CN1181057C - 新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的药物组合物 - Google Patents
新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的药物组合物，更具体地，本发明涉及5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐、制备方法以及含有所述化合物作为活性成分的药物组合物。特别地，本发明所述5-嘧啶甲酰胺衍生物由于对人免疫缺陷病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)的增殖具有抑制活性，能用作乙肝和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的治疗剂和预防剂。
Description
技术领域
本发明涉及新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的药物组合物。更具体地，涉及本发明下列式1所表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐，它们对乙肝病毒和人免疫缺陷型病毒的繁殖具有显著的抑制作用。本发明还涉及式1化合物的制备方法以及含有作为抗病毒有效成分的所述衍生物的药物组合物。
式1
其中，
R1是H、羟基、C1-C5直链或支链烷基团、C1-C5直链或支链烷氧基团、C2-C6直链或支链羟基烷基团、C2-C6二烷基氨基团、以羟基或C2-C6烷氧羰基取代的C2-C6直链或支链烷基团、C3-C6环烷基团，或饱和或不饱和的含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元杂环化合物，该化合物可以是未取代的或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不对称碳原子；
R2是H或C1-C4直链或支链烷基团；
或R1和R2两者组成含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元饱和杂环，该杂环未取代或以C1-C5直链或支链烷基或C2-C5直链或支链羟基烷基取代；
n是介于0-4间的整数；
R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基。
背景技术
乙肝病毒(HBV，下文简称“HBV”)引发急性或慢性肝炎，其可发展成肝硬化和肝癌。据估计全世界有3亿人感染HBV(Tiollais和Buendia，Sci.Am.，264，48，1991)。为寻找预防和治疗乙肝的方法，对HBV的分子生物学特性已有许多研究。现已开发出了各种疫苗和诊断药物，并正努力开辟研究治疗乙肝的新途径。
HBV基因组由编码聚合酶(P)、表面蛋白(pre-S1、pre-S2和S)、核心蛋白(pre-C和C)和X蛋白的基因组成。在这些HBV基因表达的蛋白中，聚合酶、表面蛋白和核心蛋白是结构蛋白，而X蛋白具有调控功能。
HBV聚合酶基因包含全部病毒基因组的80％，可生成94kD大小由845个氨基酸组成的蛋白，该基因在病毒基因组复制中有几种功能。该多肽包括许多序列，这些序列负责蛋白引物、RNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的DNA聚合酶和核糖核酸酶H(RNase H)的活性。Kaplan和其同事首先发现了聚合酶的反转录酶的活性，这导致在HBV复制机理方面更多的研究。
当病毒粒体表面的抗原蛋白被肝细胞特异性受体识别后，HBV就进入肝脏。在肝细胞内，DNA由HBV聚合酶作用合成并附着到短链上从而形成HBV基因组完整的双螺旋。完整的HBV双螺旋DNA基因组由于RNA聚合酶的作用产生前基因组mRNA以及核心蛋白、表面蛋白和调控蛋白的mRNA。使用这些mRNA合成病毒蛋白。聚合酶在病毒基因组产生、与核心蛋白和前基因组mRNA形成称为复制体的结构方面具有重要功能。该过程称为包壳作用。聚合酶在3’末端有谷氨酸重复单位，其对核酸有高亲和性，有利于包壳作用。当复制体形成时，(-)DNA由HBV聚合酶的反转录作用合成，而(+)DNA则通过DNA依赖的DNA聚合酶作用制成，其反过来又产生前基因组mRNA。重复全过程直到池中保持200-300以上基因组(Tiollais和Buendia，Scientific American，264：48-54，1991)。
尽管HBV和HIV是不同的病毒，但它们增殖过程中的复制机理具有一些相同步骤，即病毒RNA的反转录形成DNA以及从随后形成的RNA-DNA杂合体去除RNA链。
近来，已报道核苷化合物如lamivudine和泛苜洛弗(famvir)对HBV增殖是有用的抑制剂，虽然它们初始已经开发成治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS，下文简称“AIDS”)和带状疱疹感染的疗法(Gerin，J.L.，Hepatology，14：198-199，1991；Lok，A.S.P.，J.Viral Hepatitis，1：105-124，1994；Dienstag，J.L.等，New England Journal of Medicine，333：1657-1661，1995)。但是由于高耗费和副作用如毒性、耐药性病毒的产生以及停止治疗后疾病的复发，这些核苷化合物被当作治疗乙肝不好的选择。在非核苷化合物范围内寻找乙肝疗法的努力一直持续着，并且对喹诺酮化合物(EPO 563732，EPO 563734)、三价铱(iridos)化合物(KR 94-1886)和对苯二胺衍生物(KR 96-72384，KR 97-36589，KR 99-5100)已有抗HBV的抗病毒效果报道。尽管付出很多努力，然而治疗乙肝的有效药物仍未开发成功，疗法还主要依赖于症状治疗。
AIDS病诱导体细胞中的免疫功能显著下降并诱发各种正常人罕见的感染症状，并扩散到全身。对AIDS负责的人免疫缺陷病毒(HIV，下文简称“HIV”)已知主要进攻辅助T细胞，该细胞是免疫系统中具有调节功能的T细胞之一。当辅助T细胞感染HIV病毒并遭受坏死后，人免疫系统就不能合适发挥作用。随后免疫功能的损伤导致致命的感染和恶性肿瘤的发展。从AIDS病人在美国1981年第一次被发现，但1993年的AIDS病人数在187个国家已增长到85万以上(WHO1993年报道)。WHO预测到2000年将有3千万到4千万以上人口感染HIV，并且他们中的1千万至2千万将发展成疾病。
目前，药物控制HIV的增殖已广泛应用于治疗AIDS。在这些药物中，叠氮胸苷(zidovudine)以前称为Azidothymidine，是1987年开发的药物。当叠氮胸苷无效或由于副作用不能使用时，1991年开发出二脱氧肌苷(didanosine)作为AIDS病人的选择替代药。此外，1992年许可扎西他宾(zalcitabine)和叠氮胸苷同时使用。这些药减轻了症状，拖延了受感染个体的疾病发展成典型的AIDS，由此某种程度上延长了患者的生命。但是这些药物不能完全治愈病人，而且经常出现一些诸如抗性和副作用的问题。
根据这些问题，本发明人试图开发治疗乙肝时毒性、副作用和诱发病毒菌株抗性都小的疗法。我们发现了具有极好的抗HBV抗病毒效果的化合物，合成了式1表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物，并通过其对HIV和HBV的增殖显示了明显的抑制作用，从而完成了本发明。
发明公开
本发明提供了新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的药物组合物。更具体地，本发明提供了新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐、制备方法和含有所述衍生物作为有效成分的药物组合物。本发明的5-嘧啶甲酰胺衍生物可抑制乙肝病毒和人免疫缺陷病毒的增殖并可有效用于预防和治疗乙肝和AIDS病。
为了实现上述目标，本发明提供了以下式1表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物以及它们的可药用盐。
式1
其中，
R1是H、羟基、C1-C5直链或支链烷基团、C1-C5直链或支链烷氧基团、C2-C6直链或支链羟基烷基团、C2-C6二烷基氨基团、以羟基或C2-C6烷氧羰基团替代的C2-C6直链或支链烷基团、C3-C6环烷基团，或饱和或不饱和的含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元杂环化合物，该化合物可以是未取代或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不对称碳原子；
R2是H或C1-C4直链或支链烷基团；
或R1和R2两者组成含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元饱和杂环，该杂环未取代或以C1-C5直链或支链烷基取代或C2-C5直链或支链羟基烷基取代；
R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；
n是介于0-4间的整数。
当R1和R2代表含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元杂环化合物时，n等于0。该杂环可以是未取代或被C1-C5直链或支链烷基团、C2-C5直链或支链羟基烷基取代或羟基取代；
当式1的R1含有不对称碳原子时，它们可以R或S光学异构体存在，本发明覆盖了光学异构体以及外消旋混合物。
本发明中R3的吲唑-5-基和吲唑-6-基基团分别以式2和式3表示。
式2
式3
本发明式1的化合物可以盐的形式使用，通过加入可药用游离酸制备的酸加成盐是有用的。根据本领域的一般方法可将式1的化合物变成对应的酸加成盐。在这种情况下，无机酸和有机酸均可用作游离酸。在无机酸中，可采用盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。在有机酸中，可采用柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、甘醇酸(glycolic acid)、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、embonic acid、谷氨酸和天门冬氨酸。
进一步，如下列流程图1中所示，本发明提供了5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备方法。
反应方案1
其中，R1、R2、R3和n如式1所定义。
制备本发明式1化合物的方法包含下列两个步骤：
1)式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物的制备是将式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯与式5(5代表式2和式3两个化合物，下文简称式5)的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在合适溶剂、合适温度及碱性条件下反应(步骤1)；
2-A)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备是将步骤1中制备的式6的化合物与式7的胺化合物在合适溶剂、合适温度下反应，或
2-B)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备首先是将步骤1中合成的式6的化合物水解形成式8的5-嘧啶羧酸衍生物，然后在N，N-二甲基甲酰胺和SOCl2存在下将其活化成维斯米尔(Vilsmeier)中间产物，并使之与式7的胺化合物反应。
流程图1中所使用的化学试剂，即式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯、式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑和式7的胺化合物都有商品提供可方便购买。
下文更详细描述式1化合物的制备方法。
对于式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯与式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑反应合成式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物，有机化合物可用作碱。优选使用叔胺如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺、2，6-二甲基吡啶和吡啶。
优选反应温度为20-40℃，优选反应时间为1-6小时。
优选单一试剂，选自醇如甲醇和乙醇、氯仿、二氯甲烷和乙腈，或上述溶剂的混合物。
式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物由步骤1中合成的式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物与式7的胺混合物反应来制备可采用两种方法中的一种进行。
如步骤2-A，式7中合适的胺化合物可用来生成高产率的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物，而不需首先将式6的氨基吲唑5-嘧啶羧酸乙酯水解。
在这种情况下，式7的胺化合物用以引入R1和R2取代基，并根据所需取代基的种类选择合适的胺。对于胺化合物，可使用甲醇氨溶液、甲醇甲胺溶液、乙胺水溶液、异丙胺、环丙胺、乙醇胺或丙醇胺，这些物质都有现成商品提供。
对于碱，与式7的中间产物比较，优选过量使用如制备式6的化合物中所用的有机碱，以增加反应效率。
溶剂优选单一溶剂，选自醇如水、甲醇、乙醇和异丙醇或氯仿、二氯甲烷和乙腈以及上述溶剂的混合溶剂。
反应温度优选25-60℃，这依赖于所使用的胺化合物。
至于步骤2-B中的反应，用于水解式6的化合物的碱化合物优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾。水解反应中5-嘧啶羧酸衍生物几乎是定量形成的。
反应中的溶剂优选使用水和醇如甲醇或乙醇的混合物。
反应温度和时间分别优选30-60℃和0.5-3小时。
5-嘧啶羧酸衍生物采用加热N，N-二甲基甲酰胺和亚硫酰二氯在30-50℃所形成的Vilsmeier试剂活化，然后与合适的式7的胺化合物在0-20℃下反应制备本发明的目的化合物5-嘧啶甲酰胺衍生物。
本反应的溶剂优选非质子溶剂如氯仿、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或乙醚。
进一步，本发明提供了预防和治疗乙肝的药物组合物，该组合物包含了作为有效成分的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐。
本发明还提供了预防和治疗AIDS的药物组合物，该组合物包含了作为有效成分的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐。
本发明式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物在HIV和HBV增殖中是有效的抑制剂，这是因为它们干扰了从病毒RNA反转录成DNA时所形成的RNA-DNA杂合体中去除了RNA链。该反转录对HBV和HIV的复制过程是共同的。
式1的化合物可以口服及通过其它临床使用途径给药；例如，可以静脉内、皮下、腹膜内或局部施用和以一般药物形式使用。
对于含有本发明药物组合物药物的临床使用，式1的化合物能与可药用赋形剂混合并制成各种可药用形式；例如，口服片剂、胶囊、trochise、溶液、悬浮液；和注射溶液、悬浮液，或与蒸馏水混合制成速溶的注射溶液的干粉。
式1的化合物的有效量一般为成人10-500mg/kg，优选50-300mg/kg，其可分成数个剂量，优选分成每天1-6个剂量，以及遵照医嘱施用。
实施本发明的最佳方式
本发明实用的优选实施方案以下列实施例所显示的来进行说明。
然而，如果本领域的技术人员参考本发明内容后在本发明的精神和范围内作出修改和改进，这将是可理解的。
<制备实施例1>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯的制备
在含有4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)和5-氨基吲唑(3.15g)的甲醇溶液(70ml)中加入三乙胺(3.5ml)，然后将溶液30℃反应3小时。反应混合物放置室温冷却后，20℃搅拌1小时。然后将反应混合物过滤并用甲醇(20ml)洗涤。所获得的固体40-50℃真空干燥得到所需的化合物(6.15g，87％)。
熔点：199-201℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ1.34(t，3H)，2.42(s，3H)，4.34(m，2H)，7.48(d，1H)，7.53(d，1H)，8.06(d，2H)，8.70(s，1H)，10.18(s，1H)，13.10(brs，1H)
<制备实施例2>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯的制备
在含有4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)和6-氨基吲唑(3.15g)的甲醇溶液(70ml)中加入N，N-二异丙基乙胺(4.2ml)，然后将溶液30-35℃反应4小时。反应混合物放置室温冷却后，20℃搅拌1小时。然后将反应混合物过滤并用甲醇(20ml)洗涤。所获得的固体40-50℃真空干燥得到所需的化合物(5.8g，82％)。
熔点：212-214℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ1.33(t，3H)，2.53(s，3H)，4.33(m，2H)，7.10(d，1H)，7.70(d，1H)，8.00(s，1H)，8.22(s，1H)，8.72(s，1H)，10.40(s，1H)，13.09(br s，1H)
<制备实施例3>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸的制备
在甲醇溶液(80ml)中加入制备实施例1所获得的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)，并在该溶液中再加入H2O(30ml)和3N NaOH水溶液(15ml)，40-50℃水解1小时。反应混合物冷却后，于20℃缓慢加入3N HCl水溶液直至pH5。然后在反应混合物中缓慢加入H2O(100ml)，20℃搅拌1小时，过滤，用H2O(30ml)洗涤，得到固体产物。该固体产物在50℃真空干燥得到所需的化合物(4.44g，97％)。
熔点：＞270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.45(s，3H)，7.49(d，1H)，7.53(d，1H)，8.05(s，1H)，8.10(s，1H)，8.68(s，1H)，10.50(s，1H)，13.09(br s，1H)
<制备实施例4>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸的制备
除了使用由制备实施例2得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)作为初始反应物以外，所需化合物(95％)采用制备实施例3的相同方法获得。
熔点：＞270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.56(s，3H)，7.10(d，1H)，7.72(d，1H)，8.01(s，1H)，8.25(s，1H)，8.73(s，1H)，10.81(br s，1H)，13.06(br s，1H)
<实施例1>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在从制备实施例1所制得的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)氯仿溶液(10ml)中加入10％甲醇氨溶液(20ml)，缓慢加热并在40℃反应2天。反应混合物减压蒸馏浓缩并加入甲醇(15ml)后结晶。含有固体产物的反应混合物于20℃搅拌，过滤然后分离固体产物。固体产物用氯仿∶乙醇(1∶1)(v/v)重结晶，真空干燥后获得所需化合物(0.62g，68％)。
熔点：＞270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.49(s，3H)，7.47(d，1H)，7.55(d，1H)，7.73(br s，1H)，8.07(s，1H)，8.15(s，1H)，8.28(br s，1H)，8.71(s，1H)，11.46(s，1H)，13.07(br s，1H)
<实施例2>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
除了使用由制备实施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)作为初始反应物以外，所需化合物(62％)采用
实施例1的相同方法获得。
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.56(s，3H)，7.06(d，1H)，7.70(d，1H)，7.81(br s，1H)，7.98(s，1H)，8.28(s，1H)，8.32(br s，1H)，8.73(s，1H)，11.75(s，1H)，13.02(br s，1H)
<实施例3>4-(1H-5-吲唑氨基)-N-甲基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在40％甲胺的甲醇溶液(30ml)中加入从制备实施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1.5g)，将该溶液于25-30℃反应1小时。反应混合物冷却至20-25℃，加入H2O(90ml)并搅拌0.5小时，过滤，25％甲醇水溶液(10ml)洗涤，得到固体产物。该产物经真空干燥后得到所需化合物(1.26g，88％)。
熔点：259-261℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.46(s，3H)，2.80(d，3H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，8.03(s，1H)，8.13(s，1H)，8.61(s，1H)，8.75(br s，1H)，11.28(s，1H)，13.06(br s，1H)
<实施例4>4-(1H-6-吲唑氨基)-N-甲基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
除了使用由制备实施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯作为初始反应物以外，所需化合物(92％)采用实施例3的相同方法获得。
熔点：263-265℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.56(s，3H)，2.81(d，3H)，7.05(d，1H)，7.69(d，1H)，7.98(s，1H)，8.28(s，1H)，8.67(s，1H)，8.79(br s，1H)，11.57(s，1H)，13.02(br s，1H)
<实施例5>N-乙基-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在甲醇溶液(20ml)中加入从制备实施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室温下加入70％乙胺水溶液(25ml)，30-35℃反应1小时。反应混合物冷却后缓慢加入H2O(30ml)并搅拌0.5小时，过滤，30％甲醇水溶液(10ml)洗涤，得到所需化合物(0.8g，80％)。
熔点：252-254℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ1.17(t，3H)，2.49(s，3H)，3.33(m，2H)，7.48(d，1H)，7.55(d，1H)，8.07(s，1H)，8.15(s，1H)，8.65(s，1H)，8.78(br s，1H)，11.29(s，1H)，13.09(br s，1H)
<实施例6>N-环丙基-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在甲醇溶液(20ml)中加入从制备实施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室温下加入环丙胺(7ml)，50℃反应6小时。反应混合物冷却后缓慢加入H2O(20ml)，25℃搅拌0.5小时，过滤，30％甲醇水溶液(10ml)洗涤，得到所需化合物(0.67g，65％)。
熔点：＞270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ0.54(m，2H)，0.67(m，2H)，2.49(s，3H)，2.78(m，1H)，7.00(d，1H)，7.63(d，1H)，7.92(s，1H)，8.21(s，1H)，8.58(s，1H)，8.69(br s，1H)，11.46(s，1H)，12.97(br s，1H)
<实施例7>N-(2-羟基乙基)-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在甲醇溶液(20ml)中加入从制备实施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室温下加入乙醇胺(7ml)并回流4小时。反应混合物冷却后于20℃缓慢加入H2O(40ml)，并搅拌0.5小时，过滤，25％甲醇水溶液(10ml)洗涤，得到所需化合物(0.75g，72％)。
熔点：＞270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.45(s，3H)，3.36(m，2H)，3.55(m，2H)，4.81(m，1H)，7.47(d，1H)，7.54(d，1H)，8.06(s，1H)，8.15(s，1H)，8.71(s，1H)，8.77(br s，1H)，11.25(s，1H)，13.07(br s，1H)
<实施例8>N-(2-羟基乙基)-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
除了使用由制备实施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙醚作为初始反应物以外，所需化合物(76％)采用实施例7的相同方法获得。
熔点：269-270℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.56(s，3H)，3.33(m，2H)，3.54(m，2H)，4.79(m，1H)，7.04(d，1H)，7.69(d，1H)，7.98(s，1H)，8.27(s，1H)，8.72(s，1H)，8.81(br s，1H)，11.52(s，1H)，13.03(br s，1H)
<实施例9>N-羟基乙基-N-甲基-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制备
在二氯甲烷溶液(120ml)中加入N，N-二甲基甲酰胺(1.1ml)和亚硫酰二氯(1.2ml)，并回流2小时。将从制备实施例3得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(3g)加入到上述溶液中，并回流10小时。反应混合物冷却后，在0-5℃缓慢加入2-(甲基氨基)乙醇(4ml)，并搅拌1小时。在反应混合物中加入甲醇(80ml)，搅拌5分钟，然后过滤去除杂质。过滤液经减压蒸馏浓缩后获得固体产物。将3N NaOH水溶液(3ml)加入到含上述固体产物的甲醇∶H2O(1∶1)溶液中，搅拌1小时，过滤，用H2O洗涤。通过二氯甲烷∶异丙醚(1∶4)重结晶获得所需化合物(1.61g，45％)。
熔点：106-114℃
1H-NMR(DMSO-d6)，ppm：δ2.40(s，3H)，2.99(s，3H)，3.43(br s，2H)，3.56(br s，2H)，7.44(d，1H)，7.50(d，1H)，7.93(br s，1H)，8.03(s，1H)，8.14(s，1H)，8.93(br s，1H)，13.03(br s，1H)
实施例10-35中化合物的制备采用实施例9相同的方法。表1显示了化合物名称、产率、重结晶溶液、实施例10-35所制备化合物的熔点以及作为初始反应物的5-嘧啶羧酸衍生物(
8)和胺化合物(
7)。表2显示了实施例10-35所制备化合物的1H-NMR。
表1a
| 实施例 | 化合物 | ||||
| 5-嘧啶甲酰胺衍生物( 8) | 胺化合物( 7) | 重结晶溶液 | 产率(％) | 熔点(℃) | |
| 10 | N-羟基乙基-N-甲基-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 2-(甲氨基)乙醇 | 氯仿/异丙醚(1∶4) | 52 | 93-97 | |
| 11 | N-[(1R)-1-(羟基甲基)丙基]-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | (R)-2-氨基-1-丁醇 | 甲醇/氯仿/异丙醚(1∶2∶10) | 44 | 219-222 | |
| 12 | N-[(1R)-1-(羟基甲基)丙基]-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | (R)-2-氨基-1-丁醇 | 甲醇/异丙醇(1∶5) | 65 | 234-237 | |
| 13 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-N-(2-甲氧基乙基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 2-甲氧基乙胺 | 丙酮/异丙醚(1∶4) | 72 | 214-217 | |
| 14 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-N-(2-甲氧基乙基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 2-甲氧基乙胺 | 丙酮/异丙醚(1∶4) | 75 | 225-228 | |
| 15 | N，N-二甲基-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 二甲胺乙醇溶液(33％) | 甲醇/7酸乙酯/己烷(1∶5∶5) | 41 | 101-105 | |
| 16 | N，N-二甲基-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 二甲胺乙醇溶液(33％) | 甲醇/乙酸乙酯/己烷(1∶5∶5) | 38 | 164-166 | |
| 17 | N-[2-(二甲氨基)乙基]-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | N，N-二甲基乙二胺 | 氯仿/乙醚/甲醇(3∶3∶1) | 43 | 111-114 | |
| 18 | N-[2-(二甲氨基)乙基]-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | N，N-二甲基乙二胺 | 氯仿/乙醚/甲醇(3∶3∶1) | 35 | 162-167 | |
| 19 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-[2-(4-吗啉基)乙基]-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 4-(2-氨基乙基)吗啉 | 氯仿/乙醚/甲醇(3∶3∶1) | 52 | 113-117 | |
表1b
| 实施例 | 化合物 | ||||
| 5-嘧啶甲酰胺衍生物( 8) | 胺化合物( 7) | 重结晶溶液 | 产率(％) | 熔点(℃) | |
| 20 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-[2-(4-吗啉基)乙基]-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 4-(2-氨基乙基)吗啉 | 氯仿/乙醚/甲醇(3∶3∶1) | 56 | 226-228 | |
| 21 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-N-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 1-氨基-4-甲基哌嗪 | 二氯甲烷/己烷(1∶4) | 64 | 251-253 | |
| 22 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-N-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 1-氨基-4-甲基哌嗪 | 二氯甲烷/己烷(1∶4) | 53 | 244-247 | |
| 23 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-N-[(1S)-1-(甲氧基羰基)-(2R)-2-羟基丙基]-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | L-treonine甲酯 | 甲醇 | 76 | 227-232 | |
| 24 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-N-[(1S)-1-(甲氧基羰基)-(2R)-2-羟基丙基]-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | L-treonine甲酯 | 甲醇 | 78 | 226-228 | |
| 25 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-(3-吡啶基)甲基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 3-(氨基甲基)吡啶 | 甲醇/乙醚(1∶3) | 62 | 268-270 | |
| 26 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-(3-吡啶基)甲基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 3-(氨基甲基)吡啶 | 甲醇/乙醚(1∶3) | 74 | 253-256 | |
| 27 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 2-(2-氨基乙基)吡啶 | 二氯甲烷/乙醚(1∶2) | 49 | 220-223 | |
| 28 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-[2-(2-吡啶基)乙基]-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 2-(2-氨基乙基)吡啶 | 二氯甲烷/乙醚(1∶2) | 56 | 230-231 | |
表1C
| 实施例 | 化合物 | ||||
| 5-嘧啶甲酰胺衍生物( 8) | 胺化合物( 7) | 重结晶溶液 | 产率(％) | 熔点(℃) | |
| 29 | N-[3-(1H-1-咪唑基)丙基]-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 1-(3-氨基丙基)咪唑 | 氯仿/异丙醚(1∶3) | 53 | 121-125 | |
| 30 | N-[3-(1H-1-咪唑基)丙基]-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例4 | 1-(3-氨基丙基)咪唑 | 甲醇/乙醚(1∶3) | 61 | 230-232 | |
| 31 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-5-[(4-甲基-1-哌嗪基)羰基]-2-甲硫基嘧啶 | ||||
| 制备实施例3 | 1-甲基哌嗪 | 二氯甲烷/异丙醚(1∶2) | 57 | 153-155 | |
| 32 | 4-(1H-6-吲唑氨基)-5-[(4-甲基-1-哌嗪基)羰基]-2-甲硫基嘧啶 | ||||
| 制备实施例4 | 1-甲基哌嗪 | 二氯甲烷/异丙醚(1∶2) | 47 | 102-106 | |
| 33 | 5-{[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪]羰基}-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基嘧啶 | ||||
| 制备实施例3 | 1-(2-羟基乙基)哌嗪 | 氯仿/异丙醚(1∶3) | 58 | 166-170 | |
| 34 | 5-{[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪]羰基}-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基嘧啶 | ||||
| 制备实施例4 | 1-(2-羟基乙基)哌嗪 | 氯仿/异丙醚(1∶3) | 52 | 114-117 | |
| 35 | 4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-N-(4-吗啉基)-5-嘧啶甲酰胺 | ||||
| 制备实施例3 | 4-氨基吗啉 | 甲醇/H20(1∶1) | 60 | 239-242 | |
表2a
| 实施例 | NMR溶液 | 1H-NMR数据(ppm) |
| 10 | DMSO-d6 | δ2.49(s，3H)，3.00(s，3H)，3.45(br s，2H)，3.56(br s，2H)，7.15(d，1H)，7.67(d，1H)，7.97(s，1H)，8.05(br s，1H)，8.22(s，1H)，9.04(br s，1H)，13.00(br s，1H) |
| 11 | DMSO-d6 | δ0.88(t，3H)，1.45(m，1H)，1.63(m，1H)，2.47(s，3H)，3.45(m，2H)，3.89(br s，1H)，7.49(m，2H)，8.03(s，1H)，8.12(s，1H)，8.32(d，1H)，8.71(s，1H)，11.22(s，1H)，13.03(br s，1H) |
| 12 | DMSO-d6 | δ0.88(t，3H)，1.46(m，1H)，1.65(m，1H)，2.56(s，3H)，3.43(m，2H)，3.89(br s，1H)，7.05(d，1H)，7.70(d，1H)，7.99(s，1H)，8.28(s，1H)，8.38(d，1H)，8.77(s，1H)，11.50(s，1H)，12.99(br s，1H) |
| 13 | DMSO-d6 | δ2.46(s，3H)，3.28(s，3H)，3.46(m，4H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，8.03(s，1H)，8.12(s，1H)，8.66(s，1H)，8.84(br s，1H)，11.22(s，1H)，13.05(br s，1H) |
| 14 | DMSO-d6 | δ2.56(s，3H)，3.27(s，3H)，3.46(m，4H)，7.05(d，1H)，7.69(d，1H)，7.99(s，1H)，8.27(s，1H)，8.71(s，1H)，8.89(br s，1H)，11.51(br s，1H)，13.05(br s，1H) |
| 15 | DMSO-d6 | δ2.34(s，3H)，2.92(s，6H)，7.41(m，2H)，7.86(d，1H)，7.97(s，1H)，8.07(d，1H)，9.10(s，1H)，12.96(br s，1H)， |
| 16 | DMSO-d6 | δ2.49(s，3H)，2.99(s，6H)，7.16(d，1H)，7.67(d，1H)，7.97(s，1H)，8.04(d，1H)，8.20(s，1H)，9.31(br s，1H)，13.00(br s，1H) |
| 17 | DMSO-d6 | δ2.25(s，6H)，2.52(m，5H)，3.41(m，2H)，7.48(d，1H)，7.55(d，1H)，8.06(s，1H)，8.14(s，1H)，8.65(s，1H)，8.76(br s，1H)，11.23(br s，1H)，13.10(br s，1H) |
| 18 | DMSO-d6 | δ2.18(s，6H)，2.42(m，2H)，2.49(s，3H)，3.36(m，2H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，8.03(s，1H)，8.11(s，1H)， |
| 8.65(s，1H)，8.76(br s，1H)，11.22(br s，1H)，13.08(br s，1H) | ||
| 19 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.50(s，3H)，3.14(t，2H)，3.34(t，2H)，3.54(d，2H)，3.68(m，4H)，3.96(d，2H)，7.48(m，1H)，7.58(d，1H)，8.06(t，2H)，8.71(s，1H) |
| 20 | DMSO-d6 | δ2.36(s，4H)，2.49(s，3H)，3.26(s，2H)，3.34(d，2H)，3.50(s，4H)，6.97(d，1H)，7.63(d，1H)，7.91(s，1H)，8.20(s，1H)，8.61(s，1H)，8.71(br s，1H)，11.41(s，1H)12.97(br s，1H) |
| 21 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.37(s，3H)，2.82(s，3H)，3.13-3.22(m，6H)，3.49(d，2H)，7.49(d，1H)，7.57(d，1H)，8.03(s，1H)，8.07(s，1H)，8.67(s，1H) |
| 22 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.58(s，3H)，2.82(s，3H)，3.13-3.25(m，6H)，3.47(d，2H)，7.13(d，1H)，7.73(d，1H)，8.06(s，1H)，8.18(s，1H)，8.69(s，1H) |
| DMSO：二甲亚砜，TFA：三氟乙酸 | ||
表2b
| 实施例 | NMR溶液 | 1H-NMR数据(ppm) |
| 23 | DMSO-d6 | δ1.16(d，3H)，2.47(s，3H)，3.68(s，3H)，4.19(m，1H)，4.50(br s，1H)，5.03(d，1H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，8.04(s，1H)，8.10(s，1H)，8.71(d，1H)，8.80(s，1H)，10.86(s，1H)，13.06(br s，1H) |
| 24 | DMSO-d6 | δ1.16(d，3H)，2.56(s，3H)，3.68(s，3H)，4.19(m，1H)，4.51(br s，1H)，5.04(d，1H)，7.05(d，1H)，7.69(d，1H)，7.99(s，1H)，8.25(s，1H)，8.77(d，1H)，8.85(s，1H)，11.11(br s，1H)，13.05(br s，1H) |
| 25 | DMSO-d6 | δ2.54(s，3H)，4.60(d，2H)，7.44(m，1H)，7.52(d，1H)，7.59(d，1H)，7.84(d，1H)，8.11(d，1H)，8.19(d，1H)，8.54(d，1H)，8.66(s，1H)，8.78(d，1H)，9.43(br s，1H)， |
| 11.23(s，1H)，13.13(br s，1H) | ||
| 26 | DMSO-d6 | δ2.56(s，3H)，4.53(d，2H)，7.05(m，1H)，7.37(m，1H)，7.69(d，1H)，7.77(m，1H)，7.98(s，1H)，8.27(s，1H)，8.47(m，1H)，8.59(d，1H)，8.77(s，1H)，9.41(t，1H)，11.43(br s，1H)，13.03(br s，1H) |
| 27 | DMSO-d6 | δ2.47(s，3H)，3.01(t，2H)，3.63(t，2H)，7.22(t，1H)，7.29(d，1H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，7.71(t，1H)，8.04(s，1H)，8.13(s，1H)，8.51(s，1H)，8.58(s，1H)，8.86(br s，1H)，11.17(br s，1H)，13.06(br s，1H) |
| 28 | DMSO-d6 | δ2.56(s，3H)，3.01(t，2H)，3.64(t，2H)，7.05(d，1H)，7.22(t，1H)，7.30(d，1H)，7.70(d，2H)，7.99(s，1H)，8.27(s，1H)，8.50(s，1H)，8.63(s，1H)，8.92(br s，1H)，11.47(br s，1H)，13.03(br s，1H) |
| 29 | DMSO-d6 | δ1.98(t，2H)，2.47(s，3H)，3.24(t，2H)，4.04(t，2H)，6.88(s，1H)，7.21(s，1H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，7.66(s，1H)，8.03(s，1H)，8.13(s，1H)，8.65(s，1H)，8.76(br s，1H)，11.12(br s，1H)，13.05(br s，1H) |
| 30 | DMSO-d6 | δ1.98(m，2H)，2.57(s，3H)，3.26(m，2H)，4.04(t，2H)，6.89(s，1H)，7.05(d，1H)，7.21(s，1H)，7.69(t，2H)，7.98(s，1H)，8.28(s，1H)，8.69(s，1H)，8.81(t，1H)，11.43(br s，1H)，13.06(br s，1H) |
| 31 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.48(s，3H)，2.82(s，3H)，3.06(t，2H)，3.31(br s，2H)，3.47(d，2H)，4.26(br s，2H)，7.45(d，1H)，7.56(d，1H)，7.87(s，1H)，8.06(s，1H)，8.31(s，1H) |
| 32 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.44(s，3H)，2.77(s，3H)，3.00(t，2H)，3.25(br s，2H)，3.42(d，2H)，4.24(br s，2H)，7.18(d，1H)，7.69(d，1H)，7.86(s，1H)，8.00(s，1H)，8.30(s，1H) |
| 33 | DMSO-d6 | δ2.39(t，5H)，2.49(d，4H)，3.48(m，6H)，4.13(t，1H)，7.44(d，1H)，7.49(d，1H)，7.92(d，1H)，8.02(s，1H)， |
| 8.08(s，1H)，9.11(s，1H)，13.02(br s，1H) | ||
| 34 | DMSO-d6+TFA-d1 | δ2.45(s，3H)，3.14(d，4H)，3.49(br s，4H)，3.72(s，2H)，4.22(br s，2H)，7.22(d，1H)，7.71(d，1H)，7.89(s，1H)，8.05(s，1H)，8.34(s，1H) |
| 35 | DMSO-d6 | δ2.53(s，3H)，2.96(s，4H)，3.74(s，4H)，7.52(d，1H)，7.59(d，1H)，8.06(s，1H)，8.19(s，1H)，8.61(s，1H)，9.83(s，1H)，10.95(s，1H)，13.12(br s，1H) |
| DMSO：二甲亚砜，TFA：三氟乙酸 | ||
<试验1>对反转录中HBV聚合酶体外活性的抑制作用
为了测定式1的化合物对反转录中HBV聚合酶活性的影响进行了下列体外试验。
本发明人提交了专利申请，有关在E.coli中重组表达并从中分离出的HBV聚合酶、其制备方法以及测定酶活性的方法(KR 94-3918，KR 96-33998)。在本试验中采用了如上所述的已在E.coli中表达的HBV聚合酶。
本发明所使用的体外测定HBV聚合酶反转录活性的方法如下。基本原理如同ELISA。将附着生物素或洋地黄毒苷基团的核苷酸包括在底物中，并以附着在过氧化物酶上的抗-DIG的抗体识别该聚合底物。
在被链霉抗生物素包被的孔中加入20μl HBV聚合酶、20μl反应混合物(DIG-UTP和生物素-UTP各10μM、46mM Tris-HCl、266mMKCl、27.5mM MgCl2和9.2mM DTT底物/引物杂合体)和20μl测试化合物(添加到1、0.1和0.01μg/ml)，使其在22℃反应15小时。在反应过程中，HBV聚合酶催化DNA合成，以及附着到核苷酸上的洋地黄毒苷和生物素与包被在孔底部的链霉生物素形成键。当反应完成后，每个孔用250μl的清洗缓冲液(pH7.0)洗涤30秒钟，重复5次以去除残留杂质。将200μl抗-DIG-POD抗体加入到每个孔中，37℃反应1小时，然后用清洗缓冲液洗涤这些孔以去除杂质。然后每孔加入200μl过氧化物酶底物-ABTSTM，室温反应30分钟。使用ELISA读数仪于405nm测定吸光度。
使用没有测试化合物的组作为对照，计算反转录中HBV聚合酶活性降低的百分比，结果显示在表3中。
表3a对反转录中HBV聚合酶活性的影响
| 化合物 | 对HBV-RT的抑制活性(％) | ||
| 1μg/ml | 0.1μg/ml | 0.01μg/ml | |
| 实施例1 | 90 | 63 | 40 |
| 实施例2 | 85 | 55 | 36 |
| 实施例3 | 88 | 59 | 34 |
| 实施例4 | 96 | 77 | 52 |
| 实施例5 | 70 | 52 | 20 |
| 实施例6 | 74 | 43 | 24 |
| 实施例7 | 93 | 76 | 48 |
| 实施例8 | 95 | 68 | 50 |
| 实施例9 | 75 | 54 | 30 |
| 实施例10 | 70 | 48 | 22 |
| 实施例11 | 82 | 59 | 44 |
| 实施例12 | 85 | 55 | 36 |
| 实施例13 | 58 | 40 | 13 |
| 实施例14 | 60 | 42 | 25 |
| 实施例15 | 77 | 61 | 42 |
| 实施例16 | 54 | 30 | 10 |
| 实施例17 | 80 | 51 | 15 |
| 实施例18 | 92 | 66 | 54 |
| 实施例19 | 64 | 39 | 10 |
| 实施例20 | 67 | 40 | 12 |
| 实施例21 | 78 | 54 | 40 |
| 实施例22 | 72 | 46 | 28 |
| 实施例23 | 51 | 40 | 18 |
| 实施例24 | 82 | 63 | 50 |
| 实施例25 | 97 | 76 | 53 |
| 实施例26 | 98 | 79 | 55 |
| 实施例27 | 88 | 60 | 48 |
| 实施例28 | 95 | 70 | 52 |
| 实施例29 | 80 | 56 | 41 |
| 实施例30 | 91 | 58 | 32 |
表3b对反转录中HBV聚合酶活性的影响
| 化合物 | 对HBV-RT的抑制活性(％) | ||
| 1μg/ml | 0.1μg/ml | 0.01μg/ml | |
| 实施例31 | 82 | 58 | 43 |
| 实施例32 | 62 | 40 | 26 |
| 实施例33 | 53 | 32 | 11 |
| 实施例34 | 59 | 43 | 15 |
| 实施例35 | 90 | 61 | 46 |
如表3所示，本发明的化合物在浓度1μg/ml时对HBV聚合酶活性的抑制作用超过70％，最高达98％。进一步，预期本发明的化合物不存在如使用核苷酸所观察的问题如毒性和病毒抗性的发展，因此针对作用的不同机理可与核苷酸化合物一起施用。
总之，本发明的化合物有效降低了HBV聚合酶的活性，抑制了HBV的复制和增殖，并可用作预防和治疗乙肝的疗法。
<试验2>对HBV生成细胞系中HBV增殖的抑制作用
为了测定式1的化合物对HBV生成细胞系的增殖的抑制效果进行了下列试验。
为测试抗病毒效果，HBV的复制和增殖在一种人肝癌细胞系HepG2.2.15中测定。
将细胞浓度调整到1×105细胞/ml，并在24-孔细胞培养板的每个孔中加入1ml，然后放于培养箱中于37℃5％CO2下培养3-4天直到细胞充分生长，每天更换培养基。当细胞足够成熟时，加入测试化合物至最终浓度0.01、0.1和1μg/ml。测试化合物加入一周后，培养液在5000rpm离心10分钟。将25μl上清液转移到一个新试管中，并往每个试管中加入5μl裂解液[0.54N NaOH和0.06％NP40]。试管放置37℃1小时后，加入30μl的中和溶液[0.09N HCl和0.1M Tris-HCl，pH7.4]作为反应溶液用于竞争性的聚合酶链式反应(PCR)。
采用HBV核心蛋白的基因序列作为模板进行PCR。将1单位Taq聚合酶加入到25pmol每个引物、250μM dNTP、5μl PCR反应液[0.54NNaOH、0.06％NP40、0.09N HCl、0.1M Tris-HCl、pH7.4]。
由PCR聚合的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，为了评价本发明化合物对HBV增殖降低的影响采用成像分析仪(Gel Doc 1000，Bio-Rad)定量分析。
3TC(lamivudine)用作阳性对照，浓度和测试化合物相同。使用没有测试化合物的组作为对照，计算HBV增殖降低的百分比，结果显示在表4中。
表4对HBV增殖的抑制作用
| 化合物 | 对HBV-RT的抑制活性(％) | ||
| 1μg/ml | 0.1μg/ml | 0.01μg/ml | |
| 实施例1 | 82 | 53 | 25 |
| 实施例2 | 70 | 40 | 20 |
| 实施例3 | 75 | 42 | 15 |
| 实施例4 | 94 | 70 | 32 |
| 实施例7 | 92 | 61 | 21 |
| 实施例8 | 88 | 72 | 40 |
| 实施例9 | 65 | 48 | 20 |
| 实施例15 | 70 | 52 | 25 |
| 实施例18 | 88 | 57 | 43 |
| 实施例25 | 92 | 65 | 40 |
| 实施例26 | 97 | 75 | 47 |
| 实施例27 | 84 | 55 | 38 |
| 实施例28 | 93 | 68 | 44 |
| 实施例35 | 86 | 50 | 29 |
| 3TC | 99 | 80 | 48 |
如表4所示，本发明的非核苷酸化合物在浓度1μg/ml时对反转录中HBV聚合酶活性具有极好的抑制作用，HBV增殖降低超过80％，最高达97％。进一步，本发明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物质所观察的问题如毒性和早期病毒株抗性发展。既然本发明化合物作用在变构结合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性区域，因此也可预期前者与后者能平行使用。
如上所述，本发明化合物对HBV聚合酶活性具有很好的抑制效果，而聚合酶活性在HBV复制反转录中步骤至关重要。基于该机理，这些化合物能有效控制HBV增殖并可用作预防和治疗乙肝的疗法。
<试验3>对反转录中体外HIV酶活性的抑制作用
为了测定式1化合物对反转录中HIV酶活性降低的影响，进行了下列体外试验。
将非放射性反转录酶分析试剂盒(Boehringer Mannheim)用于体外测定转录酶的活性。将20μl(40ng)HIV转录酶和20μl含有模板-引物杂合体、poly(A)oligo(dT)15、DIG(洋地黄毒苷)-dUTP、生物素-dUTP和TTP的反应混合物加入到用链霉生物素包被的孔中。也将测试化合物加至最终浓度为0.1和1μg/ml，于37℃反应1小时。此时，凭借HIV转录酶的作用，RNA生成DNA，由于洋地黄毒苷和生物素一部分附着到核苷酸上，DNA与包被在孔底部的链霉形成键。
当反应完成后，每个孔用250μl的清洗缓冲液(pH 7.0)洗涤30秒钟，重复5次以去除残留杂质。将200μl抗-DIG-POD抗体加入到每个孔中，37℃反应1小时，并如上洗涤去除杂质。每孔加入200μl过氧化物酶底物-ABTSTM，室温反应30分钟。然后使用ELISA读数仪于405nm处读取每个溶液的吸光度，并用于定量测定对HIV转录酶活性的抑制效果。使用没有测试化合物的组作为对照，计算HIV反转录酶活性降低的百分比，结果显示在表5中。
表5对HIV反转录酶活性的抑制作用
| 化合物 | 对HBV-RT的抑制活性(％) | |
| 1μg/ml | 0.1μg/ml | |
| 实施例1 | 65 | 44 |
| 实施例3 | 62 | 48 |
| 实施例4 | 70 | 42 |
| 实施例5 | 80 | 57 |
| 实施例6 | 78 | 54 |
| 实施例9 | 84 | 52 |
| 实施例10 | 80 | 47 |
| 实施例16 | 81 | 53 |
| 实施例18 | 77 | 51 |
| 实施例19 | 75 | 48 |
| 实施例20 | 89 | 50 |
| 实施例29 | 72 | 44 |
如表5所示，本发明化合物在浓度1μg/ml时对HIV反转录酶活性具有很好的抑制作用，降低超过80％，最高达89％。进一步，本发明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物质所观察的问题如毒性和早期发展病毒株抗性。此外，既然本发明化合物作用在变构结合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性区域，因此本发明化合物可与核苷酸化合物一起使用。
如上所述，本发明化合物对反转录中HIV酶活性具有很好的抑制效果，而反转录是HIV复制中的一步。基于该机理，这些化合物能有效控制HIV增殖并可用作预防和治疗AIDS的疗法。
<试验4>细胞毒性试验
为了测定式1化合物是否表现出细胞毒性，采用HepG2细胞和公知的MTT方法进行体外测试，结果显示在以下表6中。
表6对HepG2细胞的细胞毒性试验
| 化合物 | 对HepG2的细胞毒性 | |
| IC50 1) | MCD2) | |
| 实施例3 | ＞100 | 100 |
| 实施例4 | ＞100 | 100 |
| 实施例8 | ＞100 | 100 |
| 1)IC50：50％抑制浓度(μg/ml)2)MCD：最小细胞毒性浓度(μg/ml) | ||
如上表6所显示，试验中所使用化合物的IC50超过100μg/ml，因此可认为没有细胞毒性。
<试验5>通过口服给药测试大鼠中的急性毒性
为了检验式1的化合物对大鼠是否具有急性毒性，进行下列试验。
将6周龄的SPF SD系大鼠用在测试急性毒性中。将实施例1-35的化合物悬浮在0.5％的甲基纤维素溶液中，并以4g/kg/15ml的剂量给每组6只大鼠口服一次。观察大鼠的死亡、临床症状和体重变化，进行血液的血液学测试和生物化学测试，在尸检过程中用肉眼检查胸腔和腹部胃肠器官的任何异常症状。结果显示测试化合物不会导致大鼠中任何特异的临床症状、体重变化和死亡。在血液学检验、血液的生化检验和尸检中都未发现任何变化。由于本试验中所用的化合物高达4g/kg水平未导致大鼠任何毒性变化，因此可确定大鼠的LD50值大大超过4g/kg，因此这些化合物经评价确定为安全物质。
工业实用性
如上所述，本发明式1的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物对HBV和HIV的增殖具有显著的抑制效果而无副作用，可用作预防和治疗乙肝和AIDS的治疗剂。
此外，本发明的化合物为非核苷酸，没有核苷酸物质使用中所观察的一些问题如毒性和早期发展的病毒株抗性。进一步，由于本发明化合物似乎作用在变构结合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性区域，因此本发明化合物可与核苷酸化合物一起使用。
Claims (4)
1.以下列式1表示的5-嘧啶甲酰胺衍生物及其可药用盐：式1
其中，
R1是H、羟基、C1-C5直链或支链烷基团、C1-C5直链或支链烷氧基团、C2-C6直链或支链羟基烷基团、C2-C6二烷基氨基团、以C2-C5烷氧羰基取代的C2-C6直链或支链烷基团、C3-C6环烷基团，或饱和或不饱和的含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元杂环基团，该杂环基团可以是未取代或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不对称碳原子；
R2是H或C1-C4直链或支链烷基团；
或R1和R2两者组成含有1-3个选自N、O和S杂原子的5元或6元饱和杂环，该杂环未取代或以C1-C5直链或支链烷基或以C2-C5直链或支链羟基烷基取代；
R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；
n是介于0-4间的整数。
2.权利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备方法，其包含下列步骤：
1)式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物的制备是将式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯与式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在碱性条件下反应；
2-A)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备是将式6的化合物与式7的胺化合物反应，或
2-B)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制备首先是将式6的化合物水解成式8的5-嘧啶羧酸衍生物，然后在N，N-二甲基甲酰胺和SOCl2存在下活化成维斯米尔中间产物，并使之与式7的胺化合物反应，
其中，R1、R2、R3和n如权利要求1所限定。
3.用于乙肝的治疗剂和预防剂，其中含有作为有效成分的权利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐。
4.用于获得性免疫缺陷综合征的治疗剂和预防剂，其中含有作为有效成分的权利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可药用盐。
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