CN118064449A - 调控植物花期的RcILI4基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。RcILI4基因编码一种促进植株提早开花的非DNA结合型bHLH转录因子。通过构建RcILI4基因的重组过表达载体并转化拟南芥植株，可使拟南芥植株提前开花，达到调控植株花期、创制转基因新植株等目的。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。
背景技术
开花期是植物从营养生长向生殖生长的过渡阶段，在植物的生命周期中有举足轻重的作用(邓琴霖等,2023)。植物的开花时间受外部环境和自身遗传机制共同调控，对于模式植物拟南芥的研究发现，植物成花过程受到复杂的基因网络联合调控，主要包括6条通路，分别是光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主开花途径、年龄途径和温度途径(杨小凤等,2021)。近些年对开花时间的研究也主要围绕上述6条通路展开，如FLC(FLOWERINGLOCUS C)和FRI(FRIGIDA)被认为是春化途径中开花的抑制因子(Michaels and Amasino,2001)。
基因调控是植物生长发育过程中必不可少的。bHLH转录因子家族是植物中第二大转录因子家族，具有重要的生物学功能，根据bHLH蛋白碱性区域的性质，可将其分为两类：DNA结合型和非DNA结合型(Wang等,2010)。关于DNA结合型bHLH转录因子的研究较多，目前已证实其能参与植物的营养生长和生殖生长过程，响应冷胁迫信号，调控花青素的生物合成过程(Li等,2019；Albertos等,2022)。目前为止，针对非DNA结合bHLH转录因子的功能研究主要在拟南芥和水稻中进行。拟南芥多效唑抗性基因(PACLOBUTRAZOL-RESISTANCE,PRE)编码一组非DNA结合bHLH蛋白，由6个成员组成，该基因参与调控拟南芥花器官的生长，部分成员发生突变可导致拟南芥植株矮化和花发育缺陷(Shin等,2019)。非DNA结合bHLH转录因子在植物生殖生长过程中可能发挥了关键作用，但关于月季中该转录因子功能的研究目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控植物花期的RcILI4基因及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种调控植物花期的RcILI4基因，其编码月季非DNA结合型bHLH转录因子，RcILI4基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
进一步地，RcILI4基因为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％ SDS的0.1×SSPE或含0.1％ SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供含有所述RcILI4基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。
第三方面，本发明提供所述RcILI4基因或含有所述RcILI4基因的生物材料的以下任一应用：
(1)用于调控植物花期；
(2)用于植物育种；
(3)用于制备转基因植物。
进一步地，(2)中育种目的为调控植物花期。
本发明中，所述调控植物花期包括：使植物抽薹提前，开花提前。
本发明中，所述植物包括但不限于拟南芥、月季。
第四方面，本发明提供一种促进植物抽薹和开花的方法，所述方法包括：利用基因工程手段，在植物中过表达所述RcILI4基因。
进一步地，所述过表达的方式可选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition)。
第五方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
进一步地，育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明对月季中非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4进行研究，首次揭示了RcILI4基因的功能，该基因转化拟南芥植株后可使其提前开花。本发明通过构建pH7WG2D-RcILI4-eGFP重组过表达载体，利用含重组载体的农杆菌悬浮液侵染拟南芥花序，经过抗性筛选、PCR检测和GFP荧光检测获得阳性转基因拟南芥，通过与野生型拟南芥比较，发现转基因拟南芥比野生型植株更早开花。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中月季非DNA结合bHLH转录因子RcILI4全长CDS序列克隆的琼脂糖凝胶电泳图。其中，目的片段为276bp，M代表DNA maker II，1-4代表重复试验。
图2为本发明较佳实施例中转pH7WG2D-RcILI4-eGFP的13株T3代拟南芥植株PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，PCR检测使用潮霉素抗性基因作为目的基因，目的片段为598bp，M代表DNA maker II，1-13代表13株拟南芥的检测结果。
图3为本发明较佳实施例中转pH7WG2D-RcILI4-eGFP的T3代拟南芥植株和野生型拟南芥植株的eGFP荧光鉴定表型图。其中，Col代表野生型拟南芥，OE代表转基因拟南芥。
图4为本发明较佳实施例中拟南芥pH7WG2D-RcILI4-eGFP的T3代拟南芥植株和野生型拟南芥植株的表型观察图。其中，a为4周苗龄的拟南芥植株，b为5周苗龄的拟南芥植株，c为7周苗龄的拟南芥植株。Col代表野生型拟南芥，OE代表转基因拟南芥。
具体实施方式
本发明旨在提供一种异源转化拟南芥使其提前开花的月季非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4。构建重组表达载体pH7WG2D-RcILI4-eGFP并转化拟南芥，获得转基因植株，对转基因植株进行表型观察。研究表明非DNA结合bHLH转录因子RcILI4能使拟南芥植株花期提前。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种促进植株提早开花的非DNA结合bHLH转录因子，将其命名为RcILI4，来自于月季‘月月粉’，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种包含SEQ ID NO:1所示序列的用于外源基因序列遗传转化的重组表达载体，命名为pH7WG2D-RcILI4-eGFP。
本发明进一步将上述重组表达载体利用农杆菌介导法转化拟南芥，获得转基因拟南芥植株，验证该非DNA结合bHLH转录因子能促进植株提早开花。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1非DNA结合型bHLH转录因子RcILI4的克隆
1、月季RNA提取与第一链cDNA合成
使用SV Total RNA提取试剂盒(Promega，威斯康辛州，美国)参照说明书要求提取月季‘月月粉’叶片的RNA，保存于-80℃冰箱备用。使用PrimeScriptTM RT reagent试剂盒(TaKaRa,滋贺县,日本)合成第一链cDNA。
2、基因克隆
以月季cDNA为模板，根据月季基因组数据库(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)提供的RchiOBHmChr7g0180941基因序列，利用DNAMAN软件设计基因全长克隆引物，引物见表1。采用KOD plus高保真酶(KOD-201，TOYOBO，大阪，日本)扩增目的片段。反应体系见表2。PCR反应程序如下：94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，共设置32个循环；72℃延伸2min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，天根生化科技有限公司)根据说明书要求，进行回收纯化(图1)。将回收的片段与克隆载体-Blunt(CB501-01，北京全式金生物有限公司)根据说明书方法进行连接试验，取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，在氨苄霉素培养皿筛选获得阳性菌斑，利用质粒提取试剂盒(D6942，OMEGA，美国)按照说明书要求，提取阳性重组质粒，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，获得基因CDS序列，将该基因命名为RcILI4，将重组质粒命名为pEASY-RcILI4。
3、RcILI4蛋白结构域分析
根据测序获得的RcILI4的CDS，翻译成蛋白序列，进一步分析RcILI4的蛋白结构域。进入NCBI的blastp网页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，输入RcILI4蛋白质序列作为查询序列。点击BLAST按钮，在搜索结果页面，点击Conserved Domains选项卡，查看RcILI4的保守结构域，以及与之匹配的结构域数据库和注释信息。RcILI4具有一个HLH结构域(PSSM-ID:23895)，这是bHLH家族的核心结构域。此外，RcILI4还与两个非特定匹配的结构域模型有一定的相似性，分别是bHLH_AtPRE_like
(PSSM-ID:33167)和PLN03217(PSSM-ID:33211)。可以确定RcILI4属于非DNA结合bHLH转录因子。
表1克隆引物
表2基因克隆体系
| 组分 | 含量 |
| 10×KOD plus buffer | 5μL |
| MgSO4(25mM) | 3μL |
| dNTPs(2mM) | 5μL |
| RcILI4-U | 1.5μL |
| RcILI4-L | 1.5μL |
| cDNA | 0.3μL |
| KOD plus | 1μL |
| ddH2O | 32.7μL |
| 共计 | 50μL |
RcILI4基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，RcILI4蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
实施例2重组表达载体的构建
本实施例采用pH7WG2D作为目的载体(购自BioVector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心，http://www.googbio.com/product/303794.html)，按照说明书方法，利用Gateway重组反应构建RcILI4过表达载体。以重组质粒pEASY-RcILI4为模板，使用引物gateway-RcILI4-U和gateway-RcILI4-L(表1)扩增片段。将克隆的基因片段与pDONA221中间载体连接，随后交换到pH7WG2D载体上，最终获得带绿色荧光标签的pH7WG2D-RcILI4-eGFP重组过表达载体。
实施例3拟南芥的稳定遗传转化
1、拟南芥植株养护
将野生型拟南芥播种于配制好的基质中(营养土：蛭石＝1:1，体积比)，在黑暗处理2d后转入条件为16h光照/8h黑暗的培养箱中管理，设置温度23℃，湿度70％左右。
2、重组农杆菌菌液获得
使用冻融法将重组表达载体pH7WG2D-RcILI4-eGFP转入根瘤农杆菌感受态(GV3101)，随后涂布于含50μg/mL利福平(Rif)和50μg/mL壮观霉素(SPR)的固体LB培养基上筛选阳性菌斑。将阳性菌斑接种到含相同抗生素的液体LB培养基中，28℃200rpm振荡培养，得到OD600＝0.6-0.8的重组农杆菌菌液。
3、转基因拟南芥获得
将拟南芥花序浸入农杆菌重悬菌液中，避光处理3-5min，重复此操作一次。继续培养直至种子成熟。种子收获后将其命名为T0代。将T0代种子接种于含有50μg/mL SPR的MS培养基上，筛选阳性转基因幼苗，待其成熟后收获种子，并将种子命名为T1代。重复上述操作，直到获得纯合的T3代遗传转化拟南芥植株。
4、阳性转基因植株筛选
本实施例利用以下两种方法进行阳性植株鉴定：
方法I：播种阳性拟南芥种子，待植株长出绿色莲座叶后，提取植株叶片DNA，使用HPT-U和HPT-L引物进行鉴定，目的条带为598bp，则为阳性植株(图2)。
方法II：待植株长出莲座叶后，使用手持式LUYOR-3415激发光源进行GFP荧光检测。
图3结果显示，与野生型植株(左，Col)相比较，转基因植株(右，OE)出现绿色荧光，为阳性植株。
实施例4转基因拟南芥表型观察
将实施例3中经过鉴定获得的阳性转RcILI4基因拟南芥和野生型拟南芥播种于同一培养箱中，拍照记录生长过程。随机各抽取10株，统计抽薹与开花时间。
图4结果显示，转RcILI4的拟南芥植株在第3周时已开始抽薹，而野生型未抽薹；第4周时野生型拟南芥开始抽薹，RcILI4转基因植株已经开花，部分角果开始发育；第7周时RcILI4转基因植株结束开花。表3统计数据计算可知，转RcILI4的拟南芥植株抽薹天数为21.1±2.38，开花天数为31.5±2.22；相同条件下的野生型拟南芥抽薹天数为30.4±1.17，开花天数为42.3±4.97。RcILI4的异源表达，可使拟南芥抽薹提前9天左右，开花提前11天左右。
表3拟南芥开花统计数据
注：Col代表野生型拟南芥，OE代表转基因拟南芥。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献:
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Claims (10)
1.调控植物花期的RcILI4基因，其特征在于，其编码月季非DNA结合型bHLH转录因子，RcILI4基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.含有权利要求1所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料的以下任一应用：
(1)用于调控植物花期；
(2)用于植物育种；
(3)用于制备转基因植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，(2)中育种目的为调控植物花期。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调控植物花期包括：使植物抽薹提前，开花提前。
6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥、月季。
7.一种促进植物抽薹和开花的方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，在植物中过表达权利要求1所述基因；
所述植物包括拟南芥、月季。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
9.按照权利要求7或8所述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
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