CN118086237A - 羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮中的应用 - Google Patents

羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮中的应用 Download PDF

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吴起
鲁振宇
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Abstract

本发明公开了羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2‑二取代‑3‑羟基环酮中的应用，属于生物工程技术领域，所述羰基还原酶突变体是由来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的野生型羰基还原酶在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1至251位进行单点突变、双点突变或三点突变而得；本发明提供的羰基还原酶突变体在合成手性2,2‑二取代‑3‑羟基环酮方面具有广泛的应用前景，特别是能够实现高选择性合成(2S,3R)‑2,2‑二取代‑3‑羟基环酮，填补了高选择性合成(2S,3R)‑2,2‑二取代‑3‑羟基环酮的研究空白，具有广阔的应用前景。

Description

羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮 中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及羰基还原酶突变体及其在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮中的应用。
背景技术
2,2-二取代-1,3-环二酮化合物的不对称还原可以有效地获得含有手性季碳中心及邻近手性醇的环状羟基酮或者多羟基化合物，这类化合物是一类重要的合成子，可以用于制备很多含有多手性中心的天然产物或者药物，例如左炔诺孕酮(levonorgestrel)、孕二烯酮(gestodene)等，在制药领域中具有广泛应用。然而，2,2-二取代-1,3-环二酮化合物的羰基还原产物有8种之多，包括4种一个羰基被还原的产物和4种两个羰基都被还原的产物，具体如下式所示，因此，2,2-二取代-1,3-环二酮化合物的立体选择性还原十分具有挑战性。
上式中，n为1或2；R为苯基，萘基，对甲氧基苯基，间甲氧基苯基，邻甲氧基苯基，对甲基苯基，间甲基苯基，邻甲基苯基，对氟苯基，间氟苯基，邻氟苯基，对氯苯基，间氯苯基，邻氯苯基，对溴苯基，间溴苯基或邻溴苯基。
与化学法不对称还原相比，生物催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；羰基还原酶属于短链脱氢酶家族，可以实现羰基的立体选择性还原，在制备手性醇方面应用广泛，通过对羰基还原酶进行改造可以提高酶活力和立体选择性。
如公开号为CN110551701A的中国专利文献公开了羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用，具体的，该发明利用羰基还原酶突变体提高了环戊酮醇2R、3S手性产物的比例，实现了(2R,3S)-2,2-二取代-3-羟基环戊酮的高选择性合成。(2R,3R)-2,2-二取代-3-羟基环戊(己)酮与(2S,3S)-2,2-二取代-3-羟基环戊(己)酮的高选择性合成也已有文献报道(J.Org.Chem.,2023,88,16,11905–11912；J.Am.Chem.Soc.,2021,143,7,2994–3002；Chem.Sci.,2019,10,6350-6353；Green Synth.Catal.,2021,2,320–323；Mol.Catal.,2020,497,111217)。
然而迄今为止，(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环戊(己)酮的高选择性合成未见报道。因此开发高选择性合成(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的方法是十分必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种能够高效、高选择性催化2,2-二取代-1,3-环二酮化合物反应合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮的羰基还原酶突变体。
具体采用的技术方案如下：
羰基还原酶突变体，是由来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的野生型羰基还原酶在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1至251位进行单点突变、双点突变或三点突变而得；
具体单点突变的位点为以下任意一种：
在93位上的突变；
在95位上的突变；
在152位上的突变；
在194位上的突变；
在198位上的突变；
具体双点突变的位点为以下任意一种：
在93位和195位上的组合突变；
在144位和195位上的组合突变；
在194位和195位上的组合突变；
在195位和207位上的组合突变；
具体三点突变的位点为以下任意一种：
在92位和194位和195位上的组合突变；
在93位和194位和195位上的组合突变；
在94位和194位和195位上的组合突变；
在95位和194位和195位上的组合突变；
在144位和194位和195位上的组合突变；
在152位和194位和195位上的组合突变；
在189位和194位和195位上的组合突变；
在192位和194位和195位上的组合突变；
在194位和195位和198位上的组合突变；
在194位和195位和205位上的组合突变；
在194位和195位和207位上的组合突变；
在194位和195位和210位上的组合突变。
进一步的，具体单点突变为以下任意一种：
A93Y；A93F；A93S；A93E；N95L；N95H；L152M；L194M；
L198S；L198C。
进一步的，具体双点突变为以下任意一种：
A93F且V195G；A93S且V195G；A93E且V195G；A93Y且V195G；E144F且V195G；E144M且V195G；L194M且V195G；L194F且V195G；L194K且V195G；V195G且Q207A。
进一步的，具体三点突变为以下任意一种：
I92A且L194M且V195；I92L且L194M且V195G；I92M且L194M且V195G；I92S且L194M且V195G；
A93F且L194M且V195G；A93W且L194M且V195G；A93Y且L194M且V195G；A93N且L194M且V195G；A93C且L194M且V195G；A93Q且L194M且V195G；A93S且L194M且V195G；A93T且L194M且V195G；A93R且L194M且V195G；A93H且L194M且V195G；A93K且L194M且V195G；A93D且L194M且V195G；A93E且L194M且V195G；A93G且L194M且V195G；
V94A且L194M且V195G；V94F且L194M且V195G；V94L且L194M且V195G；V94M且L194M且V195G；V94S且L194M且V195G；V94E且L194M且V195G；
N95A且L194M且V195G；N95F且L194M且V195G；N95L且L194M且V195G；N95I且L194M且V195G；N95V且L194M且V195G；N95M且L194M且V195G；N95W且L194M且V195G；N95Y且L194M且V195G；N95S且L194M且V195G；N95T且L194M且V195G；N95R且L194M且V195G；N95H且L194M且V195G；N95E且L194M且V195G；N95P且L194M且V195G；
E144F且L194M且V195G；E144M且L194M且V195G；
L152M且L194M且V195G；
Y189F且L194M且V195G；
T192S且L194M且V195G；
L198A且L194M且V195G；L198F且L194M且V195G；L198M且L194M且V195G；L198Y且L194M且V195G；L198C且L194M且V195G；L198Q且L194M且V195G；L198N且L194M且V195G；L198S且L194M且V195G；L198R且L194M且V195G；L198K且L194M且V195G；
M205F且L194M且V195G；M205Y且L194M且V195G；M205P且L194M且V195G；
Q207A且L194M且V195G；Q207L且L194M且V195G；Q207M且L194M且V195G；
K210A且L194M且V195G；K210S且L194M且V195G。
优选的，双点突变为：L194M且V195G，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，三点突变为：A93F且L194M且V195G；或者A93Y且L194M且V195G；或者A93E且L194M且V195G；对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了编码所述羰基还原酶突变体的基因。
本发明还提供了一种包含所述基因的表达载体。
本发明还提供了一种表达所述羰基还原酶突变体的基因工程菌。
本发明还提供了所述羰基还原酶突变体、编码所述羰基还原酶突变体的基因或表达所述羰基还原酶突变体的基因工程菌在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮中的应用。
具体的，利用所述羰基还原酶突变体或表达所述羰基还原酶突变体的基因工程菌将式Ⅰ所示的2,2-二取代-1,3-环二酮还原为式Ⅱ所示的手性2,2-二取代-3-羟基环酮；
式中，n为1或2；R为苯基，萘基，对甲氧基苯基，间甲氧基苯基，邻甲氧基苯基，对甲基苯基，间甲基苯基，邻甲基苯基，对氟苯基，间氟苯基，邻氟苯基，对氯苯基，间氯苯基，邻氯苯基，对溴苯基，间溴苯基或邻溴苯基。
进一步的，所述手性2,2-二取代-3-羟基环酮为(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮。
本发明还提供了一种催化剂，其有效成分包括所述羰基还原酶突变体或表达所述羰基还原酶突变体的基因工程菌。
示例的，将表达所述羰基还原酶突变体的基因工程菌发酵培养，获得湿菌体，湿菌体经超声破碎后获得的粗酶液作为催化剂，以2-甲基-2-苄基环戊二酮为底物，加入异丙醇，于搅拌条件下进行还原反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过对短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的野生型羰基还原酶进行改造，获得的羰基还原酶突变体在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮方面具有广泛的应用前景，特别是能够实现高选择性合成(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮，在一个具体的实施例中，该羰基还原酶突变体以2,2-二取代-1,3-环戊二酮为底物催化获得的(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的转化率99％，e.e.值>99％，d.r.值为93/7。
附图说明
图1为底物1a与产物2a的消旋体以及羰基还原酶催化反应的HPLC谱图：其中，A为底物1a与产物2a的消旋体的HPLC谱图；B为野生型羰基还原酶催化底物1a反应的HPLC谱图；C为羰基还原酶突变体A93Y且L194M且V195G催化底物1a反应的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
其中，如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为B，例如“L194M”表示第194位亮氨酸(L)突变为甲硫氨酸(M)；“A93Y且L194M且V195G”表示在93位、194位和195位上的组合突变，其中第93位丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)、第194位亮氨酸(L)突变为甲硫氨酸(M)、第195位缬氨酸(V)突变为甘氨酸(G)，以此类推。
本发明构建的羰基还原酶突变体均为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的野生型羰基还原酶(LbADH，PDB ID：1zk4)SEQ ID NO.1的突变体。
实施例1：羰基还原酶LbADH突变库的构建及突变体的筛选
1.pET28a(+)-LbADH质粒和重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-LbADH的构建
野生型羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。将所述核苷酸序列进行全合成并克隆到pET-28a(+)载体的限制性内切酶位点NdeI和XhoI间，得到重组质粒pET28a(+)-LbADH，进一步转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-LbADH。
2.羰基还原酶突变库的构建
以pET28a(+)-LbADH为模板，通过分析选择催化活性口袋内的92，93，94，95，144，152，189，192，194，195，198，205，207，210位点的氨基酸进行定点突变。设计引物(引物序列见表1)，采用质粒滚环扩增的方法构建突变体，高保真聚合酶KOD-plus进行PCR。
PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入5μL10×KOD buffer，5μLdNTP(2mM)，2μL MgSO4(25mM)，模板20-100ng，正向引物1μL(10mM)，反向通用引物T7-ter 1μL(10mM)，1μLKOD聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)94℃预变性2min，(2)98℃变性15sec，(3)55℃退火30sec，(4)68℃延伸3min 10sec，步骤(2)-(4)共进行40个循环。4℃保存PCR产物。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后，加入限制性内切酶DpnI于37℃消化2h。将消化产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有硫酸卡那霉素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养12h。挑取单克隆进行测序，测序正确即获得相应突变株。突变位点及突变后的氨基酸见表2。
对于某个位点的单点突变体的构建，其正向引物序列和通用反向引物序列设计见表1，仅需要将其中NNK替换为表2中相应突变的核苷酸密码子即可。对于组合突变体的构建，需要在某个单点突变体的基础上，再分步引入其他突变，从而获得多个位点的组合突变体。例如V195G且Q207A的构建过程中，利用V195G的引物以SEQ ID NO.2所示的野生型核苷酸序列作为模板，通过PCR将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的GTT突变为GGC(V195G)，测序正确后即可获得V195G突变体；进一步以V195G的质粒作为模板，利用Q207A的引物/>通过PCR将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的CAG突变为GCG(Q207A)，即可获得V195G且Q207A双突变体。其他突变体都可以利用类似分步引入突变的方法来构建。
表1突变位点的引物序列
位点 引物序列(5‘-3‘方向)
反向通用引物T7-ter GCTAGTTATTGCTCAGCGG
92 AATAATGCAGGTNNKGCAGTTAATAAA
93 AATGCAGGTATTNNKGTTAATAAAAGC
94 GCAGGTATTGCANNKAATAAAAGCGTT
95 GGTATTGCAGTTNNKAAAAGCGTTGAA
144 ATGAGCAGCATTNNKGGTTTTGTTGGT
152 GGTGATCCGAGTNNKGGTGCGTATAAT
189 GTTCATCCGGGTNNKATTAAAACACCG
192 GGTTATATTAAANNKCCGCTGGTTGATGAT
194 ATTAAAACACCGNNKGTTGATGATCTG
195 AAAACACCGCTGNNKGATGATCTGCCG
198 CTGGTTGATGATNNKCCGGGTGCAGAA
205 GCAGAAGAAGCANNKAGTCAGCGTACC
207 GAAGCAATGAGTNNKCGTACCAAAACC
210 AGTCAGCGTACCNNKACCCCGATGGGC
表2突变位点及突变后的氨基酸
实施例2：羰基还原酶突变体的诱导表达
将实施例1制得的突变的基因工程菌的单菌落分别接入2mL含有硫酸卡那霉素抗生素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)中，于37℃，200rpm摇床中培养过夜，即为种子液。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到200mL含有硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-0.8左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，并置于18℃，200rpm诱导18h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体。用Tris-HCl缓冲液(Tris50mM，NaCl 100mM，MgCl2 2mM，pH 7.5)重悬菌体(1g湿细胞使用5mL缓冲液)，并用超声波细胞破碎仪破碎，4℃，12000rpm条件下离心留取上清液即粗酶液，进行后续的反应检测。
实施例3：(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的合成
将野生型羰基还原酶及其突变体分别按照实施例2培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集粗酶液，以粗酶液作为生物催化剂；底物1a为：底物1a与产物2a的消旋体的HPLC谱图如图1中的A所示。
(1)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL野生型羰基还原酶粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率99％，(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮占产物含量为0，反应HPLC谱图如图1中的B所示。
(2)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL突变体V195G且Q207A粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率87％，产物(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的e.e.值>99％，d.r.值为40/60。
(3)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL突变体L194M且V195G粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率99％，产物(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的e.e.值>99％，d.r.值为72/28。
(4)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL突变体N95L且L194M且V195G粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率99％，产物(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的e.e.值>99％，d.r.值为81/19。
(5)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL突变体L194M且V195G且L198C粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率99％，产物(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的e.e.值>99％，d.r.值为91/9。
(6)在5mL PE管中加入含有1mg/100μL底物1a的异丙醇溶液100μL、2mg NADP+以及900μL突变体A93Y且L194M且V195G粗酶液，置于振荡器上，18℃、1500rpm反应30min。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，随后旋干溶剂。检测底物转化率99％，产物(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮的e.e.值>99％，d.r.值为93/7，反应HPLC谱图如图1中的C所示。
以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.羰基还原酶突变体，其特征在于，是由来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的野生型羰基还原酶在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1至251位进行单点突变、双点突变或三点突变而得；
具体单点突变的位点为以下任意一种：
在93位上的突变；
在95位上的突变；
在152位上的突变；
在194位上的突变；
在198位上的突变；
具体双点突变的位点为以下任意一种：
在93位和195位上的组合突变；
在144位和195位上的组合突变；
在194位和195位上的组合突变；
在195位和207位上的组合突变；
具体三点突变的位点为以下任意一种：
在92位和194位和195位上的组合突变；
在93位和194位和195位上的组合突变；
在94位和194位和195位上的组合突变；
在95位和194位和195位上的组合突变；
在144位和194位和195位上的组合突变；
在152位和194位和195位上的组合突变；
在189位和194位和195位上的组合突变；
在192位和194位和195位上的组合突变；
在194位和195位和198位上的组合突变；
在194位和195位和205位上的组合突变；
在194位和195位和207位上的组合突变；
在194位和195位和210位上的组合突变。
2.如权利要求1所述羰基还原酶突变体，其特征在于，具体单点突变为以下任意一种：
A93Y；A93F；A93S；A93E；N95L；N95H；L152M；L194M；L198S；L198C。
3.如权利要求1所述羰基还原酶突变体，其特征在于，具体双点突变为以下任意一种：
A93F且V195G；A93S且V195G；A93E且V195G；A93Y且V195G；E144F且V195G；E144M且V195G；L194M且V195G；L194F且V195G；L194K且V195G；V195G且Q207A。
4.如权利要求1所述羰基还原酶突变体，其特征在于，具体三点突变为以下任意一种：
I92A且L194M且V195；I92L且L194M且V195G；I92M且L194M且V195G；I92S且L194M且V195G；
A93F且L194M且V195G；A93W且L194M且V195G；A93Y且L194M且V195G；A93N且L194M且V195G；A93C且L194M且V195G；A93Q且L194M且V195G；A93S且L194M且V195G；A93T且L194M且V195G；A93R且L194M且V195G；A93H且L194M且V195G；A93K且L194M且V195G；A93D且L194M且V195G；A93E且L194M且V195G；A93G且L194M且V195G；
V94A且L194M且V195G；V94F且L194M且V195G；V94L且L194M且V195G；V94M且L194M且V195G；V94S且L194M且V195G；V94E且L194M且V195G；
N95A且L194M且V195G；N95F且L194M且V195G；N95L且L194M且V195G；N95I且L194M且V195G；N95V且L194M且V195G；N95M且L194M且V195G；N95W且L194M且V195G；N95Y且L194M且V195G；N95S且L194M且V195G；N95T且L194M且V195G；N95R且L194M且V195G；N95H且L194M且V195G；N95E且L194M且V195G；N95P且L194M且V195G；
E144F且L194M且V195G；E144M且L194M且V195G；
L152M且L194M且V195G；
Y189F且L194M且V195G；
T192S且L194M且V195G；
L198A且L194M且V195G；L198F且L194M且V195G；L198M且L194M且V195G；L198Y且L194M且V195G；L198C且L194M且V195G；L198Q且L194M且V195G；L198N且L194M且V195G；L198S且L194M且V195G；L198R且L194M且V195G；L198K且L194M且V195G；
M205F且L194M且V195G；M205Y且L194M且V195G；M205P且L194M且V195G；
Q207A且L194M且V195G；Q207L且L194M且V195G；Q207M且L194M且V195G；
K210A且L194M且V195G；K210S且L194M且V195G。
5.编码权利要求1-4任一所述羰基还原酶突变体的基因。
6.一种包含权利要求5所述基因的表达载体。
7.一种表达权利要求1-4任一所述羰基还原酶突变体的基因工程菌。
8.如权利要求1-4任一所述羰基还原酶突变体、如权利要求5所述基因或如权利要求7所述基因工程菌在合成手性2,2-二取代-3-羟基环酮中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述手性2,2-二取代-3-羟基环酮为(2S,3R)-2,2-二取代-3-羟基环酮。
10.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包括权利要求1-4任一所述羰基还原酶突变体或权利要求7所述基因工程菌。
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