CN118064449A - 调控植物花期的RcILI4基因及其应用 - Google Patents
调控植物花期的RcILI4基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118064449A CN118064449A CN202410219381.6A CN202410219381A CN118064449A CN 118064449 A CN118064449 A CN 118064449A CN 202410219381 A CN202410219381 A CN 202410219381A CN 118064449 A CN118064449 A CN 118064449A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- plant
- plants
- flowering
- rcili4
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 59
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 19
- 235000000100 Hibiscus rosa sinensis Nutrition 0.000 claims description 13
- 240000008254 Rosa chinensis Species 0.000 claims description 13
- 235000000664 Rosa chinensis Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000016785 Rosa della China Nutrition 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 claims description 4
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 claims 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 claims 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 abstract description 33
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- RMOGWMIKYWRTKW-UONOGXRCSA-N (S,S)-paclobutrazol Chemical compound C([C@@H]([C@@H](O)C(C)(C)C)N1N=CN=C1)C1=CC=C(Cl)C=C1 RMOGWMIKYWRTKW-UONOGXRCSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 101100257262 Caenorhabditis elegans soc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000005985 Paclobutrazol Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008638 plant developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000025488 response to cold Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。RcILI4基因编码一种促进植株提早开花的非DNA结合型bHLH转录因子。通过构建RcILI4基因的重组过表达载体并转化拟南芥植株,可使拟南芥植株提前开花,达到调控植株花期、创制转基因新植株等目的。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,具体地说,涉及一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。
背景技术
开花期是植物从营养生长向生殖生长的过渡阶段,在植物的生命周期中有举足轻重的作用(邓琴霖等,2023)。植物的开花时间受外部环境和自身遗传机制共同调控,对于模式植物拟南芥的研究发现,植物成花过程受到复杂的基因网络联合调控,主要包括6条通路,分别是光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主开花途径、年龄途径和温度途径(杨小凤等,2021)。近些年对开花时间的研究也主要围绕上述6条通路展开,如FLC(FLOWERINGLOCUS C)和FRI(FRIGIDA)被认为是春化途径中开花的抑制因子(Michaels and Amasino,2001)。
基因调控是植物生长发育过程中必不可少的。bHLH转录因子家族是植物中第二大转录因子家族,具有重要的生物学功能,根据bHLH蛋白碱性区域的性质,可将其分为两类:DNA结合型和非DNA结合型(Wang等,2010)。关于DNA结合型bHLH转录因子的研究较多,目前已证实其能参与植物的营养生长和生殖生长过程,响应冷胁迫信号,调控花青素的生物合成过程(Li等,2019;Albertos等,2022)。目前为止,针对非DNA结合bHLH转录因子的功能研究主要在拟南芥和水稻中进行。拟南芥多效唑抗性基因(PACLOBUTRAZOL-RESISTANCE,PRE)编码一组非DNA结合bHLH蛋白,由6个成员组成,该基因参与调控拟南芥花器官的生长,部分成员发生突变可导致拟南芥植株矮化和花发育缺陷(Shin等,2019)。非DNA结合bHLH转录因子在植物生殖生长过程中可能发挥了关键作用,但关于月季中该转录因子功能的研究目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种调控植物花期的RcILI4基因,其编码月季非DNA结合型bHLH转录因子,RcILI4基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因:
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
进一步地,RcILI4基因为:
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列;
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1% SDS的0.1×SSPE或含0.1% SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第二方面,本发明提供含有所述RcILI4基因的生物材料,所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。
第三方面,本发明提供所述RcILI4基因或含有所述RcILI4基因的生物材料的以下任一应用:
(1)用于调控植物花期;
(2)用于植物育种;
(3)用于制备转基因植物。
进一步地,(2)中育种目的为调控植物花期。
本发明中,所述调控植物花期包括:使植物抽薹提前,开花提前。
本发明中,所述植物包括但不限于拟南芥、月季。
第四方面,本发明提供一种促进植物抽薹和开花的方法,所述方法包括:利用基因工程手段,在植物中过表达所述RcILI4基因。
进一步地,所述过表达的方式可选自以下1)~5),或任选的组合:
1)通过导入具有所述基因的质粒;
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数;
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列;
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接;
5)通过导入增强子。
携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach,1998,Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,第411-463页;Geiserson和Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
第五方面,本发明提供按照所述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
进一步地,育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
本发明对月季中非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4进行研究,首次揭示了RcILI4基因的功能,该基因转化拟南芥植株后可使其提前开花。本发明通过构建pH7WG2D-RcILI4-eGFP重组过表达载体,利用含重组载体的农杆菌悬浮液侵染拟南芥花序,经过抗性筛选、PCR检测和GFP荧光检测获得阳性转基因拟南芥,通过与野生型拟南芥比较,发现转基因拟南芥比野生型植株更早开花。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中月季非DNA结合bHLH转录因子RcILI4全长CDS序列克隆的琼脂糖凝胶电泳图。其中,目的片段为276bp,M代表DNA maker II,1-4代表重复试验。
图2为本发明较佳实施例中转pH7WG2D-RcILI4-eGFP的13株T3代拟南芥植株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中,PCR检测使用潮霉素抗性基因作为目的基因,目的片段为598bp,M代表DNA maker II,1-13代表13株拟南芥的检测结果。
图3为本发明较佳实施例中转pH7WG2D-RcILI4-eGFP的T3代拟南芥植株和野生型拟南芥植株的eGFP荧光鉴定表型图。其中,Col代表野生型拟南芥,OE代表转基因拟南芥。
图4为本发明较佳实施例中拟南芥pH7WG2D-RcILI4-eGFP的T3代拟南芥植株和野生型拟南芥植株的表型观察图。其中,a为4周苗龄的拟南芥植株,b为5周苗龄的拟南芥植株,c为7周苗龄的拟南芥植株。Col代表野生型拟南芥,OE代表转基因拟南芥。
具体实施方式
本发明旨在提供一种异源转化拟南芥使其提前开花的月季非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4。构建重组表达载体pH7WG2D-RcILI4-eGFP并转化拟南芥,获得转基因植株,对转基因植株进行表型观察。研究表明非DNA结合bHLH转录因子RcILI4能使拟南芥植株花期提前。
本发明采用如下技术方案:
本发明提供一种促进植株提早开花的非DNA结合bHLH转录因子,将其命名为RcILI4,来自于月季‘月月粉’,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种包含SEQ ID NO:1所示序列的用于外源基因序列遗传转化的重组表达载体,命名为pH7WG2D-RcILI4-eGFP。
本发明进一步将上述重组表达载体利用农杆菌介导法转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,验证该非DNA结合bHLH转录因子能促进植株提早开花。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4的克隆
1、月季RNA提取与第一链cDNA合成
使用SV Total RNA提取试剂盒(Promega,威斯康辛州,美国)参照说明书要求提取月季‘月月粉’叶片的RNA,保存于-80℃冰箱备用。使用PrimeScriptTM RT reagent试剂盒(TaKaRa,滋贺县,日本)合成第一链cDNA。
2、基因克隆
以月季cDNA为模板,根据月季基因组数据库(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)提供的RchiOBHmChr7g0180941基因序列,利用DNAMAN软件设计基因全长克隆引物,引物见表1。采用KOD plus高保真酶(KOD-201,TOYOBO,大阪,日本)扩增目的片段。反应体系见表2。PCR反应程序如下:94℃5min,94℃30s,56℃30s,72℃1min 30s,共设置32个循环;72℃延伸2min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209,天根生化科技有限公司)根据说明书要求,进行回收纯化(图1)。将回收的片段与克隆载体-Blunt(CB501-01,北京全式金生物有限公司)根据说明书方法进行连接试验,取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α,在氨苄霉素培养皿筛选获得阳性菌斑,利用质粒提取试剂盒(D6942,OMEGA,美国)按照说明书要求,提取阳性重组质粒,送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序,获得基因CDS序列,将该基因命名为RcILI4,将重组质粒命名为pEASY-RcILI4。
3、RcILI4蛋白结构域分析
根据测序获得的RcILI4的CDS,翻译成蛋白序列,进一步分析RcILI4的蛋白结构域。进入NCBI的blastp网页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),输入RcILI4蛋白质序列作为查询序列。点击BLAST按钮,在搜索结果页面,点击Conserved Domains选项卡,查看RcILI4的保守结构域,以及与之匹配的结构域数据库和注释信息。RcILI4具有一个HLH结构域(PSSM-ID:23895),这是bHLH家族的核心结构域。此外,RcILI4还与两个非特定匹配的结构域模型有一定的相似性,分别是bHLH_AtPRE_like
(PSSM-ID:33167)和PLN03217(PSSM-ID:33211)。可以确定RcILI4属于非DNA结合bHLH转录因子。
表1克隆引物
表2基因克隆体系
组分 | 含量 |
10×KOD plus buffer | 5μL |
MgSO4(25mM) | 3μL |
dNTPs(2mM) | 5μL |
RcILI4-U | 1.5μL |
RcILI4-L | 1.5μL |
cDNA | 0.3μL |
KOD plus | 1μL |
ddH2O | 32.7μL |
共计 | 50μL |
RcILI4基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示,RcILI4蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
实施例2重组表达载体的构建
本实施例采用pH7WG2D作为目的载体(购自BioVector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心,http://www.googbio.com/product/303794.html),按照说明书方法,利用Gateway重组反应构建RcILI4过表达载体。以重组质粒pEASY-RcILI4为模板,使用引物gateway-RcILI4-U和gateway-RcILI4-L(表1)扩增片段。将克隆的基因片段与pDONA221中间载体连接,随后交换到pH7WG2D载体上,最终获得带绿色荧光标签的pH7WG2D-RcILI4-eGFP重组过表达载体。
实施例3拟南芥的稳定遗传转化
1、拟南芥植株养护
将野生型拟南芥播种于配制好的基质中(营养土:蛭石=1:1,体积比),在黑暗处理2d后转入条件为16h光照/8h黑暗的培养箱中管理,设置温度23℃,湿度70%左右。
2、重组农杆菌菌液获得
使用冻融法将重组表达载体pH7WG2D-RcILI4-eGFP转入根瘤农杆菌感受态(GV3101),随后涂布于含50μg/mL利福平(Rif)和50μg/mL壮观霉素(SPR)的固体LB培养基上筛选阳性菌斑。将阳性菌斑接种到含相同抗生素的液体LB培养基中,28℃200rpm振荡培养,得到OD600=0.6-0.8的重组农杆菌菌液。
3、转基因拟南芥获得
将拟南芥花序浸入农杆菌重悬菌液中,避光处理3-5min,重复此操作一次。继续培养直至种子成熟。种子收获后将其命名为T0代。将T0代种子接种于含有50μg/mL SPR的MS培养基上,筛选阳性转基因幼苗,待其成熟后收获种子,并将种子命名为T1代。重复上述操作,直到获得纯合的T3代遗传转化拟南芥植株。
4、阳性转基因植株筛选
本实施例利用以下两种方法进行阳性植株鉴定:
方法I:播种阳性拟南芥种子,待植株长出绿色莲座叶后,提取植株叶片DNA,使用HPT-U和HPT-L引物进行鉴定,目的条带为598bp,则为阳性植株(图2)。
方法II:待植株长出莲座叶后,使用手持式LUYOR-3415激发光源进行GFP荧光检测。
图3结果显示,与野生型植株(左,Col)相比较,转基因植株(右,OE)出现绿色荧光,为阳性植株。
实施例4转基因拟南芥表型观察
将实施例3中经过鉴定获得的阳性转RcILI4基因拟南芥和野生型拟南芥播种于同一培养箱中,拍照记录生长过程。随机各抽取10株,统计抽薹与开花时间。
图4结果显示,转RcILI4的拟南芥植株在第3周时已开始抽薹,而野生型未抽薹;第4周时野生型拟南芥开始抽薹,RcILI4转基因植株已经开花,部分角果开始发育;第7周时RcILI4转基因植株结束开花。表3统计数据计算可知,转RcILI4的拟南芥植株抽薹天数为21.1±2.38,开花天数为31.5±2.22;相同条件下的野生型拟南芥抽薹天数为30.4±1.17,开花天数为42.3±4.97。RcILI4的异源表达,可使拟南芥抽薹提前9天左右,开花提前11天左右。
表3拟南芥开花统计数据
注:Col代表野生型拟南芥,OE代表转基因拟南芥。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
参考文献:
[1]邓琴霖,王远达,冯俊杰,等,2023.芥菜BjuWRKY71-1通过调节SOC1的表达促进开花[J/OL].生物工程学报,1-14.
[2]杨小凤,李小蒙,廖万金,2021.植物开花时间的遗传调控通路研究进展[J].生物多样性,29(6):825-842.
[3]Albertos P,Wlk T,Griffiths J,等,2022.Brassinosteroid-regulatedbHLH transcription factor CESTA induces the gibberellin 2-oxidase GA2ox7[J].Plant Physiology,188:2012-2025.
[4]Li G-H,Chen H-C,Liu J-L,等,2019.A high-density genetic mapdeveloped by specific-locus amplified fragment(SLAF)sequencing andidentification of a locus controlling anthocyanin pigmentation in stalk ofZicaitai(Brassica rapa L.ssp.chinensis var.purpurea)[J].BMC Genomics,20:343.
[5]Michaels SD,Amasino RM,2001.Loss of FLOWERING LOCUS C ActivityEliminates the Late-Flowering Phenotype of FRIGIDA and Autonomous PathwayMutations but Not Responsiveness to Vernalization[J].The Plant Cell,13:935-941.
[6]Shin K,Lee I,Kim E,等,2019.PACLOBUTRAZOL-RESISTANCE Gene FamilyRegulates Floral Organ Growth with Unequal Genetic Redundancy in Arabidopsisthaliana[J].International Journal of Molecular Sciences,20:869.
[7]Wang H,Zhu Y,Fujioka S,等,2010.Regulation of ArabidopsisBrassinosteroid Signaling by Atypical Basic Helix-Loop-Helix Proteins[J].ThePlant Cell,21:3781-3791.
Claims (10)
1.调控植物花期的RcILI4基因,其特征在于,其编码月季非DNA结合型bHLH转录因子,RcILI4基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因:
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.含有权利要求1所述基因的生物材料,其特征在于,所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料的以下任一应用:
(1)用于调控植物花期;
(2)用于植物育种;
(3)用于制备转基因植物。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,(2)中育种目的为调控植物花期。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述调控植物花期包括:使植物抽薹提前,开花提前。
6.根据权利要求3-5任一项所述的应用,其特征在于,所述植物包括拟南芥、月季。
7.一种促进植物抽薹和开花的方法,其特征在于,所述方法包括:利用基因工程手段,在植物中过表达权利要求1所述基因;
所述植物包括拟南芥、月季。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述过表达的方式选自以下1)~5),或任选的组合:
1)通过导入具有所述基因的质粒;
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数;
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列;
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接;
5)通过导入增强子。
9.按照权利要求7或8所述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410219381.6A CN118064449B (zh) | 2024-02-28 | 调控植物花期的RcILI4基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410219381.6A CN118064449B (zh) | 2024-02-28 | 调控植物花期的RcILI4基因及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118064449A true CN118064449A (zh) | 2024-05-24 |
CN118064449B CN118064449B (zh) | 2024-09-27 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116837000A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-10-03 | 云南农业大学 | 一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080235827A1 (en) * | 2006-03-07 | 2008-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and Methods for Increasing Plant Tolerance to High Population Density |
CN103288944A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-11 | 清华大学 | bHLH17蛋白及其编码基因和其应用 |
CN113444736A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-09-28 | 中国农业科学院棉花研究所 | GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用 |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080235827A1 (en) * | 2006-03-07 | 2008-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and Methods for Increasing Plant Tolerance to High Population Density |
CN103288944A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-11 | 清华大学 | bHLH17蛋白及其编码基因和其应用 |
CN113444736A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-09-28 | 中国农业科学院棉花研究所 | GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
"putative transcription factor bHLH family [Rosa chinensis] GenBank: PRQ16137.1", 《 GENBANK》, 13 March 2018 (2018-03-13) * |
孙琼琳 等: "一个水稻bHLH转录因子的反响遗传学分析", 《天津师范大学学报(自然科学版)》, vol. 35, no. 2, 30 April 2015 (2015-04-30), pages 67 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116837000A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-10-03 | 云南农业大学 | 一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用 |
CN116837000B (zh) * | 2023-07-27 | 2024-09-10 | 云南农业大学 | 一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104450744B (zh) | 一种水稻SBP‑box转录因子基因及其应用 | |
CN113337520B (zh) | 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用 | |
CN112876551B (zh) | 一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89及其应用 | |
CN110643618A (zh) | 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用 | |
Li et al. | Function of BrSOC1b gene in flowering regulation of Chinese cabbage and its protein interaction | |
CN110684757A (zh) | 控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用 | |
CN115927370B (zh) | 海刀豆CrHsf2基因及其应用 | |
CN114875042B (zh) | OsTPR075的突变体在水稻抽穗期调控过程中的应用 | |
CN114085854B (zh) | 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用 | |
JPH07503850A (ja) | 組み替えジベレリンdnaおよびその用途 | |
CN118064449A (zh) | 调控植物花期的RcILI4基因及其应用 | |
CN110964728B (zh) | 控制油菜株高的基因ed1及其应用 | |
CN108191980B (zh) | C4水稻底盘受体材料的设计、创制与应用 | |
CN103614385B (zh) | 一个基因kt525在提高植物耐逆性上的应用 | |
CN108728447B (zh) | 一种花生抗逆相关基因及其应用 | |
CN115947808B (zh) | 通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用 | |
CN117305266B (zh) | 一种与水稻抗逆相关的基因OsBDG1及其编码蛋白的应用 | |
CN112745376A (zh) | 一种转录抑制因子lip1调控水稻产量的功能及应用 | |
CN114736919B (zh) | 通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用 | |
CN104560906B (zh) | 纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like‑1及其应用 | |
CN114672493B (zh) | 一种用ZmPHT1;7蛋白或其编码基因培育抗旱植物的方法 | |
CN112725353B (zh) | 重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用 | |
CN112920263B (zh) | 表观遗传修饰OsMOF蛋白在改良水稻产量性状中的应用 | |
CN112251438B (zh) | 植物高温诱导基因at3g56970的启动子在改良植物抗逆性中的应用 | |
CN116262921A (zh) | 一种控制稻类籽粒长度和产量的基因hhc4及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |