CN110093458A

CN110093458A - 检测猪非典型性瘟病毒的套式rt-pcr引物组、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN110093458A
Application number: CN201910454968.4A
Authority: CN
Inventors: 贺东生; 韦柳明; 苏丹萍; 谢永生; 李锦辉; 梁伟放; 司广斌
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2019-08-06

Abstract

本发明提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒根据猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计多组套式PCR引物，并通过引物筛选以及反应体系优化，研发出一种检测灵敏性高、特异性好的套式PCR检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒只需要一台普通PCR仪，即可获得与实时荧光定量PCR相当的检测灵敏性，不仅可监测猪非典型性瘟病毒的微量潜伏感染，实现对猪非典型性瘟病毒的早期预警，同时检测成本低，对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。

Description

检测猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及检测猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用。

背景技术

非典型猪瘟(APP)是猪非典型性瘟病毒(Atypical porcine pestivirus virus，APPV)引起的仔猪先天性震颤(俗称“抖抖病”)，APPV临床上可以导致出生仔猪全身肌肉震颤、八字腿、严重可导致全身震颤，吮乳困难。

猪非典型性瘟病毒(APPV)是黄病毒科瘟病毒属的单链正链RNA病毒。基因组约为12KB，包括5'和3'非编码区域和一个多蛋白阅读框(ORF)。APPV是黄病毒科和瘟病毒属的成员，其中还包括牛病毒性腹泻病毒1型和2型(bvdv-1和bvdv-2)、猪瘟病毒(CSFV)和边界病病毒(BDV)以及其他病毒。

最初，Arruda等人报道了从仔猪样本(血清、大脑、小脑、脊髓、脑脊液和肺)中检测到APPV，并伴有临床CT。回顾性研究表明，APPV至少从2005年开始在匈牙利猪群中流行。同样，西班牙一项为期20年(1997-2016)的猪血清学回顾性研究发现，早在1997年，西班牙猪就存在APPV。自2016年以来，中国广东、广西、四川、云南和江西的大型养猪场也报告了在CT猪群中检测到APPV。

常规的病毒检测技术如病理切片、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次性确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量小的特点，特别适用于病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪，即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此，有必要建立对APPV套式PCR检测技术，不仅可监测APPV的微量潜伏感染，实现对APPV的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。

发明内容

有鉴于此，本发明提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒，该试剂盒检测成本低，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪非典型性瘟病毒的微量潜伏感染，从而尽早实施正确的治疗方案，挽回经济损失。

为此，本发明第一方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，所述引物根据检测猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。

本发明第二方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸模板；

2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮PCR扩增产物。

3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物，得第二轮扩增产物；

4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μL，包括：10μM的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示核苷酸序列各1.4μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer(Dye Plus)12.5μL，待测样品RNA3μL，RNase Free dH₂O 5.7μL。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括：50℃，30min；95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μL，包括：第一轮PCR扩增产物2μL，10μM的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示核苷酸序列各1.4μL，dNTP Mixture 2μL，10×PCR Buffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRaTaq0.5μL，RNase Free dH2O 15.2μL。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括：95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，35个循环；最后72℃终延伸10min。

本发明第三方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒，包括如本发明第一方面所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒的第一轮反应试剂包括：PrimeScript 1Step Enzyme Mix，2×1Step Buffer(Dye Plus)，RNaseFree dH₂O。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒的第二轮反应试剂包括：dNTPMixture，10×PCRBuffer(Mg2++plus)，TaKaRaTaq，RNase FreedH₂O。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测试剂盒对猪非典型性瘟病毒的最低检出量可低至10copies/μL。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒可特异性检测鉴定猪非典型性瘟病毒(APPV)，不能检测出塞尼卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)中的一种或多种。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的套式PCR引物、如本发明第二方面所述的套式PCR检测方法或如本发明第三方面所述的套式PCR检测试剂盒在猪非典型性瘟病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。

本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高病毒微量感染时对猪非典型性瘟病毒的检出率，而对设备和人员技能要求较低，因此，适用于对猪非典型性瘟病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广。

附图说明

图1为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物筛选电泳图，其中，泳道M为DNAMarker DL5000，泳道1～3分别代表第一组外引物APPV-1-F1/R1、第二组外引物APPV-2-F1/R1、第三组外引物APPV-1-F3/R3的扩增样品，泳道6～8分别代表第一组内引物APPV-1-F2/R2、第二组内引物APPV-2-F2/R2、第三组内引物APPV-3-F2/R2的扩增样品；

图2为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR外引物引物浓度优化电泳图，其中，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～6分别代表第一组引物浓度为0.24μM、0.32μM、0.40μM、0.40μM、0.48μM、0.64μM；

图3为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR内引物引物浓度优化电泳图，其中，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～6分别代表第一组引物浓度为0.24μM、0.32μM、0.40μM、0.40μM、0.48μM、0.64μM；

图4为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR外引物退火温度优化电泳图，其中，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～6分别代表第一组引物退火温度为51.5℃、52℃、53℃、54℃、55℃、55.8℃；

图5为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR内引物退火温度优化电泳图，其中，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～6分别代表第一组引物退火温度为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃；

图6为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR检测敏感性试验，其中，M：泳道M为DNAMarker DL2000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b、8a/8b、9a/9b分别代表10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、100copies/μL；

图7为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR的中外引物一步法RT-PCR和内引物套式PCR特异性结果分析图：其中泳道M为DNA Marker DL2000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b分别代表APPV、SVV、PDCOV、PEDV、TGEV、PRRSV和阴性对照的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果图；

图8为本发明实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR的临床样品检测结果电泳图，其中泳道M为DNAMarker DL2000、泳道1～22为检测样品。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

本发明实施例中提及的试剂：PrimerScript 1step Enzyme Mix、2×1stepBuffer、RNase Free dH₂O、TaKaRaTaq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)均购自TAKARA生物科技有限公司，货号LMP204；Simpiy P总RNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司，贷号BSC52S1)。

实施例1

1.检测非典型猪瘟病毒(APPV)的套式RT-PCR引物设计与合成

根据参考与比对GenBank中已公布的APPV基因的保守序列，利用MegAlign软件进行序列比对，选择位于全基因序列中的保守基因片段NS5B区域作为引物设计区域，确定该保守核甘酸序列中的高度保守片段作为扩增区域，利用引物辅助设计软件primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了三组检测APPV的套式RT-PCR引物组：包括正向引物APPV-X-F1、反向引物APPV-X-R1组成的外引物以及正向引物APPV-X-F2、反向引物APPV-X-R2组成的内引物(X为1、2或3，分别代表第一组、第二组、第三组引物组)，由北京擎科生物科技有限公司广州分公司合成，具体序列见表1：

表1用于非典型猪瘟病毒(APPV)的套式PCR的特异性引物

2病毒基因组RNA提取

使用Simpiy P总RNA提取试剂盒提取APPV的RNA，以及对照病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株的基因组RNA。

3套式PCR扩增

用步骤2所得RNA模板，进行套式PCR扩增，反应条件如下：

第一轮一步法RT-PCR反应总体积25μL体系，具体成分以用量见表1：

表1一步法RT-PCR反应体系

第一轮一步法RT-PCR反应条件见表2：

表2一步法RT-PCR反应条件

第二轮PCR反应总体积25μL体系，具体成分以用量见表3：

表3第二轮PCR反应体系

第二轮PCR反应条件见表4：

表4第二轮PCR反应条件

4套式PCR扩增产物的鉴定

将套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，同时将套式PCR鉴定阳性的核酸送华大基因有限公司测序，验证套式PCR检测的准确性。

5体系优化

5.1最佳引物筛选

将步骤1设计所得三组套式PCR引物组以及步骤2所得的非典型猪瘟病毒(APPV)RNA模板按步骤3反应条件进行套式PCR扩增，筛选最佳引物，结果如图1所示，根据扩增的产物量及其特异性等条件，第一组套式PCR引物组扩增效果最好，后续将以此引物组作为非典型猪瘟病毒(APPV)的套式PCR检测的优势引物组合开展下一步实验。

5.2引物浓度优化

通过单一变量，改变第一轮、第二轮引物浓度的用量，筛选最优引物浓度，结果显示，第一轮25μL反应体系中当引物的使用终浓度均为0.56μM时，扩增效果最好，目标条带最亮，如图2所示。第二轮25μL反应体系中当引物的使用终浓度均为0.56μM时，扩增效果最好，目标条带最亮，如图3所示。

5.3退火温度的优化

通过改变第一轮、第二轮退火温度，筛选最优退火温度，结果显示，第一轮反应中，当退火温度为52℃，扩增产物条带最清晰，没有非特异扩增条带产生，如图4所示。第二轮反应中，当退火温度为55℃，扩增产物条带最清晰，没有非特异扩增条带产生，如图5所示。

6试剂盒性能

6.1灵敏度检测

取1.0×10⁸copies/μL的猪非典型性瘟病毒阳性质粒为模板作10倍梯度稀释，得到10-10⁸copies/μL的梯度模板，用本发明试剂盒检测，测试本发明试剂盒检测灵敏度，同时利用本发明试剂盒提供的第一轮反应体系作为常规PCR方法对照，结果如图6所示，常规PCR方法对照只能检测到10²copies/μL，而本发明的套式PCR试剂盒在DNA模板浓度为10copies/μL时仍有明亮的条带，可见，本发明的套式PCR试剂盒的检测灵敏度是常规PCR方法的10倍。

6.2特异性检测

利用本发明试剂盒对非典型猪瘟病毒(APPV)阳性样品DNA模板进行扩增，凝胶电泳结果显示非典型猪瘟病毒(APPV)得到有效扩增，而对其他样品如塞尼卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)均未出现扩增条带，如图7所示。实验结果表明，本发明试剂盒具有良好的病原特异性。

6.3临床样品检测

运用本发明的套式PCR检测试剂盒对华南地区的部分猪场猪只进行检测，同时以常规PCR检测方法作为对照，结果如图8所示，常规PCR检测方法只能从20份样品检出3份阳性样品，而本发明的套式PCR检测试剂盒以及荧光定量PCR检测方法均可从20份样品中检测出6份阳性。将阳性扩增的PCR产物送华大基因公司进行测序，测序结果显示6份阳性样品的扩增产物的序列均存在与APPV的NS5B片段中保守序列相同的基因序列。可见，本发明的试剂盒检测能特异检测非典型猪瘟病毒，并且其检测灵敏度比常规PCR高，可对非典型猪瘟病毒进行有效扩增，显示本发明试剂盒在复杂样品检测中仍能保持良好的病原特异性。

综上所述，本发明的套式PCR检测试剂盒具备较高的检测灵敏度以及特异性，同时本发明提供的检测试剂盒对设备和人员技能要求较低，适用于对非典型猪瘟病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广，可大幅增加非典型猪瘟病毒微量感染情况下的病原检出率，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，有利于对症下病实施正确的治疗方案，具有很好的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 检测猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accaayatcc ccaaccaaag 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcatargtga ycttsacctt tttctt 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgccmaaaaa tgagaaaagr gayg 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggyttccag aycccyaagt aagtc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcacyagtg atgggtggga 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctatyttct tcatgaayac catggc 26

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taggyccygg cagaathcc 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttatrttyg trgcttcagg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagtgggtr tgygtgaarc c 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atragrgagt cattcttctt wgc 23

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccyacacagr tytggathg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agytggaaca trtcvccct 19

Claims

1.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。

2.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸模板；

4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

3.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μL，包括：10μM的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示核苷酸序列各1.4μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL，2×1 Step Buffer(Dye Plus)12.5μL，待测样品RNA 3μL，RNase Free dH₂O 5.7μL。

4.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括：50℃，30min；95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。

5.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μL，包括：第一轮PCR扩增产物2μL，10μM的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示核苷酸序列各1.4μL，dNTPMixture 2μL，10×PCR Buffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRaTaq 0.5μL，RNase Free dH2O15.2μL。

6.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括：95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30 sec，35个循环；最后72℃终延伸10min。

7.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂，其中第一轮反应试剂包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，PrimeScript 1Step Enzyme Mix，2×1 Step Buffer(Dye Plus)，RNase Free dH₂O；第二轮反应试剂包括：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，dNTP Mixture，10×PCR Buffer(Mg2++plus)，TaKaRaTaq，RNase Free dH₂O。

8.如权利要求7所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述套式PCR检测试剂盒对猪非典型性瘟病毒的最低检出量可低至10copies/μL。

9.如权利要求7所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒可特异性检测鉴定猪非典型性瘟病毒，不能检测出塞尼卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)中的一种或多种。

10.如权利要求1所述的套式PCR引物、如权利要求2所述的套式PCR检测方法、如权利要求7所述的套式PCR检测试剂盒在猪非典型性瘟病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。