CN118147017A - 一种含细菌和真菌的复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种含细菌和真菌的复合菌剂，所述细菌为假单胞菌N134，其分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏编号为CGMCC NO.29191；所述真菌为木霉NJAU4742，其分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，保藏编号为CGMCC NO.12166。本发明还公开了所述复合菌剂在促进酸性土壤油菜生长中的应用。本发明筛选到一株假单胞菌N134，能够有效促进酸性土壤中油菜的生长，其除了耐酸促生作用，对尖孢镰刀菌也具有拮抗作用，还具有溶磷功能。将假单胞菌N134和木霉NJAU4742制成复合菌剂，其对酸性土壤中油菜的生长更具有促进效果，为酸性土壤产能提升提供支撑。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种含细菌和真菌的复合菌剂及其应用。
背景技术
土壤酸化会影响农业、生态系统和环境，我国的酸性土壤主要分布在长江以南地区和云贵川等地。目前使用的改良酸性土壤的方法主要是物理改良和化学改良，现有的技术对微生物改良的研究较少，可应用于实际生产的菌种资源依然比较匮乏。
细菌和真菌是环境微生物组中的主要成员。细菌和真菌通过多种方式的互作影响着彼此的生存，真菌与细菌的协同作用在土壤生态系统中发挥着重要的功能，包括提高土壤养分利用效率、抑制病原微生物的生长和改善植物生长环境等。这种协同作用不仅有助于农业发展和生物资源利用，还对污染治理与土壤修复具有潜在的应用前景。进一步的研究将有助于深入了解真菌与细菌之间的相互作用机制，为解决农业和环境问题提供理论基础和技术支持。
目前关于微生物菌剂促进植物生长的研究多集中于单一菌株的测试，然而植物体内部是一个复杂的微生态系，若是将单一菌株分离出来进行培养，可能会因为缺少与其他微生物的相互作用而使此菌株的某些功能发生转变。一些研究显示菌株共接种对植物的有益作用具有协同效应。因此将互补的细菌、真菌进行组合，研制细菌-真菌复合菌剂，对促进植物生长至关重要。
油菜是十字花科、芸苔属一年或两年生草本植物，冬性较强，常以食用油或蔬菜的形式为人类所利用，其在经济、生态和观赏方面均有重要价值，是我国南方酸性土壤旱地种植的主要经济作物之一。因此本发明以油菜为供试作物。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种含细菌和真菌的复合菌剂及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种含细菌和真菌的复合菌剂，所述细菌为假单胞菌N134，所述假单胞菌N134的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月30日，保藏编号为CGMCCNO.29191；所述真菌为木霉NJAU4742，所述木霉NJAU4742的分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166；
所述复合菌剂包括如下步骤制备得到：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134进行液体发酵，获得假单胞菌N134发酵液；将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742进行液体发酵，获得木霉NJAU4742孢子液；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；用无菌水稀释木霉NJAU4742孢子液，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
进一步地，所述复合菌剂包括如下步骤制备得到：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基包括TSB液体培养基、LB液体培养基或R2A液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速170-200rpm，发酵时间1-2d，获得假单胞菌N134发酵液，稀释涂布计数菌体数量，所述假单胞菌N134发酵液菌体浓度≥1×108cfu/mL；
将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742孢子接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基为PDA液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速140-160rpm，先黑暗条件发酵2-3d，后光照条件下发酵2-3d，过滤除去菌丝，得到木霉NJAU4742孢子液，用血球板计数法测定孢子液中孢子数量，所述木霉NJAU4742孢子液孢子浓度≥0.5×108个/mL；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用假单胞菌N134发酵液十倍体积的无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；
将木霉NJAU4742孢子液用无菌水稀释十倍，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
本发明第二方面提供了一种含细菌和真菌的复合菌剂的制备方法，所述细菌为假单胞菌N134，所述假单胞菌N134的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月30日，保藏编号为CGMCCNO.29191；所述真菌为木霉NJAU4742，所述木霉NJAU4742的分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166；
所述复合菌剂制备时，包括如下步骤：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134进行液体发酵，获得假单胞菌N134发酵液；将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742进行液体发酵，获得木霉NJAU4742孢子液；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；用无菌水稀释木霉NJAU4742孢子液，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
进一步地，所述复合菌剂制备时，包括如下步骤：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基包括TSB液体培养基、LB液体培养基或R2A液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速170-200rpm，发酵时间1-2d，获得假单胞菌N134发酵液，稀释涂布计数菌体数量，所述假单胞菌N134发酵液菌体浓度≥1×108cfu/mL；
将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742孢子接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基为PDA液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速140-160rpm，先黑暗条件发酵2-3d，后光照条件下发酵2-3d，过滤除去菌丝，得到木霉NJAU4742孢子液，用血球板计数法测定孢子液中孢子数量，所述木霉NJAU4742孢子液孢子浓度≥0.5×108个/mL；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用假单胞菌N134发酵液十倍体积的无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；
将木霉NJAU4742孢子液用无菌水稀释十倍，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
本发明第三方面提供了上述含细菌和真菌的复合菌剂在促进酸性土壤油菜生长中的应用。
进一步地，所述酸性土壤pH在4.5-6.5。
进一步地，应用时，在油菜苗移栽7-10d后施入所述菌剂，施入量为30-50mL/株油菜苗。
本发明的有益效果：
本发明筛选到一株假单胞菌N134，能够有效促进酸性土壤中油菜的生长。假单胞菌N134除了耐酸促生作用，对尖孢镰刀菌也具有拮抗作用，还具有溶磷功能。本发明将假单胞菌N134和木霉NJAU4742制成含细菌和真菌的复合菌剂，其对酸性土壤中油菜的生长更具有促进效果，为酸性土壤产能提升提供支撑。
附图说明
图1为菌株N134平板照片。
图2为菌株N134的16S rRNA系统发育树。
图3为菌株溶磷效果图（包括N134、N111）。
图4为菌株溶磷效果图（包括N144）。
图5为接种不同单一菌株处理对温室油菜鲜重的影响。
图6为接种不同单一菌株处理对温室油菜干重的影响。
图7为接种不同单一菌株处理对温室油菜叶绿素含量（SPAD）的影响。
图8为菌株N134对尖孢镰刀菌拮抗效果图。
图9为菌株N144对尖孢镰刀菌拮抗效果图。
图10为菌株N111对尖孢镰刀菌拮抗效果图。
图11为两两菌株的亲和性（即涂布对峙）。
图12为接种不同菌株处理对温室油菜鲜重的影响。
图13为接种不同菌株处理对温室油菜干重的影响。
图14为接种不同菌株处理对温室油菜叶绿素含量（SPAD）的影响。
柱状图上方的不同字母为不同处理之间显著性差异（p<0.05）。
生物材料保藏信息
N134，分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年11月30日，保藏编号为CGMCC NO.29191。
NJAU4742，分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
若无特别说明，以下实施例中所用原料如下：
育苗基质是由江苏兴农基质科技有限公司生产的兴兴向农牌育苗专用基质，产品编号为：161102G0097N。
TSB固体培养基，即胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基（1L）：胰蛋白胨大豆肉汤30g，去离子水定容至1L，20g琼脂粉，115℃灭菌30min。
LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g，去离子水定容至1L，115℃灭菌30min。
溶磷固体培养基（1L）：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，酵母膏 0.4g，Ca3(PO4)2 10g，去离子水定容至1L，琼脂粉20g，115℃灭菌30min。
解钾固体培养基（1L）：葡萄糖10g，NH4NO3 3.0g，NaH2PO4 1g，FeSO4·7H2O 1g，MgSO4·7H2O 1g，钾长石粉1.5g，去离子水定容至1L，琼脂粉20g，115℃灭菌30min。
PDA液体培养基（1L）：200g去皮土豆切成1cm3小块，锅里加800mL水，水沸后倒入土豆，煮15-20min，至水有粘稠状，烧杯中加20g葡萄糖，杯口放置两层纱布，将粘稠状土豆液从纱布上倒入，再加水定容至1L，用0.04mol/L稀盐酸调pH值为4，115℃灭菌30min。
PDA固体培养基（1L）：马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，去离子水定容至1L，琼脂粉20.0g，115℃灭菌30min。
实施例1 耐酸菌株的筛选
第一步：摇菌
活化江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室所保存的从种植香蕉、番茄等作物的土壤或根际中分离获得的202株细菌，将菌株接入3mL LB液体培养基，30℃、170rpm培养2d，获得发酵液。
第二步：菌株酸性条件下生长性能的测定
①将第一步培养好的发酵液4000rpm离心6min，去上清再用无菌水重悬，获得菌悬液，用无菌水调节菌悬液OD600至1。
②配制LB液体培养基，用0.04mol/L稀盐酸调节LB液体培养基pH值分别至4.0和5.0，并设置未调节pH值的LB液体培养基（pH=6.86）为对照；将上述准备好的不同pH值LB液体培养基按每孔180µL分别加入三块96孔板中备用，依次接种20µL①中稀释好的菌悬液到不同pH值LB液体培养基中，每株菌设置4次重复，放置在30℃恒温培养箱中培养1d、2d，再利用酶标仪分别测定培养1d、2d后各菌株的OD600，OD值越高表明菌株生长性能越强；最终得到供试的202株菌均能在未调节pH值的LB液体培养基中生长，178株能够在pH为5.0的LB液体培养基中生长，9株能够在pH为4.0的LB液体培养基中生长（这9株菌虽能在pH为4.0的LB液体培养基中生长，但经鉴定不具功能性，后续实验不涉及这9株菌）。本发明所述的菌株N134能够在pH为5.0的条件下生长。
实施例2 菌株功能性测定
将实施例1中筛选到的178株能够在pH为5.0的LB液体培养基中生长的耐酸菌株进一步对其功能性进行测定。
（1）耐酸产IAA菌株的筛选
LB液体培养基pH用0.04mol/L稀盐酸调至5.0，并添加L-色氨酸（0.1mg/mL），将配置好的含有L-色氨酸的LB液体培养基分装至摇菌管中，每管3mL，将实施例1中筛选到的耐酸菌株接种至含有L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃、170rpm摇床培养2d后，获得菌液。
取100µL菌液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积的比色液（称取1g Fecl3·6H2O溶解至21.485mL浓H2SO4中，缓慢掉入蒸馏水中稀释后用蒸馏水定容至50mL，得到比色液），并以加入100µL未接菌的LB液体培养基（pH值调至5.0，方法同上）与等体积比色液的混合液作为对照。将白色陶瓷板置于室温避光放置30min后观察，颜色变粉红者表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌强度越大，不变色则表示不能分泌IAA。
对初筛获得的具有分泌IAA能力的菌株进行定量测定，吸取1mL菌液以1000rpm离心10min，取上清液，加入等体积比色液，避光静置30min，每株菌设置3个重复，测定其OD530值。对照标准曲线计算单位体积菌液中IAA的含量。
（2）溶磷菌株的筛选
配制LB液体培养基，分装至摇菌管，每管3mL，将实施例1中筛选到的耐酸菌株分别接种至LB液体培养基中，30℃、170rpm摇床培养2d，获得菌液。将菌液涂布于溶磷固体培养基平板上，平板倒置于30℃培养箱培养3-5d。选取有溶磷圈且形态不同的菌落。
（3）解钾菌株的筛选
配制LB液体培养基，分装至摇菌管，每管3mL，将实施例1中筛选到的耐酸菌株分别接种至LB液体培养基中，30℃、170rpm摇床培养2d，获得菌液。将菌液涂布于解钾固体培养基平板上，平板倒置于30℃培养箱培养3-5d。培养过程中观察菌落形态，以菌落形态呈圆形、透明、凸起较高、表面湿润粘稠且富有弹性的菌落。
最终分别获得耐酸并具产IAA功能菌22株，溶磷功能菌6株和解钾功能菌7株，从中分别筛选出各功能效果较好的3株菌，共9株，分别为耐酸并具产IAA功能的菌株B3-54、O2-35、N96；具溶磷功能的菌株N134、N144、N111（图3-图4）；具解钾功能的菌株C3-11、N51、O2-8。
实施例3 单一功能菌对酸性土壤油菜的促生效果试验
菌剂的制备：将上述实施例2筛选的9株菌株作为供试菌株。将9株菌株分别接种于TSB固体培养基中，37℃培养1d进行活化，待菌落长出备用，将挑选的单菌落分别置于LB液体培养基中30℃、170rpm摇床上振荡2d，获得发酵液，稀释涂布计数菌体数量，所述发酵液菌体浓度≥1×108cfu/mL。将发酵液4000rpm离心6min，去上清后用发酵液十倍体积的无菌水重悬，制成菌剂。
油菜种子温水浸种晾干后备用，准备育苗基质、育苗盘、塑料盆。将江西土壤（pH为4.5）与石英砂按体积比1：1混合得到混合土壤，每个塑料盆装混合土壤300g备用。
本实施例试验于温度为25℃、相对湿度在60%-70%的温室中进行，出芽后打开温室的植物补光灯，在夜间22:00至次日清晨6：00植物补光灯自动关闭。
将油菜种子点播于装有育苗基质的育苗盘中，每穴2-3粒种子，浇水浸透，培养4-5d种子出芽，喷洒适量矮壮素（防止形成高脚苗），继续培养，育苗期间定期浇水（每隔2d浇水一次，下同）。待油菜苗长到3片真叶，选择生长势较为一致的油菜苗将其移栽至装好混合土壤的塑料盆（每盆一株油菜苗）中，待移栽完毕后，浇水至塑料盆中，且后续定期浇水。
上述移栽至塑料盆中的油菜苗共设置T1（CK，清水（无菌水））、T2（B3-54）、T3（O2-35）、T4（N96）、T5（N134）、T6（N144）、T7（N111）、T8（C3-11）、T9（N51）、T10（O2-8）十个处理，每处理设9个重复，待移栽后的油菜苗稳定生长一周后，接入菌剂（将菌剂浇入塑料盆的混合土壤中，靠近油菜苗根部的地方），接种比例为10%（100µL/g混合土壤干重即每塑料盆浇入30mL菌剂），浇菌完成后继续培养，培养3周后，待长出第6片真叶，每个处理随机选取3株油菜苗，测定油菜苗的鲜干重、叶绿素含量，比较各处理的油菜苗的生长状况。
各指标测定方法如下：
鲜重测定：用水清洗油菜苗根部，吸水纸擦拭后，称重；
干重测定：将称完鲜重后的油菜苗放置于信封中于105℃下杀青15min，后70℃下烘干至恒重，称重；
叶绿素含量（SPAD）测定：用SPAD测定仪测定油菜苗上中下三个部位叶片的叶绿素含量，取平均值。
由图5至图7可知，浇菌完成培养3周后，T5（N134）、T6（N144）和T7（N111）处理的油菜苗各项生长指标均显著优于T1（CK）处理。T5（N134）的鲜重最高，为9.43g，与T1（CK）相比提高了3.76g；其次是T6（N144）、T4（N96）和T7（N111），与T1（CK）相比，分别提高了2.90g、2.66g和2.42g。T7（N111）的干重最高，为0.56g，其次是T5（N134）和T6（N144），干重均为0.54g。T5（N134）的SPAD最大，为39.15，其次是T6（N144）和T7（N111），SPAD分别为39.11和38.50。综上所述，T5（N134）、T6（N144）和T7（N111）对油菜苗的鲜重、干重、叶片SPAD值均有不同程度的提高，对酸性土壤油菜有较好的促生效果。
实施例4 拮抗病原菌能力鉴定
尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种危害严重的土传病原真菌，被列为世界十大植物病原真菌之一。该菌能够侵染100多种具有重要经济价值的作物，引起枯萎病和根腐病等。因此，筛选出对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的菌株能够优化土壤条件促进植株生长。
拮抗尖孢镰刀菌能力鉴定：将上述实施例3筛选出的3株促生效果好的菌株（N134、N144、N111）分别接种至LB液体培养基中，30℃、170rpm振荡1d得到的细菌菌液用于在PDA培养基平板上与尖孢镰刀菌进行对峙实验。
用直径为5mm的灭菌打孔器取尖孢镰刀菌菌丝块置于PDA固体培养基平板中央，放置于28℃培养箱中培养，1d后在距病原菌中心2cm处的4个点上分别接种1µL细菌菌液，放置于28℃培养箱中培养5-7d观察测试菌株的抑菌情况。如图8-图10所示，结果表明，只有菌株N134（对应上述T5处理）有明显拮抗尖孢镰刀菌的效果，N144和N111（分别对应上述T6和T7处理）不具备拮抗尖孢镰刀菌的效果。
实施例5 菌株组合对酸性土壤油菜的促生效果试验
（1）将上述实施例3筛选出的优势功能性促生菌株N134、N144、N111作为细菌供试菌株（结合形态特征和16S rRNA系统发育树，N134、N144、N111均归类为假单胞菌Pseudomonas sp.）；将木霉NJAU4742（保藏编号为CGMCC No.12166）作为真菌供试菌株。
（2）优势功能性促生菌株平板对峙试验
将N134、N144和N111菌株分别接种于TSB固体培养基中，37℃培养1d进行活化。将活化后的菌株两两在TSB固体培养基平板上互相垂直划线置于30℃培养箱内培养1d，观察细菌的生长和互相抑制状况，如图11所示，供试菌株之间互相不存在拮抗作用。
（3）菌剂的制备
分别活化菌株N134、N144和N111（同上），待菌落长出备用，将挑选的单菌落分别置于LB液体培养基中30℃、170rpm摇床上振荡2d，获得N134发酵液、N144发酵液和N111发酵液，稀释涂布计数菌体数量，N134发酵液、N144发酵液和N111发酵液菌体浓度均≥1×108cfu/mL。
将保存的木霉NJAU4742菌株接种于PDA固体培养基平板，放置于28℃培养箱中培养7d，待孢子长满整个平板后取出备用。将长满孢子的平板用无菌水冲洗获得孢子，取0.1mL接种于装有100mL PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，放置于28℃、150rpm的摇床中，先黑暗条件摇瓶发酵2-3d，后光照条件下摇瓶发酵2-3d。用4层无菌纱布过滤除去菌丝，获得木霉NJAU4742孢子液，用血球板计数法测定孢子液中孢子数量，所述木霉NJAU4742孢子液孢子浓度≥0.5×108个/mL。
单一菌剂制备：分别将N134发酵液、N144发酵液和N111发酵液4000rpm离心6min，去上清后用发酵液十倍体积的无菌水重悬，制成单一菌剂即N134菌剂、N144菌剂和N111菌剂；将木霉NJAU4742孢子液用无菌水稀释十倍，获得木霉NJAU4742菌剂。
复合菌剂制备：将N134菌剂、N144菌剂和N111菌剂中的一种、两种、三种分别和木霉NJAU4742菌剂混合，混合时各液体等体积混合，制成复合菌剂。
（4）复合菌剂对酸性土壤油菜的促生效果试验
油菜种子温水浸种晾干后备用，准备育苗基质、育苗盘、塑料盆。将江西土壤（pH为4.5）与石英砂按体积比1：1混合得到混合土壤，每个塑料盆装混合土壤300g备用。
本实施例试验于温度为25℃、相对湿度在60%-70%的温室中进行，出芽后打开温室的植物补光灯，在夜间22:00至次日清晨6：00植物补光灯自动关闭。
将油菜种子点播于装有育苗基质的育苗盘中，每穴2-3粒种子，浇水浸透，培养4-5d种子出芽，喷洒适量矮壮素（防止形成高脚苗），继续培养，育苗期间定期浇水（每隔2d浇水一次，下同）。待油菜苗长到3片真叶，选择生长势较为一致的油菜苗将其移栽至装好混合土壤的塑料盆（每盆一株油菜苗）中，待移栽完毕后，浇水至塑料盆中，且后续定期浇水。
如表1所示，上述移栽至塑料盆中的油菜苗共设置12个处理，其中4个单一菌剂，7个复合菌剂和1个清水（无菌水）对照（CK），每个处理设9个重复。
待移栽后的油菜苗稳定生长一周后，接入菌剂（将菌剂浇入塑料盆的混合土壤中，靠近油菜苗根部的地方），接种比例为10%（100µL/g混合土壤干重即每塑料盆浇入30mL菌剂），浇菌完成后继续培养，培养3周后，待长出第6片真叶，每个处理随机选取3株油菜苗，测定油菜苗的鲜干重、叶绿素含量，比较各处理的油菜苗的生长状况。各指标测定方法同实施例3。
由图12至图14可知，浇菌完成培养3周后，T6（N134-木霉）处理的油菜苗鲜重最大，优于其他处理；T6（N134-木霉）处理和T10处理（N134-N111-木霉）干重最大，优于其他处理。T6（N134-木霉）处理SPAD显著高于T1（CK）处理，略低于T5（木霉）处理和T2（N134）处理，但差异均不显著。综合分析，得出T6（N134-木霉）处理鲜干重均为最大，SPAD值也较高，为最优处理。
实施例6 菌株N134的鉴定
利用形态学以及16S rRNA基因序列分析，对菌株N134进行生物学鉴定。
如图1所示，菌株N134在TSB固体培养基平板上30℃培养1-2d形成黄褐色、不规则圆形、不透明、湿润、边缘较为光滑的菌落。
通过对菌株N134的16S rRNA基因序列与相近序列进行比对，并构建发育树。图2结果显示，菌株N134与假单胞菌同源性较高，和Pseudomonas bijieensis strain L22-9处于同一分支。
菌株N134已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29191。
Claims (7)
1.一种含细菌和真菌的复合菌剂，其特征在于，所述细菌为假单胞菌N134，所述假单胞菌N134的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月30日，保藏编号为CGMCC NO.29191；所述真菌为木霉NJAU4742，所述木霉NJAU4742的分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166；
所述复合菌剂包括如下步骤制备得到：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134进行液体发酵，获得假单胞菌N134发酵液；将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742进行液体发酵，获得木霉NJAU4742孢子液；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；用无菌水稀释木霉NJAU4742孢子液，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种含细菌和真菌的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括如下步骤制备得到：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基包括TSB液体培养基、LB液体培养基或R2A液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速170-200rpm，发酵时间1-2d，获得假单胞菌N134发酵液，稀释涂布计数菌体数量，所述假单胞菌N134发酵液菌体浓度≥1×108cfu/mL；
将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742孢子接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基为PDA液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速140-160rpm，先黑暗条件发酵2-3d，后光照条件下发酵2-3d，过滤除去菌丝，得到木霉NJAU4742孢子液，用血球板计数法测定孢子液中孢子数量，所述木霉NJAU4742孢子液孢子浓度≥0.5×108个/mL；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用假单胞菌N134发酵液十倍体积的无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；
将木霉NJAU4742孢子液用无菌水稀释十倍，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
3.一种含细菌和真菌的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述细菌为假单胞菌N134，所述假单胞菌N134的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月30日，保藏编号为CGMCC NO.29191；所述真菌为木霉NJAU4742，所述木霉NJAU4742的分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166；
所述复合菌剂制备时，包括如下步骤：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134进行液体发酵，获得假单胞菌N134发酵液；将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742进行液体发酵，获得木霉NJAU4742孢子液；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；用无菌水稀释木霉NJAU4742孢子液，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种含细菌和真菌的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合菌剂制备时，包括如下步骤：
（1）将保藏编号为CGMCC NO.29191的假单胞菌N134接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基包括TSB液体培养基、LB液体培养基或R2A液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速170-200rpm，发酵时间1-2d，获得假单胞菌N134发酵液，稀释涂布计数菌体数量，所述假单胞菌N134发酵液菌体浓度≥1×108cfu/mL；
将保藏编号为CGMCC NO.12166的木霉NJAU4742孢子接种于液体培养基中进行液体发酵，所述液体培养基为PDA液体培养基，液体发酵条件为：温度28-30℃，转速140-160rpm，先黑暗条件发酵2-3d，后光照条件下发酵2-3d，过滤除去菌丝，得到木霉NJAU4742孢子液，用血球板计数法测定孢子液中孢子数量，所述木霉NJAU4742孢子液孢子浓度≥0.5×108个/mL；
（2）将假单胞菌N134发酵液离心，去上清后用假单胞菌N134发酵液十倍体积的无菌水重悬，获得假单胞菌N134菌剂；
将木霉NJAU4742孢子液用无菌水稀释十倍，获得木霉NJAU4742菌剂；
（3）将假单胞菌N134菌剂和木霉NJAU4742菌剂等体积混合，得到所述复合菌剂。
5.权利要求1-2任一权利要求所述的含细菌和真菌的复合菌剂在促进酸性土壤油菜生长中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酸性土壤pH在4.5-6.5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用时，在油菜苗移栽7-10d后施入所述菌剂，施入量为30-50mL/株油菜苗。
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