阿萨太罗欣类抗癌化合物及其制法和药物组合物及用途
本发明关于一种新颖阿萨太罗欣(Azatyrosine)类抗癌化合物,以及阿萨太罗欣类抗癌化合物的制造方法和医药上的用途。
癌症是一种发生在人类及大部分动物身上的疾病,引起癌症病征的肿瘤(tumor)生长速度超过正常组织且不协调,具备有生长较快及分化较不完全的特色。而肿瘤细胞为了要能较快速生长,其细胞内的生化代谢途径以及遗传物质在功能上的表现较一般正常细胞强,因此这些高度表现的代谢途径以及遗传物质便成为药物设计以及癌症化学治疗上的一个显著目标。但由于正常细胞也具备了上述的代谢途径以及遗传物质,因此都具有对肿瘤细胞缺少专一性及选择性以及毒性太大的缺点。而目前使用的抗癌药大部分都是细胞毒化合物。为了避免这些毒性副作用的发生,设计具有选择性的抗癌药一直是癌症化学治疗药物开发的一大挑战。
近年来细胞生长循环和肿瘤生成间关联的研究显示,细胞生长循环的错乱是形成癌细胞生长不受控制以及遗传上的不稳定性两个主要特征的成因,如文献1:(Hunter,T.;Pines,J.Cell,1994,79,573-584)中描述的。细胞中的讯息传递在细胞生长循环中扮演了重要的角色,如文献2:(Prescott,D.M.Jones and Bartlett Publishers,Boston,1988)所述,而在分子生物学的领域中讯息传递和致癌基因间的关系也越来越清楚如文献3和4、5:(Parker,P.J.;Katan,M.,“Molecular Biology of Oncogenes andCell Control Mechanism”,Ellis Horwood Limited,New York,1990.Cooper,G.M.,“Oncogenes”,2nd ed.,Jones and BartlettPublishers,London,1995,Fry,D.W.,Recent Advances in Tyrosine KinaseInhibitors,Annu.rep.med.chem.,1996,31,151-160)。
哺乳类动物细胞中的H-,K-及N-ras原致癌基因经解码后会分别产生相应的p21ras蛋白质,在与GAP(GTPase activating protein)结合后则会有GTPase的活性,在讯息传递以及细胞的增殖和分化上扮演重要且基本的角色,如文献6、7:(Bolton,G.L.;Sebolt-Leopold,J.S.;Hodges,J.C.,Annu.Rep.Med.Chem.,1994,29,165-174.;Grand,R.J.A.in“New Molecular Targets in Cancer Chemtherapy”Kerr,J.D.;Workman,P.Eds.,CRCPress,Boca Raton,F1,1994.)所描述的。当这些原致癌基因被某些RNA病毒或致癌物质激化而产生ras致癌基因后,其p21ras发生点突变(pointmutation),失去GTPase的活性,导致细胞的不正常增殖和分化。在人类的所有癌症疾病中,约有25%是由于ras致癌基因突变所造成的,就不同的癌症而言,90%的胰脏癌,50%的结肠癌以及约50%的甲状腺癌是和ras致癌基因的突变有关,如文献8:(Bos,J.L.,ras Oncogenes in Human Cancer:AReview,Cancer Res.,1989,49,4682-9.)所述。
阿萨太罗欣化学结构式如下:
(阿萨太罗欣)
早期文献中阿萨太罗欣的合成方法有七个反应步骤的流程图1(Norton,S.J.等J.Org.Chem.,1961,26,1495-8.)及八个反应步骤的流程图2(真壁野等人 日本专利平2-273659 1990.)两种。流程图1Norton等人的合成法起始物曲酸(kojic acid)价格较贵,不适合于大量合成。流程图2真壁野等人专利的合成法则步骤较多,部分中间体因水溶性太高造成产物回收率较低。
L-b-(5-羟基-2-吡啶基)-丙氨酸,(Shindo-Okada,N.;Makabe,O.;Nagahara,H.;Nishimura,S.Mol.Carcinog.,1989,2,59-67.)是从链霉菌属千叶菌株(Streptomyces chibaensis)中所分离的类似酪胺酸的天然物,能够抑制由活化的人类c-Ha-ras致癌基因所引发的转形NIH 3T3细胞的生长,而对正常NIH 3T3细胞生长则不具明显的抑制作用。最令人振奋的是,经阿萨太罗欣处理过的转形NIH 3T3细胞具有正常细胞表征(normalphenotype),而且这些具有正常表征的反突变种细胞(revertant cells)可以在阿萨太罗欣的存在下持续生长直到细胞汇合(confluency)为止。在长期的培养中,这些反突变种细胞在无阿萨太罗欣的存在下仍可保持正常细胞表征,在软琼脂培养基中无法生长,且在裸鼠中几乎没有增殖现象。这些结果代表了反突变种细胞的细胞生理就如同一般正常细胞一样。另外,阿萨太罗欣对人类胰腺癌细胞(Shindo-Okada等.Mol.Carcinogen.,1989,2,59-67.)、由ras所引发的转形人类乳房上皮细胞MTSI1-7(Kyprianou,N.等Oncogene,1992,7,57-63.)、由ras或raf所引发的摄护腺癌细胞PC-12的轴突赘生(Fujita-Yoshigaki,J.等人Oncogene,1992,7,2019-24.)、TSU-Prl,DU-145和PC-3细胞株(Benoit,R.M.,Urology,1995,46,370-7.)、老鼠胚胎细胞SFEM(serum-free mouse embryo cells,Nomura,T.Jap.J.Cancer Res.,1992,83,851-8.)等都具有使之转变成反突变种细胞并且不伤害正常细胞的效果。有别于传统细胞毒药物,阿萨太罗欣呈现的是崭新的癌化学疗法观念,将癌细胞的增殖及分化导入正轨,因此这类药物应具有对癌细胞选择性高及对正常细胞毒性小的特色。
然而阿萨太罗欣的药理活性不够大,阿萨太罗欣对体外癌细胞株的有效治疗浓度高达1-2mM(Shindo-Okada等Mol.Carcinog.,1989,2,59-67.),可能原因在于阿萨太罗欣属于低脂溶性胺基酸类双性离子,较难穿透细胞膜,因此需较高浓度的药物才能使细胞内达到所需的有效活性浓度。
本发明的目的是为了克服阿萨太罗欣无法进入细胞以至药理活性不够大的问题,本发明目的以增加脂溶性为前提,设计改变阿萨太罗欣双性离子结构,合成具有中性物理化学性质的阿萨太罗欣类似物,增加被动运输穿透细胞膜的速率,以增加细胞内身体可用率而提高药效,从而提供一种制备阿萨太罗欣类似物及合成方法和用途。
本发明的目的是这样完成的:
本发明设计并制备一系列具有下式(I)的新颖阿萨太罗欣类化合物:
其中,R1为C1-6烷基、苯甲基或C1-6烷基羰基;R2为C1-6烷基或C1-6烷氧基;R3为CONR4R5、CONHNR4R5或COOR6,其中R4和R5独立的,个别为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基,或NR4R5结合为一饱和或不饱和五元含氮杂环或六元含氮杂环,该含氮杂环上的碳可为氮、氧或硫所取代;R6为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基或苯甲基。
本发明提供的式(I)化合物的制备方法如下:
参阅反应流程3(附图3),是使用5-羟基-2-羟甲基吡啶(化合物1)为起始物,按下列反应式进行反应:
而制备出中间体式(V)化合物,其中R1与R2定义如前所述;再由中间体式(V)化合物与HNR4R5、NH2NR4R5、R6X或R6OH进行反应,化合物式(I)的一般制备法,是将式(V)化合物、等当量醇类、胺类或肼类反应物及等当量的二环己基碳二亚胺(DCC)(dicyclohexylcarbodiimide)或羧基二咪唑(CDI)(carboxydiimidazole)溶于质子惰性的(aprotic)有机溶剂如二甲酰胺或二氯甲烷中,在20-45℃反应2-12小时后,将溶剂抽掉,再结晶即得所需产物式(I)结构的化合物,其中R4、R5及R6定义如前所述,X为卤素。
本发明结构式(I)化合物的抑制细胞生长的活性
式(I)化合物对细胞生长抑制筛检
野生型NIH 3T3细胞以及ras-转形NIH 3T3细胞株的生长抑制筛检实验中是利用含有10%蛰伏脂瘤牛血清(fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养液、细胞密度为1,500-2,000细胞/容器(cells/well)的96孔洞培养皿,37℃含7.5%CO2空气中培养。首先建立细胞生长曲线。药物活性筛检中,以血球计数计(hemacytometer)和MTT比色分析法(Hansen,M.c以血球计数计和MTT比色分析法)(Hansen,M.B.等人,J.Immunol.Methods,1989,119,203-10.)所建立的标准曲线求得试验中存活细胞的数目。再利用S形曲线回归(sigmoidal regression)(Parellada,J.;Guinea,M.,FlavonoidInhibitors of Trypsin and Leucine Aminopeptidase:a ProposedMathematical Model for IC50 Estimation.,J.Nat.Prod.,1995,58,823.)的方法求得IC50。每一种受测化合物都进行了至少三次实验,结果列于表一。此系列化合物活性可比阿萨太罗欣高458倍(化合物12)。由结构—活性间关系显示,将阿萨太罗欣的羟基衍生成醚基、将碱性的胺基衍生成偏中性的酰胺(amides)或胺基甲酸酯(carbamates)、以及将羧基衍生成中性的酯类或酰胺则大大增强其药理活性。更为重要的发现为,此系列化合物对转形细胞的生长具有选择性抑制活性(亦即选择性毒性Seletive toxicity,ST)。如化合物12对转形细胞的生长抑制IC50为对正常细胞生长抑制IC50的138倍,亦即选择性毒性(IC50野生型/IC50ras-转形=138)。其活性以及对癌细胞的选择性抑制具有治疗癌症价值。
表1阿萨太罗欣及如下式化合物对野生型NIH 3T3以及ras-转形NIH3T3细胞株的生长抑制活性
IC50(mM)a 相对活 选择性
化合物 R4 R5
野生型细胞 ras-转形细胞 性b 毒性c
阿萨太罗欣 N 10793.0±471.8 7554.8±417.5 1 1.4
7 H H 1716.8±10.4 73.1±41.8 103 23.5
8 正-丙基 H 989.7±707.3 34.8±0.8 217 28.4
9 烯丙基 H 213.7±111.5 74.2±15.2 102 2.9
10 炔丙基 H 410.8±247.3 45.8±1.65 165 9.0
11 环丙基 H 1926.1±898.7 104.5±83.8 72 18.4
12 环己基 H 2284.8±1763 16.5±2.2 458 138.5
13 N(CH2)5 N 74.8±18.7 42.0±3.9 180 1.8
14 N(CH2)4 N 148.1±12.5 59.3±17.8 127 2.5
15 -(CH2)2-S-(CH2)2- 154.4±3.9 50.3±1.04 150 3.1
a3-5次实验的平均值±标准差。b相对活性指阿萨太罗欣与测试化合物的βIC50ras-转形细胞的比值。c选择性毒性指IC50野生型/IC50ras-转形。
本发明医药组成物,其包括一医疗上有效剂量的结构式(I)化合物,及一医药上可接受载体。
本发明的结构式(I)阿萨太罗欣类抗癌化合物的用途,供用以治疗胰脏癌、结肠癌、甲状腺癌及黑色素癌等ras-相关癌症。
本发明的优点:
本发明以阿萨太罗欣为先导药物,针对其活性不佳的缺点设计一系列具有式(I)的新颖阿萨太罗欣类化合物。此系列化合物以新颖的合成方法制备。式(I)系列化合物活性比阿萨太罗欣高了约450倍,而且对转形细胞的抑制活性比对正常细胞的抑制活性可高约138倍。其活性以及对癌细胞的选择性抑制具有治疗癌症的价值。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细地说明:
附图1是反应流程图。
附图2是反应流程图。
附图3是反应流程图。
实施例1
1.制备2-乙酰氨基-2-((5-苄氧-吡啶-2-基)甲基)丙二酸二乙基酯(化合物3a)的步骤。
将化合物1(53.81克,0.25摩尔)溶于二氯甲烷(500毫升)后于3小时内慢慢滴入三氯氧磷(phosphoryl trichloride,38.33克,0.25摩尔)的二氯甲烷(1升)溶液中。经一天后将反应溶液慢慢倾入剧烈搅拌的饱和碳酸氢钠水溶液中以完全中和掉酸性物质。将二氯甲烷溶液分出后用无水硫酸镁加以干燥,过滤后将滤液于减压下蒸去二氯甲烷即得粗产物。将化合物2(56.48克,0.26摩尔)溶于极性滤液后再加入叔丁醇钾(30.30克,0.27摩尔),待其完全溶解后再将前述的粗产物加入。反应8小时后将二甲基甲酰胺于减压下蒸去,残余物用水(1升)和二氯甲烷(1升)萃取后分出二氯甲烷溶液,用无水硫酸镁加以干燥并过滤后将滤液于减压下蒸去二氯甲烷即得粗产物3a。利用异辛烷和乙酸乙酯的混合物剂(9∶1)重覆萃取粗产物3a后将萃取液合并抽干即得纯化的化合物3a(97.40克,产率94%),熔点91-92℃。1HNMR(200MHz,CDCl3):d 8.182(1H,d,J=2.8Hz,吡啶-α-H),7.357(5H,m,Ph-H),7.116(1H,d,J=2.8,8.4Hz,吡啶-g-H),6.953(1H,d,J=2.8,8.4Hz,吡啶-b-H),6.771(1H,s,Ac--NH),5.031(2H,S,Ph-CH2-),4.22(2H,q,J=7.0Hz,COO-CH2-),3.731(2H,s,吡啶-CH2-),1.918(3H,s,CH3CO-),1.246(3H,t,J=7.0Hz,COO-CH2-CH3)ppm;IR(KBr):3400.2975,1750,1725.1675,1575,1490,1475cm-1;质谱:414,341,323,295,253;元素分析:计算含C63.76,H6.32,N6.76;实测含C63.72,H6.33,N6.69.)
2.制备3-(5-苄氧-2-吡啶)-2-胺基丙酸(化合物4a)的步骤:
将化合物3a(41.45克,0.1摩尔)溶于如盐酸的有机酸水溶液(500毫升)中加热回流24小时,溶液放冷后加水(500毫升)稀释并加入氢氧化钠(120克,3摩尔)提高PH值,再度放冷后接着再用碳酸氢钠或醋酸将溶液的PH值调节到约7.5~8.5。沉淀物滤出后先用水(100毫升×2)洗,接着改用甲醇(100毫升×2)洗过后于真空中干燥即得产物化合物4a(22.33克,产率82%),熔点249-252℃。1HNMR(80MHz,D2O+TFA):d 7.89(1H,s,吡啶-a-H),7.54(2H,s,吡啶-a-H,吡啶-a-H),7.54(5H,m,Ph--H),4.69(2H,S,Ph-CH2-),4.13(H,t,J=7.2Hz,吡啶-CH2-CH-),3.24(H,d,J=7.2Hz,吡啶-CH2-)ppm;IR(KBr):3436,3035,2964,1620,1590.1573,1504,1500,1416cm-1;元素分析:计算含C66.16,H5.92,N10.24;实测含C66.09,H5.87,N9.92.
3.制备3-(5-羟基-2-吡啶)-2-胺基丙酸(Azatyrosine)的步骤:
将化合物4a(13.62克,50毫摩尔)悬浮在水(500毫升)中,加入10%Pd/C(0.5克)后于常压下进行氢化。经24小时后先将Pd/C及其它不溶物滤掉,滤液于减压下将水及甲苯蒸去,残余物加入甲醇(100毫升)后滤出沉淀物并于真空中干燥即得产物阿萨太罗欣(8.65克,产率95%),熔点248-250℃,文献值245-247℃。元素分析:计算含C52.74,H5.53,N15.38;实测含C52.63,H5.59,N15.26。
4.制备3-(5-苄氧-2-吡啶)-2-(叔-丁氧羧基氨基)丙酸(化合物5a)的步骤:
化合物4a(8.17克,30毫摩尔)及(Boc)2O(7.46克,35毫摩尔)的四氢呋喃(200毫升)溶液搅拌3小时后将四氢呋喃蒸去,用硫酸氢钾将溶液的PH值调到3-4,用二氯甲烷(200毫升×2)萃取。将二氯甲烷溶液分出后用无水硫酸镁加以干燥,过滤后将滤液于减压下蒸去二氯甲烷即得化合物V(10.63克,产率95%)。熔点156-157.5℃。1H NMR(80MHz,CDCl3):d 9.16(1H,b,-COOH),8.25(1H,d,吡啶-a-H),7.65-7.03(7H,m,吡啶-a-H,吡啶-a-H,Ph-H),5.70(1H,d,J=3.8Hz,-NH)5.08(2H,S,Ph-CH2-),4.42(1H,dt,J=5.06,6.53Hz,吡啶-CH2-CH-),3.29(2H,m,吡啶-CH2-CH-),1.43(9H,s,t-Bu)ppm;IR(KBr):3395,2975,1719,1695.1573,1504cm-1;质谱:372,316,277,166,91,57;元素分析:计算含C64.50,H6.50,N7.52;实测含C63.67,H6.82,N7.02.
实施例2
N-丙基3-(5-苄氧-2-吡啶)-2-(叔-丁氧羧基氨基)丙酰胺(化合物8a)的制备:
取化合物5a、等当量丙胺(propylamine)及等当量羧基二咪唑溶于二氯甲烷中在室温反应12小时后,将二氯甲烷抽掉,除去咪唑,再用乙醚再结晶即得所需产物:熔点117-117.5℃;1H NMR(200MHz,CDCl3):d 8.234(1H,d,J=2.6Hz,吡啶-α-H),7.37(5H,m,Ph-H),7.169(1H,dd,J=2.6,8.6Hz,吡啶-α-H),7.097(1H,d,J=8.6Hz,吡啶-g-H),6.734(1H,broad,BocNH),6.194(1H,dJ=6.8Hz,-CONH),5.058(2H,s,Ph-CH2-),4.460(1H,broad,吡啶-CH2-CH-),3.113(4H,m,J=6.14Hz,吡啶-CH2-CHCONH-CH2--),1.407(9H,s,t-Bu),1.357(2H,J=7.2Hz,CONH-CH2-CH2-),0.768(2H,t,J=7.2Hz,CONH-CH2-CH2-CH3)ppm;IR(KBr):3323,3258,2972,1697,1646cm-1;质谱:339,248,225,91;元素分析:计算含C66.81,H7.56,N10.16;实测含C66.43,H7.26,N10.20.
实施例3
N-环己烷3-(5-苄氧-2-吡啶)-2-(叔-丁氧羧基氨基)丙酰胺
(化合物12a)的制备:
取化合物5a、等当量环己胺(Cyclohexylamine)及等当量羧基碳二亚胺(carboxycarbodiimide)溶于二氯甲烷中在室温下反应12小时后,将二氯甲烷抽掉,除去咪唑,再用乙醚再结晶即得所需产物:熔点136-136.5℃;1HNMR(200MHz,CDCl3):d8.239(1H,d,J=2.4Hz,吡啶-α-H),7.372(5H,m,Ph-H),7.158(1H,dd,J=2.4,8.4Hz,吡啶-α-H),7.088(1H,d,J=8.4Hz,吡啶-g-H),6.585(1H,broad,BocNH),6.164(1H,d J=6.0Hz,-CONH),5.063(2H,s,Ph-CH2-),4.418(1H,broad,吡啶-CH2-CH-),3.653(1H,m,CONH-CH-),3.175(1H,dd,J=6.0,14.4Hz,吡啶-CH2-),3.047(1H,dd,J=6.0,14.4Hz,吡啶-CH2-),1.405(9H,s,t-Bu),1.720-0.750(10H,m,c-己烷基)ppm;IR(KBr):3348,3313,2931,2851,1651cm-1;质谱:379,288,225,91;元素分析:计算含C68.58,H7.78,N9.26;实测含C68.53,H7.50,N9.46.
实施例4
3-(5-苄氧-2-吡啶)-2-氨基丙酸苄酯(化合物16)的制备:
化合物4a(7.35克,27毫摩尔)、氢氧化钠(1.188克,30毫摩尔)及(Boc)2O(7.07克,32毫摩尔)的水/四氢呋喃溶液于室温下搅拌3小时,于减压下将四氢呋喃蒸去后再加入碳酸氢钠(1.36克,16毫摩尔),溶有溴化苄(5.08克,30毫摩尔)的二氯甲烷(200毫升)溶液并搅拌过夜。首先分出二氯甲烷溶液,水层再用二氯甲烷(100毫升×1)萃取后合并。在此溶液中加入三氟醋酸(15.39克,135毫摩尔)反应24小时后将溶液于减压下蒸干。粗产物利用管柱层析(EtOAc∶TFA=100∶1)加以纯化后得产物16(8.729克,产率46%),熔点143-145℃。1HNMR(80MHz,CDCl3):d 8.08(1H,d,J=2.24Hz,吡啶-a-H),8.08(1H,dd,J=2.24,8.96Hz,吡啶-g-H),7.78(1H,d,J=8.96Hz,吡啶-a-H),7.41(10H,m,Ph-H),5.21(4H,m,Ph-CH2-),4.76(1H,t,J=7.60Hz,吡啶-CH2-CH-),3.80(2H,d,J=7.60Hz,吡啶-CH2-CH-)ppm;IR(KBr):3408,3076,2947,1762,1672.1569,1455cm-1;质谱:227,199,136,108,91,65.