CN118290602A - 一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖及其制备方法与应用 - Google Patents
一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖及其制备方法与应用，属于医药技术领域。本发明通过浸提法提取松杉灵芝粗多糖再经三次纯化得到松杉灵芝酸性纯化多糖。本发明提供的松杉灵芝酸性纯化多糖能有效降低小鼠血清中TC、TG、LDL‑C水平，提高HDL‑C水平，使小鼠脂肪组织脂滴数量和体积明显下降，改善高脂饮食造成的脂肪组织脂质积累，减少脂质浸润，具有更好的降血脂效果。还有效地减小了动脉粥样硬化中脂质核心和巨噬细胞的数量，降低了厚壁菌门的丰度，逆转了高脂饮食引起的乳杆菌丰度下降现象，显著增加有益菌嗜黏蛋白阿克曼菌丰度。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖及其制备方法与应用。
背景技术
动脉粥样硬化是一种严重的心血管疾病，发病率和死亡率都很高，其特征是局部动脉壁炎症和脂质沉积。
目前治疗动脉粥样硬化的主要手段是控制高血压和高脂血症。临床常用的瑞舒伐他汀或阿托伐他汀进行治疗，虽然能一定程度上减少患者的斑块，但多达三分之一的患者仍有动脉粥样硬化进展。此外，使用他汀类药物伴随着肝脏损伤、消化不良、肌肉疼痛等不良反应。目前尚无有效且安全的治疗动脉粥样硬化的方法。在传统中医中，松杉灵芝经常被用来改善健康、增加活力和延长寿命。由于松杉灵芝多糖，安全无害，毒副作用小，越来越多的科研人员开始致力于利用灵芝多糖开发安全、经济、有效的天然药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖及其制备方法与应用，以松杉灵芝子实体为原料，通过提取、分离纯化得到一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)松杉灵芝粗多糖的制备：取松杉灵芝子实体干燥、粉碎过筛、浸泡后恒温水浴提取、离心，得到松杉灵芝粗多糖提取液，将提取液旋转蒸发浓缩后，醇沉后收集沉淀，Sevag法去蛋白，透析去除有机试剂，冻干得松杉灵芝粗多糖；
(2)松杉灵芝酸性多糖的制备：将步骤(1)得到的松杉灵芝粗多糖用去离子水溶解，通过二乙胺基乙基纤维素凝胶柱，以水和氯化钠溶液进行梯度洗脱，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集盐洗酸性多糖，旋转蒸发浓缩、透析过夜、冻干得到松杉灵芝酸性多糖；
(3)初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(2)得到的松杉灵芝酸性多糖用去离子水溶解，通过HiPrep 26/60Sephacryl S-400HR色谱柱纯化，以氯化钠溶液洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩、透析过夜、冻干得到初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖；
(4)松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(3)得到的初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖用去离子水溶解，通过HiLoad 16/600Superdex 200pg制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩、透析过夜，冻干得到松杉灵芝酸性纯化多糖。
进一步的，步骤(1)所述干燥温度为55-65℃；所述过筛时筛网的目数为100-200目；所述浸泡的料液比为1:40-1:60，在4℃冰箱浸泡过夜；所述恒温水浴提取的温度为70-90℃，时间为5-6h；所述旋转蒸发浓缩至1/15体积；所述沉淀为：4℃环境下用75-80％(v/v)乙醇沉淀过夜；收集沉淀利用Sevag法去蛋白，用3500Da的透析袋去除有机试剂后，冻干收集粗多糖。
进一步的，步骤(2)所述松杉灵芝粗多糖浓度为40mg/mL，加入到二乙胺基乙基纤维素凝胶柱中；氯化钠梯度洗脱浓度为0.1、0.3和0.5mol/L，流速为1mL/min。
进一步的，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)所述旋转蒸发浓缩至1/6体积；所述透析的方法为：将浓缩后的溶液装于3500Da透析袋中，温度为4℃。
进一步的，步骤(3)、步骤(4)所述松杉灵芝酸性多糖浓度为5mg/ml；氯化钠溶液的浓度均为0.15mol/L。
本发明还提供了上述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法制备的缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖。
本发明还提供了上述松杉灵芝酸性纯化多糖在缓解动脉粥样硬化药物中的应用。
本发明还提供了一种以上述松杉灵芝酸性纯化多糖为活性成分的药物制剂，还包括一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅剂。
本发明提供的松杉灵芝酸性纯化多糖能有效降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高HDL-C水平，使小鼠脂肪组织脂滴数量和体积明显下降，改善高脂饮食造成的脂肪组织脂质积累，减少脂质浸润，具有更好的降血脂效果。还有效地减小了动脉粥样硬化中脂质核心和巨噬细胞的数量，降低了厚壁菌门的丰度，逆转了高脂饮食引起的乳杆菌(Lactobacillus)丰度下降现象，同时显著增加有益菌嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia)丰度。
附图说明
图1为实施例1松杉灵芝酸性纯化多糖DEAE Sepharose FastFlow洗脱曲线；
图2为实施例1松杉灵芝酸性纯化多糖洗脱曲线。A为HiPrep 26/60Sephacryl S-400HR洗脱曲线；B为HiLoad 16/600Superdex 200pg洗脱曲线；
图3为实施例1松杉灵芝酸性纯化多糖红外光谱图；
图4为实施例1松杉灵芝酸性纯化多糖单糖组分分析图；
图5为实施例2松杉灵芝酸性纯化多糖绝对分子量分析图；
图6为实施例2松杉灵芝酸性纯化多糖总离子流图；
图7为实施例2松杉灵芝酸性纯化多糖扫描电镜图；
图8为实施例3松杉灵芝酸性纯化多糖对小鼠血清脂代谢标志物水平的影响；
图9为实施例3松杉灵芝酸性纯化多糖对小鼠主动脉的影响；A为H&E染色；B为油红O染色；
图10为实施例3小鼠4种脂肪组织HE染色结果图；
图11为实施例3小鼠肠道微生物结果图，A为微生物韦恩图；B为Alpha多样性分析；C为主成分分析；D为门水平物种组成分析；E为属水平物种组成分析；F为物种组成热图；G为物种差异与标志物种分析；
图12为实施例3小鼠脂质核心和巨噬细胞的数量。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：
(1)松杉灵芝粗多糖的制备：将10kg松杉灵芝子实体于60℃烘箱内干燥至恒重后，超微粉碎成粉末，过150目筛。按料液比1:50加入去离子水，搅拌均匀于4℃冰箱浸泡过夜，于80℃恒温水浴中提取5小时。冷却至室温后8000rmp离心5min取上清，旋转蒸发浓缩至1/15体积，使用75％(v/v)乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，Sevag法去蛋白，用3500Da的透析袋去除有机试剂后，冻干收集，得到松杉灵芝粗多糖。
(2)松杉灵芝酸性多糖的制备：将步骤(1)中获得的松杉灵芝粗多糖用去离子水溶解至浓度为40mg/ml，通过二乙胺基乙基纤维素凝胶(DEAE-52)柱，以水和氯化钠溶液进行梯度洗脱(结果如图1所示)，氯化钠浓度为0.1、0.3和0.5mol/L，流速为1mL/min，分别收集不同组分溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集0.3mol盐洗酸性多糖(GTP-c)，旋转蒸发浓缩至1/6体积，用3500Da的透析袋4℃透析72h去除氯化钠，冷冻干燥12h后，得到松杉灵芝酸性多糖；
(3)初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(2)得到的松杉灵芝酸性多糖用去离子水溶解至浓度为5mg/ml，通过HiPrep 26/60Sephacryl S-400HR色谱柱纯化，以0.15mol/L氯化钠溶液洗脱(如图2所示)，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，用3500Da的透析袋4℃透析72h去除氯化钠，冷冻干燥12h后，得到初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖(GTP-c 1)；
(4)松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(3)得到的初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖用去离子水溶解，浓度为5mg/ml，通过HiLoad 16/600Superdex 200pg制备级色谱柱进行进一步纯化，以0.15mol/L氯化钠溶液洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，用3500Da的透析袋4℃透析72h去除氯化钠，冷冻干燥12h后即获得松杉灵芝酸性纯化多糖(GTP-2)。
实施例2
松杉灵芝酸性纯化多糖结构特征分析：
(1)红外光谱分析：称取实施例1制备的干燥的松杉灵芝酸性纯化多糖样品2mg于在研钵中，加入KBr粉末200mg研磨均匀，压片，使用傅里叶变换显微红外光谱仪进行红外扫描样品，波长范围4000～400cm-1，记录红外光谱图，如图3所示。
由图3可知，红外光谱分析表明，多糖样品具有多糖特征吸收峰：3396.79cm-1处存在强且宽的吸收峰，系多糖分子间或分子内氢键O-H伸缩振动的强吸收峰；2889.98cm-1附近的中等强度尖峰为甲基(-CH3)和次甲基(-CH2)的C-H伸缩振动吸收峰；糖醛酸结构中的C＝O的伸缩振动导致红外光谱中1724.87cm-1出现吸收峰；1614.69cm-1处的吸收峰为羰基的C＝O伸缩振动或形成了结晶水；1450-1200cm-1的吸收峰1413.62cm-1，1372.30cm-1为C-H的变角振动吸收峰，它和C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收；1157.46cm-1为吡喃糖C-O-C的伸缩振动；1150-1010cm-1之间的强吸收峰，1072.07cm-1、1044.53cm-1处再次证明了吡喃糖苷的存在，这两处的吸收为C-O-H或C-O-C结构中C-O键的弯曲振动；898.55cm-1为β-吡喃糖苷键的特征区域，推测为多糖中含有β型吡喃糖；796.63cm-1处显示吡喃环的对称环伸缩振动峰。
(2)单糖组成分析：取干净的色谱瓶，精确称量实施例1制备的干燥的松杉灵芝酸性纯化多糖样品5mg(±0.05mg)，加入1mL 2M三氟乙酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入3mL甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2～3次。加入5mL无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。取上清液，旋转浓缩或氮气吹干。加入1mL 2M三氟乙酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2～3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。取单糖标准品溶液或多糖水解液0.2mL于具塞尖底离心管，加入0.2mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液，0.5mL 0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，涡旋混匀后于70℃水浴中反应1h，反应完成后加0.2mL 0.5mol/L盐酸中和所加入的氢氧化钠，加氯仿1mL涡旋萃取3次除去多余的PMP，弃去氯仿层后，取0.3mL加水定容至1mL。使用ThermoU3000液相色谱系统，色谱柱为ZORBAX EclipseXDB-C18，流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾12g/L，2M NaOH调整PH至pH＝6.8)等度洗脱，乙腈和磷酸盐缓冲液的体积比为17:83，流速为0.8mL/min，柱温30℃，检测波长250nm，进样量10μL，结果如图4所示。
由图4可知，松杉灵芝酸性多糖由甘露糖(Man)、盐酸氨基葡萄糖(GlcN)、葡萄糖醛酸(GlcA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)组成，其摩尔比(mol％)为4.11:1.82:11.30:79.25:3.52。
(3)多糖分子量分析：将实施例1制备的干燥的松杉灵芝酸性纯化多糖样品溶解在0.1M NaNO3水溶液(含0.02％NaN3,w/w)中，终浓度为1mg/mL，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤后上机检测。色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，液相系统为U3000(Thermo,USA)，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatt technology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ(Wyatt technology，CA，USA)。柱温45℃，进样量100μL，流动相A(0.02％NaN3，0.1MNaNO3)，流速0.6mL/min，洗脱梯度：等度75min。利用软件ASTRA 6.1处理色谱数据。结果如图5所示，其中以检测的保留时间(Time，min)为横坐标，以摩尔质量MolarMass(g/mol)为纵坐标。
(4)多糖甲基化分析：称取10mg实施例1制备的干燥的松杉灵芝酸性纯化多糖样品，加入1mL一级水溶解，加入1mL 100mg/mL碳二亚胺，反应2h；加入1mL 2M的咪唑，加入1mL30mg/ml的NaBD4，反应3h；加入100μl冰醋酸终止反应。透析样品48h，透析完成后冷冻干燥样品，进行甲基化处理；冻干样品中加入500μLDMSO溶解；加入1mg NaOH，孵育30min；加入50μL碘甲烷溶液反应1h；加入1mL水和2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次；吸取下层二氯甲烷相并蒸干；加入100μL 2M TFA，121℃反应90min；30℃蒸干；加入50μL 2M氨水，50μL 1M NaBD4，混匀，室温下反应2.5h；加入20μL乙酸终止反应，氮气吹干，250μL甲醇洗两次，氮气吹干；加入乙酸酐250μL，涡旋混匀，100℃反应2.5h；加入1mL水静置10min；加入500μL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次；取下层二氯甲烷相，上机检测。色谱系统采用的是Agilent气象色谱系统(Agilent 7890A；Agilent Technologies，USA)，HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，载气为高纯氦气(纯度不小于99.999％)，流速1.0mL/min，进样口的温度为260℃。进样量1μL，分流进样，分流比10:1，溶剂延迟2.2min。50℃保持1.0min，50℃/min升温至130℃，3℃/min升温至230℃，保持2min。质谱系统采用的是美国Aiglent公司的四极杆质谱检测系统(Agilent5977B；Agilent Technologies，USA)，配有电子轰击离子源(EI)和MassHunter工作站。电子轰击离子源(EI)，进样口温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围(m/z):30-600。样品总离子流如图6。
根据保留时间和复杂碳水化合物研究中心(CCRC)光谱数据库中部分甲基化糖醇乙酸酯(PMAA)的标准数据，松杉灵芝酸性多糖主要由6个糖苷片段组成(如表1所示)。非还原末端(t-Glc(p))和分支糖残基(3-Glc(p)，4-Glc(p)，4-Glc(p)UA，6-Glc(p)和3,6-Glc(p))的摩尔比分别达到16.748％和75.998％，表明可能存在分支残基。
表1松杉灵芝酸性多糖的甲基化分析结果
| 连接方式 | 衍生物名称 | MW | RT(min) | 相对摩尔比(％) |
| t-Glcp | 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methylglucitol | 323 | 16.809 | 16.748 |
| 3-Glc(p) | 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methylglucitol | 351 | 19.694 | 18.701 |
| 4-Glc(p) | 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methylglucitol | 351 | 20.034 | 6.840 |
| 4-Glc(p)UA | 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methylglucitol | 351 | 20.034 | 10.300 |
| 6-Glc(p) | 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methylglucitol | 351 | 20.553 | 21.490 |
| 3,6-Glc(p) | 1,3,5,6-tetra-O-acetyl-2,4-di-O-methylglucitol | 379 | 23.511 | 18.667 |
(5)扫面电镜分析：为了观察多糖的微观结构和形态特征，对松杉灵芝酸性多糖进行扫描电镜分析，如图7所示。由图7可知，在聚集状态下，观察到具有不均匀表面的不规则分支网络结构，表明多糖无定形结构。多糖表面厚薄不均，出现波峰和凹陷，可能是多糖的分枝结构造成的。
实施例3
松杉灵芝酸性纯化多糖缓解动脉粥样硬化活性研究
(1)小鼠分组及给药：准备8只健康6周龄雄性C57BL/6J小鼠，饲养温度23±1℃，相对湿度55±5％，正常饲料喂养，作为对照组(灌胃给予10mL/kg生理盐水)。24只ApoE-/-小鼠先进行高脂饲料喂养4周诱导建立动脉粥样硬化小鼠模型。ApoE-/-小鼠随机分成3组，每组8只，分别作为模型组(灌胃给予10mL/kg生理盐水)、多糖组(灌胃给予松杉灵芝酸性纯化多糖100mg/kg)、阳性对照组(灌胃给予瑞舒伐他汀3mg/kg)。连续给药6周，过程中一直给予高脂饮食。
(2)样本的制备方法：末次给药后，各组小鼠禁食、不禁水4h后尾静脉取血，室温静置30min，3000r/min离心10min，取上清，置于-80℃冰箱保存待用。随后将实验动物处死，先取盲肠内容物，迅速分离小鼠主动脉及eWAT、iWAT、pWAT和BAT4种脂肪，-80℃冰箱保存，备用。
(3)血清脂代谢相关因子检测：根据ELISA试剂盒提供说明书进行测试，检测小鼠血清中胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
脂代谢紊乱是诱发高脂血症的关键原因，血清中的TG，TC，HDL-C，LDL-C的含量可在一定程度反映机体脂肪代谢状况，可作为监测血脂变化的重要指标。研究表明高脂血症会导致TC、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平降低。各组对小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影响结果如图8所示。由图8可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中LDL-C、TC和TG水平明显升高，HDL-C水平明显降低。而与模型组小鼠相比，本申请松杉灵芝酸性纯化多糖能够有效降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高HDL-C水平，具有显著的降血脂活性。
(4)组织病理学观察：脂肪和主动脉标本在4％多聚甲醛中固定，4℃保存。常规石蜡包埋、切片，采用HE和油红O染色，通过光学显微镜观察，进行病理分析，结果如图9所示。如图9A所示，模型组的小鼠比对照组的小鼠产生更多的主动脉斑块，细胞肿胀明显，阳性药和多糖治疗均显著减少了病变。油红色O染色主动脉也显示，阳性药和多糖治疗均显著减少了胞质中有明显的脂肪液滴(图第9B段)。
肥胖会引起小鼠脂肪组织中出现大量体积较大的白色空泡，脂滴数量和体积均显著增加，脂肪浸润度高。各组对小鼠4种脂肪组织(腹股沟脂肪iWAT、附睾脂肪eWAT、肾周脂肪pWAT、棕色脂肪BAT)的影响如图10所示：与模型组相比，松杉灵芝酸性多糖能使脂滴数量和体积明显下降，改善高脂饮食造成的脂肪组织脂质积累，减少脂质浸润，具有更好的降血脂效果。
(5)肠道微生物群落分析：粪便样本从对照组、模型组、阳性药组、多糖组中随机选择(n＝6/组)。使用IlluminaMiSeq平台对每个样本的细菌组成进行16S rRNA基因分析。序列被分配到具有>97％的成对同一性的操作分类单元(OTU)。使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)来确定各组的生物标志物(当LDA评分>2，p≤0.05时显著)，结果如图11所示。
松杉灵芝纯化酸性多糖通过靶向肠道菌群对宿主具有有益作用。进一步比较了实验组的肠道微生物群。根据韦恩图，共有170个OTU(图11A)，而对照组、模型组和多糖组分别发现2548个(86.69％)、812个(56.62％)和662个(55.86％)唯一OTU(见图11A)，这表明各组之间肠道菌群组成存在显著差异。如图11B所示，高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠显示出明显较低的肠道菌群丰度和多样性。主坐标分析(PCoA)揭示了三组肠道微生物组整体结构的特定分离(图11C)。在门水平上，多糖降低了厚壁菌门的丰度，逆转了高脂饮食引起的肠道菌群失衡(图11D)。在属水平上，多糖的Akkermansia丰度显著增加(图11E)。Akkermansia已被证明对改善小鼠的肥胖、2型和1型糖尿病、肠道炎症和不同癌症有疗效。不同类群的前20个细菌属在属水平上的群落热图如图11F所示，多糖逆转了Lactobacillus丰度的下降，据报道，Lactobacillus是一种肠道益生菌。此外，线性判别分析效应大小(LEfSe)分析显示，Bacteroidetes在各组中有差异表达(p<0.05，LDA>2.0)(图11G)。
(6)免疫荧光分析：利用TSA法，使用CD86、CD206一抗体进行染色。使用山羊抗兔二级抗体和DAPI对细胞核进行染色。使用Pannoramic SCAN显微镜拍摄安装的组织载玻片。使用ZEN2.6软件对强度剖面进行分析。
为了评估斑块的特征，对动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞进行染色，为了评估多糖是否直接影响巨噬细胞极化，用CD86和CD206对斑块进行染色，这两种标记物分别常用于巨噬细胞M1和M2标记，结果如图12所示。由图12可知，相对于模型组，多糖组在主动脉中的CD86荧光强度较小，这表明松杉灵芝多糖有效地减小了动脉粥样硬化中脂质核心和巨噬细胞的数量，而多糖组中CD206的表达量增加，表明多糖能促进巨噬细胞能向抗炎表型M2型极化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)松杉灵芝粗多糖的制备：取松杉灵芝子实体干燥、粉碎过筛、浸泡后恒温水浴提取、离心，得到松杉灵芝粗多糖提取液，将提取液旋转蒸发浓缩，醇沉后收集沉淀，Sevag法去蛋白，透析去除有机试剂，冻干得松杉灵芝粗多糖；
(2)松杉灵芝酸性多糖的制备：将步骤(1)得到的松杉灵芝粗多糖用去离子水溶解，通过二乙胺基乙基纤维素凝胶柱，以水和氯化钠溶液进行梯度洗脱，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集盐洗酸性多糖，旋转蒸发浓缩、透析过夜、冻干得到松杉灵芝酸性多糖；
(3)初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(2)得到的松杉灵芝酸性多糖用去离子水溶解，通过HiPrep 26/60Sephacryl S-400HR色谱柱纯化，以氯化钠溶液洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩、透析过夜、冻干得到初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖；
(4)松杉灵芝酸性纯化多糖的制备：将步骤(3)得到的初步纯化的松杉灵芝酸性纯化多糖用去离子水溶解，通过HiLoad 16/600Superdex 200pg制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩、透析过夜，冻干得到松杉灵芝酸性纯化多糖。
2.根据权利要求1所述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述干燥温度为55-65℃；所述过筛时筛网的目数为100-200目；所述浸泡的料液比为1:40-1:60，在4℃冰箱浸泡过夜；所述恒温水浴提取的温度为70-90℃，时间为5-6h；所述旋转蒸发浓缩至1/15体积；所述醇沉为：4℃环境下用75-80％(v/v)乙醇沉淀过夜；收集沉淀利用Sevag法去蛋白，用3500Da的透析袋去除有机试剂后，冻干收集粗多糖。
3.根据权利要求2所述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述松杉灵芝粗多糖浓度为40mg/mL，加入到二乙胺基乙基纤维素凝胶柱中；氯化钠梯度洗脱浓度为0.1、0.3和0.5mol/L，流速为1mL/min。
4.根据权利要求3所述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)所述旋转蒸发浓缩至1/6体积；所述透析的方法为：将浓缩后的溶液装于3500Da透析袋中，温度为4℃。
5.根据权利要求4所述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)、步骤(4)所述松杉灵芝酸性多糖浓度为5mg/ml；氯化钠溶液的浓度均为0.15mol/L。
6.一种权利要求1～5任一项所述松杉灵芝酸性纯化多糖的制备方法制备的缓解动脉粥样硬化的松杉灵芝酸性纯化多糖。
7.一种权利要求6所述松杉灵芝酸性纯化多糖在缓解动脉粥样硬化药物中的应用。
8.一种以权利要求6所述的松杉灵芝酸性纯化多糖为活性成分的药物制剂，还包括一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅剂。
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