CN118086469A - 一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，包括如下步骤：制作微流控芯片，将恒温扩增反应混合物从进样口注入微流控芯片，在反应孔内进行恒温扩增反应，反应结束后，将反应液抽到吸附区域，进行单链核酸分子吸附与荧光淬灭，然后将反应液抽到检测区域，进行核酸分子吸附，最后对检测区域进行荧光检测。本发明所公开的方法可以实现对核酸分子的快速、高灵敏度、高通量检测，检测样品需求量少，可用于核酸快速高灵敏检测分析。
Description
技术领域
本发明分子生物学检测技术领域，特别涉及一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法。
背景技术
抗体、抗原和核酸检测已被报道用于诊断COVID-19等传染病。血清学抗体检测只能检测感染几天后血液中出现的抗体，因此，它不能用于活动性感染的早期诊断。抗原检测是一种检测特定病毒抗原存在的免疫测定方法。这种方法可用于追踪和确认病毒感染、康复和注射疫苗后的抗体，但不能有效防止疾病的传播，且灵敏度相对较低。核酸检测方法准确靶向特定基因，与核酸提取和扩增技术相结合，用于高灵敏度的传染病检测，是目前最为准确的诊断早期活动性感染的方法。此外，核酸检测可用于多种标本，包括痰液、口咽拭子或鼻咽拭子和粪便。
实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)是诊断和确认病毒感染的金标准，但由于需要配备齐全的实验室、昂贵的试剂和训练有素的人员，导致检测周期长，阻碍了其在资源有限地区的应用。为了改进核酸检测技术，开发了其他方法。基于簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)的核酸检测技术作为一种简单灵敏的COVID-19检测方法而备受关注。它通过对靶核酸进行预扩增，然后通过胱天蛋白酶(Cas)酶介导的核酸检测来进行核酸检测，尽管基于CRISPR的核酸检测简单且高灵敏度，但它增加了预扩增过程，延长了检测时间，并且可能由于放大误差而导致假阴性或假阳性结果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，以提供一种快速、高灵敏度、高通量、检测样品需求量少，的新型核酸检测方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，包括如下步骤：
步骤1，制作微流控芯片：
所述微流控芯片包括贴合在一起的玻璃基底和PDMS层，所述玻璃基底上分为单链核酸吸附区域和双链核酸吸附检测区域，所述单链核酸吸附区域固定有GO纳米材料，所述双链核酸吸附检测区域固定有PLL材料；所述PDMS层与玻璃基底相对的一面刻蚀有多条流道，流道的两端分别为贯穿PDMS层的进样口和出样口，所述进样口位于吸附区域，所述出样口位于检测区域，所述进样口处的玻璃基底上开设反应孔；
步骤2，恒温扩增反应：
从进样口加入BSA溶液进行掩蔽处理，然后清洗抽干，再加入恒温扩增反应混合物使其位于反应孔内，并在进样口上覆盖一层PDMS软膜，防止样品挥发；在65℃下孵育20-50min，进行恒温扩增反应；
步骤3，单链核酸分子吸附与荧光淬灭：
恒温扩增反应结束后，从出样口抽吸反应液，使反应孔的反应液充满吸附区域的流道，孵育10-30min，使扩增反应混合物充分与固定在该区域的GO纳米材料结合，反应溶液流过时利用GO纳米材料吸附单链核酸分子并通过FRET效应淬灭荧光基团，此时反应液中为带有荧光基团的茎环状双链核酸分子的扩增产物；
步骤4，双链核酸分子吸附与检测：
继续从出样口用抽吸反应液，使反应液充满检测区域的流道，孵育1-15min，使带有荧光的双链核酸分子的扩增产物充分与PLL材料结合，从而将带有荧光基团的双链核酸分子的扩增产物固定在检测区域；最后将多余的液体抽干并且将芯片置于BSA溶液中，将PDMS层揭下，浸泡5-15min，然后将没有吸附在玻璃基底上的试剂洗干净，甩干芯片后通过芯片扫描仪检测光学信号的强度，从而实现对核酸分子的检测分析。
上述方案中，步骤2中，恒温扩增反应混合物包括5μL的WarmStart Lamp 2X预混液，1μL的10X引物混合物，1.5μL的RNA模板以及2.5μL的无核酸酶水。
进一步的技术方案中，10X引物混合物中包含2μM的F3和B3引物，4μM的loopF和loopB引物，16μM的FIP和BIP引物，其中在FIP和BIP引物序列一端标记荧光基团。
进一步的技术方案中，所述RNA模板是将检测样本与细胞裂解液等体积混合后，裂解3-5min得到。
上述方案中，所述BSA溶液是用磷酸盐缓冲液作为溶剂配制的质量体积浓度为3％的牛血清蛋白溶液，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2-7.4。
上述方案中，步骤2中，恒温扩增反应时，芯片上盖温度为65-75℃。
上述方案中，步骤4中，依次用质量体积浓度为100％的PBS溶液，质量体积浓度为50％的PBS的磷酸盐缓冲液溶液，超纯水冲洗玻璃基底，将没有吸附在玻璃基底上的试剂洗干净。
上述方案中，吸附区域负载GO纳米材料的方法如下：
(1)对载玻片进行正反面以及吸附区域和检测区域分界线的标记，并采用去离子水超声清洗、吹干；
(2)使用氧气对洁净载玻片的正面进行等离子处理，使表面覆盖有羟基；
(3)将等离子处理过的载玻片置于体积分数为2-5％的APTES溶液中，孵育；然后采用去离子水超声清洗、吹干；APTES溶液采用质量分数为95％的乙醇作为溶剂配制而成；
(4)将载玻片上需要组装GO纳米材料的部分浸泡在浓度为0.5-1.5mg/mL的GO溶液内孵育，然后采用去离子水对载玻片超声清洗、吹干。
上述方案中，检测区域负载PLL材料的方法如下：
(1)将已经组装GO纳米材料的载玻片置于等离子清洗机腔室中，同时遮挡已经组装GO纳米材料的部分，使用氧气对载玻片暴露的部分进行等离子处理，使表面覆盖有羟基；
(2)将载玻片经等离子处理过的部分在PLL溶液中孵育30-60min，然后取出，采用去离子水对载玻片该部分进行超声清洗、吹干；重复该步骤两次以上，完成PLL材料的组装；
PLL溶液的配置如下：取一定体积浓度为0.1-0.5％的PLL溶液，按照PLL：PBS：超纯水＝1:1:8的体积比进行稀释得到。
上述方案中，将带有多个流道的PDMS层与处理好的载玻片对准贴合，让其通过重力作用键合在一起，完成微流控芯片的制备。
通过上述技术方案，本发明提供的一种基于微流控芯片的集成恒温扩增的核酸检测方法具有如下有益效果：
(1)本发明构建了一个集恒温扩增反应和荧光检测于一体的微流控芯片检测方法；整个检测过程在芯片内完成，避免检测过程中外界环境的干扰。
(2)本发明利用负载有GO纳米材料的吸附区域，吸附单链核酸分子并通过FRET效应淬灭荧光基团，避免单链核酸分子干扰实验结果；利用负载有PLL材料的检测区域将带有荧光基团的双链核酸分子扩增产物固定在检测区域，检测浓度可低至1copy/微升，实现对核酸分子的高灵敏度检测。
(3)本发明的微流控芯片包括多个流道，每个流道彼此独立，避免了检测过程中样本之间的干扰，可同时进行多个样本的检测，提高了检测效率；检测时间短，只需要50min可实现多个样本的检测。
(4)本发明缩小了样本反应体积，每个样本只需要10μL，减少试剂用量和检测步骤，降低了检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法流程示意图。
图2为微流控芯片的制作流程图。
图3为绘制的标准曲线图。
图4为健康人与模拟新冠患者的检测结果示意图；
图5为60个检测样本的统计性差异示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，如图1所示，具体实施例如下：
一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，包括如下步骤：
步骤1，制作微流控芯片：
如图2所示，微流控芯片包括贴合在一起的玻璃基底和PDMS层，玻璃基底上分为吸附区域和检测区域，吸附区域负载有GO纳米材料，检测区域负载有PLL材料；PDMS层与玻璃基底相对的一面刻蚀有多条流道，流道的两端分别为贯穿PDMS层的进样口和出样口，进样口位于吸附区域，出样口位于检测区域，进样口处的玻璃基底上开设反应孔。
玻璃基底采用载玻片制成，尺寸为75mm*25mm，吸附区域尺寸为55mm*25mm，检测区域尺寸为20mm*25mm。PDMS层厚度为4mm；反应孔尺寸4mm*2mm，深度为4mm；进样口和出样口尺寸为4mm*2mm，流道宽度为100μm，流道深度为150μm。
微流控芯片的制作方法如下：
1、吸附区域负载GO纳米材料：
(1)对载玻片进行正反面以及吸附区域和检测区域分界线的标记，并采用去离子水超声清洗30min，吹干；
(2)将洁净载玻片置于异丙醇溶液中，与空气隔绝，避免载玻片的污染；
(4)配制APTES溶液：采用质量分数为95％的乙醇作为溶剂配制成体积分数为2％的APTES溶液；
(5)配制GO溶液。采用的GO溶液浓度为0.5mg/mL。在进行GO溶液配制与稀释时，需要采用超声波对溶液进行10min超声处理，目的是将溶液内大颗粒物质破碎成小颗粒物质，易于在洁净载玻片上组装；超声破碎后，测量溶液PH值，保证溶液PH值在5.5左右；
(6)从异丙醇溶液中取出载玻片，吹干，采用Plasma Cleaner，使用氧气对洁净载玻片的正面进行等离子处理，使表面覆盖有羟基；
(7)将等离子处理过的载玻片置于APTES溶液中，浸泡45min；然后采用去离子水超声清洗载玻片40min，吹干；
(8)将载玻片上需要组装GO纳米材料的部分浸泡在GO溶液内20min，然后采用去离子水对载玻片超声清洗60min，吹干完成GO纳米材料的组装。
2、检测区域负载PLL材料：
(1)配制PLL溶液：取一定体积浓度为0.1％的PLL溶液，按照PLL：PBS：超纯水＝1:1:8的体积比进行稀释得到；
(2)将已经组装GO纳米材料的载玻片置于等离子清洗机腔室中，同时遮挡已经组装GO纳米材料的部分，使用氧气对载玻片暴露的部分进行羟基化处理；
(3)将载玻片经等离子处理过的部分浸泡在PLL溶液中1h，然后取出，采用去离子水对载玻片浸泡PLL溶液的部分超声清洗30min，吹干；完成PLL材料的组装；
3、制备PDMS层
(1)按照PDMS聚合物和固化剂以10:1的比例称取一定质量混合并搅拌均匀；
(2)将混合好的PDMS和固化剂置于真空桶内，并抽真空约1h，目的是排出PDMS内的气泡；
(3)将配制好的PDMS采用注射器注入到亚克力模板中，PDMS厚度约为4mm即可；
(4)放入烘箱中，80℃下烘烤一段时间后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间。
(5)从模板上将其揭下，按照设计好的s型流道对其进行激光切割反应孔和流道，反应孔的切割速度为10mm/s，功率为70w，流道部分的切割速度为50mm/s，功率为10w，最后进行清洗烘干，得到印有设计图案的多流道PDMS芯片。
4、PDMS层与玻璃基底的固定结合
将制备好的多流道PDMS芯片与处理好的功能化载玻片对准，让其通过重力作用键合在一起，完成微流控芯片的制备。
步骤2，恒温扩增反应：
从进样口加入BSA溶液进行掩蔽处理，然后清洗抽干，再加入恒温扩增反应混合物使其位于反应孔内，并在进样口上覆盖一层PDMS软膜，防止样品挥发；在65℃下孵育30min，芯片上面温度为70℃，进一步防止样品挥发冷凝；进行恒温扩增反应。
BSA溶液是用磷酸盐缓冲液作为溶剂配制的质量体积浓度为3％的牛血清蛋白溶液，磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2-7.4。
恒温扩增反应混合物包括5μL的WarmStart Lamp 2X预混液，1μL的10X引物混合物，1.5μL的RNA模板以及2.5μL的无核酸酶水。
RNA模板是将100μL的假病毒和100μL的细胞裂解液等体积混合，裂解5min得到，然后取裂解后的溶液稀释一定倍数得到。
10X引物混合物中包含2μM的F3和B3引物，4μM的loopF和loopB引物，16μM的FIP和BIP引物，其中在FIP和BIP引物序列一端标记FAM荧光基团。
步骤3，单链核酸分子吸附与荧光淬灭：
恒温扩增反应结束后，从出样口用真空泵抽反应液，使反应孔的反应液充满吸附区域的流道，孵育10min，使扩增反应混合物充分与GO纳米材料结合，反应溶液流过时利用GO纳米材料吸附单链核酸分子并通过FRET效应淬灭荧光基团，此时反应液中带有荧光基团的为茎环状双链核酸分子的扩增产物。
步骤4，双链核酸分子吸附与检测：
继续从出样口用真空泵抽反应液，使反应液充满检测区域的流道，孵育10min，使双链核酸分子的扩增产物充分与PLL材料结合，从而将带有荧光基团的双链核酸分子的扩增产物固定在检测区域；最后将多余的液体抽干并且将芯片置于BSA溶液中，将PDMS层揭下，浸泡10min，依次用质量体积浓度为100％的PBS溶液，质量体积浓度为50％的PBS的磷酸盐缓冲液溶液，超纯水冲洗玻璃基底，将没有吸附在玻璃基底上的试剂洗干净，甩干芯片后通过GenePix 4400微阵列扫描仪检测光学信号的强度，从而实现对核酸分子的检测。
绘制标准曲线：
将购买的目的基因新冠假病毒作为标准品，与细胞裂解液等体积混合后，裂解5min，得到RNA模板，然后将RNA模板进行浓度梯度稀释，分别取不同浓度的1.5μL的RNA模板与5μL的WarmStart Lamp 2X预混液，1μL的10X引物混合物以及2.5μL的无核酸酶水混合，制备恒温扩增反应混合物，采用上述步骤2-步骤4的方法进行反应与检测，检测波长为488nm，并给出不同浓度目的基因RNA的荧光强度检测结果。总的检测时间为50分钟，根据浓度与荧光信号值绘制标准曲线见图3，本发明的检测方法可以检测10-20mol/L-10-11mol/L的宽线性检测范围，有超高的检测灵敏度。
样本检测：
将从健康人采集的鼻咽拭子加入五个不同浓度的新冠假病毒RNA进行模拟五位新冠患者(P1-P5)与另外五个未加入新冠假病毒的健康人咽拭子(H1-H5)中的核酸分子标志物进行检测，检测结果见图4，可以准确的检测咽拭子中的病毒RNA，并且统计了60次低中高浓度目的基因和不含目的基因的样本检测数据见图5，60个检测样本的检测结果具有统计性差异，该方法同一浓度水平样品的信号强度基本一致，相对标准偏差RSD<5％，表明该方法具有一致性和良好的重现性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，制作微流控芯片：
所述微流控芯片包括贴合在一起的玻璃基底和PDMS层，所述玻璃基底上分为单链核酸吸附区域和双链核酸吸附检测区域，所述单链核酸吸附区域固定有GO纳米材料，所述双链核酸吸附检测区域固定有PLL材料；所述PDMS层与玻璃基底相对的一面刻蚀有多条流道，流道的两端分别为贯穿PDMS层的进样口和出样口，所述进样口位于吸附区域，所述出样口位于检测区域，所述进样口处的玻璃基底上开设反应孔；
步骤2，恒温扩增反应：
从进样口加入BSA溶液进行掩蔽处理，然后清洗抽干，再加入恒温扩增反应混合物使其位于反应孔内，并在进样口上覆盖一层PDMS软膜，防止样品挥发；在65℃下孵育20-50min，进行恒温扩增反应；
步骤3，单链核酸分子吸附与荧光淬灭：
恒温扩增反应结束后，从出样口抽吸反应液，使反应孔的反应液充满吸附区域的流道，孵育10-30min，使扩增反应混合物充分与固定在该区域的GO纳米材料结合，反应溶液流过时利用GO纳米材料吸附单链核酸分子并通过FRET效应淬灭荧光基团，此时反应液中为带有荧光基团的茎环状双链核酸分子的扩增产物；
步骤4，双链核酸分子吸附与检测：
继续从出样口用抽吸反应液，使反应液充满检测区域的流道，孵育1-15min，使带有荧光的双链核酸分子的扩增产物充分与PLL材料结合，从而将带有荧光基团的双链核酸分子的扩增产物固定在检测区域；最后将多余的液体抽干并且将芯片置于BSA溶液中，将PDMS层揭下，浸泡5-15min，然后将没有吸附在玻璃基底上的试剂洗干净，甩干芯片后通过芯片扫描仪检测光学信号的强度，从而实现对核酸分子的检测分析。
2.根据权利要求1所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，步骤2中，恒温扩增反应混合物包括5μL的WarmStart Lamp 2X预混液，1μL的10X引物混合物，1.5μL的RNA模板以及2.5μL的无核酸酶水。
3.根据权利要求2所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，10X引物混合物中包含2μM的F3和B3引物，4μM的loopF和loopB引物，16μM的FIP和BIP引物，其中在FIP和BIP引物序列一端标记荧光基团。
4.根据权利要求2所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，所述RNA模板是将检测样本与细胞裂解液等体积混合后，裂解3-5min得到。
5.根据权利要求1所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，所述BSA溶液是用磷酸盐缓冲液作为溶剂配制的质量体积浓度为3％的牛血清蛋白溶液，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2-7.4。
6.根据权利要求1所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，步骤2中，恒温扩增反应时，芯片上盖温度为65-75℃。
7.根据权利要求1所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，步骤4中，依次用质量体积浓度为100％的PBS溶液，质量体积浓度为50％的PBS的磷酸盐缓冲液溶液，超纯水冲洗玻璃基底，将没有吸附在玻璃基底上的试剂洗干净。
8.根据权利要求1所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，吸附区域负载GO纳米材料的方法如下：
(1)对载玻片进行正反面以及吸附区域和检测区域分界线的标记，并采用去离子水超声清洗、吹干；
(2)使用氧气对洁净载玻片的正面进行等离子处理，使表面覆盖有羟基；
(3)将等离子处理过的载玻片置于体积分数为2-5％的APTES溶液中，孵育；然后采用去离子水超声清洗、吹干；APTES溶液采用质量分数为95％的乙醇作为溶剂配制而成；
(4)将载玻片上需要组装GO纳米材料的部分浸泡在浓度为0.5-1.5mg/mL的GO溶液内孵育，然后采用去离子水对载玻片超声清洗、吹干。
9.根据权利要求8所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，检测区域负载PLL材料的方法如下：
(1)将已经组装GO纳米材料的载玻片置于等离子清洗机腔室中，同时遮挡已经组装GO纳米材料的部分，使用氧气对载玻片暴露的部分进行等离子处理，使表面覆盖有羟基；
(2)将载玻片经等离子处理过的部分在PLL溶液中孵育30-60min，然后取出，采用去离子水对载玻片该部分进行超声清洗、吹干；重复该步骤两次以上，完成PLL材料的组装；
PLL溶液的配置如下：取一定体积浓度为0.1-0.5％的PLL溶液，按照PLL：PBS：超纯水＝1:1:8的体积比进行稀释得到。
10.根据权利要求9所述的一种集成恒温扩增的微流控芯片核酸检测方法，其特征在于，将带有多个流道的PDMS层与处理好的载玻片对准贴合，让其通过重力作用键合在一起，完成微流控芯片的制备。
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