CN118077758A - 一种促进肠道akk菌株增殖的配方牛奶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：生牛乳587～990份、钙源0～2.2份、复配营养素0.1～1.0份、益生元8.8～407份；所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种；所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。本发明上述配方牛奶存在一定的成分和剂量上的协同作用改善肠道菌群的构成，特别是促进Akkermansia muciniphila增殖。

Description

一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶及其应用
技术领域
本发明涉及营养补充剂技术领域，尤其是涉及一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶及其应用。
背景技术
Akk菌(Akkermansia muciniphila)，一种肠道共生菌，是目前最受关注，具有巨大发展潜力的下一代益生菌，多项科学证据显示其在炎症性肠病、肠易激综合征、糖尿病、自闭症及非酒精性脂肪肝病等方面具有显著的防治效果。
Akk菌是一种黏蛋白降解细菌。黏蛋白是肠上皮黏液层的重要组成部分，其核心由含有丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸的序列组成，称为富含PTS的序列。黏蛋白在肠组织表面形成透明的粘液层，是大量肠道微生物栖息的主要部位。研究发现A.muciniphila可增加杯状细胞数量和刺激黏蛋白的生成，增加occludin and ZO-1的表达，提示增加粘液层和改善肠道屏障功能，也可以通过改善肠道屏障来减轻机体的炎症反应，进而可促进骨折愈合。在最近的人群研究中，发现骨健康的人群中的A.muciniphila的含量高于骨质疏松的人群。
作为下一代益生菌中的新星，Akk菌的发展历程很短，2004年才被发现，2011年完成全基因组测序，后续的研究多数为其功效的研究。关于膳食因素对其影响的研究还不是很多，一项关于膳食因素与Akkermansia muciniphila的系统综述显示，限制能量膳食和补充石榴提取物、白藜芦醇、聚葡萄糖、酵母发酵物、丁酸钠和菊粉增加了黏液嗜菌A.muciniphila的丰度，而低FODMAPs则降低了黏液嗜菌A.muciniphila的丰度。
AKK菌是益生菌中的明星菌株，研究表明，AKK菌可改善肥胖、糖尿病等代谢紊乱疾病、神经退行性疾病和肠道炎症等。
因此，如何提高AKK菌增殖的效果，如何提高粪便和盲肠内容物中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akk.muciniphila)的丰度是非常值得研究的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶。
本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：
生牛乳587～990份、钙源0～2.2份、复配营养素0.1～1.0份、益生元8.8～407份；所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种；所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。
优选的，所述内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖的质量比为(0.8～1.5):(0.8～1.5)；所述内源性低聚半乳糖为添加Nurica乳糖酶利用牛奶自有乳糖合成。
优选的，所述外添加低聚半乳糖为0～270重量份；Nurica乳糖酶的添加量为0～5重量份；
所述配方牛奶中低聚半乳糖的含量为0.1～6.0g/100mL；
所述聚葡萄糖的添加量为3～137重量份；所述配方牛奶中聚葡萄糖的添加量为0.4～25g/100mL。
优选的，所述复配营养素包括维生素A、铁、锌中的一种或几种与维生素D3的组合；
所述复配营养素中D3含量为10～220μg/g；
所述钙源包括碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、L-苏氨酸钙、甘氨酸钙、天门冬氨酸钙、柠檬酸苹果酸钙、醋酸钙、氯化钙、磷酸三钙、维生素E琥珀酸钙、甘油磷酸钙、氧化钙、硫酸钙、磷酸二氢钙、乳矿物盐、酪蛋白钙、苹果酸钙和抗坏血酸钙中的一种或几种。
优选的，所述配方牛奶还包括如下重量份的组分，乳化剂1～3份；稳定剂0.1～2份；磷酸缓冲盐0.2～0.6份；乳矿物盐为0～2.2份；
所述乳化剂包括单，双甘油脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯中的一种或几种；
所述稳定剂包括结冷胶、海藻酸钠、微晶纤维素或卡拉胶；
所述磷酸缓冲盐包括三聚磷酸钠、六偏磷酸钠或磷酸氢二钠中的一种或几种。
本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶的制备方法，包如下步骤：
A)将生牛乳标准化、杀菌，得到标准化的牛奶；
B)将第一部分标准化的奶、低聚半乳糖混合化料，均质，得到第一部分半成品奶；
C)将第二部分标准化的奶、钙源、复配营养素、聚葡萄糖混合化料，均质，得到第二部分半成品奶；
D)将第一部分半成品奶、第二部分半成品奶和剩余部分半成品奶混合，灭菌，即得配方牛奶。
优选的，所述步骤B)前还包括将部分标准化的牛奶和乳糖酶混合酶解，化料，酶解后灭活酶，得到部分半成品奶；
所述标准化的方式为闪蒸或反渗透膜浓缩；
所述标准化的牛奶的蛋白含量≥2.8g/100g；
所述第一部分标准化的牛奶和第二部分标准化的奶的质量比为(15～30)：(15～30)；
所述酶解温度为45～50℃；所述酶解时间为1.5～2h；
所述杀菌温度为135～150℃；所述杀菌时间为3～20s。
本发明提供了一种上述技术方案任意一项所述的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶在制备改善肠道菌群的构成的产品中的应用。
优选的，所述改善肠道菌群的构成包括改善粪便中菌群的构成；所述改善粪便中菌群的构成包括提高粪便中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌的丰度。
优选的，所述改善肠道菌群的构成包括改善盲肠内容物中菌群的构成；所述改善盲肠内容物中菌群的构成包括提高盲肠内容物中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌的丰度。
与现有技术相比，本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：生牛乳587～990份、钙源0～2.2份、复配营养素0.1～1.0份、益生元8.8～407份；所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种；所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。本发明上述配方牛奶存在一定的成分和剂量上的协同作用改善肠道菌群的构成，特别是促进Akkermansia muciniphila增殖。
附图说明
图1为大鼠粪便的肠道菌群在属水平的前10的菌群分布的物种相对丰度柱形图；
图2为28天粪便的属水平上的三元相图；
图3为钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)益生元暴露后大鼠肠道菌群在属水平上的的T_test物种差异分析图；
图4为钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)暴露后大鼠肠道菌群在属水平上的T_test物种差异分析图；
图5为高比益生元联用对大鼠粪便肠道菌群的影响；
图6为盲肠内容物菌群在属水平的前10的菌群分布的物种相对丰度柱形图；
图7为盲肠菌群属水平上的三元相图；
图8为高比益生元联用对大鼠盲肠差异变化菌群LDA分值柱状图(LDA阈值为4)。
具体实施方式
本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：
生牛乳587～990份、钙源0～2.2份、复配营养素0.1～1.0份、益生元8.8～407份；所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种；所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。
本发明提供的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶包括生牛乳587～990重量份；更优选包括生牛乳590～970重量份；更优选为590～960重量份；最优选为590～920重量份；
本发明提供的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶包括钙源0～2.2重量份；优选包括0.2～2.0重量份；更优选包括0.4～1.8重量份。
本发明所述钙源包括碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、L-苏氨酸钙、甘氨酸钙、天门冬氨酸钙、柠檬酸苹果酸钙、醋酸钙、氯化钙、磷酸三钙、维生素E琥珀酸钙、甘油磷酸钙、氧化钙、硫酸钙、磷酸二氢钙、乳矿物盐、酪蛋白钙、苹果酸钙和抗坏血酸钙中的一种或几种。本发明对于上述来源不进行限定，市售即可。
本发明提供的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶包括复配营养素0.1～1.0份；优选包括0.2～0.9份；更优选包括0.2～0.8份。
本发明所述复配营养素包括维生素A、铁、锌中的一种或几种与维生素D3的组合；所述复配营养素中D3含量优选为10～220μg/g；更优选为20～210μg/g；最优选为30～200μg/g。
本发明中涉及的维生素A的化合物来源：醋酸视黄酯(醋酸维生素A)或棕榈酸视黄酯(棕榈酸维生素A)中的一种或多种；
本发明中涉及的维生素D的化合物来源：麦角钙化醇(维生素D2)或胆钙化醇(维生素D3)中的一种或多种；
本发明中涉及的铁化合物来源：乙二胺四乙酸铁纳、焦磷酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸亚铁或乳酸亚铁中的一种或多种；
本发明中涉及的锌的化合物来源：葡萄糖酸锌、氧化锌、柠檬酸锌或乳酸锌中的一种或多种。
本发明提供的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶包括益生元8.8～407份；更优选包括9～400份；更优选包括20～380份；最优选为70～360份；
所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖。
所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种。
本发明中低聚半乳糖有两种来源，分别为外添加低聚半乳糖原料和添加Nurica乳糖酶利用牛奶自有乳糖合成内源低聚半乳糖两种来源。
所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。在本发明其中一部分优选实施方式中，所述聚葡萄糖和低聚半乳糖的重量比为(3～9)：1；更优选为(3～8)：1；最优选为(4～8)：1；具体可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1；或者上述任意二者之间的点值。
本发明聚葡萄糖符合GB 25541的要求；低聚半乳糖符合卫生部2008年第20号的要求。
本发明中低聚半乳糖的添加方式：可采用同时添加低聚半乳糖原料和Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)或单独外添加低聚半乳糖原料或单独添加Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)三种方式添加低聚半乳糖。优选地，按照同时添加低聚半乳糖原料和Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)的方式添加低聚半乳糖。
按照本发明，所述内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖的质量比为(0.8～1.5):(0.8～1.5)；更优选为(0.9～1.2):(0.9～1.2)；最优选的，本发明外添加低聚半乳糖与内源低聚半乳糖质量比在1:1左右，此时货架期甜感最佳。
所述内源性低聚半乳糖为添加Nurica乳糖酶利用牛奶自有乳糖合成。
按照本发明，添加方式为单独外添加低聚半乳糖原料时，所述外添加低聚半乳糖为0～270重量份；更优选为10～260重量份；最优选为20～250重量份。
按照本发明，添加方式为低聚半乳糖原料和Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)时候，所述外添加低聚半乳糖为0～270重量份；更优选为10～160重量份；最优选为20～150重量份。
此时，本发明Nurica乳糖酶的添加量优选为0～5重量份；更优选为1～5重量份。
本发明所述配方牛奶中低聚半乳糖的含量为0.1～6.0g/100mL；更优选为0.2～5.5g/100mL；最优选为1～5g/100mL。
本发明所述聚葡萄糖的添加量优选为3～137重量份；更优选为5～130重量份；更优选为10～100重量份。
所述配方牛奶中聚葡萄糖的添加量优选为0.4～25g/100mL；更优选为0.5～24g/100mL；最优选为0.8～20g/100mL。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：
生牛乳590～970份、钙源0.2～2.0份、复配营养素0.2～0.9份、益生元9～400份；
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：
生牛乳590～960份、钙源0.2～1.9份、复配营养素0.2～0.8份、益生元20～380份；
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，包括如下重量份的原料：
生牛乳590～920份、钙源0.4～1.8份、复配营养素0.3～0.8份、益生元70～360份；
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述配方牛奶中营养素含量为：
蛋白质3.0g/100mL，钙100mg/100mL，维生素D2.2ug/100mL，聚葡萄糖1.0g/100mL，低聚半乳糖1.0g/100mL。可以为外添加低聚半乳糖。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述配方牛奶中营养素含量为：
蛋白质3.0g/100mL，钙125mg/100mL，维生素D2.2ug/100mL，聚葡萄糖1.6g/100mL，低聚半乳糖0.4g/100mL。
可以为同时添加低聚半乳糖原料和Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)的方式添加低聚半乳糖。
本发明所述配方牛奶还包括如下重量份的组分，乳化剂1～3份；稳定剂0.1～2份；磷酸缓冲盐0.2～0.6份；乳矿物盐为0～2.2份；
更优选的，配方牛奶还包括如下重量份的组分，乳化剂1～2份；稳定剂0.1～1.8份；磷酸缓冲盐0.2～0.5份；乳矿物盐为0.1～2.0份；
具体的，所述乳化剂包括单，双甘油脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯中的一种或几种；
所述稳定剂包括结冷胶、海藻酸钠、微晶纤维素或卡拉胶；
所述磷酸缓冲盐包括三聚磷酸钠、六偏磷酸钠或磷酸氢二钠中的一种或几种。
本发明对其来源不进行限定，市售即可。
当低聚半乳糖的添加为外源添加时，本发明提供的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶的制备方法，包如下步骤：
A)将生牛乳标准化、杀菌，得到标准化的牛奶；
B)将第一部分标准化的奶、低聚半乳糖混合化料，均质，得到第一部分半成品奶；
C)将第二部分标准化的奶、钙源、复配营养素、聚葡萄糖混合化料，均质，得到第二部分半成品奶；
D)将第一部分半成品奶、第二部分半成品奶和剩余部分半成品奶混合，灭菌，即得配方牛奶。
本发明对于上述组分和配比已经有了清楚的描述，在此不再赘述。
当低聚半乳糖的添加为外源和内源都添加时，所述步骤B)前还包括将部分标准化的牛奶和乳糖酶混合酶解，化料，酶解后灭活酶，得到部分半成品奶。
首先将生牛乳标准化、杀菌，得到标准化的牛奶。优选采用闪蒸或反渗透膜浓缩方法对生牛乳进行标准化，得到标准化后原奶。更优选对标准化后的原奶进行巴氏杀菌，得到巴氏奶。巴氏杀菌采用本领域技术人员熟知的方式参数杀菌即可。
将部分标准化的牛奶和乳糖酶混合酶解，化料，酶解后灭活酶，得到部分半成品奶。
将占配料量15～30％的巴氏奶加热至45～50℃，将Nurica乳糖酶均匀、缓慢、分散地加入化料罐中；酶解的温度保持在45～50℃之间，酶解时间1.5～2h；更优选的，所述酶解温度为46～49℃；所述酶解时间为1.6～1.8h。
采用具有混合、分散、剪切效果的化料设备，使料液成为均匀混合物。酶解后升温至90～100℃，保持200～400s，更优选升温至92～98℃，保持210～380s，将酶灭活，酶灭活后快速将料液冷却至1～8℃后打入半成品罐。
本发明所述标准化的牛奶的蛋白含量≥2.8g/100g；
将第一部分标准化的奶、低聚半乳糖混合化料，均质，得到第一部分半成品奶；
更优选将占配料量15-30％的巴氏奶加热至50-80℃，剪切搅拌，缓慢加入乳化剂、稳定剂，化料10～20min，之后再将GOS(低聚半乳糖)缓慢均匀的添加并化料5～15min，化料结束后进行均质，冷却至1～8℃后打入半成品罐。
将第二部分标准化的奶、钙源、复配营养素、聚葡萄糖混合化料，均质，得到第二部分半成品奶。
更优选将占配料量15～30％的巴氏奶加热至40-60℃，剪切搅拌，将复配营养素、磷酸缓冲盐干混后缓慢加入巴氏奶中，之后再将乳矿物盐、PDX(聚葡萄糖)均匀、缓慢的添加并化料10～20min。化料结束后进行均质，均质结束后冷却至1～8℃，在半成品罐搅拌状态下打入上述料液，混合均匀。
在本发明中，所述第一部分标准化的牛奶和第二部分标准化的奶的质量比优选为(15～30)：(15～30)；更优选为(16～28)：(17～28)。
将第一部分半成品奶、第二部分半成品奶和剩余部分半成品奶混合，灭菌，即得配方牛奶。
用剩余配料巴氏奶将上述混合料液定容至配料量。超高温灭菌灌装：对上述半成品进行超高温杀菌处理，采用板式杀菌机或管式杀菌机杀菌，杀菌温度135～150℃，杀菌时间3～20s；更优选的，所述杀菌温度为137～148℃；所述杀菌时间为5～18s。
本发明提供了一种上述技术方案所述的促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶在制备改善肠道菌群的构成的产品中的应用。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述奶粉在促进Akkermansiamuciniphila增殖的应用剂量为：
钙源400mg～500mg/d，维生素D8μg～12μg/d，聚葡萄糖6g～10g/d，低聚半乳糖1.5g～2.5g/d。
本发明人发现，本发明提供的配方牛奶具有改善肠道菌群的作用。
本发明上述组分和比例是功能上彼此互相支持，存在相互作用关系的技术特征；只要满足上述特定的组分和比例，均能实现本发明的应用。
本发明所述改善肠道菌群的构成包括改善粪便和盲肠内容物中菌群的构成。
在本发明一些优选实施方式中，所述改变肠道菌群的构成包括提高粪便和盲肠内容物中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌的丰度。
本发明所述改善肠道菌群的产品包括食品；所述食品包括乳制品、休闲食品、饮品或宠物食品。
本发明食品为本领域技术人员熟知的食品，包括但不限于蔬菜制品、食用菌制品、豆类制品、饮料制品等。本发明所述乳制品优选包括发酵乳、奶片、奶酪或奶类零食中的一种或几种。
本发明提供了“配方牛奶”用于调节嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akk.muciniphila)增殖的健康效果，以及该组合物在食品中的应用。具体地，本发明提供了组合物在制备用于调节嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akk.muciniphila)食品中的应用，其健康效果通过粪便16s rRNA测序及分析得到验证，取得了意料之外的效果。
具体为：1)粪便肠道菌群结果显示，与钙+维生素D组相比，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)和钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度均增加，但钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)的阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度优于钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)，在种水平上，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)显著提升了Akk.muciniphila的丰度；2)盲肠内容物肠道菌群结果显示，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)和钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度均显著增加，在种水平上，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)显著提升了Akk.muciniphila的丰度。
无论是粪便还是盲肠内容物，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)的阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度明显增加，在种水平上，Akk.muciniphila的丰度显著增加。
本发明通过模拟钙不同摄入量水平的生长期大鼠模型，提供了5个不同对比例，低钙组、高钙组、钙+维生素D组、钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)、钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)；低钙组钙剂量仅占推荐量1/3的成长期动物模型，高钙组钙剂量补充到了成长期动物的推荐理想剂量；钙+维生素D组补充后钙剂量为高钙组的3/4，维生素D剂量为低钙组和高钙组的1.5倍；钙+维生素D+PDX+GOS组合(PDX：GOS＝1:1)，补充后钙剂量为高钙组的3/4，维生素D剂量为低钙组和高钙组的1.5倍；钙+维生素D+PDX+GOS组合(PDX：GOS＝4:1)补充后钙剂量为高钙组的3/4，维生素D剂量为低钙组和高钙组的1.5倍。
本发明发现，与钙+维生素D组相比，无论是粪便还是盲肠内容物，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)的阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度明显增加，在种水平上，Akk.muciniphila的丰度显著增加。
通过以上组别的对比，本发明发现钙+维生素D+PDX+GOS组合物(PDX：GOS＝4:1)在促进Akk.muciniphila增殖方面的显著影响，取得了意料之外的技术效果。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶及其应用进行详细描述。
实施例1
配方牛奶：蛋白质3.0g/100mL，钙100mg/100mL，维生素D2.2ug/100mL，聚葡萄糖1.0g/100mL，低聚半乳糖1.0g/100mL(外添加低聚半乳糖)
配方牛奶制备步骤如下：
(1)采用反渗透膜浓缩方法对生牛乳进行标准化，得到标准化后原奶。
(2)对标准化后的原奶进行巴氏杀菌，得到巴氏奶，占配料量18％的巴氏奶加热至80℃，剪切搅拌，缓慢加入乳化剂、稳定剂，化料15min，之后再将GOS(低聚半乳糖)缓慢均匀的添加并化料15min，化料结束后进行均质，冷却至8℃后打入半成品罐。
(3)将占配料量20％的巴氏奶加热至50℃，剪切搅拌，将复配营养素、磷酸缓冲盐干混后缓慢加入巴氏奶中，之后再将PDX(聚葡萄糖)均匀、缓慢的添加并化料15min。化料结束后进行均质，均质结束后冷却至8℃，在半成品罐搅拌状态下打入上述料液，混合均匀。
(4)用剩余配料巴氏奶将上述混合料液定容至配料量。
(5)超高温灭菌灌装：对上述半成品进行超高温杀菌处理，采用管式杀菌机杀菌，杀菌温度137℃，杀菌时间6s。
在上述制备方法中，标准化后原奶的蛋白含量≥2.8g/100g。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，乳化剂的添加量为2.0重量份，包括单，双甘油脂肪酸酯1.0重量份、蔗糖脂肪酸酯1.0重量份；稳定剂的添加量为0.3重量份，包括结冷胶0.3重量份。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，GOS的添加量为25重量份(成品中GOS含量为1.0g/100mL)。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，复配营养素的添加量为0.3重量份，营养素种类包括维生素A、维生素D、铁、锌。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，PDX的添加量为25重量份(成品中PDX含量为1.0g/100mL)。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，磷酸缓冲盐的添加量为0.3重量份，包括六偏磷酸钠。
按照中国3-6、7-9、10-13岁儿童钙摄入量P50值分别为245mg、280mg、344mg计，其RNI值分别为800mg、1000mg和1200mg，维生素D摄入量P75值分别为3.89ug、4.29ug和4.61ug，其RNI值为10ug。饮用实施例1制备的400ml配方牛奶，钙膳食摄入量可提升至745mg、780mg和844mg，达到了RNI的75％左右，维生素D摄入量可提升至12.7ug、13.1ug和13.4ug，近RNI的1.4倍，PDX摄入量为4g，GOS摄入量为4g，对应动物实验中实验组4的膳食钙和维生素D及两种益生元摄入量。
实施例2
配方牛奶：蛋白质3.0g/100mL，钙125mg/100mL，维生素D2.2ug/100mL，聚葡萄糖1.6g/100mL，低聚半乳糖0.4g/100mL(同时添加低聚半乳糖原料和Nurica乳糖酶(自身合成内源低聚半乳糖)的方式添加低聚半乳糖)
配方牛奶制备步骤如下：
(1)采用闪蒸或反渗透膜浓缩方法对生牛乳进行标准化，得到标准化后原奶。对标准化后的原奶进行巴氏杀菌，得到巴氏奶。
(2)将占配料量30％的巴氏奶加热至50℃，将Nurica乳糖酶均匀、缓慢、分散地加入化料罐中，酶解的温度保持在50℃，酶解时间1.5h；采用具有混合、分散、剪切效果的化料设备，使料液成为均匀混合物。酶解后升温至95℃，保持300s，将酶灭活，酶灭活后快速将料液冷却至8℃后打入半成品罐。
(3)将占配料量20％的巴氏奶加热至65℃，剪切搅拌，缓慢加入乳化剂、稳定剂，化料15min，之后再将GOS(低聚半乳糖)缓慢均匀的添加并化料10min，化料结束后进行均质，冷却至8℃后打入半成品罐。
(4)将占配料量20％的巴氏奶加热至50℃，剪切搅拌，将复配营养素、磷酸缓冲盐干混后缓慢加入巴氏奶中，之后再将乳矿物盐、PDX(聚葡萄糖)均匀、缓慢的添加并化料15min。化料结束后进行均质，均质结束后冷却至8℃，在半成品罐搅拌状态下打入上述料液，混合均匀。
(5)用剩余配料巴氏奶将上述混合料液定容至配料量。
(6)超高温灭菌灌装：对上述半成品进行超高温杀菌处理，采用板式杀菌机杀菌，杀菌温度139℃，杀菌时间3s。
在上述制备方法中，其特征在于，标准化后原奶的蛋白含量≥2.8g/100g。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，乳化剂的添加量为1.5重量份，包括单，双甘油脂肪酸酯1.0重量份、蔗糖脂肪酸酯0.5重量份；稳定剂的添加量为1.1重量份，包括微晶纤维素1.0重量份、卡拉胶0.1重量份。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，GOS的添加量为5重量份、Nurica乳糖酶的添加量为3.5重量份(成品中GOS含量为0.4g/100mL)。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，复配营养素的添加量为0.3重量份，营养素种类包括但不限于维生素A、维生素D、铁、锌。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，PDX的添加量为40重量份(成品中PDX含量为1.6g/100mL)。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，磷酸缓冲盐的添加量为0.3重量份，包括但不限于三聚磷酸钠。
在上述制备方法中，其特征在于，基于1000重量份的成品，乳矿物盐的添加量为1.8重量份(成品中钙含量125mg/100mL)。
按照中国3-6、7-9、10-13岁儿童钙摄入量P50值分别为245mg、280mg、344mg计，其RNI值分别为800mg、1000mg和1200mg，维生素D摄入量P75值分别为3.89ug、4.29ug和4.61ug，其RNI值为10ug。饮用实施例2制备的400ml配方牛奶，钙膳食摄入量可提升至745mg、780mg和844mg，达到了RNI的75％左右，维生素D摄入量可提升至12.7ug、13.1ug和13.4ug，近RNI的1.4倍，PDX摄入量为6.4g，GOS摄入量为1.6g，对应动物实验中实验组5的膳食钙和维生素D及两种益生元摄入量。
对比例1
高钙牛奶：蛋白质3.0g/100mL，钙150mg/100mL，维生素D1.5ug/100mL
制备步骤如下：
(1)采用反渗透膜浓缩方法对生牛乳进行标准化，得到标准化后原奶，对标准化后的原奶进行巴氏杀菌，得到巴氏奶，将占配料量15％的巴氏奶加热至60℃，剪切搅拌，缓慢加入单，双甘油脂肪酸酯、结冷胶，化料15min，化料结束后进行均质，冷却至8℃后打入半成品罐。
(2)将占配料量10％的巴氏奶加热至45℃，剪切搅拌，将维生素D、磷酸缓冲盐缓慢加入巴氏奶中，之后加入乳矿物盐，化料15min。化料结束后冷却至8℃，在半成品罐搅拌状态下打入上述料液，混合均匀。
(3)用剩余配料巴氏奶将上述混合料液定容至配料量。
(4)超高温灭菌灌装：对上述半成品进行超高温杀菌处理，采用板式杀菌机杀菌，杀菌温度137℃，杀菌时间4s。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，单，双甘油脂肪酸酯的添加量为1.0重量份，结冷胶0.3重量份。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，维生素D添加量为0.01重量份。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，磷酸缓冲盐的添加量为0.4重量份，包括但不限于三聚磷酸钠。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，乳矿物盐的添加量为2.9重量份(成品中钙含量150mg/100mL)。
按照中国3-6、7-9、10-13岁儿童钙摄入量P50值分别为245mg、280mg、344mg计，其RNI值分别为800mg、1000mg和1200mg，维生素D摄入量P75值分别为3.89ug、4.29ug和4.61ug，其RNI值为10ug。饮用对比例1制备的400ml配方牛奶，钙膳食摄入量可提升至近RNI值，维生素D摄入量可提升至10ug左右，接近RNI值，对应动物实验中实验组2的膳食钙和维生素D摄入量。
对比例2
按照现有膳食模式，饮奶量较低，钙摄入量仅占推荐量1/3左右的膳食模式，对应动物实验组1.
对比例3
强化了维生素D的普通儿童成长牛奶，钙含量100mg/100ml,维生素D含量2.2ug/100ml
制备步骤如下：
(1)采用反渗透膜浓缩方法对生牛乳进行标准化，得到标准化后原奶。
(2)原奶进行巴氏杀菌，得到巴氏奶，占配料量15％的巴氏奶加热至60℃，剪切搅拌，缓慢加入单，双甘油脂肪酸酯，化料15min，化料结束后进行均质，冷却至8℃后打入半成品罐。
(3)将占配料量10％的巴氏奶加热至45℃，剪切搅拌，将维生素D缓慢加入巴氏奶中，化料15min。化料结束后冷却至8℃，在半成品罐搅拌状态下打入上述料液，混合均匀。
(4)用剩余配料巴氏奶将上述混合料液定容至配料量。
(5)超高温灭菌灌装：对上述半成品进行超高温杀菌处理，采用板式杀菌机杀菌，杀菌温度137℃，杀菌时间4s。
在上述制备方法中，其特征在于，标准化后原奶的蛋白含量≥2.8g/100g。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，单，双甘油脂肪酸酯的添加量为1.0重量份。
在上述制备方法中，基于1000重量份的成品，维生素D添加量为0.014重量份。
按照中国3-6、7-9、10-13岁儿童钙摄入量P50值分别为245mg、280mg、344mg计，其RNI值分别为800mg、1000mg和1200mg，维生素D摄入量P75值分别为3.89ug、4.29ug和4.61ug，其RNI值为10ug。饮用对比例3制备的400ml配方牛奶，钙膳食摄入量可提升至745mg、780mg和844mg，达到了RNI的75％左右，维生素D摄入量可提升至12.7ug、13.1ug和13.4ug，近RNI的1.4倍，对应动物实验中实验组3的膳食钙和维生素D摄入量。
实施例3动物试验
1.1试验动物与分组：
SPF级断乳SD大鼠60只，雄性，体重45g～65g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2016-0006。动物饲养于四川大学华西公共卫生学院屏障级动物房，合格证号SYXK(川)2018-011。饲养中保证动物自由饮水和充分进食，饮水为灭菌纯水。大鼠饲养在底部为无锈钢铁丝的笼具中，动物房内保持安静、清洁、通风和适宜光照状态，20-26℃，湿度40％～70％，明暗交替周期为12h。
大鼠由AIN-93G标准饲料(南通特诺菲饲料科技有限公司，生产许可证号：苏饲证((2019)06092)适应性喂养2周。将大鼠按体重随机分成5组，每组12只。钙、维生素D3、低聚半乳糖(GOS)、聚葡萄糖(PDX)的给予均采用拌饲的方式，各组饲料配方见表1-2。所有拌饲处理均在动物适应性喂养后连续进行93天，于实验第93天处死动物并进行各指标检测。
表1实验分组
表2各实验组的饲料配方
1.2实验方法
收集灌胃后28天的各组大鼠粪便。实验第93天处死动物最后一次灌胃后，大鼠禁食16h，水自由饮用，大鼠取血处死后，迅速分离盲肠，盲肠置于-80冰箱冻存，后无菌手术刀剖开后在超净工作台，用一次性药勺刮取取盲肠内容物分存于冻存管中，置于-80冰箱冻存。
对粪便和盲肠内容物进行16s rRNA基因测序，并对测序数据进行OTU、样本复杂度、多样本比较等分析。
1.3实验结果
(1)粪便肠道菌群的结构和组成的影响
1)肠道菌群落结构分析
由物种相对丰度柱形图和三元相图可知，在属水平上，与低钙组相比，钙+维生素D组的阿克曼氏菌属(Akkermansia)丰度有增加，但没有明显变化，提示增加钙和维生素D对阿克曼氏菌属(Akkermansia)无显著影响。
与钙+维生素D组相比，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)和钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度均增加，但钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)的阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度优于钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)。
结果如图1和图2所示，其中图1为大鼠粪便的肠道菌群在属水平的前10的菌群分布的物种相对丰度柱形图；图2为28天粪便的属水平上的三元相图。
2)T_test物种差异分析
由T_test物种差异分析图可知，在属水平上，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)Akkermansia的相对丰度增加。
与钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)和钙+维生素D不同，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)的Akkermansia显著高于钙+维生素D。进一步在种水平上，发现钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)的丰度显著增加(P<0.05)。
图3钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)暴露后大鼠肠道菌群在属水平上的的T_test物种差异分析图
3)LDA分值柱状图
从LDA score图中可知，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)中显著差异物种包括在疣微菌门(Verrucomicrobiota)的Akkermansia属和Akk.muciniphila。图4各组大鼠粪便差异菌群LDA分值柱状图(LDA阈值为4)；图5高比益生元联用对大鼠粪便肠道菌群的影响
(2)“营养组合物”对盲肠菌群的结构和组成的影响
1)组间肠道菌群落结构分析
由物种相对丰度柱形图和三元相图可知，盲肠内容物的肠道菌群在属水平上，与低钙组相比，钙+维生素D组的阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度有增加，但没有显著变化，提示钙+维生素D对阿克曼氏菌属(Akkermansia)无显著影响。
与钙+维生素D组相比，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝1:1)和钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度均显著增加。
图6盲肠内容物菌群在属水平的前10的菌群分布的物种相对丰度柱形图；图7盲肠菌群属水平上的三元相图
2)LDA score图
从LDA score图中可知，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)中艾克曼菌属的Akkermansia muciniphila为显著差异物种，这与上述T_test物种差异分析结果、28天粪便的LefSe分析结果一致。即Akk.muciniphila为钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)干预的优势菌。图8高比益生元联用对大鼠盲肠差异变化菌群LDA分值柱状图(LDA阈值为4)。
综上，无论是粪便还是盲肠内容物，与钙+维生素D相比，钙+维生素D+PDX+GOS组合组(PDX：GOS＝4:1)中Akk.muciniphila的相对丰度明显增加。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶，其特征在于，包括如下重量份的原料：
生牛乳587～990份、钙源0～2.2份、复配营养素0.1～1.0份、益生元8.8～407份；所述益生元包括聚葡萄糖和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖包括内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖中的一种或两种；所述聚葡萄糖和所述低聚半乳糖的质量比为(3～10):1。
2.根据权利要求1所述的配方牛奶，其特征在于，所述内源性低聚半乳糖和外添加低聚半乳糖的质量比为(0.8～1.5):(0.8～1.5)；所述内源性低聚半乳糖为添加Nurica乳糖酶利用牛奶自有乳糖合成。
3.根据权利要求2所述的配方牛奶，其特征在于，所述外添加低聚半乳糖为0～270重量份；Nurica乳糖酶的添加量为0～5重量份；
所述配方牛奶中低聚半乳糖的含量为0.1～6.0g/100mL；
所述聚葡萄糖的添加量为3～137重量份；所述配方牛奶中聚葡萄糖的添加量为0.4～25g/100mL。
4.根据权利要求1所述的配方牛奶，其特征在于，所述复配营养素包括维生素A、铁、锌中的一种或几种与维生素D3的组合；
所述复配营养素中D3含量为10～220μg/g；
所述钙源包括碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、L-苏氨酸钙、甘氨酸钙、天门冬氨酸钙、柠檬酸苹果酸钙、醋酸钙、氯化钙、磷酸三钙、维生素E琥珀酸钙、甘油磷酸钙、氧化钙、硫酸钙、磷酸二氢钙、乳矿物盐、酪蛋白钙、苹果酸钙和抗坏血酸钙中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的配方牛奶，其特征在于，所述配方牛奶还包括如下重量份的组分，乳化剂1～3份；稳定剂0.1～2份；磷酸缓冲盐0.2～0.6份；乳矿物盐为0～2.2份；
所述乳化剂包括单，双甘油脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯中的一种或几种；
所述稳定剂包括结冷胶、海藻酸钠、微晶纤维素或卡拉胶；
所述磷酸缓冲盐包括三聚磷酸钠、六偏磷酸钠或磷酸氢二钠中的一种或几种。
6.一种促进肠道AKK菌株增殖的配方牛奶的制备方法，其特征在于，包如下步骤：
A)将生牛乳标准化、杀菌，得到标准化的牛奶；
B)将第一部分标准化的奶、低聚半乳糖混合化料，均质，得到第一部分半成品奶；
C)将第二部分标准化的奶、钙源、复配营养素、聚葡萄糖混合化料，均质，得到第二部分半成品奶；
D)将第一部分半成品奶、第二部分半成品奶和剩余部分半成品奶混合，灭菌，即得配方牛奶。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)前还包括将部分标准化的牛奶和乳糖酶混合酶解，化料，酶解后灭活酶，得到部分半成品奶；
所述标准化的方式为闪蒸或反渗透膜浓缩；
所述标准化的牛奶的蛋白含量≥2.8g/100g；
所述第一部分标准化的牛奶和第二部分标准化的奶的质量比为(15～30)：(15～30)；
所述酶解温度为45～50℃；所述酶解时间为1.5～2h；
所述杀菌温度为135～150℃；所述杀菌时间为3～20s。
8.一种权利要求1～5任意一项所述的配方牛奶在制备改善肠道菌群的构成的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述改善肠道菌群的构成包括改善粪便中菌群的构成；所述改善粪便中菌群的构成包括提高粪便中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌的丰度。
10.根据权利要求8所述的应用，所述改善肠道菌群的构成包括改善盲肠内容物中菌群的构成；所述改善盲肠内容物中菌群的构成包括提高盲肠内容物中嗜粘蛋白-阿克曼氏菌的丰度。
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