CN118185919A - 一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用，本发明通过电化学法剥离，得到尺寸为1‑10μm的无线微电极细胞贴片，尺寸小，缺陷较少，石墨烯结构完整，具有良好的导电性，为具有微米级、各向异性的石墨烯纳米电贴片，可以避免被细胞内吞，并且可以高效、稳定、长期地结合在细胞膜表面，方法极其简单，成本低，并且可以批量化生产，效率高，便于锚定在神经干细胞上，实现定时、定量对干细胞进行精确电刺激，避免有些细胞电刺激不到，可以明显促进神经分化，并促进神经发育成熟，为临床上脑损伤修复，改善脑损伤行为，促进损伤区域修复作了重要指导。
Description
技术领域
本发明涉及一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用，属于生物医学领域。
背景技术
创伤性脑损伤是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。脑损伤会严重影响神经系统，导致患者功能障碍，甚至威胁患者生命。脑损伤的自愈合能力非常差，这是由于体内神经元无法再生，脑损伤后的脑组织会形成空洞或者被胶质瘢痕替代。神经干细胞移植是一种治疗脑损伤的有效手段，在以往的研究中，已经证明在脑损伤的动物模型中植入神经干细胞可以改善脑组织的结构。但是由于干细胞分化效率低，速度慢，限制了神经干细胞在脑损伤治疗中的应用。
电刺激是治疗神经系统疾病的一种有效措施，可以激活细胞内信号通路，影响细胞迁移、增殖和分化。电刺激会改变细胞膜表面电荷分布，激活膜受体和离子通道，促进神经分化。但是，传统的电刺激设备需要通过导线将电信号输入和输出设备连接，容易导致感染，并且需要植入大量导电支架，操作复杂，成本高。如中国专利文献CN105087544A一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法及装置，采用对机体和细胞均无害的低频交流电，采用物理刺激的方法刺激干细胞，使其能够向神经方向分化；且此方法易操作，能随时给予电刺激，具有很高的可控性。
基于电磁感应现象，导体在磁场中运动产生感应电动势可以实现无线电刺激。然而，传统的导电材料由于其尺寸限制，即使使用无线电刺激，对每一个处于动态迁移状态的移植干细胞进行精确的电刺激仍然是一个巨大的挑战。
比如中国专利文献CN111944750A一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架及其制备方法与应用。所述制备方法包括：采用化学气相沉积法在铜/镍模板上生长石墨烯，制得三维环形细胞支架；或者，将导电物质与纤维进行混纺处理形成导电纤维，之后采用模板法进行处理，制得三维环形细胞支架；或者，采用3D打印的方法将导电水凝胶和/或导电气凝胶进行打印，制得三维环形细胞支架，该三维环形细胞支架尺寸大，无法通过微注射植入体内，且无法随细胞流动迁移，因此无法实现对干细胞的精确电刺激。
如何设计一种无线电极使其贴在细胞膜上而不被细胞内吞，实现在细胞膜上长期锚定，在物理场驱动下产生电信号，实现对动态迁移干细胞的精准刺激，诱导干细胞的神经分化，是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
无线微电极细胞贴片的批量制备方法，包括步骤如下：
1)将石墨芯作为工作电极，铂箔作为对电极，硫酸作为电解质，对石墨芯进行电化学剥离；
2)剥离完成后，进行抽滤，收集剥离的石墨烯，去离子水清洗；
3)清洗后的石墨烯重新分散在去离子水中，得石墨烯分散液，静置，取上清液；
4)上清液灭菌处理后加入层粘连蛋白溶液进行孵育，得到无线微电极细胞贴片。
根据本发明优选的，步骤1)中，石墨芯的型号为12B-16B。
根据本发明优选的，步骤1)中，硫酸的浓度为0.1-0.3M。
根据本发明优选的，步骤1)中，电化学剥离施加的电压为+10V。
根据本发明优选的，步骤1)中，电化学剥离时间为10-60min，过程中进行磁力搅拌。
根据本发明优选的，步骤2)中，抽滤收集石墨烯使用的滤膜孔径为0.22μm。
根据本发明优选的，步骤2)中，使用去离子水清洗3-5次。
根据本发明优选的，步骤3)中，石墨烯分散液中石墨烯的浓度为1-10mg/mL。
根据本发明优选的，步骤3)中，静置时间为24-48h。
根据本发明优选的，步骤3)中，灭菌处理为上清液进行高压处理。
根据本发明优选的，步骤3)中，层粘连蛋白溶液的浓度为0.5-5μg/mL。
根据本发明优选的，步骤3)中，孵育温度为37℃，孵育时间为1-8h。
本发明制得的无线微电极贴片尺寸在1-10μm，尺寸小，缺陷较少，具有良好的导电性，为具有微米级、各向异性的石墨烯纳米电贴片，可以避免被细胞内吞，并且可以高效、稳定、长期地结合在细胞膜表面，通过电化学法剥离石墨烯，通过电流驱使离子迁移到石墨层间隔中将石墨烯层剥离得到，方法极其简单，成本低，并且可以批量化生产。
一种无线微电极细胞贴片，采用上述方法制得。
上述无线微电极细胞贴片在制备治疗脑损伤贴片复合体中的应用。
一种治疗脑损伤修复的贴片复合体，包括无线微电极细胞贴片和干细胞。
根据本发明优选的，治疗脑损伤修复的贴片复合体的制备方法，步骤如下：
(1)将干细胞离心吹打后用神经分化培养基重新分散，得到干细胞悬液；
(2)向干细胞悬液中加入无线微电极细胞贴片分散液，得混合液，进行孵育；
(3)孵育后进行离心，去除上清液，得到治疗脑损伤修复的贴片复合体。
根据本发明优选的，步骤(1)中，神经分化培养基为含体积浓度2％ B27神经培养添加剂，体积浓度1％胎牛血清(FBS)，体积浓度1％ GlutaMax和体积浓度1％双抗的Neurobasal培养基。
Neurobasal培养基为现有技术。
根据本发明优选的，步骤(1)中，干细胞为神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胚胎干细胞。
根据本发明优选的，步骤(1)中，干细胞悬液中干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中，混合液中无线微电极细胞贴片的浓度为10-160μg/mL，干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中，孵育环境为恒温振荡摇床，孵育温度为37℃，摇床振荡频率为50-200rpm，孵育时间为0.5-24h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，离心的速度为600-900rpm，离心的时间为3-5min。
本发明制得的无线微电极贴片能高效结合在不同类型的干细胞上，并跟随动态迁移的干细胞移动，迁移至损伤区域后，进行旋转磁场刺激，实现神经分化；不影响干细胞的增殖分化，可以在细胞表面长期稳定锚定，对细胞实现长期精准电刺激。
上述治疗脑损伤修复的贴片复合体的应用，用于在磁场驱动下介导无线电刺激实现神经分化。
根据本发明优选的，治疗脑损伤修复的贴片复合体的应用，将治疗脑损伤修复的贴片复合体接种在细胞培养板中，体外培养，进行旋转磁场刺激，实现神经分化。
根据本发明优选的，接种的细胞悬液体积为0.5-2mL，包含的细胞个数为1-4×106个；
根据本发明优选的，体外培养为在37℃下含5％ CO2的饱和湿度环境下体外培养5-10天。
根据本发明优选的，细胞培养板到磁铁的距离为0.5-1cm，旋转磁场刺激条件为：转速为100-1000rpm，磁场强度为50-100mT，每次刺激时间为10-30min，每天刺激1-3次。
本发明的技术特点及优点：
1、本发明通过电化学法剥离，通过电流驱使离子迁移到石墨层间隔中将石墨烯层剥离得到石墨烯片，然后与层粘连蛋白孵育，得到无线微电极细胞贴片。通过硫酸浓度和施加电压的控制以及静置，得到的无线微电极细胞贴片尺寸小，尺寸在1-10μm，缺陷较少，石墨烯结构完整，具有良好的导电性。微米级、各向异性的无线微电极细胞贴片，可以避免被细胞内吞，并且可以高效、稳定、长期地结合在细胞膜表面，方法极其简单，成本低，并且可以批量化生产，效率高。
2、本发明无线微电极细胞贴片可以长期稳定锚定在多种类型的干细胞膜表面，并跟随动态迁移的干细胞移动，如神经干细胞，骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，胚胎干细胞等，适用范围广，不影响干细胞的增殖分化，对干细胞实现长期伴随式精准电刺激。
3、本发明的无线微电极细胞贴片可以基于电磁感应原理，在旋转磁场驱动下产生无线电刺激，通过调控磁场强度和频率，改变电信号的强度和频率，实现定时、定量对干细胞进行精确电刺激，避免有些细胞电刺激不到，可以明显促进神经分化，并促进神经发育成熟，为临床上脑损伤修复，改善脑损伤行为，促进损伤区域修复作了重要指导。
附图说明
图1为实施例1制得的无线微电极细胞贴片的原子力显微镜图片(a)和高度测试(b)图；
图2为实施例1制得的无线微电极细胞贴片的拉曼测试图；
图3为无线微电极细胞贴片荧光标记后与细胞膜荧光共定位的图片；
图4为无线微电极细胞贴片与细胞膜共定位的扫描电子显微镜图片；
图5为不同浓度(30，60，90μg/mL)的无线微电极细胞贴片与细胞膜荧光共定位的图片；
图6为试验例4各处理培养五天后Tuj1和Map2基因的PCR分析；
图7为试验例4各处理培养十天后Tuj1和Map2基因的PCR分析；
图8为试验例4各处理培养五天后Tuj1和Map2蛋白的免疫荧光染色；
图9为试验例4各处理培养五天后Tuj1和Map2蛋白的Western Blot分析；
图10为试验例5神经干细胞NSCs锚定不同浓度(30，60，和90μg/mL)无线微电极细胞贴片后施加转速为600rpm的旋转磁场培养五天后Tuj1和Map2基因的PCR分析；
图11为试验例6神经干细胞NSCs锚定无线微电极细胞贴片后施加转速为300rpm，600rpm和900rpm的旋转磁场培养五天后Tuj1和Map2基因的PCR分析；
图12为试验例7及不同处理修复后脑组织照片；
图13为试验例7及不同处理修复后在水迷宫的定向导航轨迹和空间探索试验中路线轨迹的代表性图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
Neurobasal完全培养基为Neurobasal培养基添加2％ B27神经培养添加剂，1％胎牛血清(FBS)，1％ GlutaMax和1％双抗。
实施例中神经干细胞(NSCs)来源：无菌条件下取孕期为12-14天的C57小鼠胚胎放入增殖培养基中培养三代以后。增殖培养基为含有2％ B27神经培养添加剂，1％胎牛血清(FBS)，1％ GlutaMax，1％双抗，20ng/mL mEGF和20ng/mL mbFGF的Neurobasal培养基。
实施例1
无线微电极细胞贴片的批量制备方法，步骤如下：
1)将16B的石墨芯作为工作电极，铂箔作为对电极，0.1M的硫酸作为电解质进行电化学剥离，剥离电压为+10V，剥离时间为10min；
2)使用0.22μm的滤膜进行抽滤，收集石墨烯，并使用去离子水清洗5次；
3)将石墨烯重新分散在去离子水中，得3mg/mL的石墨烯分散液，静置48h，取上清液，得石墨烯分散液；
4)将石墨烯分散液高压灭菌，加入2μg/mL层粘连蛋白溶液，在37℃下孵育3h，得到无线微电极细胞贴片。
实施例2
治疗脑损伤修复的贴片复合体的制备方法，步骤如下：
(1)将神经干细胞离心吹打后用神经分化培养基重新分散，离心转速为750rpm，离心时间为5min，得到神经干细胞悬液，神经干细胞悬液中细胞浓度为1×106个/mL；
(2)向神经干细胞悬液中加入实施例1制得的无线微电极细胞贴片分散液，得混合液，在37℃下孵育1h，无线微电极细胞贴片结合到神经干细胞膜表面，混合液中细胞的浓度为1×106个/mL，无线微电极细胞贴片的浓度为60μg/mL；
(3)孵育后的细胞悬液进行离心，离心转速为750rpm，离心时间为5min，去除上清液，得到治疗脑损伤修复的贴片复合体。
实施例3
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤2)中，混合液中无线微电极细胞贴片的浓度为30μg/mL L。
实施例4
同实施例3所述的制备方法，不同之处在于：
步骤2)中，无线微电极细胞贴片的浓度为90μg/mL。
实施例5
治疗脑损伤修复的贴片复合体的应用，将实施例2或3或4得到的治疗脑损伤修复的贴片复合体接种在细胞培养板中，接种的体积为1mL，包含的细胞个数为4×106个；体外培养，施加旋转磁场，磁场强度为80mT，转速为600rpm，刺激时间为15min，每天刺激一次，持续5天或10天，实现神经分化。
实施例6
同实施例5所述的应用，不同之处在于：
磁场转速为300rpm.
实施例7
同实施例5所述的应用，不同之处在于：
磁场转速为900rpm。
试验例1
对实施例1制备的无线微电极细胞贴片进行形貌和性质表征。测得原子力显微镜图片如图1所示，从图1中可以看出，无线微电极细胞贴片的尺寸大概在2μm，厚度在2nm左右，说明厚度为2-3层。拉曼测试如图2所示，1330cm-1、1578cm-1和2668cm-1处的峰分别属于石墨烯的D、G和2D特征带。石墨烯的G带是由sp2碳原子的面内振动引起的，而D带则与结构缺陷和无序有关。所得石墨烯纳米片D带和G带的强度比(ID/IG)为0.33，表明石墨烯纳米片具有良好的石墨烯结构，缺陷较少，具有良好的导电性。2D和G波段的强度比(I2D/IG)为0.67，表明无线微电极细胞贴片是多层的。
试验例2
1、对实施例2孵育前无线微电极细胞贴片和神经干细胞膜分别进行荧光标记，按实施例2步骤(1)-(3)的方法进行孵育，无线微电极细胞贴片与神经干细胞共同孵育3h后增殖培养24h，进行荧光共定位，如图3所示，可以观察到红色荧光与绿色荧光一致，几乎细胞中存在红色荧光，说明本发明的无线微电极细胞贴片可以高效地结合在细胞膜表面。
2、无线微电极细胞贴片与细胞共同孵育3h，测得细胞扫描电子显微镜如图4所示，可以观察到细胞表面有褶皱，说明成功结合无线微电极细胞贴片，因此，本发明制得的无线微电极细胞贴片可以稳定的锚定在细胞上。
试验例3
将不同浓度(30，60，90μg/mL)的无线微电极细胞贴片与神经干细胞共同孵育3h后，方法按实施例2步骤(1)-(3)的方法进行，进行荧光共定位，如图所示5，可以观察到随着浓度的增加，神经干细胞上结合的无线微电极细胞贴片逐渐增加，当浓度达到60μg/mL时，细胞上结合的无线贴片含量增加幅度降低，说明无线微电极细胞贴片结合到干细胞膜的效率很高。
试验例4
将实施例5(Nanopatch+MF)中培养五天、十天的神经细胞进行基因和蛋白检测，同时做空白组(Ctrl)、磁场组(MF only)、石墨烯组(Nanopatch only)作为对照；无线微电极细胞贴片的浓度为60μg/mL；
空白组：将实施例5的方法中治疗脑损伤修复的贴片复合体替换为神经干细胞悬液(实施例2步骤(1))，不施加旋转磁场进行培养；
磁场组：将实施例5的方法中治疗脑损伤修复的贴片复合体替换为神经干细胞悬液(实施例2步骤(1))，施加旋转磁场进行培养；
石墨烯组：将实施例5的方法中治疗脑损伤修复的贴片复合体替换为无线微电极细胞贴片分散液，不施加旋转磁场进行培养；
检测各处理神经元标记物β-微管蛋白(Tuj1)和微管结合蛋白(Map2)的表达水平，检测结果见图6、图7、图8、图9。
检测结果发现：磁场转速为600rpm时，无线微电极细胞贴片介导的无线电刺激明显促进神经分化，神经元标记物Tuj1和Map2的表达水平与其他组相比均有提高。
培养五天时，Tuj1的表达量提高了6.4倍，Map2的表达量提高了5.7倍；
培养十天时，Tuj1的表达量提高了7.3倍，Map2的表达量提高了4.6倍。
试验例5
将实施例5不同无线微电极细胞贴片浓度培养五天的神经细胞进行基因检测，检测神经元标记物β-微管蛋白(Tuj1)和微管结合蛋白(Map2)的表达水平，检测结果见图10。
空白组：将实施例5的方法中治疗脑损伤修复的贴片复合体替换为神经干细胞悬液(实施例2步骤(1))，不施加旋转磁场进行培养；
检测结果发现：与空白对照对比，无线微电极细胞贴片浓度为30，60，和90μg/mL时，Tuj1的表达量分别上调3.1，4.6和4.1倍，Map2的表达量分别提高1.73，3.65和4.44倍，说明无线微电极细胞贴片浓度较低时，介导的无线电刺激对神经分化仍有一定的促进作用，无线微电极细胞贴片浓度较高时对神经分化的促进效果最明显。
试验例6
将实施例5-7不同磁场转速条件下培养五天的神经细胞进行基因检测，检测神经元标记物β-微管蛋白(Tuj1)和微管结合蛋白(Map2)的表达水平，检测结果见图11。
空白组：将实施例5的方法中治疗脑损伤修复的贴片复合体替换为神经干细胞悬液(实施例2步骤(1))，不施加旋转磁场进行培养；
检测结果发现：与空白对照对比，磁场转速为300rpm，600rpm和900rpm时，Tuj1的表达量分别上调2.0，5.6和5.9倍，Map2的表达量分别提高2.4，7.7和8.1倍，说明转速较低时，无线微电极细胞贴片介导的无线电刺激对神经分化仍有一定的促进作用，而磁场转速较高时，无线微电极细胞贴片对神经分化的促进作用较好，磁场转速为600rpm和900rpm时，效果差不多。
试验例7
将实施例2的治疗脑损伤修复的贴片复合体注射到小鼠硬脑膜损伤处，注射3μL，包含的细胞个数为2×107个；注射后施加旋转磁场，磁场强度为80mT，转速为600rpm，刺激时间为30min，每天刺激一次，持续14天；同时做空白组、细胞组、细胞+磁场组、石墨烯+细胞组作为对照。
空白组为正常脑组织(Sham)；
对小鼠脑部进行击打，形成创伤性脑损伤模型组(TBI)；
细胞组为将神经干细胞注射到TBI脑膜损伤处(TBI+NSCs)；
细胞+磁场组为将神经干细胞注射到TBI脑膜损伤处，注射后按试验例7的方法施加旋转磁场(TBI+NSCs+MF)；
石墨烯+细胞组将实施例2步骤3)得到锚定石墨烯的神经干细胞注射到硬脑膜损伤处，未施加旋转磁场(TBI+NSCs++NSCs)；
试验例7及不同处理修复后脑组织见图12，修复后在水迷宫的定向导航轨迹和空间探索试验中路线轨迹的代表性图像见图13。
检测结果发现：无线微电极细胞贴片介导的无线电刺激对TBI小鼠脑损伤的修复有明显的促进作用。并且通过水迷宫实验可以证明，石墨烯介导的无线电刺激明显改善了小鼠的行为学能力和认知能力，可见无线微电极细胞贴片在神经干细胞上，作为纳米电贴片，可以伴随细胞迁移，实现非侵入式精准电刺激，避免手术和免疫排斥，减少导电材料的植入。
Claims (10)
1.无线微电极细胞贴片的批量制备方法，包括步骤如下：
1)将石墨芯作为工作电极，铂箔作为对电极，硫酸作为电解质，对石墨芯进行电化学剥离；
2)剥离完成后，进行抽滤，收集剥离的石墨烯，去离子水清洗；
3)清洗后的石墨烯重新分散在去离子水中，得石墨烯分散液，静置，取上清液；
4)上清液灭菌处理后加入层粘连蛋白溶液进行孵育，得到无线微电极细胞贴片。
2.根据权利要求1所述的批量制备方法，其特征在于，步骤1)中，石墨芯的型号为12B-16B，硫酸的浓度为0.1-0.3M，电化学剥离施加的电压为+10V，电化学剥离时间为10-60min，过程中进行磁力搅拌。
3.根据权利要求1所述的批量制备方法，其特征在于，步骤2)中，抽滤收集石墨烯使用的滤膜孔径为0.22μm，使用去离子水清洗3-5次。
4.根据权利要求1所述的批量制备方法，其特征在于，步骤3)中，石墨烯分散液中石墨烯的浓度为1-10mg/mL，静置时间为24-48h，灭菌处理为上清液进行高压处理，层粘连蛋白溶液的浓度为0.5-5μg/mL，孵育温度为37℃，孵育时间为1-8h。
5.一种无线微电极细胞贴片，采用权利要求1-4任一所述方法制得。
6.权利要求5所述的无线微电极细胞贴片在制备治疗脑损伤贴片复合体中的应用。
7.一种治疗脑损伤修复的贴片复合体，包括无线微电极细胞贴片和干细胞，是按如下方法制得：
1)将干细胞离心吹打后用神经分化培养基重新分散，得到干细胞悬液；
2)向干细胞悬液中加入无线微电极细胞贴片分散液，得混合液，进行孵育；
3)孵育后进行离心，去除上清液，得到治疗脑损伤修复的贴片复合体。
8.根据权利要求1所述的贴片复合体，其特征在于，步骤1)中，神经分化培养基为含体积浓度2％B27神经培养添加剂，体积浓度1％胎牛血清(FBS)，体积浓度1％GlutaMax和体积浓度1％双抗的Neurobasal培养基，干细胞为神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胚胎干细胞，干细胞悬液中干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/mL。
9.根据权利要求1所述的贴片复合体，其特征在于，步骤2)中，混合液中无线微电极细胞贴片的浓度为10-160μg/mL，干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/mL，步骤2)中，孵育环境为恒温振荡摇床，孵育温度为37℃，摇床振荡频率为50-200rpm，孵育时间为0.5-24h，步骤3)中，离心的速度为600-900rpm，离心的时间为3-5min。
10.权利要求7所述的贴片复合体的应用，将治疗脑损伤修复的贴片复合体接种在细胞培养板中，体外培养，进行旋转磁场刺激，实现神经分化，接种的细胞悬液体积为0.5-2mL，包含的细胞个数为1-4×106个；体外培养为在37℃下含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养5-10天，细胞培养板到磁铁的距离为0.5-1cm，旋转磁场刺激条件为：转速为100-1000rpm，磁场强度为50-100mT，每次刺激时间为10-30min，每天刺激1-3次。
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