGTGGTTAGGTAATAGACCTACCTTCCAGGGTGGTTGGCAGCATTAAGCAAGCTAACTATGTAAACACTTGGAGGGGCTTGGCCTGGGTAAGTCTCCACATGTTCTTTCTGTTACTATTAGCAGCAGTGCCATTAGTCACGGCTGCAGAGTGGGGCACACTGAAGCCTGGTGGTCCCAGTGCCTGGCACGTGCCTGGCACACAATCGGTGCTCACTGAT
SEQ ID NO. 21：
AAAACTCCATTTTTTCCAAATATTTAACCAATTGTCTCGGCACTCTTTATTATAATCTATTATTTTTGTTTGTTTGTTTTTGAGACGGAGTCTTGCTGTGTTGTCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACCTCTTGGGTTCAAGAGATTCTCCTGCCTCAGACTTCCAATCGCTGGGATTATAGGCACCTGCCATCATGCCCGGCTAATTTTTGTGTTTTTGTAGAAACGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAGGTTATCTGCCTGCCTCGACCTCCCGAAATGCTAGGATTACAGGCATGAGCCACCATGCCTGGCTTCTATAATCTATTCTTTCCCCATGTATGTGACTGCTACATTTGTCATGTAATCCACATGTTCAAATGGAGTCTATTCATGCATCACTTCAATGATTGAAATCAGCAATTTAAAATTGATCAGTAAATATCTAGCAGCTGATAATCCCATGAGGAGAGAGAAACTTCTTTTGCCTTTGAGAAAGAAAATGTTTTCCTTCTGATTCTAAAAGAATAGGTGAGTTGCTTTCCTCTATCTCTGCAATTTTTCCCTCTGCTGGGACCCACAGATGGGGAAAATGAGACCTCTGATGAGGCAGCAGAAACCCAGAAGCCAGAACACCGCTAACCAGTAATGAAGCTGTGGGATCACTGAAGCTCCCCTGCCCCAGGGAGACACGGGTGGTCAAAGTAGAAACTGAAGATCAGCCTCAGAGACTCCCAGACTGAGGAGTCAGCCTAATTTTCTGATAAGAAATTAAAGACTAGGGGCTGGGGGAGTGAGAGAAGTATTATTCTCAAACTTTTAGGAAAAAAAACAAAATGAAACAAAACAGTGAAAAGAATGATCAGGAAGTCAGTAACTT
SEQ ID NO. 22：
GTGTATGTGTATGGGGGGCGGAGGAGGGCGGGAGGCAGAAAAAGAAACAGCTGATTGTTTTAAAGCTATTTTATAAATGCCCTACAATGTAGATGGTAACTAACACTAAGCAAGATCATTTATGGCTTTTTATTTTTCTTCCTGATCCTTTACTTTTTGCCATCCTTTCCCCAAATATTCTATAATTAACCAAGTATTACTTTTACAATCAGAAACATCAGGAAAATTCACACATGACAATGTTCCTTTTCTAGTAGTCATAGATCATCTATCTTTTGGTAAAACTACTCCCTAGACTAAAACACCCTCCATTTTAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGATGCCCATAAGTTAAGTGTAGATAAGATGGTAAATGAACCAAAAGTGTTGCCATTCCACCCAAACCAAGTACTTAAATGCAAGATACACTCAGAAAGCATCAACACTCAACTCCTTTCCAA
SEQ ID NO. 23：
TTGTAGTTAGGAACCTGGGTTCAAACCCTCTTCCACTAATTGGCTATGTCTCTGGACAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCCTTTCTGAACTTTCACTTTCTATGTCTACCTCAAAGAATTGTTGTGAGGCTTGAGATAATGCATTTGTAAAGGGTCTGCCAGATAGGAAGATGCTAGTTATGGATTTACAAGGTTGTTAAGGCTGTAAGAGTCTAAAACCTACAGTGAATCACAATGCATTTACCCCCACTGACTTGGACATAAGTGAAAACTAGCCAGAAGTCTCTTTTTCAAATTACTTACAGGTTATTCAATATAAAATTTTTGTAATGGATAATCTTATTTATCTAAACTAAAGCTTCCTGTTTATACACACTCCTGTTATTCTGGGATAAGATAAATGACCACAGTACCTTAATTTCTAGGTGGGTGCCTGTGATGGTTCATTGTAGGTAAGGACATTTTCTCTTTTTCAGCAGCTGTGTAGGTCCAGAGCCTCTGGGAGAGGAGGGGGGTAGCATGCACCCAGCAGGGGACTGAACTGGGAAACTCAAGGTTCTTTTTACTGTGGGGTAGTGAGCTGCCTTTCTGTGATCGGTTTCCCTAGGGATGTTGCTGTTCCCCTCCTTGCTATTCGCAGCTACATACAACGTGGCCAACCCCAGTAGGCTGATCCTATATATGATCAGTGCTGGTGCTGACTCTCAATAGCCCCACCCAAGCTGGCTATAGGTTTACAGATACATTAATTAGGCAACCTAAAATATTGATGCTGGTGTTGGTGTGACATAATGCTATGGCCAGAACTGAAACTTAGAGTTATAATTCATGTATTAGGGTTCTCCAGAGGGACAGAATTAGTAGGATATATGTATATATGAAAGGGAGGTTATTAGGGAGAACTGGCTCCCACAGTTA
上述SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22和SEQ IDNO. 23序列中加粗的碱基即为SNP位点。
本发明选择与SLE发病有关联的SNP位点，建立了多种引物和探针体系，可检测系统性红斑狼疮关联基因多态性，设计的特异性引物在五种基因上游引物的5’-端引入5个重复碱基T，减少了不同引物扩增效率的差异和不一致性，降低了引物之间形成引物二聚体的概率，增加了引物扩增效率与特异性；对探针序列中具有高SNP的碱基进行次黄嘌呤修饰，所述高SNP是指突变概率大于万分之一的SNP，次黄嘌呤可以较好地和A、C、G、T四种碱基进行匹配，提高了探针结构的稳定性，减少了扩增过程中探针序列中具有高SNP的碱基发生突变的概率，从而增大了野生型基因和突变型基因与探针所形成的两种杂交链对应的熔解Tm值的差距，提高了野生型基因和突变型基因的区分度，减少了漏检或基因型错判的情况，提高了基因型鉴定的准确性；此外，本发明的引物和探针组合中包括五种基因的高特异性引物和探针组合，能同时检测5种基因的多态性，缩短了诊断时间。
此外，表1中的引物和探针序列的长度设计在合适的范围内，这是由于引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不同。引物、探针太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏度下降。
本发明还提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dUTP、dGTP、DNA聚合酶、甜菜碱、UNG酶以及所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合。
在扩增过程中，UNG酶能选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，消除PCR产物污染，从而达到PCR防污染的作用。UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃可被灭活。
本发明的PCR反应液中以dUTP取代常规的dTTP，与UNG酶一起建立了反应体系的UNG酶防污染体系。一般情况下，尿嘧啶U并不出现在DNA中，在PCR反应液中加入dUTP，能使得PCR扩增得到的DNA产物中包含尿嘧啶脱氧核苷酸dU，UNG酶能够在PCR反应前或PCR循环之间去除DNA分子中的尿嘧啶残基，形成的无碱基位点高温条件下非常不稳定，会导致DNA链断裂，从而无法作为下一轮PCR反应的有效模板，从而消除前一轮PCR反应留下的污染，确保后续实验的特异性。
此外，本发明的试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。阳性对照品和阴性对照品可以是可以预先与PCR反应液混合在一起，便于用户一步操作完成，也可以在后续实验步骤中按需加入到PCR溶液中，灵活适应不同的实验流程和需求。设置两种对照品的目的都是为了确保实验结果的真实性和有效性。
在本发明的任意实施例中，在所述PCR反应液中，所述dATP、dCTP、dUTP和dGTP的加入可以通过dN(U)TP Mix和额外的dUTP共同实现，其中dN(U)TP Mix中dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度比为1:1:1:1，在PCR反应液中dN(U)TP Mix的浓度为25mM、额外的dUTP浓度为100mM。dN(U)TP Mix的浓度可以保证每个反应周期中都有足够的脱氧核苷酸供DNA聚合酶用于新链的合成，同时又不能过高以致于引起非特异性结合或抑制PCR反应。
在本发明的任意实施例中，在所述PCR反应液中，所述引物和探针组合中的引物和探针的浓度均为0.05~0.5μM，通过大量实验对比，最终确定最终引物探针用量。所述引物和探针组合的浓度过高会促进非特异性的扩增，从而导致假阳性结果增多；过量的引物可能会相互竞争或与模板结合形成二聚体或其他非功能性复合物，消耗反应体系中的有效成分，反而降低目标序列的扩增效率；过高的探针浓度可能导致背景荧光增强，干扰真实信号的检测。探针浓度过低会导致扩增效率低下，且无法充分捕获并报告目标序列的存在。
在本发明的任意实施例中，在所述PCR反应液中，所述UNG酶的酶活为0.2U，UNG酶的酶活在合适的范围内可以有效去除前一轮PCR反应中遗留的污染DNA，显著降低实验中的假阳性结果，确保实验数据的准确性和可靠性。UNG酶的酶活太高可能导致正常模板DNA也被降解。
在本发明的任意实施例中，在所述PCR反应液中，所述DNA聚合酶为Taq酶，所述DNA聚合酶的酶活为2.5U。在PCR循环中需要在约95℃下进行DNA的变性，Taq酶具有较高的热稳定性，可以在PCR的过程中反复经受高温处理而不失活，极大地简化了PCR操作流程。所述DNA聚合酶的酶活可以保证每次PCR循环中都有足够的酶促反应进行，从而实现目标DNA片段的快速、高效扩增。
在本发明的任意实施例中，所述阳性对照品包括rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs11585 C＞T、rs12576440 A＞G、以及β-actin的质粒DNA混合物。采用混合质粒样本作为阳性对照来监控实验的有效性，包含本试剂盒所检测的5种杂合突变型基因的质粒以及内参基因β-Actin的质粒。
目前常用于检测基因分型和突变检测技术包括PCR-RFLP、Sanger测序和二代测序技术。
PCR-RFLP是指使用限制性内切酶对引物扩增的目标片段进行消化，再通过电泳分析片段来鉴定基因型别的方法。其优点在于易上手；其缺点在于对于消化正常/突变型别的目标片段，需选择特殊的限制性内切酶，局限性大，成本高。限制性内切酶对样本消化不完全可能导致错误判断患者的基因型。此外，从PCR扩增目标区域至限制性内切酶消化，再到电泳分析，步骤偏多，达不到临床上大规模使用的要求。
Sanger测序法是第一代基因测序的基本原理，因为其准确率高，被称为基因检测的金标准，但缺点是灵敏度较低且无法进行同管多重检测，此外检测时需要先进行核酸提取，接着进行扩增，拿扩增产物进行上机测序，整个检测流程繁琐复杂。
而对系统性红斑狼疮基因检测位点使用二代测序技术进行检测，检测前需要对全血样本进行基因组DNA提取，且检测时进行单位点检测，检测时间较长，且需要开盖操作，增加污染的风险，检测成本偏高。同时，该方法不适合临床大样本量检测。
因此，本发明还提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S10、获取待测核酸样品和所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒；
S20、将待测核酸样品与样本处理液混合，得待测样品溶液；
S30、向PCR反应液中加入待测样品溶液，得待测样品PCR反应液；
S40、将所述待测样品PCR反应液、阳性对照品、以及阴性对照品分别进行PCR扩增和熔解，在熔解过程中通过FAM、VIC、ROX、CY5四个通道同时检测待测样品PCR反应液、阳性对照品、以及阴性对照品中探针与包含检测位点的核酸序列杂交形成的杂交链在不同温度下的荧光信号；
S50、根据各温度以及其对应的所述杂交链的荧光信号，建立包含检测位点的杂交链在FAM、VIC、ROX、CY5四个通道的熔解曲线图；
S60、根据熔解曲线图上峰值对应的温度，确认待测样品中检测位点的基因类型。
步骤S10中，待测核酸样品包括抗凝全血样本和口腔脱落细胞样本。抗凝全血样本中的抗凝剂包括乙二胺四乙酸和枸橼酸钠。获取待测核酸样品的方法包括抽取静脉血不少于0.4mL，放入含有抗凝剂的管中。抗凝全血样本在室温放置可保存24h，在2~8℃下可保存1个月，在-18℃以下可保存5年，但冷冻保存时应避免反复冻融。抗凝全血样本运输时需用泡沫箱加冰袋密封，且运输时长不宜超过72小时。
步骤S20中，所述样本处理液包括氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液浓度为0.08M，待测核酸样品与样本处理液的体积比为按照的1：10。
步骤S40中，所述PCR扩增和熔解程序如下所示：
所述PCR扩增的程序为：第一步UNG酶消化50℃，2min；第二步预变性95℃，5min；第三步35个循环扩增步骤：95℃变性10s，65℃退火30s；
所述熔解曲线分析程序：95℃，2min，40℃，4min，从40℃~75℃收集荧光，进行熔解曲线分析。
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，优化结果显示退火温度偏低会其有非特异性扩增信号导致假阳性结果、温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。通过控制退火温度和退火时间在合适的范围内可以保证无非特异性扩增信号，特异性好，扩增效率高，灵敏度高。检测上机前免提取可节约检测成本，总反应时间约为1.5小时，与其他方法学相比较可以就节约时间。因此，本发明采用多重荧光PCR技术和熔解曲线法扩增体系，建立了一种高特异性、高灵敏度、低成本的检测系统，实验结果简单易懂，在1.5小时内得出结果。
荧光PCR-熔解曲线技术的主要原理是：通过PCR扩增含检测位点的核苷酸序列，而后由从低温到高温的升温过程，荧光探针与单链靶序列形成的探针-扩增产物复合体从互补配对到解链变性，期间的荧光值变化过程记录为熔解曲线。由于SNP位点的碱基突变，导致靶序列与探针的匹配程度不一，从而产生热稳定性不同的PCR产物-探针杂交复合体，导致不同SNP型别具有不同特征的熔解峰图和不同的温度，熔解峰对应的温度即Tm值。如图1所示，若待测样本的某SNP位点只有一种等位基因，则同一通道的熔解曲线中只有一个熔解峰，可凭借Tm值的高低区分出野生纯合型别和突变纯合型别；若待测样本的某SNP位点有两种等位基因，即突变杂合型别，则同一通道的熔解曲线中会出现两个熔解峰，此两个熔解峰的Tm值分别与两种纯合等位基因的熔解峰的Tm值一致。因此，可通过对同一通道中熔解峰图中熔解峰个数及对应Tm值对同一SNP位点基因型进行判读；可以通过不同通道中的熔解峰图对五个高SNP位点的基因型进行判读。
本发明可以直接对全血样本或口腔脱落细胞样本进行检测、无需进行繁琐的核酸提取过程，操作时间短、成本低；利用熔解曲线分析，采用FAM、VIC、ROX和CY5标记5种与SLE关联的基因以及内参基因，根据不同检测位点型别会有不同的熔解温度来进行分型，提高检测效率，满足临床低成本高通量的检测需求。
在本发明的任意实施例中，步骤S60中，判断待测样品中检测位点的基因类型的方法包括：
当荧光通道为FAM通道，Tm值为50.86~54.97℃时，则确认待测样品中rs4832054基因位点的基因类型包括A；
当荧光通道为FAM通道，Tm值为45.05~49.74℃时，则确认待测样品中rs4832054基因位点的基因类型包括G；
当荧光通道为FAM通道，Tm值为63.11~67.92℃时，则确认待测样品中rs13400210基因位点的基因类型包括C；
当荧光通道为FAM通道，Tm值为57.51~62.06℃时，则确认待测样品中rs13400210基因位点的基因类型包括T；
当荧光通道为VIC通道，Tm值为49.32~55.05℃时，则确认待测样品中rs1055141基因位点的基因类型包括T；
当荧光通道为VIC通道，Tm值为59.86~65.58℃时，则确认待测样品中rs1055141基因位点的基因类型包括C；
当荧光通道为ROX通道，Tm值为66.07~71.95℃时，则确认待测样品中rs11585基因位点的基因类型包括C；
当荧光通道为ROX通道，Tm值为57.14~62.76℃时，则确认待测样品中rs11585基因位点的基因类型包括T；
当荧光通道为CY5通道，Tm值为61.33~67.78℃时，则确认待测样品中rs12576440基因位点的基因类型包括A；
当荧光通道为CY5通道，Tm值为51.51~58.66℃时，则确认待测样品中rs12576440基因位点的基因类型包括G；
当荧光通道为CY5通道，Tm值为43.76~47.86℃时，则确认待测样品中基因类型为β-actin。
按照熔解曲线图像，根据四个荧光通道上的特定Tm值范围内有无熔解峰来鉴定样本的基因型别。由于仪器软件只能自动读取高于阈值线的熔解峰的Tm值，因此，当软件无法自动给出Tm值时，可通过适当调节阈值或者人工判读的方式获得Tm值。
表2各突变位点多态性的Tm值参考范围
阴性对照组的检测结果应为：FAM、VIC、ROX、CY5通道均无明显熔解峰。
如表2所示，阳性对照品包括5种杂合突变型基因，因此FAM、VIC、ROX、CY5通道的检测结果应均为阳性，且熔解峰Tm值应均在表2的参考范围之内。任意检测位点或内参基因β-actin出现无熔解峰或熔解峰Tm值不在参考范围之内，说明该检测结果无效，建议重新检测。
满足阴性对照和阳性对照检测结果的条件，表明本次实验成功有效，可对待检样本进行分析。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，包括24份PCR反应液，与每份PCR反应液中对应配套的阴性对照品和阳性对照品，其中，阳性对照品中为rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs11585 C＞T、rs12576440 A＞G、以及β-actin的质粒DNA混合物，所述质粒来自于生工生物工程(上海)股份有限公司；阴性对照品为纯化水。每份PCR反应液具体包括PCR反应缓冲液（10×HA Buffer和5×Probe qPCRBuffer）、dN(U)TP Mix（包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP）、dUTP、Taq聚合酶、甜菜碱、UNG酶以及检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合，各组分含量如表3所示：
表3 PCR反应液的配方
试剂 1人份（μL） 浓度
ddH2O 7.2495 /
HA Buffer 2.500 10×
Probe qPCR Buffer 5.000 5×
dN(U)TP Mix 0.200 25mM
UNG酶 0.200 1U/μL
甜菜碱 0.100 5M
dUTP 1.500 100mM
AF1 0.075 100μM
AR3 1.000 100μM
BF2 0.025 100μM
BR1 1.00 100μM
CF2 0.050 100μM
CR2 0.750 100μM
DF4 0.0125 100μM
DR1 0.200 100μM
EF2 1.000 100μM
ER3 0.025 100μM
FF2 0.075 100μM
FR3 1.000 100μM
AP2 0.063 100μM
BP3 0.075 100μM
CP1 0.125 100μM
DP2 0.125 100μM
EP3 0.075 100μM
FP1 0.075 100μM
Taq酶 0.50 5U/μL
总量 23.0
如表3所示，AF1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，AR3的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示，AP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；BF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，BR1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；CF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，CR2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，CP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；DF4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，DR1的核苷酸序列如SEQID NO. 11所示，DP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；EF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，ER3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示，EP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；FF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示，FP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示。原材料来源：dN(U)TP Mix（dATP、dUTP、dCTP、dGTP）和dUTP购买自广东菲鹏生物股份有限公司，PCR反应缓冲液（10×HA Buffer和5×Probe qPCRBuffer）和Taq聚合酶购买自天根生化科技（北京）有限公司、甜菜碱购买自生工生物工程（上海）股份有限公司、UNG酶购买自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
根据表3的配方配置得到一人份PCR反应液后，振荡混匀，2000rpm离心20s，按23μL/人份将PCR反应液分装到八联管中，密封保存。
实施例2
本实施例提供实施例1试剂盒对2例待测全血样品的检测实验，具体操作如下：
将待测全血样本充分颠倒混匀后，取出5μL待测样本，加入50μL 0.08M的NaOH样本处理液，震荡混匀，离心3s，分别标记为待测核酸样品A和待测核酸样品B。
从试剂盒中取出四人份PCR反应液、1份阳性对照品和1份阴性对照品，PCR反应液需求量=待测全血样本数+阳性对照品数+阴性对照品数。每人份PCR反应液为23μL。将PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品置于25℃融化并震荡混匀，离心5s。
将四人份的PCR反应液分别加入96孔PCR板中，分别吸取2μL的待测核酸样品A、待测核酸样品B、阳性对照品以及阴性对照品，分别加到四份PCR反应液中，盖紧管盖，离心5s。在加样过程中要避免交叉污染。
按表4所示的程序进行PCR扩增和熔解：
表4 PCR熔解反应程序
阳性对照品的检测结果如图2~5和表5所示。与表2中各突变位点多态性的Tm值参考范围进行对照。其中，图2表示FAM通道的熔解曲线，峰1的Tm值处于45.05~49.74℃范围内，表示rs4832054基因位点上包括突变型G碱基；峰2的Tm值处于50.86~54.97℃范围内，表示rs4832054基因位点上包括野生型A碱基；峰3的Tm值处于57.51~62.06℃范围内，表示rs13400210基因位点上包括突变型T碱基；峰4的Tm值处于63.11~67.92℃范围内，表示rs13400210基因位点上包括野生型C碱基。图3表示VIC通道的熔解曲线，峰1的Tm值处于49.32~55.05℃范围内，表示rs1055141基因位点上包括野生型C碱基；峰2的Tm值处于59.86~65.58℃范围内，表示rs1055141基因位点上包括突变型T碱基。图4表示ROX通道的熔解曲线，峰1的Tm值处于57.14~62.76℃范围内，表示rs11585基因位点上包括突变型T碱基；峰2的Tm值处于66.07~71.95℃范围内，表示rs11585基因位点上包括野生型C碱基。图5表示CY5通道的熔解曲线，峰1的Tm值处于43.76~47.86℃范围内，表示内参β-actin；峰2的Tm值处于51.51~58.66℃范围内，表示rs12576440基因位点上包括突变型G碱基；峰3的Tm值处于61.33~67.78℃范围内，表示rs12576440基因位点上包括野生型A碱基。因此，在四个通道上，阳性对照品的结果都为阳性。
表5阳性对照品的检测结果
阴性对照品的检测结果如图6所示。其中，四个通道的检测结果均为阴性，即无熔解峰出现。
阳性对照品和阴性对照品的检测结果表明实验过程没有污染，可以对待测核酸样品进行熔解曲线分析。
待测核酸样品A的检测结果如图7~10所示。与表2中各突变位点多态性的Tm值参考范围进行对照。图7的FAM通道中，峰1为rs4832054基因位点的突变型G碱基的信号，峰2为rs4832054基因位点的野生型A碱基的信号，峰3为rs13400210基因位点的突变型T碱基的信号，这表明待测核酸样本A中rs4832054位点是杂合型，rs13400210位点是纯合突变型。图8的VIC通道中，峰1为rs1055141基因位点的突变型C碱基，这表明待测样本A中rs1055141位点是纯合突变型。图9的ROX通道中，峰1为rs11585基因位点的突变型T碱基的信号，表明待测样本A中rs11585位点为突变纯合型。图10的CY5通道中，峰1为内参β-actin，峰2为rs11585基因位点的突变型G碱基的信号，峰3为rs12576440基因位点上野生型A碱基的信号，表明待测样本A中rs12576440位点为突变杂合型。
待测核酸样品B的检测结果如图11~14所示。与表2中各突变位点多态性的Tm值参考范围进行对照。图11的FAM通道中，峰1、峰2、峰3分别为rs4832054基因位点的野生型A碱基的信号、rs13400210基因位点的突变型T碱基的信号、rs13400210基因位点的野生型C碱基的信号，这表明待测核酸样本B中rs4832054位点是野生型，rs13400210位点是杂合型。图12的VIC通道中，峰1、峰2分别为rs1055141基因位点的突变型T碱基、rs1055141基因位点的野生型C碱基，表明待测样本B中rs1055141位点是杂合型。图13的ROX通道中，峰1为rs11585基因位点的突变型T碱基的信号，表明待测样本B中rs12576440位点为纯合突变型。图14的CY5通道中，峰1为内参β-actin，峰2为rs12576440基因位点的突变型G碱基的信号，表明待测样本B中rs12576440位点为纯合突变型。
综上，2例待测全血样本检测结果如下：
待测核酸样品A中：rs4832054位点是杂合型，rs13400210位点是纯合突变型，rs1055141位点是纯合突变型，rs115850位点为纯合突变型，rs12576440位点为杂合型。
待测核酸样本B中：rs4832054位点是野生型，rs13400210位点是杂合型，rs1055141位点是杂合型，rs115850位点为纯合突变型，rs12576440位点为纯合突变型。
对比例1
本对比例提供一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，采用二代测序技术进行检测，检测前需要对全血样本进行基因组DNA提取，其试剂盒组分为PCR反应组（5×Probe qPCR Buffer、dN(U)TP Mix、dUTP、Taq聚合酶、甜菜碱、UNG酶以及检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合）、PCR产物纯化组（SPA酶、ExoI酶以及H2O）以及测序反应组（BigDye mix、DNA测序引物、EDTA溶液、乙醇、HIDI溶液以及H2O）。本对比例试剂盒按实施例2所述的方法采用将实施例2中的2例样本进行检测，检测结果如下：
待测核酸样品A中：rs4832054位点是杂合型，rs13400210位点是纯合突变型，rs1055141位点是纯合突变型，rs115850位点为纯合突变型，rs12576440位点为杂合型。
待测核酸样本B中：rs4832054位点是野生型，rs13400210位点是杂合型，rs1055141位点是杂合型，rs115850位点为纯合突变型，rs12576440位点为纯合突变型。
从上述结果可以看出，本实施例试剂盒相较于对比例1而言，节省成本：免提取、全血直扩；快速：一次上机只需1.5小时；检测通量高：一次上机可以检测96个样本。
性能测试
对检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒的检测方法的准确性、检测限、特异性和精密度进行检测分析。
对准确性进行分析：选择涵盖各目的基因各位点的纯合突变型、杂合突变型、野生型样本，共30例临床样本，对准确性进行研究，结果显示5个位点的所有基因型本试剂盒均能准确检出，结果如表6所示。
表6 准确性研究所用的样本检测结果
对检测限进行分析：1）基因组DNA检测限确定：选择涵盖本产品所有检测位点的所有基因型别的DNA样本作为研究对象，各样本基因型如表7所示，将表7的6例DNA样本，通过梯度稀释，每例样本形成7个浓度（200ng/μL、100ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL），每个样本的每个浓度重复检测3次，确定检测限浓度后进行样本重复20次验证。2）全血样本检测限确定：将已知白细胞数6例全血样本用生理盐水进行梯度稀释，稀释比例为：全血体积：生理盐水体积=1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7，共7个浓度梯度，每个浓度重复检测3次，确定检测限后进行重复20次验证，最终确定本试剂盒的最低检测限为0.5ng/μL。检测结果与样本相关信息见表7~表11。
表7 不同浓度的DNA样本被准确检出的次数
表8 DNA样本最低检测限验证结果
表9 稀释后各梯度的白细胞计数（WBC）
表10 含有不同白细胞数的全血样本被准确检出的次数
表11 全血样本最低检测限验证结果
对分析特异性进行分析：本研究主要针对常见的血液干扰物质（包括：甘油三酯、总胆红素、EDTA、枸橼酸钠）进行效果评价，每例样本收集前都是经过血常规检测并获得相关血常规指标参数，本试剂盒对常见干扰物如甘油三酯≤13.5mmol/L、总胆红素≤358.24μmol/L、EDTA≤5mg/mL、枸橼酸钠≤2mg/mL具有一定的抗干扰能力。检测结果表12。
表12 干扰物的干扰评价结果
对精密度进行分析：选择本产品所有检测位点的杂合突变型的全血样本作为研究的对象，其中，以白细胞计数在4×109/L~10×109/L范围的全血样本作为中浓度水平样本，而用生理盐水将中浓度水平样本稀释至白细胞计数为1.0×109/L左右的样本作为低浓度水平样本。将以上8例全血样本在指定的适用机型上进行检测，每台机型一天做2次，每次试验每个样本重复检测2次，共做20天，通过分析重复检测结果的基因型别是否一致性。具体各样本基因型及白细胞数。检测结果与样本相关信息见表13~表14。
表13 中、低浓度水平的全血样本及基因型
表14 精密度样本检出情况
综上所述，本发明的引物和探针组具有较高特异性、较高灵敏度、较高准确性和较好的精密度，能同时检测5种SLE关联基因的多态性，缩短了诊断时间。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合，其特征在于，包括第一组合、第二组合、第三组合、第四组合、第五组合、以及内参组合，其中：
所述第一组合包括针对rs1055141 T＞C检测位点的上游引物AF1、下游引物AR3、以及探针AP2，所述AF1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述AP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述第二组合包括针对rs13400210 C＞T检测位点的上游引物BF2、下游引物BR1、以及探针BP3，所述BF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述BR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述第三组合包括针对rs4832054 A＞G检测位点的上游引物CF2、下游引物CR2、以及探针CP1，所述CF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，所述CR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述CP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
所述第四组合包括针对rs12576440 A＞G检测位点的上游引物DF4、下游引物DR1、以及探针DP2，所述DF4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，所述DR1的核苷酸序列如SEQ IDNO. 11所示，所述DP2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；
所述第五组合包括针对rs11585 C＞T检测位点的上游引物EF2、下游引物ER3、以及探针EP3，所述EF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，所述ER3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述EP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；
所述内参组合包括针对β-actin的上游引物FF2、下游引物FR3、以及探针FP1，所述FF2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，所述FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示，所述FP1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示。
2.一种检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；
所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dUTP、dGTP、DNA聚合酶、甜菜碱、UNG酶以及如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的引物和探针组合。
3.如权利要求2所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，其特征在于，在所述PCR反应液中：
所述引物和探针组合中的引物和探针的浓度均为0.05~0.5μM。
4.如权利要求2所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，其特征在于，在所述PCR反应液中：
所述UNG酶的酶活为0.2U；
所述DNA聚合酶的酶活为2.5U。
5.如权利要求2所述的检测系统性红斑狼疮关联基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括rs1055141 T＞C、rs13400210 C＞T、rs4832054 A＞G、rs11585 C＞T、rs12576440 A＞G、以及β-actin的质粒DNA混合物。
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Title
胡金川等: "红细胞免疫分子、T细胞亚群水平及相关基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮、肝细胞癌的关联研究", 国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 10, 15 October 2009 (2009-10-15), pages 065 - 37 *

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