CN118240773A - 一种荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006及其在食品保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光假单胞菌噬菌体YZU‑PF‑006及其在食品保鲜中的应用，该噬菌体已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年1月22日，保藏编号为CCTCC NO:M 2024152。本发明获得一种高效裂解致腐性荧光假单胞菌的噬菌体，可应用于食品加工和冷藏的保鲜中，尤其是能显著抑制生牛乳在冷链流通中由荧光假单胞菌增殖和代谢引起的腐败和品质劣变，延长产品货架期。同时，该噬菌体可单独或复配制备保鲜剂或生物控制剂，能有效抑制设备、器皿、原料固体表面荧光假单胞菌生物被膜形成，且制备简单，使用方便，为乳品保鲜和货架期延长提供一种安全、高效、廉价的生物制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006及其作为生物抗菌剂在低温保鲜、贮藏环境中的抑菌应用。
背景技术
荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)是一种好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，无菌毛，有数根极端鞭毛，广泛存在于乳制品、肉制品、水产品等高蛋白和高脂食品中，致腐能力极强，且能在低温条件下繁殖代谢，是原料乳及其乳制品中的优势腐败菌。其分泌的耐热性蛋白酶和脂肪酶难以被巴氏杀菌和瞬时高温灭菌(UHT)灭活，从而会导致冷藏食品的风味等理化性质发生劣变。因此，荧光假单胞菌被认为是冷藏温度下引起食品品质劣变的重要腐败菌，对全球乳品工业造成重大经济损失。
当前乳品生产加工过程中用于控制生产环境中细菌生长的抑菌方法主要为依赖于强酸和强碱的CIP清洗，该方法中使用的化学试剂残留对人畜健康有危害并会对环境造成污染。荧光假单胞菌在适应CIP清洗的过程中，极易在乳品储存容器及加工设备的表面，尤其是弯角、垫圈、管材连接处等难清洗之处形成生物被膜，被膜态的细菌对常规杀菌剂的抵抗能力提高数百倍，极难被清除，从而引起持续性的微生物污染。此外，处生物被膜状态的荧光假单胞菌所分泌腐败酶的量是对应浮游态微生物产生的数倍，腐败酶的耐热性也显著提高，这将大大增加腐败酶在原料奶运输、加工过程中出现并最终导致乳品品质劣变的几率。
近年来，出于对食品绿色抗菌的迫切需求，已经从动植物、微生物中提取出大蒜素、茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素等天然抗菌物质作为生物抑菌剂。上述抗菌剂虽能满足绿色环保需求，但存在制造成本昂贵、易引起食品风味和品质改变、杀菌效果不佳等缺点，因此亟待开发新型生物抑菌剂。
噬菌体作为一类细菌依赖性病毒，广泛存在于自然界中，制备成本低，且对人畜健康无害。近年来，新型噬菌体抑菌剂研发已受广泛关注，世界各国在噬菌体资源、生物学特性以及在不同基质中的减/控菌展开大量研究，在美国和欧洲国家已经形成沙门氏菌、李斯特菌等病原菌的商品化生物抑菌剂，在控制食品及生产环境中的致腐/致病菌污染与传播中表现出高效、廉价、安全等优势。荧光假单胞菌是原料乳及乳制品中的优势腐败菌，开发以荧光假单胞菌噬菌体作为主要组分的生物控制剂或保鲜剂，可对减少乳制品的低温腐败，提升乳品品质具有潜在价值。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对荧光假单胞菌生长具有强烈裂解作用的噬菌体，该噬菌体可用于食品生产和冷藏保鲜中，尤其是能抑制冷链流通过程中由荧光假单胞菌增殖引起的乳制品以及冷鲜食品腐败变质，从而延长产品货架期。
本发明还提供所述噬菌体的应用，该噬菌体能单独或复配制备保鲜剂或生物控制剂，能有效抑制冷藏条件下乳制品以及冷鲜食品中由荧光假单胞菌繁殖与代谢引起的腐败和品质劣变，为乳品以及冷鲜食品保鲜和货架期延长提供一种安全、高效、廉价的生物制剂。此外，本发明还提供该噬菌体在乳品以及冷鲜食品加工过程中作为生物被膜抑制剂中的应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明所述的一种荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)噬菌体YZU-PF-006，经鉴定具有独特的基因组结构特征，属于一种新型噬菌体，本发明的噬菌体是从江苏省扬州市污水样品中分离获得，具有高效裂解荧光假单胞菌功能的荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006(Pseudomonas fluorescens phage YZU-PF-006)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCCNO:M 2024152；保藏日期：2024年1月22日。
本发明中荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006具有以下生物学特征：
(1)形态学特征：通过透射电镜观察，YZU-PF-006头部对称，直径约为58nm，尾部长5nm，形态学特征归属短尾噬菌体科。
(2)核酸类型：YZU-PF-006为dsDNA噬菌体。
(3)基因组结构特征：YZU-PF-006基因组全长为40307bp，GC含量为59.93％。其中ORFs 37500bp，平均长度为797bp，占总长的93.0％。GC含量为57.3％。含有45个开放阅读框(ORFs)，包括17个假设蛋白(hypothetical protein)和23个已知蛋白功能的序列。不含有任何已知的毒力基因。经NCBI数据库全基因组比对发现，与噬菌体YZU-PF-006接近的噬菌体的同源性均低于95％，根据目前的命名法则，YZU-PF-006为一种新型噬菌体。(4)在4-37℃温度下具有强烈裂解荧光假单胞菌功能。
(5)在4-37℃温度下能够抑制荧光假单胞菌生物被膜形成。
(6)在4-37℃温度下能够延缓荧光假单胞菌对牛奶品质的影响。
本发明所述的噬菌体YZU-PF-006在抑制荧光假单胞菌中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制食品或者环境中荧光假单胞菌中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制原料乳中荧光假单胞菌中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制冷鲜食品荧光假单胞菌中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006在用于原料乳保鲜及其乳品生产环境或保藏运输器具中清除荧光假单胞菌及其生物被膜中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006在在抑制冷鲜食品加工、低温冷链过程中荧光假单胞菌繁殖、代谢及其生物被膜中的应用。
本发明所述的噬菌体YZU-PF-006在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
其中，所述噬菌体YZU-PF-006分离物或培养物单独或者与现有抑菌剂混合在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
其中，纯化的噬菌体BtpYZU01噬菌体YZU-PF-006制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中荧光假单胞菌污染；或者将纯化的噬菌体作为保鲜剂，在配料和贮藏时加入，用于抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中荧光假单胞菌代谢和繁殖。
本发明将上述荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006制备成一种微生态制剂，用作食品冷藏保鲜中的保鲜剂，制备方法特征在于：分别取100μLYZU-PF-006噬菌体液与相应对数生长期的荧光假单胞菌菌液100μL混合，室温放置10min，然后加到10mL TSB液体培养基中，28℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经8000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加PEG 8000，NaCl，摇匀至溶解，4℃过夜；于4℃下10000×g离心20min，去上清液；加0.5mL SM(1L：NaCl5.8g，MgSO47H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH 7.4)50mL)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；于4℃下3000×g离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的YZU-PF-006噬菌体颗粒与SM缓冲液按1：10比例混合形成噬菌体制剂母液。
有益效果：与现有技术相比较，本发明具有如下优点：
本发明分离获得能够高效裂解荧光假单胞菌的噬菌体YZU-PF-006，具有独特的形态和功能特征，是一种全新的有效抑制荧光假单胞菌的噬菌体，该噬菌体YZU-PF-006可应用于制备绿色、廉价的荧光假单胞菌抑制剂中。
由于本发明的噬菌体YZU-PF-006通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行除菌，能有效控制各种基质中荧光假单胞菌的生长及生物被膜形成，从而降低生产环境中荧光假单胞菌对冷鲜产品的污染风险；本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，具有宿主专一性，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可作为冷鲜食品及其储放设备、器皿、环境、原料固体表面的专用保鲜剂或生物控制剂。
本发明提出了一种低温致腐菌-荧光假单胞菌噬菌体，其作为生物抑菌剂乳制品冷藏保鲜中的应用。本发明的荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006可运用在低温保鲜中，其制剂能够抑制原料乳储运及冷藏乳制品及其环境中荧光假单胞菌的生长，有效降低荧光假单胞菌致病和引发乳制品品质劣化的风险，从而延长产品货架期。
附图说明
图1为噬菌体YZU-PF-006噬菌斑形态。
图2为噬菌体YZU-PF-006透射电镜图片。
图3为噬菌体YZU-PF-006全基因组序列特征。
图4为噬菌体YZU-PF-006在不同MOI下对固体表面荧光假单胞菌生物膜的抑制与清除作用。图4A为对固体表面荧光假单胞菌生物膜的抑制结果；图4B对固体表面荧光假单胞菌生物膜的清除作用结果。
图5为噬菌体YZU-PF-006在不同MOI下对培养基中的荧光假单胞菌抑制作用。图中黑色曲线(对照组)表示未加噬菌体YZU-PF-00的荧光假单胞菌接种物28℃恒温培养过程中OD值变化；彩色曲线(试验组)为不同MOI噬菌体YZU-PF-006处理的荧光假单胞菌接种物在28℃恒温培养过程中OD值变化。
图6为噬菌体YZU-PF-006在牛奶模型中对荧光假单胞菌的生长抑制作用。图中黑色曲线表示未经噬菌体处理的高温灭菌奶在28℃恒温培养过程中菌落数变化；彩色曲线表示不同MOI噬菌体YZU-PF-006处理的高温灭菌奶在28℃恒温培养过程中菌落数变化。
图7为噬菌体YZU-PF-006在牛奶模型中对荧光假单胞菌产生蛋白酶的抑制作用。A为不同MOI下的噬菌体YZU-PF-006在24小时的处理结果；B为不同MOI下的噬菌体YZU-PF-006在36小时处理结果；C为不同MOI下的噬菌体YZU-PF-006在48小时处理结果。使用偶氮酪蛋白作为底物酶活力用单位时间、单位体积变化的吸光度表示(ΔA/h/mL)。
图8为噬菌体YZU-PF-006在低温牛奶模型中对荧光假单胞菌的生长抑制作用。图中黑色曲线表示未经噬菌体处理的高温灭菌奶在7℃恒温培养过程中菌落数变化；彩色曲线表示不同MOI噬菌体YZU-PF-006处理的高温灭菌奶在7℃恒温培养过程中菌落数变化。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。
本发明试验用噬菌体宿主菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens，菌株号：P.F17)，采用常规方法分离自腐败原料乳样品(Calcium-mediatedmodulation ofPseudomonas fluorescens biofilm formation，J.Dairy Sci.TBC。2023；Microbialbiodiversity of raw milk collected from Yangzhou and the heterogeneousbiofilm-forming ability ofPseudomonas，Society ofDairy Technology，2022)，由扬州大学食品科学与工程学院食品质量与安全实验室保藏，为一株野生型荧光假单胞菌。
实施例1
噬菌体分离及纯化制备
噬菌体分离
污水样品采自江苏扬州农贸市场。取30mL污水样品放入50mL离心管，5000×g离心10min，取5mL上清液加入到5mL TSB液体培养基中，加入100μL对数生长期的荧光假单胞菌菌株P.F17，28℃，100rpm摇床培养过夜；将试管中培养物转至无菌离心管中，4℃，5000×g离心10min，取上清过0.22μm滤膜，得到的噬菌体裂解液。
用SM缓冲液(1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)对噬菌体原液按体积比进行10倍梯度稀释，取100μL稀释后的噬菌体悬液与100μL对数生长期的荧光假单胞菌在室温下混合10min，再加入5mL TSB半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的TSB固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在28℃恒温培养箱中培养。
在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；次日用无菌SM缓冲液对噬菌体液进行10倍梯度稀释(10-1-10-7)，分别取各稀释度的噬菌体液100μL与100μL对数生长期的荧光假单胞菌在室温下混合10min，再加入5mL TSB半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的TSB固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在28℃恒温培养箱中过夜培养。重复双层平板法的操作3次，得到的噬菌斑大小一致后，即认为分离到的是纯的噬菌体，挑取50个噬菌体空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；于次日取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得噬菌体分离液，4℃保存备用。采用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。在5mL融化好的TSB半固体培养基中加入50μL荧光假单胞菌培养物(对数生长期的荧光假单胞菌P.F17菌液)，立即倾倒在底层TSB固体培养基上，在室温下放置10min，待培养基凝固后，在划分好的区域中分别滴加10μL各上述噬菌体分离液，在无菌操作台中吹干后将平板倒置于28℃培养箱中过夜培养，筛选在菌株P.F17平板上的裂解圈均明亮清澈的噬菌体，命名为YZU-PF-006。
噬菌体的纯化制备
取100μL荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006分离液(制备方法同上)与100μL对数期生长期的荧光假单胞菌液(P.F17菌液)混合，室温放置10min，然后加入10mL TSB液体培养基，28℃，150rpm恒温振荡培养过夜；将培养物转至灭菌离心管，5000×g离心10min后收集上清，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌；收集噬菌体增殖液，加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃放置过夜；4℃条件下10000×g离心20min，去上清，加0.5mL SM(1L：NaCl5.8g，MgSO47H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH 7.4)50mL)溶液，室温作用1h；加入等体积氯仿抽提30s；3000×g离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，即为噬菌体纯化液；用双层平板检测噬菌体纯化液滴度，具体程序为：用SM缓冲液对噬菌体纯化液进行10倍梯度稀释(10-1-10-7)，取各稀释度的噬菌体稀释液100μL与100μL对数生长期的荧光假单胞菌在室温下混合10min，再加5mL TSB半固体培养基，混匀，倾倒在TSB固体培养基上，凝固后倒置放在28℃恒温培养箱中培养8h，对形成的空斑进行人工计数，计算滴度。结果显示YZU-PF-006纯化液对菌株P.F17滴度均达到1012PFU/mL以上，而YZU-PF-006纯化液与荧光假单胞菌P.F17(等体积对数期菌液混合)作用的平板上形成的噬菌斑明亮清澈、大小均一(如图1所示)，说明对菌株P.F17有抑制作用。
实施例2
噬菌体YZU-PF-006特征分析
噬菌体形态特征
用透射电镜观察噬菌体微观形态特征。采用磷钨酸负染色法，将铜网有膜的一面朝上，取10μL实施例1中获得的YZU-PF-006纯化液(1012PFU/mL)滴于铜网上，吸附15min后吸干水分，取出铜网，自然干燥2-3min。然后在铜网上滴加2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。噬菌体YZU-PF-006微观形态如图2所示，噬菌体YZU-PF-006呈现头部对称，直径约为58nm，尾部长约5nm，形态学特征归属短尾噬菌体科。
噬菌体基因组特征
将上述制备的噬菌体YZU-PF-006纯化液(1012PFU/mL)加DNase I至终浓度5μg/mL，RNaseA至1μg/mL，37℃温育1h；加入EDTA(pH 8.0)至终浓度20mmol/L；加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，加SDS至终浓度0.5％(mg/mL)，混匀，56℃孵育1h；加入等体积平衡酚(pH 8.0)振荡抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；用等体积氯仿抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；加入1/10体积3mol/LNaAc(pH 5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜；4℃，12000×g离心10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，沉淀在空气中干燥10min；用适量TE(pH 8.0)混悬沉淀，应用GeneQuant核酸定量仪进行噬菌体DNA定量，-20℃保存；提取获得的噬菌体DNA送至上海凌恩生物基因测序有限公司进行Illumina Hiseq测序。噬菌体DNA测序结果(如图3所示)显示YZU-PF-006基因组全长为40307bp(SEQ IDNO.1)，GC含量为59.93％。其中ORFs37500bp，平均长度为797bp，占总长的93.0％。GC含量为57.3％。含有45个开放阅读框(ORFs)，包括17个假设蛋白(hypothetical protein)和23个已知蛋白功能的序列。不含有任何已知的毒力基因。经NCBI数据库全基因组比对发现，与噬菌体YZU-PF-006接近的噬菌体的同源性均低于95％，例如同源性最近的噬菌体phage vB_Pci_PCMW57(94.92％)，根据目前的命名法则，YZU-PF-006为一种新型噬菌体。基因组数据显示YZU-PF-006为一种新的噬菌体。结合噬菌体的生理生化特征，鉴定为荧光假单胞菌噬菌体，命名为荧光假单胞菌噬菌体YZU-PF-006(PseudomonasfluorescensphageYZU-PF-006)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:M 2024152；保藏日期：2024年1月22日。
实施例3
噬菌体YZU-PF-006对荧光假单胞菌生物被膜形成的抑制与清除作用
取对数生长期的荧光假单胞菌(荧光假单胞菌P.F17)，用TSB液体培养基将菌株浓度稀释到104CFU/mL。用TSB液体培养基将噬菌体稀释为108、107、106、105、104、103、102PFU/mL，分取500μL菌液与噬菌体于1.5mL离心管中混匀，加入96孔板。设五组平行。在28℃下培养48h。倒掉96孔板中的菌液，用PBS冲洗3次，去除未粘附浮游细胞，室温下晾干。各孔加入200μL甲醇溶液固定粘附细胞，15min后倒掉，晾干。各孔加入200μL 0.05％(W/V)结晶紫染色，10min后倒掉，PBS冲洗3次，晾干。加入200μL的33％(V/V)乙酸水溶液，溶解10min后，将各孔中的菌液依次吸入相对应的新96孔板的孔中，在600nm处测定其OD值。
实验结果如图4A所示，加入噬菌体的各个实验组的OD600nm均显著低于阴性对照组(p<0.01)，表明噬菌体YZU-PF-006显著抑制荧光假单胞菌生物被膜的形成。
取对数生长期的荧光假单胞菌(荧光假单胞菌P.F17)，用TSB液体培养基将菌株浓度稀释到104CFU/mL。加入96孔板。设五组平行。在28℃下培养48h。倒掉96孔板中的菌液，用TSB液体培养基将噬菌体稀释为108、107、106、105、104、103、102CFU/mL，加入96孔板。按上述方法测定OD值。
实验结果如图4B所示入噬菌体的实验组的OD600nm均显著低于阴性对照组(p<0.01)，表明噬菌体YZU-PF-006显著清除了荧光假单胞菌产生的生物被膜。表明噬菌体YZU-PF-006均可以显著抑制和清除固体多孔板表面荧光假单胞菌生物被膜。
实施例4
噬菌体YZU-PF-006在培养基中的抑菌作用
将荧光假单胞菌(菌株P.F17)按104CFU/mL浓度接种到30mL LB液体培养基，YZU-PF-006处理组中加入噬菌体YZU-PF-006悬液至不同MOI，阴性对照组中加入等体积SM缓冲液(0PFU/mL)，经处理的接种物分别放置在28℃培养箱中恒温培养，每隔1h取样1mL，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于分析。
实施结果如图5所示，随着培养时间延长，阴性对照组OD600nm快速增长，24h时达到1.4，而添加YZU-PF-006处理组OD600nm在培养24h内始终保持在较低的水平(OD600nm<0.3)，表明本发明中YZU-PF-006噬菌体在培养基中对荧光假单胞菌生长起到显著抑制作用(p<0.01)。
实施例5
噬菌体YZU-PF-006高温灭菌奶中的抑菌作用
使用购买的高温灭菌奶，将荧光假单胞菌(菌株P.F17)按104CFU/mL浓度接种到40mL高温灭菌奶中，YZU-PF-006处理组加入不同MOI下的噬菌体，阴性对照组中加入等量的SM缓冲液(0PFU/mL)，放置在28℃培养箱中恒温培养24h，每隔3h取样1mL，使用平板稀释涂布法测定菌含量，每组设置3个平行，取平均值用于分析。
实施结果如图6所示，在牛奶恒温保藏24h内，阴性对照组的菌落数在24h内迅速上升至108CFU/mL左右，而噬菌体YZU-PF-006在24h以内均能将菌落数控制在2logCFU/mL左右，抑菌效果显著，结果显示本发明中各组YZU-PF-006噬菌体在牛奶中对荧光假单胞菌起到显著抑制作用(p<0.01)。
实施例6
噬菌体YZU-PF-006对荧光假单胞菌蛋白酶产生的抑制作用
使用购买的高温灭菌奶，将活化后的菌种(菌株P.F17)与不同浓度的噬菌体YZU-PF-006等比例混合接种在10mL的UHT(高温灭菌奶)牛奶中，使最终菌落数为104CFU/mL。噬菌体MOI浓度在0.001到100之间。于28℃培养48h。第24小时开始每12h取一次样，每次取样1mL培养后的样品在4℃下12000g离心10min。以偶氮酪蛋白作为底物来测定蛋白酶活性。取100μL离心后的上清液与500μL的PBS缓冲液(50mmol/L，pH 7.2)混合，添加100μL的浓度为1.5％偶氮酪蛋白溶液(溶解于50mmol/L，pH 7.2的PBS缓冲液，现配现用)，于37℃下反应60min后，添加500μL的浓度为20％的TCA终止反应。经4℃、12000g离心5min后，测定366nm下的吸光度。酶活力用单位时间、单位体积变化的吸光度表示(ΔA/h/mL)。分别做三个平行，每个平行重复测定三次。24h，36h，48h后的实施结果分别如图7A，图7B和7C所示，YZU-PF-006可以有效的控制蛋白酶活的增加，随贮藏时间增加，YZU-PF-006处理组酶活在整个实验期始终低于对照组，表明本发明中YZU-PF-006噬菌体处理对牛奶中荧光假单胞菌蛋白酶活具有显著的抑制作用。
实施例7
噬菌体YZU-PF-006在7℃下在高温灭菌奶中的抑菌作用
使用购买的高温灭菌奶，将荧光假单胞菌(菌株P.F17)按104CFU/mL浓度接种到40mL高温灭菌奶中，YZU-PF-006处理组加入不同MOI下的噬菌体，阴性对照组中加入等量的SM缓冲液(0PFU/mL)，放置在7℃培养箱中恒温培养192h，每隔24h取样1mL，使用平板稀释涂布法测定菌含量，每组设置3个平行，取平均值用于分析。
实施结果如图8所示，在牛奶7℃保藏192h内，阴性对照组的菌落数在96h内迅速上升至108CFU/mL左右，而噬菌体YZU-PF-006在96h以内均能将菌落数控制在很低的数量级下，抑菌效果显著，结果显示本发明中YZU-PF-006噬菌体在低温储藏环境下对牛奶中的荧光假单胞菌菌起到显著抑制作用(p<0.01)。
Claims (10)
1.一种荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)噬菌体YZU-PF-006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年1月22日，保藏编号为CCTCC NO:M 2024152。
2.一种权利要求1所述的噬菌体YZU-PF-006在抑制荧光假单胞菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制食品或者环境中荧光假单胞菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制原料乳中荧光假单胞菌中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006在抑制冷鲜食品荧光假单胞菌中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006在用于原料乳保鲜及其乳品生产环境或保藏运输器具中清除荧光假单胞菌及其生物被膜中的应用。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006在在抑制冷鲜食品加工、低温冷链过程中荧光假单胞菌繁殖、代谢及其生物被膜中的应用。
8.一种权利要求1所述的噬菌体YZU-PF-006优选在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述噬菌体YZU-PF-006分离物或培养物单独或者与现有抑菌剂混合在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，纯化的噬菌体BtpYZU01噬菌体YZU-PF-006制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中荧光假单胞菌污染；或者将纯化的噬菌体作为保鲜剂，在配料和贮藏时加入，用于抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中荧光假单胞菌代谢和繁殖。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410409583.7A CN118240773A (zh) | 2024-04-07 | 2024-04-07 | 一种荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006及其在食品保鲜中的应用 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN118240773A true CN118240773A (zh) | 2024-06-25 |
Family
ID=91562107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410409583.7A Pending CN118240773A (zh) | 2024-04-07 | 2024-04-07 | 一种荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006及其在食品保鲜中的应用 |
Country Status (1)
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|---|---|
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-
2024
- 2024-04-07 CN CN202410409583.7A patent/CN118240773A/zh active Pending
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| PB01 | Publication |