CN118048312A

CN118048312A - 靶向cd19和/或cd20的car-nk细胞及其制备与应用

Info

Publication number: CN118048312A
Application number: CN202410204234.1A
Authority: CN
Inventors: 赵星; 何志旭; 张彩丽; 杨娜; 林小金; 范玉婷; 张晶
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-05-17

Abstract

本发明提供了靶向CD19和/或CD20的CAR‑NK细胞及其制备与应用。具体地，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)‑NK细胞，其含有靶向第一靶蛋白CD19的第一CAR，任选地还可含有靶向第二靶蛋白CD20的第二CAR，还提供了相应的编码核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物等，及其电穿孔制备方法与应用。此外，还提供了上述CAR‑NK细胞与利妥昔单抗的协同施用。通过非病毒载体依赖的转染方式制备的以上CAR‑NK细胞为CD19阳性肿瘤、CD20阳性肿瘤提供了一种更安全、更高效的预防和/或治疗方法。

Description

靶向CD19和/或CD20的CAR-NK细胞及其制备与应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫领域，更具体涉及一种靶向CD19和/或CD20的CAR-NK细胞及其制备与应用。

背景技术

CD19和CD20是B细胞表面标志物，高表达于成熟的正常B细胞以及恶性B细胞表面，是治疗B细胞源性恶性血液肿瘤疾病的热门靶点，以上述标志物为靶点的产品如单克隆抗体、双抗、ADC和CAR-T细胞的研发和临床试验不断涌现。

CAR-T细胞疗法目前已在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了巨大的成功，但CAR-T细胞引发的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)是CAR-T细胞疗法常见且严重的不良反应。与此同时CAR-T细胞的生产和应用也存在一定的局限性，需要耗费大量的人力、物力和时间，因此CAR-T细胞治疗的价格也居高不下。此外，部分患者可能由于免疫抑制或放化疗影响，导致自体T细胞耗竭、衰老并发生功能缺陷，最终将影响CAR-T细胞质量及功能，从而严重影响临床疗效。

对此，本领域需要开发相比CAR-T细胞更具优势的CAR-NK细胞疗法。

此外，目前临床上大多使用逆转录病毒或慢病毒等病毒载体来稳定引入CAR。例如，通过病毒载体转导或质粒载体转染，将CAR基因转入T细胞中从而获得CAR-T细胞，当大量扩增的CAR-T细胞回输到患者体内后，CAR能特异性地识别肿瘤抗原，活化后的T细胞可以杀伤肿瘤细胞，从而达到精准治疗肿瘤目的。但传统CAR基因递送的方法是用病毒载体递送以随机整合的形式插入到基因组中，存在潜在的安全风险。

因此，本领域迫切需要开发靶向CD19和/或CD20的CAR-NK细胞疗法，以及通过非病毒载体依赖的转染方式制备CAR-NK细胞的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种靶向CD19和/或CD20的CAR-NK细胞及其制备与应用。

本发明的另一目的在于提供一种CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗(Rituximab)的体内外协同抗肿瘤应用。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞，所述CAR-NK细胞含有以下元件：

(a)第一CAR，所述第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白CD19的第一结合元件；

(b)任选地第二CAR，所述第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白CD20的第二结合元件。

在另一优选例中，所述CAR-NK细胞含有第一CAR。

在另一优选例中，所述CAR-NK细胞含有第一CAR和第二CAR。

在另一优选例中，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：

L-EB-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

EB为胞外结合域；

H为铰链区；

TM为跨膜区；

C为共刺激信号结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述L是本领域常用的免疫细胞表面分子的信号肽，优选为选自下组蛋白的信号肽：CSF2RB、CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137、NKG2D，或其突变/修饰体，或其组合。

在另一优选例中，所述L为CSF2RB信号肽，其具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述EB为靶向所述靶蛋白的抗体的抗原结合结构域ScFv，所述的ScFv的结构如下式A或式B所示：

VH-VL(A)

VL-VH(B)

式中，VH为抗体重链可变区；

VL为抗体轻链可变区；

“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，当所述靶蛋白为CD19时，所述VH具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述VL具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

或者，所述VH与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，所述VL与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，当所述靶蛋白为CD19时，所述VH具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述VL具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，当所述靶蛋白为CD20时，所述VH具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述VL具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

或者，所述VH与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，所述VL与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，当所述靶蛋白为CD20时，所述VH具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述VL具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述连接肽具有如SEQ ID NO:6或7所示的氨基酸序列；优选地，具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述H是本领域常用的免疫细胞表面分子的铰链区，优选为为选自下组蛋白的铰链区：CD8(包括CD8α、CD8β)、CD28、CD137、IgG，或其组合。

在另一优选例中，所述H为CD8α铰链区，具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述TM是本领域常用的免疫细胞表面分子的跨膜区，优选为选自下组蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8(包括CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233，或其突变/修饰体，或其组合。

在另一优选例中，所述TM为CD8α跨膜区，具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述C是本领域常用的免疫细胞表面分子的共刺激信号结构域，优选为选自下组蛋白的共刺激信号结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD-1、Dap10、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、2B4、TLR，或其突变/修饰体，或其组合。

在另一优选例中，所述C为4-1BB共刺激信号结构域，具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述CD3ζ具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述第一CAR具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；或者，所述第一CAR的核苷酸序列与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述第一CAR具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第二CAR具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；或者，所述第二CAR的核苷酸序列与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述第二CAR具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞中的元件(a)和/或(b)。

在另一优选例中，所述核酸分子为DNA、RNA，或其组合。

在另一优选例中，所述核酸分子为mRNA。

在另一优选例中，所述核酸分子具有选自下组的一种或多种核苷酸序列：

(a)如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的核苷酸序列；

(d)与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体，或其组合。

在另一优选例中，所述载体为pT7ggAGA载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有如本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为NK细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(a)如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或其组合；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。

在另一优选例中，所述药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或其组合；和0.01～99.99％的药学上可接受的载体；所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

在另一优选例中，所述药物组合物中所述CAR-NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/mL，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/mL。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他用于预防和/或治疗肿瘤(优选地CD19阳性肿瘤和/或CD20阳性肿瘤)的药物或活性成分。

在本发明的第六方面，提供了一种协同药物组合物，所述协同药物组合物含有：

(a)如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或其组合；

(b)利妥昔单抗；和

(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述协同药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。

在另一优选例中，所述利妥昔单抗的Fab段与肿瘤细胞的抗原表位结合，所述利妥昔单抗的Fc段与所述CAR-NK细胞的Fc受体(FcR)结合。

在另一优选例中，所述CAR-NK细胞为抗CD19 CAR-NK细胞。

在另一优选例中，所述CAR-NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/mL，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/mL，更佳地1×10⁷个细胞/mL。

在另一优选例中，所述利妥昔单抗的剂量为1-10000μg，较佳地10-1000μg，更佳地100-500μg，最佳地200μg。

在本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞、如本发明第五方面所述的药物组合物，或如本发明第六方面所述的协同药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤包括CD19阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括CD20阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括CD19阳性和CD20阳性的任意肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL))、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病、慢性粒细胞白血病(CML)、非B非T淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤等)、Burkitt淋巴瘤、单发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤，或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤是对单一CD19或CD20靶向疗法不敏感或发展出抗药性的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤是传统化疗或靶向疗法失败(低效或无效)的肿瘤。

在本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞、如本发明第五方面所述的药物组合物，或如本发明第六方面所述的协同药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病包括CD19阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述疾病包括CD20阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述疾病包括CD19阳性和CD20阳性的任意肿瘤。

在另一优选例中，所述对象是对单一CD19或CD20靶向疗法不敏感或发展出抗药性的对象。

在另一优选例中，所述对象是传统化疗或靶向疗法失败(低效或无效)的对象。

在本发明的第九方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的CAR-NK细胞的方法，所述方法包括步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体导入免疫细胞内，从而获得所述的CAR-免疫细胞。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：通过电穿孔导入如本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述核酸分子为mRNA。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)对如本发明第三方面所述的载体进行酶切，以制备线性化DNA模板；

(b)转录所述线性化DNA模板，从而获得CAR-mRNA。

(c)任选地对所述CAR-mRNA进行转录后加帽；

(d)任选地对步骤(b)或步骤(c)中所获得的CAR-mRNA进行纯化和/或鉴定。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：使用1～6μg(较佳地，1～4μg；更佳地，2～3μg)CAR-mRNA电穿孔1～5×10⁶个NK细胞。

在另一优选例中，所述NK细胞为脐带血来源的NK细胞。

在另一优选例中，进行所述电穿孔时，电转仪的设置参数为420～450V，20～50ms。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CD19-CAR和CD20-CAR的结构示意图。

图2显示了靶向CD19及CD20的第二代CAR的构建及其鉴定。A.编码CD19和CD20 CAR的mRNA体外转录示意图；B.CD19及CD20 CAR-mRNA的结构示意图；C.CAR-mRNA的变性琼脂糖凝胶电泳。

图3显示了不同浓度CAR-mRNA经电穿孔制备CAR-NK细胞的CAR表达水平。

图4显示了流式细胞术检测CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞或CD19-CD20CAR-NK细胞上CAR的表达。A.流式细胞术检测各CAR-NK细胞上CAR表达；B.CD19 CAR-NK细胞表面CD19 CAR的持续表达时间；C.CD19-CD20 CAR-NK细胞表面CD19-CD20 CAR共表达持续时间。

图5显示了CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞或CD19-CD20 CAR-NK细胞对急性淋巴细胞白血病细胞的特异性杀伤作用。A.CCK-8法检测CAR-NK及NK细胞对BALL-1、REH以及Jurkat的杀伤作用(n＝3)，*p≤0.05,**p≤0.01,ns.no significance；B.流式细胞术检测CAR-NK及NK细胞对BALL-1、REH以及Jurkat的杀伤作用。

图6显示了在靶细胞存在下CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞或CD19-CD20CAR-NK细胞的活化、细胞毒物质及细胞因子的释放水平。A.ELISA法检测CAR-NK细胞与BALL-1细胞共培养后细胞上清中的perforin、IFN-γ和IL-15分泌水平；B-C.流式细胞术检测CAR-NK细胞作用于BALL-1细胞后CD69、CD107a和IFN-γ的表达。

图7显示了无肿瘤细胞刺激时CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞或CD19-CD20CAR-NK细胞的活化、细胞毒物质及细胞因子的释放水平。a.ELISA法检测CAR-NK细胞与NK细胞培养上清中的perforin、IFN-γ和IL-15分泌水平；b-c.流式细胞术检测CAR-NK细胞及NK细胞CD69、CD107a和IFN-γ的表达。

图8显示了在PBS组、NK细胞组、CD19 CAR-NK细胞组、CD20 CAR-NK细胞组、CD19-CD20 CAR-NK细胞组中，各组NTG急性淋巴细胞白血病小鼠体内抗肿瘤作用的实验验证结果。A.荧光素酶表达的各组白血病NTG小鼠的活体成像图；B.各组白血病NTG小鼠的股骨内肿瘤发光结果。

图9显示了NK细胞/CD19 CAR-NK细胞对CD19⁺肿瘤细胞的特异性杀伤作用。A.流式细胞术检测肿瘤细胞株表面CD19和CD20的表达；B.在不同效靶比下NK/CD19 CAR-NK细胞对Raji、Daudi、Reh和K562细胞株的杀伤作用；C.流式细胞术检测NK/CD19 CAR-NK细胞作用于Raji细胞后的CD69、CD107a和IFN-γ的表达；D.ELISA检测NK/CD19 CAR-NK细胞与Raji共培养后细胞培养上清中perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平，其中对照组为未接触肿瘤细胞时的CD19 CAR-NK细胞。

图10显示了NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗的体外抗肿瘤活性。A.流式细胞术检测NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗对Daudi和Reh细胞的杀伤作用；B.流式细胞术检测NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗后细胞CD69和CD107a的表达；C.ELISA检测NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗与Raji细胞共培养后细胞上清中perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。

图11显示了PBS组、CD19 CAR-NK组、利妥昔单抗组、CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗组分别治疗Raji荷瘤小鼠。A.PBS组、CD19 CAR-NK组、利妥昔单抗组、CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗组分别治疗Raji荷瘤小鼠的示意图；B.不同治疗组荷瘤鼠的肿瘤生长曲线，**p<0.01；C.小动物活体荧光成像系统观察肿瘤生物发光成像情况；D.不同治疗组荷瘤鼠的生存曲线图，***p<0.001。

图12显示了肿瘤组织中CD56和Ki67的免疫组化检测及安全性评价。A.各组小鼠肿瘤组织中Ki67和CD56的免疫组化染色；B-C.肿瘤组织中Ki67和CD56+细胞浸润的定量分析，**p<0.01；D.各组小鼠体重；E.H&E染色观察各组小鼠的心脏、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏的组织形态学变化。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一种靶向CD19和/或CD20的CAR-NK细胞。具体地，本发明高效地通过将编码CAR的mRNA电穿孔NK细胞来制备上述CAR-NK细胞，可修饰90％以上的NK细胞，并且制备的NK细胞存活率高达90％。在本发明中，mRNA电穿孔的转染率更高，编辑效率更强，且不会整合到基因组中，这种非病毒载体依赖的转染方式安全性更高，更适合于编辑NK细胞，获得“现货型”安全CAR-NK细胞产品。此外，本发明还意外地发现抗CD19 CAR-NK细胞能够与利妥昔单抗发挥协同抑制肿瘤的作用。以上电穿孔方式制备的CAR-NK细胞及其与利妥昔单抗的联用，为CD19阳性肿瘤、CD20阳性肿瘤，尤其是单一CD19或CD20靶向疗法不敏感或发展出抗药性的肿瘤，或传统化疗或靶向疗法失败(低效或无效)的肿瘤，提供了一种更安全、更高效、更低价且优质的预防和/或治疗方法。在此基础上，完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、瘤内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)-T细胞是一种新型细胞疗法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效。CAR通常由四个部分构成，分别为抗原结合区(scFv)、胞外铰链区(hinge)、跨膜区(transmembrane,TM)和胞内信号区(signaling chain)。scFv由抗体的重链可变区和轻链可变区及连接区构成，可以靶向肿瘤表面特定抗原分子。目前临床上大多使用逆转录病毒或慢病毒等病毒载体来稳定引入CAR。但与此同时，通过非病毒载体依赖的转染方式也在逐渐兴起，为CAR-T细胞制备提供了更多选择。通过病毒载体转导或质粒载体转染，将CAR基因转入T细胞中从而获得CAR-T细胞，当大量扩增的CAR-T细胞回输到患者体内后，CAR能特异性地识别肿瘤抗原，活化后的T细胞可以杀伤肿瘤细胞，从而达到精准治疗肿瘤目的。

CAR-T细胞疗法作为一种“活的细胞药物”清除肿瘤，可以避免主要组织相容性复合体(MHC)的限制性，目前已在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了巨大的成功，部分难治或复发性血液系统肿瘤患者获得了相对较高的客观缓解率，但CAR-T细胞引发的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)是CAR-T细胞疗法常见且严重的不良反应。

与此同时CAR-T细胞的生产和应用也存在一定的局限性，目前获批上市的CAR-T细胞产品均采用自体T细胞来制备，工艺繁琐且耗时长。部分患者可能由于免疫抑制或放化疗影响，导致自体T细胞耗竭、衰老并发生功能缺陷，最终将影响CAR-T细胞质量及功能，从而严重影响临床疗效。此外，患者的病情可能在等待CAR-T细胞生产的过程中进一步恶化甚至死亡，且每个患者的CAR-T药物都是一个单独批次生产的，需要耗费大量的人力、物力和时间，因此CAR-T细胞治疗的价格也居高不下。

嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞

自然杀伤(natural killer,NK)细胞是机体重要的免疫细胞，是人体抗肿瘤、抗病原体感染的第一道防线。由于NK细胞在机体非特异性抗肿瘤应答中发挥着关键作用，因此已有大量的基础及临床研究将NK细胞应用于造血系统恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等)和实体瘤(如黑色素瘤、卵巢癌和肺癌等)的治疗。CAR-NK细胞的研发及制备思路与CAR-T细胞类似，是通过基因编辑使得NK细胞表达CAR从而制备CAR-NK细胞，之后向肿瘤患者回输具有特异性抗肿瘤能力的CAR-NK细胞发挥抗肿瘤作用，从而达到治疗目的。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有如下优势：(1)更高的安全性：在近期的数项临床试验中，CAR-NK细胞都显示出了良好的安全性。CAR-NK细胞引起的CRS和神经毒性均较CAR-T细胞小，其原因可能是二者分泌的细胞因子谱不同，激活的CAR-NK细胞通常产生IFN-γ和GM-CSF，而CAR-T细胞产生的IL-2、IL-6和IL-8等细胞因子与CRS和严重的神经毒性高度相关；(2)更多样的肿瘤杀伤机制：CAR-NK细胞除了以CAR依赖的方式杀死肿瘤细胞外，仍然具有NK细胞本身的识别和抗肿瘤能力，可通过非CAR依赖的机制被激活，还可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)进一步清除肿瘤细胞。因此，通过CAR依赖和非依赖的机制，CAR-NK细胞能有效清除高度异质性的肿瘤细胞；(3)有望实现“现货型”CAR-NK细胞产品：CAR-T细胞由患者自身的T细胞制备而来，细胞功能常存在缺陷，且制备过程复杂费时，因而限制了很多晚期肿瘤患者的使用。而CAR-NK细胞可由多种来源细胞制备，如NK92细胞株、外周血单个核细胞(PBMC)、脐带血(UCB)和诱导的多能干细胞(iPSCs)等。因此，CAR-NK细胞有望成为一种“现货型”产品，从而为肿瘤患者提供低价优质的细胞治疗产品。

虽然CAR-NK细胞近些年来在治疗血液恶性肿瘤及实体肿瘤方面取得了令人瞩目的进步，但CAR-NK细胞仍面临着较大挑战以及优化空间。如CAR结构设计、CAR基因转导方式及转导效率等都是关键的影响因素。传统CAR基因递送的方法是用病毒载体递送以随机整合的形式插入到基因组中，存在潜在的安全风险。与病毒载体相比，mRNA转染效率高并被认为是最安全的基因转导方法。

CAR-NK细胞免疫治疗的一个关键阻碍是难以快速生产大量制备高活性的CAR-NK细胞。对此，本发明提供了一种CAR-NK细胞高效的非病毒制备方法，且制备的CAR-NK细胞存活率高、活性好，解决了病毒载体制备CAR-NK细胞转染效率低、存在安全性风险以及存活率低等难题。首先构建编码CAR核苷酸序列，所述抗CD19 CARs、抗CD20 CARs构建体包含：(a)抗CD19 CARs(FMC63 ScFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)，其包含抗原结合结构域-FMC63 ScFv，跨膜结构域CD8α和细胞内NK细胞信号传导结构域4-1BB-CD3ζ；(b)抗CD20CARs(Leu16 ScFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)，其包含抗原结合结构域LEU16 ScFv、跨膜结构域CD8α和细胞内NK细胞信号传导结构域4-1BB-CD3ζ；(c)优化序列；其中优化序列位于所述抗原结合域重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)之间的连接Linker。其次利用上述DNA模板体外高效转录及纯化mRNA，并进行mRNA电穿孔。通过理论和实验研究，优化了电穿孔过程中参数水平，显著改善了体外大规模高效制备CAR-NK细胞的存活率，进而提高了CAR转染效率、相关细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力，降低了CAR-NK细胞的制备成本。而mRNA电转可以快速地使CAR编码的基因瞬时表达，减少因载体残留带来的插入突变风险，具有免疫原性低，成本低，效率高等优点。制备得到的CAR-NK细胞具有强烈的肿瘤杀伤能力和IFNγ分泌能力，采用编码CAR(CD19 CAR、CD20 CARs)的mRNA转染后，其肿瘤杀伤能力和IFNγ分泌能力进一步增强。

CAR的设计

CAR的抗原结合域传统上是由可变重链(VH)、可变轻链(VL)及两者之间的柔性连接物(Linker)形成的单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)，设计不同长度的Linker，使VH和VL之间的灵活度增加，进而影响结合亲和力短Linker的CAR更容易二聚化，

有研究表明，scFvs的VH和VL两条链之间的相互连接方式会影响CAR分子对其目标表位的亲和力和特异性。因此，不同的Linker分子已被成功地用于设计scFvs。目前，针对CAR分子，使用的大多数Linker是基于甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)重复多肽的一些变异体。例如，(Gly₄Ser)₃，Linker由三次重复Gly₄-Ser组成。使用这些残基的目的是赋予Linker灵活性，将对Linker所连接的蛋白质结构域折叠的干扰降到最低。此外Linker不能太短，否则容易形成聚集体。非抗原依赖性的CAR聚集，会诱导tonic信号，介导CAR-T的耗竭及失能。所以一般最佳Llinker长度是15-20个氨基酸，通常会用(Gly₄Ser)₃或(Gly₄Ser)₄。本发明采用的CAR分子结构为第二代结构，优化了FMC63 scFv(anti-CD19)及lEU16 scFv(anti-CD20)的Linker分子，通过铰链区分别连接于CD8α跨膜域，4-1BB共刺激结构域及CD3ζ信号转导结构域。

CAR编码基因导入NK细胞的方式

原代NK细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致NK细胞对多种载体系统的摄取率低，NK细胞的转基因表达量低。目前，对原代NK细胞进行CAR修饰一般通过慢病毒/逆转录病毒感染或者采用电转CAR编码基因的mRNA的方式来实现。慢病毒/逆转录病毒转染可以制备CAR基因稳定表达的NK细胞，但是原代NK细胞感染难度极大。此外，由于慢病毒和或逆转录病毒具有插入突变的潜力，从而存在安全风险；而且在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，大大增加了CAR-NK细胞在临床转化应用中的生产成本。

而通过电转CAR编码基因mRNA的方法构建CAR-NK细胞可减少因载体残留带来的插入突变风险，具有安全性好，成本低，效率高等优点。mRNA电转染是一种细胞质表达系统，即它不需要进入细胞核来介导其功能。该系统的特点主要包括：(1)具有转染静止或慢速增殖细胞的能力；(2)没有基因组整合，因此插入诱变的可能性非常低；(3)随时间推移逐渐减少的瞬时表达；(4)转导效率高，多在90％以上；(5)适用于各种类型的细胞；(6)一次可电转制备约10⁶-10⁸数量级细胞的弹性空间。最后，mRNA基因工程的相对容易性使得该系统在基因或细胞的临床治疗中具有极大吸引力。

mRNA电穿孔制备CAR-NK细胞的挑战体现在：(1)mRNA分子稳定低。对于该问题，可通过加帽技术、5’UTR和3’UTR的优化设计、Poly(A)尾的优化设计来增加mRNA的稳定性及翻译效率；(2)mRNA的瞬时表达。在mRNA电穿孔后几个小时就可以观察到CAR的表达，通常持续48～72小时。而通过mRNA电穿孔来制备CAR-NK细胞上CAR的短暂表达，对于CAR-NK细胞疗法却是有利的，临床研究表明，由于CARs分子与正常组织的交叉反应，某些CARs的组成型表达可导致严重的不良反应。因此，CARs的瞬时表达可以提高安全性，尤其是当某一CAR的组织交叉反应性未知时，该策略可以为新设计的CAR分子提供更快的调控途径。

基于以上的技术缺陷，本发明的优势在于：使用电穿孔技术，本发明人成功地将抗CD19 CAR-mRNA/抗CD19-CD20 CARs-mRNA导入NK细胞分别构建了CD19 CAR-NK、CD20 CAR-NK以及CD19-CD20 CAR-NK细胞。在给予1μg CAR-mRNA电穿孔10⁶个NK细胞的实验条件下，即可检测到NK细胞表面CAR的表达。值得注意的是，NK细胞表面CAR的表达水平并非同mRNA的浓度呈正相关，NK细胞负载过量mRNA可引起NK细胞表面CAR表达的降低。为获得CAR的高表达及细胞的高活性，本发明人优化了mRNA电转量与细胞数的比例、电转时间、电转电压等条件，使得超过86％的NK细胞可同时表达两种CARs，CAR的表达在电转后24h到达峰值(87.6％±2.98％)，之后持续到96h仍可检测到高表达(56.5％±1.83％)。本发明人认为这与优化后更稳定的CAR结构有关。优化后的CAR在有效转染和持续表达之间取得了平衡。

CD19 CAR和/或CD20 CAR

在CAR-NK细胞进行临床治疗时，发现接受单靶点CAR-NK细胞疗法治疗的患者，会出现靶向抗原表达丢失导致抗原逃逸，肿瘤细胞继续生长而阴性肿瘤复发的情况。对此，一方面，CD19/CD20或CD19/CD22的双靶点CAR-T细胞用于治疗复发或难治性血液肿瘤患者的疗效已得到了验证；另一方面，NK细胞可与抗体联合，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)而增强抗肿瘤活性。因此，为进一步增强CAR-NK细胞的抗肿瘤活性，为解决单靶点CAR-NK细胞治疗应用中肿瘤免疫逃逸导致肿瘤阴性复发的问题，本发明的目的在于提供一种利用非病毒法高效制备的CAR-NK细胞，通过联合靶向治疗性抗体，或是制备双靶点CAR-NK细胞来改善单靶点CAR-NK细胞所面临的肿瘤免疫逃逸导致肿瘤阴性复发问题。相应的方案是：(1)将CD19 CAR-NK细胞，与靶向CD20的利妥昔单抗联合使用，通过利妥昔单抗的搭桥作用，使得CD19CAR-NK细胞能够固定在CD19表达降低或丢失的肿瘤细胞上，促进CD19CAR-NK细胞更好的识别及杀伤肿瘤；(2)制备CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞。大量的双靶点CAR-T细胞的研究已经表明，双靶点CAR-T细胞可以成为避免抗原逃逸阴性复发的有效手段，但CAR-T细胞可被多个靶抗原识别并高强度激活T细胞，容易引起CRS，并对低表达靶抗原的正常细胞过度杀伤。而CAR-NK细胞在激活后由于与CAR-T细胞的细胞因子谱的差异，目前未观察到CAR-NK细胞出现CRS等不良反应，因此双靶点CAR-NK细胞将具有更好的安全性和疗效。

构建CAR-T细胞或CAR-NK细胞时，CAR的选择也至关重要。CD19和CD20是B细胞表面标志物，高表达于成熟的正常B细胞以及恶性B细胞表面，是治疗B细胞源性恶性血液肿瘤疾病的热门靶点，以上述标志物为靶点的产品如单克隆抗体、双抗、ADC和CAR-T细胞的研发和临床试验不断涌现。

本发明及其他研究均发现，在CD19 CAR-T治疗过程中出现肿瘤细胞上CD19的表达下降或缺失，且肿瘤细胞表面CD19密度降低与疾病进展相关。为了防止CD19^-或CD19^lo疾病复发，本发明首先设计了靶向CD19和CD20两种抗原的CAR，并优化了CAR分子的scFv结构域，将编码抗CD19 CARs(FMC63ScFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)和抗CD20 CARs(Leu16 ScFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)的ScFv结构域VL与VH之间的Linker优化为(G₄S)₃。优化的Linker结构是基于甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)重复多肽((Gly₄Ser)₃或(Gly₄Ser)₄)，赋予Linker灵活性，将Linker所连接蛋白质结构域的空间折叠的干扰降到最低，从而可改善CAR的表达及CAR-NK细胞的功能。

基于此，构建了抗CD19-CAR和抗CD20-CAR的重组质粒载体，使用限制性内切酶对重组质粒载体进行切割得到线性化的DNA模板，并利用体外转录(In VitroTranscription,IVT)技术获得编码CD19 CARs和CD20 CARs的mRNA，在此基础上，并进一步对mRNA加帽、纯化以提高其转染表达效率。本发明提供了一种将编码CARs的mRNA电穿孔NK细胞来制备CAR-NK细胞的方法，通过优化mRNA与NK细胞的比例、电穿孔的时间、电压及转染后细胞的处理等，显著提升了转染率、转染后细胞的状态及CAR-NK细胞的功能。

随后分别通过两种方案来增强并评价制备的CAR-NK细胞的功能：1.将CD19 CAR-mRNA电转入NK细胞制备CD19 CAR-NK细胞，与利妥昔单抗联合使用；2.将编码CD19和CD20CARs-mRNA同时电转入NK细胞，制备CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞。通过两种不同的方案验证其对B细胞源性恶性血液肿瘤疾病的治疗效果。

本发明的主要优点

1.本发明高效地通过将编码CAR的mRNA电穿孔NK细胞制备CAR-NK细胞，可修饰90％以上的NK细胞，制备的NK细胞存活率高达90％。在本发明中，mRNA电穿孔的转染率更高，编辑效率更强，且不会整合到基因组中，安全性更高，更适合于编辑NK细胞，获得“现货型”安全CAR-NK细胞产品。

2.为增强CD19 CAR-NK细胞的疗效，本发明将CD19 CAR-NK细胞与利妥昔单抗(靶向CD20的单克隆抗体)联合用于治疗肿瘤(如B细胞恶性肿瘤)。这种联合治疗策略可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，通过互补或协同作用来增强CAR-NK细胞的特异性抗肿瘤效应，可避免CD19/CD20表达下调或丢失而出现的阴性复发。在联合利妥昔单抗后，CD19 CAR-NK对Raji及Daudi等肿瘤细胞株的特异性杀伤活性进一步增强。CD19 CAR-NK细胞和利妥昔单抗联合治疗可有效延缓Raji-luc荷瘤鼠的肿瘤生长，在接受联合治疗小鼠的肿瘤组织内可检测到CD19 CAR-NK细胞明显增加，联合治疗组小鼠生存期显著延长，未检测到对组织器官的毒副作用。因此，本发明有望为治疗肿瘤(如B细胞恶性肿瘤)提供一种安全、有效的联合治疗方案。

3.本发明还制备了CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞，进一步增强了CAR-NK细胞的靶向性，即使在治疗过程中CD19或CD20的表达低下或丢失，CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞也能否发挥有效的特异性杀伤作用，并且发现CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞较单靶点CAR-NK细胞的抗肿瘤活性、细胞因子分泌水平更强。

4.利用本发明制备的CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞和/或CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞，可规避由CAR-T细胞引发的细胞因子释放综合征(cytokine releasesyndrome,CRS)以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)等CAR-T细胞疗法常见且严重的不良反应。本发明的CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞和/或CD19-CD20双靶点CAR-NK细胞安全性更高。此外，上述CAR-NK细胞的制备难度、制备成本均低于CAR-T细胞，有望为肿瘤患者提供更低价且优质的细胞治疗产品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：CD19 CAR-NK细胞/CD19-CD20 CAR-NK细胞的制备和鉴定

1.分别构建编码第2代抗CD19 CARs及抗CD20 CARs的重组质粒载体：

以pT7ggAGA质粒载体为空白转录模板载体，序列顺序为T7启动子序列、5’α-globin UTR序列、3’α-globin UTR序列和poly(A)尾序列。之后将克隆信号肽序列、抗CD19或CD20的编码区、跨膜和胞质结构域序列至pT7ggAGA质粒载体的编码克隆位点XhoⅠ和NotⅠ之间，即分别得到抗CD19 CARs和抗CD20CARs的体外转录模板DNA载体。具体制备流程如下：

1)空白转录模板pT7ggAGA载体序列(SEQ ID NO:1)如下：

taatacgactcactatagggaaatatcttctggtccccacagactcagagagaacctcgagtttgcggccgcgctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagaattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgaagagctgcatcgcatcgatacggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgcccgggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacaccgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaggagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggtgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaggagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatagccttctatcgccttcttgacgagttcttctgacacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctc

完整编码蛋白的序列由将以下克隆信号肽的编码序列、抗CD19或CD20的编码区、跨膜和胞质结构域的编码序列按5’到3’的方向插入前述载体序列的ggtccccacagactcagagagaac(SEQ ID NO:2)和gctggagcctcggtggccatgcttcttgc(SEQ IDNO:3)之间得到。

2)如图1所示，完整蛋白编码序列为第2代抗CD19 CARs或抗CD20CARs，分别包括胞外结构域、跨膜结构和胞内结构域。

胞外结构域为抗原结合结构域，由“CSF2RB信号肽”、“抗原识别结构域”和“铰链区”组成。其中“CSF2RB信号肽”位于目标蛋白编码序列的5’端，蛋白序列为：MVLAQGLLSMALLALCWE(SEQ ID NO:4)。

CD19-CAR的“抗原识别结构域”源自FMC63的单链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGT KLEIT(SEQ ID NO:5)；

Linker序列为GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO:6)，还可优化为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:7)；

重链可变区的氨基酸序列为：

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLG VIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYY GGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:8)。

CD20-CAR的“抗原识别结构域”源自LEU-16的单链可变区，其轻链可变区的氨基酸序列为：

DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYA TSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGT KLEIK(SEQ ID NO:9)；

Linker序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:7)；

重链可变区的氨基酸序列为：

EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEW IGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARS NYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:10)。

有研究发现，通过灵活引入合适长度的Linker，可提升scFv和CAR结构的稳定性。这种稳定性在CAR-NK细胞治疗的效力和持久性方面尤为关键。在此基础上，本发明人优化了本发明中所采用CAR分子的scFv结构域，将FCM63ScFv及LEU16 ScFv结构域VL与VH之间的Linker优化为(G₄S)₃(也即SEQ ID NO:7)。优化的Linker结构是基于甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)重复多肽((Gly₄Ser)₃或(Gly₄Ser)₄)，赋予Linker灵活性，将Linker所连接蛋白质结构域的空间折叠的干扰降到最低，以此增强CAR-NK细胞的功能。

“铰链区”为CD8α铰链区，氨基酸序列为：

FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACD(SEQ ID NO:11)。

“跨膜区”为CD8α跨膜区，氨基酸序列为：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(SEQ ID NO:12)。

“胞内结构域”包括共刺激信号传导区和ζ链，源自4-1BB胞内区和CD3ζ活化序列，位于目标蛋白编码序列的3’端，4-1BB胞内区氨基酸序列为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:13)；

CD3ζ活化序列氨基酸序列为：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT KDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:14)。

CD-19CAR的完整核苷酸序列为：

atggtcctagcgcagggcctcctaagcatggccctgctggcactctgctgggaagacatacagatgacccaaaccacaagcagcctcagcgccagcctaggggacagagtgaccatcagctgcagagcaagccaggacataagcaagtacctgaactggtaccaacaaaagccagacggcaccgtgaaactactgatataccacaccagccgcctccacagcggcgtacccagccggttcagcgggagcggaagcgggaccgactacagcctcaccatcagcaacctcgaacaagaagacatagcgacctacttctgccaacaaggcaacaccctgccctacaccttcggaggagggaccaaactagagatcaccggaggaggggggagcggcggcggaggcagcggcgggggaggcagcgaagtcaagctacaggaaagcggacccggcctcgtcgccccgagccagagcctgagcgtgacatgcacagtgagcggagtgagcctcccagactacggggtcagctggatacggcagccaccacgcaaggggctcgaatggctgggagtaatatggggaagcgagacgacatactacaacagcgcactaaagagccgactgacgatcataaaagacaacagcaagagccaggtattcctgaaaatgaacagcctccaaacggacgacaccgcgatctactactgcgcgaaacactactactacggaggcagctacgcgatggactactgggggcaaggaacgagcgtaaccgtcagcagcttcgtgccagtcttcctcccagccaagccgaccacgacaccggcaccgcggccacccacacccgcacccacaatcgcaagccaacccctgagcctacggccggaggcatgcagacccgcggcagggggagcggtgcacacaagaggcctcgacttcgcatgcgacatatacatatgggcgccactcgcagggacgtgcggcgtgctcctgctcagcctagtaataaccctctactgcaaccaccggaacaagcggggacggaagaagctgctctacatattcaagcaacccttcatgcgaccggtccagacaacccaggaagaggacggctgcagctgccgattcccagaggaagaagagggagggtgcgagctacgggtcaaattcagccgcagcgccgacgcaccagcgtaccaacagggccagaaccagctatacaacgaactcaacctgggacgcagagaggagtacgacgtgctcgacaaacgcagaggacgagacccagagatggggggaaagccgagaagaaagaacccccaggaggggctctacaacgaactgcagaaagacaagatggcagaggcatacagcgagatagggatgaaaggcgaacgaaggcgggggaaaggacacgacggactctaccaagggctaagcacggcaacaaaggacacatacgacgccctccacatgcaggcgctaccacccaga(SEQ ID NO:15)

CD-20CAR的完整核苷酸序列为：

atggtgctggcacaaggactcctgagcatggcactcctagcgctatgctgggaggacatagtgctgacgcagagcccagccatactgagcgcgagcccaggcgagaaagtcacaatgacgtgccgagcgagcagcagcgtcaactacatggactggtaccaaaaaaagccgggaagcagcccgaagccctggatatacgcaaccagcaacctggccagcggcgtcccagcgcggttcagcgggagcggaagcggcacaagctacagcctgacaatcagccgggtagaggcggaagacgcagcaacatactactgccaacagtggagcttcaacccgccgaccttcggaggagggacaaagctagaaatcaaaggcggaggggggagcggcggaggcgggagcggcggagggggaagcgaagtccagctgcagcagagcggcgcggaactcgtgaagccaggggcaagcgtaaagatgagctgcaaggcaagcgggtacaccttcacgagctacaacatgcactgggtaaagcagaccccaggccaaggcctagagtggatcggggcgatatacccaggcaacggcgacacaagctacaaccaaaaattcaagggaaaagcgacactaaccgcagacaagagcagcagcacagcgtacatgcaactaagcagcctgacaagcgaagacagcgccgactactactgcgcccgcagcaactactacggcagcagctactggttcttcgacgtgtggggggcaggaacgacagtgacggtgagcagcttcgtgccagtcttcctgccagcaaagccaacgaccaccccggcaccacgacccccaacaccggcgccaaccatcgcgagccagccgctcagcctaaggccagaagcatgccgaccagcagccggaggcgccgtacacaccagaggactagacttcgcgtgcgacatatacatatgggcgcccctagccggcacctgcggagtactactactaagcctagtaatcaccctatactgcaaccacagaaacaaacgcgggaggaaaaagctactctacatcttcaaacagcccttcatgaggccggtccaaacaacgcaggaggaggacggctgcagctgccgattccccgaagaggaggagggcggatgcgaactaagggtcaaattcagcagaagcgccgacgcccccgcataccaacaggggcagaaccagctctacaacgagctcaacctggggcggagggaagagtacgacgtgctcgacaagaggagagggagagaccccgaaatggggggcaagccgcgcaggaaaaacccgcaagagggcctatacaacgagctacaaaaagacaaaatggccgaggcgtacagcgaaataggaatgaagggagaacggagacgcgggaaagggcacgacggactctaccaaggcctcagcaccgcaacgaaggacacatacgacgccctccacatgcaggcactgccgccccga(SEQ ID NO:16)

2.制备线性化DNA模板：

使用限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ在poly(A)的末尾处对重组质粒载体进行切割得到体外转录所需的线性化DNA模板。酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳，确认酶切完全。

3.体外转录mRNA：

如图2A所示，在设计并合成了编码CD19及CD20 CARs的重组质粒载体后，通过IVT技术获得编码CD19及CD20 CARs的mRNA：具体地，制备线性化DNA模板后，向所述线性化DNA模板中加入T7 RNA聚合酶、核苷酸底物、RNA酶抑制剂等原料体外转录线性化DNA模板，即可得到mRNA。随后用牛痘病毒加帽酶和二氧甲基转移酶对mRNA进行转录后加帽。最后，用oligo(dT)30磁珠纯化加帽后的mRNA，并用变性琼脂糖凝胶电泳法评估所合成mRNA的质量。

如图2B、2C所示，变性琼脂糖凝胶电泳法检测第2代CD19 CAR-mRNA、CD20 CAR-mRNA，其条带位置与设计相吻合。

4.对脐带血扩增而来的NK细胞通过电穿孔导入抗CD19 CAR mRNA、抗CD20 CARmRNA制备CD19 CAR-NK/CD19-CD20 CAR-NK细胞：

1)将脐带血扩增而来的NK细胞(通过K562基因工程细胞及细胞因子通过体外诱导扩增人脐带血来源的单个核细胞获得NK细胞)悬液于50mL离心管中，350g离心5min，弃上清；

2)取5mL NK细胞完全培养基重悬细胞，计数后分别取1～5×10⁶个细胞悬液到1.5mL EPP管中，350g离心5min，弃上清；

3)轻弹EPP管底部使细胞呈糊状，加电转液A液与B液1:1混匀，分别加入2～6μg抗CD19 CAR mRNA、抗CD20 CAR mRNA混合至20μL体系，混匀，将细胞悬液转移至电击杯中，避免产生气泡；

4)启动电转仪(Celetrix CTX-1500A)，设置参数：420～450V，20～50ms，将电击杯快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速将细胞悬液转移至细胞培养皿中；

5)补加10mL NK完全培养基，37℃恒温培养箱中培养6～8小时，即得到CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞和CD19-CD20 CAR-NK细胞。

如图3所示，使用电穿孔技术，本发明人成功地将CD19-CD20 CARs-mRNA导入NK细胞分别构建了CD19 CAR-NK、CD20 CAR-NK以及CD19-CD20CAR-NK细胞。

并且，为获得高表达抗CD19-CD20 CAR-NK细胞，本发明人摸索并优化了mRNA的电转浓度：在给予1～4μg CAR-mRNA电穿孔1～5×10⁶个NK细胞的实验条件下，均可检测到NK细胞表面CAR的表达。但值得注意的是，NK细胞表面CAR的表达比例并非同mRNA电穿孔浓度呈正相关，NK细胞负载过量的CAR-mRNA可引起NK细胞表面CAR表达的降低。

根据NK细胞的CAR阳性表达率，本发明人发现：

抗CD19 CAR-NK细胞的优化mRNA电转浓度为：使用2μg的CD19-CAR mRNA电穿孔10⁶个NK细胞，即可获得高表达CD19-CAR的CD19 CAR-NK细胞；

抗CD20 CAR-NK细胞的优化mRNA电转浓度为：使用3μg的CD20-CAR mRNA电穿孔10⁶个NK细胞，即可获得高表达CD20-CAR的CD20 CAR-NK细胞；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞的优化mRNA电转浓度为：使用3μg的等体积CD19-CARmRNA和CD20-CAR mRNA同时电穿孔等体积10⁶个NK细胞，即可获得高表达两种CAR的CD19-CD20 CAR-NK细胞。

5.流式检测：

1)CD19 CAR-NK+PE-anti-FMC63抗体

i.将电转后的CD19 CAR-NK细胞于37℃恒温培养箱中培养6h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶的NK细胞、CD19 CAR-NK细胞350g离心5min，弃上清；用1mL PBS溶液洗一次，350g离心5min，弃上清；

ii.在细胞沉淀中加1μL PE-anti-FMC63抗体和90μL FACS Buffer溶液，轻弹流式管底部混匀，4℃，避光孵育60min；

iii.加1mL PBS溶液洗去抗体，350g离心5min，弃上清；

iv.加300μL PBS上机检测；

2)CD20 CAR-NK+Biotinylated CD20 Protein+Streptavidin Protein,AlexaFluor^TM647

i.将电转后的CD20 CAR-NK细胞于37℃恒温培养箱中培养6h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶的NK细胞、CD20 CAR-NK细胞350g离心5min，弃上清；用1mL PBS溶液洗一次，350g离心5min，弃上清；

ii.在细胞沉淀中加4μL Biotinylated CD20 Protein抗体和90μL FACS Buffer溶液，轻弹流式管底部混匀，4℃，孵育60min；

iii.加1mL PBS溶液洗去抗体，350g离心5min，弃上清；

iv.在细胞沉淀中加1μL Streptavidin Protein,Alexa Fluor^TM647抗体和90μLFACS Buffer溶液，轻弹流式管底部混匀，4℃，避光孵育60min；

v.加300μL PBS上机检测；

3)CD19-CD20 CARs-NK+FITC-anti-FMC63抗体+Biotinylated CD20Protein+Streptavidin Protein,Alexa Fluor^TM647

i.将电转后的CD19-CD20 CARs-NK细胞于37℃恒温培养箱中培养6h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶的NK细胞、CD19-CD20 CARs-NK细胞350g离心5min，弃上清；用1mLPBS溶液洗一次，350g离心5min，弃上清；

iii.加1mL PBS溶液洗去抗体，350g离心5min，弃上清；

iv.在细胞沉淀中加1μL Streptavidin Protein,Alexa Fluor^TM647抗体、1μLFITC-anti-FMC63抗体和90μL FACS Buffer溶液，轻弹流式管底部混匀，4℃，避光孵育60min；

v.加300μL PBS上机检测；

4)流式上机检测

结果如图4A所示，使用前述抗CD19 CAR-NK细胞、抗CD20 CAR-NK细胞、抗CD19-CD20 CAR-NK细胞的优化mRNA电转浓度，成功制备得到CD19CAR-NK、CD20 CAR-NK及CD19-20CAR-NK细胞，并且CD19 CAR、CD20CAR和CD19-CD20 CAR在NK细胞上具有较高的阳性表达率，分别为93.1％±2.98％、90.5％±2.30％和86.4％±1.83％。

本发明人还对CAR-NK细胞表面阳性CAR的持续表达时间进行了观测。

如图4B所示，CD19-CAR mRNA电转4小时即可检测到CD19-CAR的高表达，24小时达到高峰，96小时后仍可以成功检测到CAR的表达。

如图4C所示，CD19-CAR mRNA以及CD20-CAR mRNA电转8小时即可检测到CD19-CD20CAR的共同高表达，24小时达到高峰，96小时后仍可以成功检测到CAR的表达，且表达率高达56.5％±1.83％。

先前的文献报道，CAR-mRNA电穿孔NK细胞后，mRNA的表达在4天内会逐渐下降，最终恢复到基线水平。而本发明CAR-mRNA的表达在电转后24h到达峰值(87.6％±2.98％)，之后持续到96h仍可检测到高表达(56.5％±1.83％)。

此外，令人意外的是，相比抗CD19 CAR-NK细胞，抗CD19-CD20 CAR-NK细胞在电转72小时、96小时后的CD19 CAR表达率居然显著高于抗CD19CAR-NK细胞中的CD19 CAR表达率。

本发明人认为，上述优势与本发明中CD19-CAR、CD20-CAR、CD19-CD20CAR优化后更稳定的CAR结构有关。优化后的CAR在有效转染和持续表达之间取得了平衡，从而成功构建了可高表达且持续表达阳性CAR的CD19 CAR-NK、CD20 CAR-NK及CD19-CD20 CAR-NK细胞。

实施例2：CD19-CD20 CAR-NK细胞的特异性杀伤效果

1.靶细胞及效应细胞的准备：

收集BALL-1细胞(CD19⁺CD20⁺，人B淋巴细胞急性白血病细胞)、REH细胞(CD19⁺CD20^-，人急性非B非T淋巴细胞白血病细胞)及Jurkat细胞(CD19^-CD20^-，人T淋巴细胞白血病细胞)作为靶细胞，收集NK细胞、CD19CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞及CD19-CD20 CAR-NK细胞，使细胞密度为5×10⁵个/mL。

2.CCK-8法检测肿瘤细胞杀伤效果：

将肿瘤细胞作为靶细胞，NK细胞或CAR-NK细胞作为效应细胞，在96孔圆底板中将靶细胞按5×10⁴个细胞每孔(50μL)，三个复孔进行铺板。结束后按照效靶比分别为1：1、2：1、5：1的比例加入与之相对应数量的效应细胞，然后将孔板置于培养箱，37℃，5％CO₂，共培养4h。

按照说明书指示，每孔100μL体系加入10μL CCK-8试剂，37℃，5％CO₂，避光孵育1～2h后，450nm检测OD值后按照公式：死亡率＝1-[(效靶孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值)]×100％，计算肿瘤细胞的死亡率。

不同效应细胞(即NK细胞、CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞及CD19-CD20 CAR-NK细胞)对BALL-1(CD19⁺CD20⁺)靶细胞、REH(CD19⁺CD20^-)靶细胞、Jurkat(CD19^-CD20^-)靶细胞分别的杀伤率比较如下表1-表3与图5A所示：

表1不同效应细胞对BALL-1(CD19⁺CD20⁺)靶细胞的杀伤率比较(百分比x±s)

注：*表示与NK细胞组比较，杀伤率百分比具有明显差异性；*p<0.05,**,p<0.01,n＝3

表2不同效应细胞对REH(CD19⁺CD20^-)靶细胞的杀伤率比较(百分比x±s)

注：*表示与NK细胞组比较，杀伤率百分比具有明显差异性；ns表示与NK细胞组比较，杀伤率百分比无明显差异性；*p<0.05,ns:no significance,n＝3

表3不同效应细胞对Jurkat(CD19^-CD20^-)靶细胞的杀伤率比较(百分比x±s)

注：ns表示与NK细胞组比较，杀伤率百分比无明显差异性；ns:no significance,n＝3

如表1-3与图5A所示，本发明人评估和比较了CD19-CD20 CAR-NK细胞对不同ALL靶细胞的细胞毒作用。

结果显示：与NK细胞不同，CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞及CD19-CD20 CAR-NK细胞对BALL-1细胞具有显著的特异性细胞毒作用；CD19CAR-NK细胞及CD19-CD20 CAR-NK细胞对REH细胞具有显著的特异性细胞毒作用。而对于CD19^-CD20-的Jurkat细胞，CAR-NK细胞与NK细胞表现出相似的杀伤活性。

值得注意的是，在1:1效靶比时，CD19-CD20 CAR-NK细胞对BALL-1和REH细胞仍具有比单靶点CAR-NK更强的细胞毒活性。

这表明双靶向性CAR结构域仅需要一个同源抗原即可识别并发挥抗肿瘤作用，也就是说抗CD19-CD20 CAR-NK细胞在CD19-或CD20-肿瘤逃逸发生时仍可保留消除CD19⁺CD20-或CD19^-CD20⁺肿瘤细胞的能力。

此外，相比于单靶点CAR-NK细胞，CD19-CD20 CAR-NK细胞的细胞毒作用显著增强表明同时负载两种CAR对NK细胞毒性功能无明显影响，并具有协同促进CAR-NK细胞的细胞毒作用。

例如，对于BALL-1细胞，在1:1效靶比时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：29.01％-20.72％＝8.29％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：38.19％-20.72％＝17.47％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：49.32％-20.72％＝28.60％；

可以看出，8.29％+17.47％＝25.76％＜28.60％。

类似地，对于BALL-1细胞，在2:1效靶比时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：39.76％-27.55％＝12.21％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：48.88％-27.55％＝21.33％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：64.22％-27.55％＝36.67％；

可以看出，12.21％+21.33％＝33.54％＜36.67％。

类似地，对于REH细胞，在1:1效靶比时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：32.17％-25.08％＝7.09％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：27.71％-25.08％＝2.63％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：37.30％-25.08％＝12.22％；

可以看出，7.09％+2.63％＝9.72％＜12.22％。

类似地，对于REH细胞，在2:1效靶比时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：55.21％-46.62％＝8.59％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：51.35％-46.62％＝4.73％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：63.26％-46.62％＝16.64％；

可以看出，8.59％+4.73％＝13.32％＜16.64％。

类似地，对于REH细胞，在5:1效靶比时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：61.63％-51.51％＝10.12％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：52.23％-51.51％＝0.72％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：70.22％-51.51％＝18.71％；

可以看出，10.12％+0.72％＝10.84％＜18.71％。

以上结果表明，相比单靶点CAR-NK细胞，抗CD19-CD20 CAR-NK细胞具有意外的协同细胞毒作用。

3.流式细胞术法检测特异性杀伤效果：

为进一步定量评估CD19-CD20 CAR-NK细胞的特异性杀伤功能，采用流式细胞术检测CFSE阳性肿瘤细胞的PI染色情况，以评估共培养体系中肿瘤细胞的死亡情况。

使用CFSE染料提前预染肿瘤细胞30min，收集肿瘤细胞，加1mL PBS溶液洗去染料，离心1200rpm，5min，重悬细胞，在6孔圆底板中将靶细胞按5×10⁵个细胞每孔(1mL)进行铺板。按照1：1的效靶比加入与之相对应的效应细胞，6孔板置培养箱，37℃，5％CO₂，共培养4h。

收集细胞加1mL PBS溶液润洗，350g离心5min，弃上清，参照碘化丙啶(PI)DNA染色法(Solarbio)说明书，每管500μL体系加入10μL PI试剂，立即上机检测。将数值结果于Flowjo 10软件上进行分析。

如图5B结果显示，制备的CD19-CD20 CAR-NK细胞可特异性识别表达CD19和/或CD20抗原的肿瘤细胞，并较单靶点CAR-NK细胞具有更强的细胞毒作用。

例如，对于BALL-1细胞：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：29.0％-20.6％＝8.4％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：38.6％-20.6％＝18％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对BALL-1细胞的杀伤率提升了：48.3％-20.6％＝27.7％；

可以看出，8.4％+18％＝26.4％＜27.7％。

类似地，对于REH细胞：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：32.6％-23.5％＝9.1％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：24.4％-23.5％＝0.9％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞对REH细胞的杀伤率提升了：38.4％-23.5％＝14.9％；

可以看出，9.1％+0.9％＝10％＜14.9％。

实施例3：CD19-CD20 CAR-NK细胞的活化及细胞因子释放水平检测

为了检测制备的CD19 CAR-NK、CD20 CAR-NK及CD19-CD20 CAR-NK细胞的活化及细胞因子释放水平，本实施例采用CD19 CAR-NK、CD20 CAR-NK及CD19-CD20 CAR-NK细胞和NK细胞分别与BALL-1靶细胞共培养，然后通过ELISA试剂盒检测穿孔素(perforin)、IFN-γ和细胞因子IL-15的分泌量，流式细胞术检测CD69、CD107a和IFN-γ水平。

将BALL-1作为靶细胞，NK/CAR-NK细胞作为效应细胞，将每孔1×10⁶个效应细胞和每孔1×10⁶个靶细胞接种至96孔板中共培养，做3个重复，37℃5％CO₂中培养6h。吸取培养的上清液，于350g离心5min，留存细胞沉淀用于流式检测，收获上清液用于ELISA检测。

不同效应细胞(即NK细胞、CD19 CAR-NK细胞、CD20 CAR-NK细胞及CD19-CD20 CAR-NK细胞)释放perforin、IFN-γ及IL-15水平的比较如下表4与图6A(肿瘤细胞刺激)、图7a(无肿瘤细胞刺激)所示：

表4效应细胞释放perforin、IFN-γ及IL-15水平比较(浓度x±s)

注1：*表示在无肿瘤细胞刺激情况下，与NK细胞组比较，效应细胞穿孔素、IFN-γ及IL-15的分泌水平具有明显差异性；ns表示在无肿瘤细胞刺激情况下，与NK细胞组比较，效应细胞穿孔素、IFN-γ及IL-15的分泌水平无明显差异性；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:no significance,n＝3

注2：#表示在BALL-1(CD19⁺CD20⁺)肿瘤细胞刺激情况下，与NK细胞组比较，效应细胞穿孔素、IFN-γ及IL-15的分泌水平具有明显差异性；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,n＝3

如表4与图6A所示，在BALL-1靶细胞的存在下，NK细胞及CAR-NK细胞释放的perforin、IFN-γ、IL-15水平增加，其中抗CD19-CD20 CAR-NK细胞所释放的细胞因子水平最高，且相比单靶点CAR-NK细胞具有意外的协同提升作用。

例如，对于穿孔素(perforin)，在BALL-1靶细胞的存在下：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的穿孔素(perforin)释放提升了：47.83-43.39＝4.44pg/ml；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的穿孔素(perforin)释放提升了：47.09-43.39＝3.7pg/ml；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的穿孔素(perforin)释放提升了：54.50-43.39＝11.11pg/ml；

可以看出，4.44+3.7＝8.14pg/ml＜11.11pg/ml。

类似地，对于IFN-γ，在BALL-1靶细胞的存在下：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：1913.58-1742.68＝170.9pg/ml；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：2036.69-1742.68＝294.01pg/ml；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：2370.69-1742.68＝628.01pg/ml；

可以看出，170.9+294.01＝464.91pg/ml＜628.01pg/ml。

类似地，对于IL-15，在BALL-1靶细胞的存在下：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：24.34-21.78＝2.56pg/ml；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：25.95-21.78＝4.17pg/ml；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：30.08-21.78＝8.3pg/ml；

可以看出，2.56+4.17＝6.73pg/ml＜8.3pg/ml。

如表4与图7a所示，在无肿瘤细胞刺激时，CAR-NK细胞释放的perforin、IFN-γ、IL-15水平高于NK细胞，并且CD19-CD20 CAR-NK细胞释放的IFN-γ、IL-15相比单靶点CAR-NK细胞具有意外的协同提升作用：

例如，对于IFN-γ，在无肿瘤细胞刺激时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：843.80-490.02＝353.78pg/ml；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：929.13-490.02＝439.11pg/ml；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IFN-γ释放提升了：1713.58-490.02＝1223.56pg/ml；

可以看出，353.78+439.11＝792.89pg/ml＜1223.56pg/ml。

类似地，对于IL-15，在无肿瘤细胞刺激时：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：14.06-13.08＝0.98pg/ml；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：16.23-13.08＝3.15pg/ml；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的IL-15释放提升了：17.42-13.08＝4.34pg/ml；

可以看出，0.98+3.15＝4.13pg/ml＜4.34pg/ml。

以上结果表明，在无肿瘤细胞刺激时以及在BALL-1靶细胞的存在下，相比单靶点CAR-NK细胞，抗CD19-CD20 CAR-NK细胞均具有意外的协同提升细胞因子释放水平的作用。

此外，使用流式细胞术评估NK细胞早期激活标志物CD69、脱颗粒标志物CD107a和细胞内IFN-γ的表达。

CD69是淋巴细胞被激活后最早表达的表面抗原，是NK细胞活化的重要表面标志。在CAR-NK细胞与肿瘤细胞相互作用后，细胞激活通常伴随着CD69的表达上调。CD107a是存在于NK细胞表面的一种溶酶体膜蛋白，当NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤时，CD107a分子可伴随溶酶体转运转至细胞膜表面，从而释放穿孔素，进而使肿瘤细胞凋亡。因此，CD107a分子表达水平与NK细胞杀伤能力呈正相关，可以作为评价NK细胞杀伤活性的一种指标。细胞内IFN-γ的表达水平也与NK细胞的活性密切相关。例如，当体内存在某些病原体或肿瘤细胞时，NK细胞会分泌大量的IFN-γ，进一步激活其他免疫细胞的活性，以清除这些病原体或肿瘤细胞。

如图6B流式结果显示，在一定的肿瘤负荷下，与NK细胞相比，CAR-NK细胞表面CD69的表达均上升，其中抗CD19-CD20 CAR-NK细胞表面CD69的表达水平最高，表明抗CD19-CD20CAR-NK细胞的活化程度更高。

而在没有肿瘤抗原刺激的情况下，如图7b所示，与NK细胞相比，抗CD19CAR-NK细胞、抗CD20 CAR-NK细胞表面CD69的表达水平出现下降，但抗CD19-CD20 CAR-NK细胞表面CD69的表达水平意外地出现上升。抗CD19-CD20 CAR-NK细胞表面CD69的表达水平最高，表明抗CD19-CD20 CAR-NK细胞的活化程度更高，证明其在未接触肿瘤细胞时已经处于预激活状态，因而待其接触肿瘤细胞后可以更快地更好地发挥杀伤作用。

如图6C流式结果所示，与NK细胞相比，CAR-NK细胞在肿瘤细胞的激活下，CD107a、细胞内IFN-γ表达水平更高，且抗CD19-CD20 CAR-NK细胞表现出更加显著的表达水平。此外，相比单靶点CAR-NK细胞，抗CD19-CD20CAR-NK细胞的CD107a表达水平具有意外的协同提升作用。

对于CD107a表达水平，在BALL-1靶细胞的存在下：

抗CD19 CAR-NK细胞相比NK细胞的CD107a表达水平提升了：73.8％-69.7％＝4.1％；

抗CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的CD107a表达水平提升了：74.8％-69.7％＝5.1％；

抗CD19-CD20 CAR-NK细胞相比NK细胞的CD107a表达水平提升了：89.9％-69.7％＝20.2％；

可以看出，4.1％+5.1％＝9.2％＜20.2％。

因此，相比单靶点CAR-NK细胞，抗CD19-CD20 CAR-NK细胞的CD107a表达水平具有意外的协同提升作用，进一步表明了抗CD19-CD20 CAR-NK细胞具备更强的NK细胞杀伤能力。

而在没有肿瘤抗原刺激的情况下，如图7c所示，与NK细胞相比，CAR-NK细胞的CD107a、细胞内IFN-γ表达水平均更高，且抗CD19-CD20 CAR-NK细胞表现出更加显著的表达水平。

综上所述，这些结果表明：在无肿瘤细胞刺激时以及在BALL-1靶细胞的存在下，相比单靶点CAR-NK细胞，抗CD19-CD20 CAR-NK细胞的活化、释放的细胞毒性物质及细胞因子水平均更为显著，可产生更佳的肿瘤杀伤效果。

实施例4：CD19-CD20 CAR-NK细胞的体内抗肿瘤作用

NTG急性淋巴细胞白血病小鼠体内实验验证CD19-CD20 CAR-NK细胞的抗肿瘤作用：

将35只4～5周、体重18～20g的NTG雌鼠尾静脉注射2×10⁶个BALL-1-luc细胞。接种后每隔7d，使用活体成像仪检测肿瘤成瘤情况。成像前用腹腔麻醉剂三溴乙醇麻醉小鼠(0.2ml/10g)，严格按照说明书向麻醉后的小鼠腹腔注射D荧光素钾盐(0.1ml/10g体重)，注射后10min内进行活体成像分析肿瘤生长情况。

注射BALL-1-luc肿瘤细胞后的第30天，将荧光素酶表达平均的NTG雌鼠随机分成5组，每组小鼠(n＝7)。实验组(CD19 CAR-NK组、CD20 CAR-NK组、CD19-CD20 CAR-NK组)每只小鼠通过尾静脉注射1×10⁷个CAR-NK细胞，对照组则同时尾静脉注射1×10⁷个未转染的NK细胞。空白对照组则同时注射200μL PBS。治疗后每隔10d进行一次活体成像，以观察肿瘤负荷变化，同时注意观察小鼠状况，并记录体重变化以及生存期

如图8所示，对荧光素酶表达的白血病NTG小鼠活体成像显示，注射CAR-NK细胞治疗的实验组小鼠，相比于对照组肿瘤负荷维持较低的增长速度，但注射未转染NK细胞治疗的对照组小鼠，随着时间延长肿瘤负荷持续增加。值得注意的是，CD19-CD20 CAR-NK细胞的实验组小鼠，在接受治疗后第20天进行活体成像显示：股骨内肿瘤发光明显低于NK细胞对照组，同时也要低于单靶点CAR-NK细胞组。以上结果证明CD19-CD20 CAR-NK细胞在小鼠体内能更加有效地靶向肿瘤抗原，发挥抗肿瘤疗效。

实施例5：CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗的特异性抗肿瘤作用

1.CCK-8法检测CD19 CAR-NK体外特异性抗肿瘤作用：

1)靶细胞准备：收集淋巴瘤细胞系Daudi和Raji(CD19⁺CD20⁺)，急性淋巴细胞白血病细胞系Reh(CD19⁺CD20^-)和白血病细胞系K562(CD19^-CD20^-)，细胞计数后将所有细胞调整密度为4×10⁵cells/mL；

2)效应细胞准备：收集NK细胞和制备好的CD19 CAR-NK细胞，细胞计数后将所有细胞调整密度为4×10⁵cells/mL；

3)铺板：在96孔圆底板中将靶细胞按2×10⁴个细胞每孔，三个复孔进行铺板。按效靶比分别为1：1、5：1、10：1的比例加入CD19 CAR-NK，总体积为100μL，37℃、5％CO₂条件下孵育4h。

4)检测特异性杀伤作用每孔：按照CCK-8试剂盒说明，每孔加入10μLCCK8试剂，置于37℃恒温培养箱，避光孵育2h后使用多功能酶标仪在450nm波长下检测OD值后按照公式：死亡率＝1-[(效靶孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值)]×100％，计算肿瘤细胞的死亡率。

如图9A所示，通过流式细胞术检测本发明中使用的肿瘤细胞系表面CD19和CD20的表达。结果表明，K562(人慢性髓系白血病细胞)为CD19^-CD20^-细胞，Raji(人Burkitt's淋巴瘤细胞)为CD19⁺CD20⁺细胞，Daudi(人Burkitt's淋巴瘤细胞)为CD19⁺CD20⁺细胞，Reh(人急性非B非T淋巴细胞白血病细胞)为CD19⁺CD20^-细胞。

随后，本发明人评估了NK细胞和CD19 CAR-NK细胞对包括淋巴瘤细胞系Daudi和Raji(CD19⁺CD20⁺)、急性淋巴细胞白血病细胞株Reh(CD19⁺CD20^-)和白血病细胞株K562(CD19^-CD20^-)的杀伤作用。

如图9B结果显示，相对于NK细胞而言，CD19 CAR-NK对CD19⁺Daudi、Raji和Reh细胞均表现出特异性的细胞毒作用，对CD19^-K562细胞的杀伤作用与NK细胞相差不大。这些结果证实了CD19 CAR-NK细胞对CD19⁺的肿瘤细胞的具有特异性杀伤作用。

此外，本发明人还检测了NK/CD19 CAR-NK细胞作用于Raji细胞后的CD69、CD107a和IFN-γ的表达。如图9C所示，结果表明CD19 CAR-NK细胞的CD69、CD107a和IFN-γ的表达水平相比NK细胞均有显著上升，说明CD19CAR-NK细胞具有更高的活化程度、更强的NK细胞杀伤能力、更多的细胞因子释放。

本发明人还检测了NK/CD19 CAR-NK细胞与Raji共培养后细胞培养上清中perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。

如图9D所示，结果表明：与未接触肿瘤细胞时的CD19 CAR-NK细胞相比(即图9D中的对照组)，Raji共培养后的CD19 CAR-NK细胞的perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平均有显著上升；并且，相比与Raji共培养后的NK细胞，与Raji共培养后的CD19 CAR-NK细胞的perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平也均有显著上升。以上结果说明CD19 CAR-NK细胞能够更容易、更快速、更好地被肿瘤抗原激活，从而具有更强的活性、更强的NK细胞杀伤能力、更多的细胞因子释放。

2.流式细胞术检测CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗的特异性抗肿瘤作用：

利妥昔单抗(Rituximab)能特异性结合B细胞表面CD20，可桥联CD19 CAR-NK细胞，通过ADCC来杀伤CD20⁺的肿瘤细胞。因此，本发明人使用流式细胞术评估了CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗对肿瘤细胞的杀伤作用。CFSE标记的肿瘤细胞与结合有利妥昔单抗的CD19 CAR-NK细胞按效靶比为1：1共孵育4h后，用PI染色以鉴定死亡细胞，以CFSE⁺PI⁺来代表死亡的肿瘤细胞。

CFSE及PI染色：收集Raji细胞350g离心5min，PBS洗涤2遍，加入5μM CFSE工作液，37℃避光孵育20min，加入10mL含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，37℃孵育10min，350g离心5min，用适当完全培养基重悬成单细胞悬液后进行细胞计数，调整细胞密度为1×10⁶cells/mL。

收集CD19 CAR-NK及NK细胞，350g离心10min，弃上清，用适当完全培养基重悬成单细胞悬液后进行细胞计数，调整细胞密度为1×10⁶cells/mL。取24孔板，按效靶比1：1接种NK/CAR-NK、Raji细胞、Daudi细胞或Reh细胞，37℃、5％CO₂条件下孵育4h。

收集细胞PBS洗涤，350g离心5min，弃上清，用500μL PBS重悬细胞，加入20μg/mLPI溶液，5min后流式细胞仪上机检测。

如图10A所示，结果表明，NK细胞/CD19 CAR-NK细胞和利妥昔单抗联合使用显著增强了对CD19⁺CD20⁺Daudi细胞的杀伤作用，且产生了协同杀伤的效果。

例如，对于(NK细胞+利妥昔单抗)的联用：

(UCB-NK+利妥昔单抗)组对Daudi细胞的杀伤率(15.7％)＞利妥昔单抗组对Daudi细胞的杀伤率(6.66％)+UCB-NK细胞组对Daudi细胞的杀伤率(5.61％)。

类似地，对于(CD19 CAR-NK细胞+利妥昔单抗)的联用：

(CD19 CAR-NK+利妥昔单抗)组对Daudi细胞的杀伤率(37.2％)＞利妥昔单抗组对Daudi细胞的杀伤率(6.66％)+CD19 CAR-NK细胞组对Daudi细胞的杀伤率(15.5％)。

而利妥昔单抗存在与否，并未显著改变对NK细胞/CD19 CAR-NK细胞对CD19⁺CD20^-Reh细胞的杀伤作用。但CD19 CAR-NK细胞单用时，已经相比NK细胞单用时产生了显著提升的杀伤作用，CD19 CAR-NK细胞的杀伤率(42.2％)已经达到了NK细胞杀伤率(12.1％)的约3.5倍。

此外，本发明人还对NK细胞/CAR-NK细胞联合利妥昔单抗后细胞CD69和CD107a的表达、细胞上清中perforin、IFN-γ和TNF-α的分泌水平进行了检测。

如图10B所示，NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗后，NK细胞/CD19 CAR-NK细胞上CD69及CD107a的表达进一步增加，提示联合利妥昔单抗后细胞活化及细胞毒性的增强。

表5在肿瘤细胞刺激情况下不同效应细胞IFN-γ及TNF-α的分泌水平比较(浓度x±s)

注：*表示在Raji(CD19⁺CD20⁺)肿瘤细胞刺激情况下，与NK细胞组比较，效应组IFN-γ及TNF-α的分泌水平具有明显差异性；ns表示在Raji(CD19⁺CD20⁺)肿瘤细胞刺激情况下，与NK细胞组比较，效应组IFN-γ及TNF-α的分泌水平无明显差异性；**p≤0.01,***,p≤0.001,ns:no significance,n＝3

如图10C与表5所示，NK细胞/CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗后细胞释放的perforin、IFN-γ和TNF-α的水平也出现了显著增加，也进一步提示在联合利妥昔单抗后NK细胞/CD19 CAR-NK细胞的功能增强。

以上结果表明，联合利妥昔单抗后，NK细胞/CD19 CAR-NK细胞的抗肿瘤作用得到显著提升，可产生协同杀伤效果，且细胞活化、细胞毒性、细胞因子释放等功能均出现增强。

3.体内实验评估CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗对B细胞恶性肿瘤的疗效以及安全性评估：

1)CD19 CAR-NK细胞联合Rituximab的抑瘤作用

实验分为4组：PBS组、CD19 CAR-NK组、利妥昔单抗组、CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗组。

如图11A所示，显示了PBS组、CD19 CAR-NK组、利妥昔单抗组、CD19CAR-NK联合利妥昔单抗组分别治疗Raji荷瘤小鼠的示意图。具体地，收集肿瘤细胞Raji-Luc，按照2×10⁶cells/只注射到NTG小鼠皮下。第7天，当肿瘤体积达到50mm³，将小鼠随机分为四组(PBS/CD19 CAR-NK细胞/利妥昔单抗/CD19 CAR-NK细胞+利妥昔单抗，n＝7)。小鼠尾静脉注射PBS100μL，单独治疗组尾静脉注射1×10⁷个CD19 CAR-NK细胞或腹腔注射200μg利妥昔单抗，联合治疗组采用序贯式给药，先在尾静脉注射1×10⁷个CD19 CAR-NK细胞12h后腹腔注射200μg利妥昔单抗。动物每周治疗一次，连续3周。每周用游标卡尺测量肿瘤两次，肿瘤体积计算方法为:1/2×长×宽×高。此外，在Raji-Luc移植后第39天利用小动物活体成像仪观察肿瘤的发光情况。定期观察小鼠生存状态，记录小鼠死亡时间，计算生存期。

表6肿瘤移植模型小鼠接受不同治疗后第39天肿瘤体积大小比较(体积)

注：*表示与接受PBS治疗组小鼠比较，接受治疗后第39天肿瘤体积大小具有明显差异性；***,p≤0.001,n＝6

如图11B与表6所示，在第39天，肿瘤生长曲线显示，与CD19 CAR-NK细胞组(805.78±66.93mm³)、利妥昔单抗组(963.15±98.09mm³)以及PBS组(1429.27±102.26mm³)相比，联合治疗组可显著抑制肿瘤生长(80.88±13.29mm³,p<0.01)。并且，联合治疗组产生了对肿瘤的协同抑制效果：

利妥昔单抗组相比PBS组的肿瘤体积减少了：1429.27-963.15＝466.12mm³；

CD19 CAR-NK细胞组相比PBS组的肿瘤体积减少了：1429.27-805.78＝623.49mm³；

联合治疗组联合治疗组相比PBS组的肿瘤体积减少了：1429.27-80.88＝1348.39mm³；

可以看出，466.12+623.49＝1089.61mm³＜1348.39mm³。

如图11C所示，与肿瘤体积结果一致，CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗治疗组测量的荧光素酶信号相比其他治疗组显著降低。

此外，如图11D所示，数据还显示，相比其他治疗组，CD19 CAR-NK联合利妥昔单抗还显著延长了荷瘤小鼠的生存时间。PBS组荷瘤小鼠在约第39天时全部死亡，利妥昔单抗组荷瘤小鼠在约第40天时全部死亡，CD19 CAR-NK组荷瘤小鼠在约第47天时全部死亡，而CD19CAR-NK联合利妥昔单抗组的荷瘤小鼠生存时间远超50天，直到第50天时，小鼠依然100％存活。

2)HE染色和免疫组化分析

肿瘤免疫治疗的联合策略能有效提高抗肿瘤疗效，但评估联合治疗产生的相关毒副作用也至关重要。为了评估治疗过程中潜在的毒副作用，每周测量小鼠体重。处死后，取肿瘤经石蜡固定后进行免疫组化分析，并收集心、肝、脾、肺、肾脏进行HE染色。将肿瘤、心、肝、脾、肺和肾脏在4％多聚甲醛中固定过夜，并用石蜡包埋。进行HE染色时，将石蜡包埋标本制备成厚度为3μm的切片，切片进行苏木精和伊红(H&E)染色，然后对这些样本进行组织病理学分析，以评估形态学变化或异常。免疫组化检测CD56和Ki67在肿瘤样本中的表达，首先将石蜡包埋标本以4μm厚度切片，在65℃烤片20min。脱蜡复水后，用柠檬酸钠缓冲液修复抗原，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，切片与抗CD56抗体(1:100,CST,#99746S)或抗ki67抗体(1:100,Servicebio,#GB121141)孵育。与二抗孵育后，DAB染色、苏木精复染、脱水、清洗、中性树胶封片后显微镜下观察切片染色情况。使用Image J定量分析CD56和Ki67阳性染色细胞的数量。

如图12A、12B、12C所示，免疫组化检测可见，与CD19 CAR-NK单药治疗组相比，联合治疗组小鼠肿瘤组织中CD56⁺CD19 CAR-NK细胞数明显增加，表明有更多CAR19-NK细胞浸润到了肿瘤微环境中。此外，在PBS、利妥昔单抗、CD19 CAR-NK单药治疗组的肿瘤组织中观察到肿瘤细胞的增殖标志物Ki67的阳性细胞多，而联合治疗组显示Ki67阳性细胞数最少。以上结果提示通过利妥昔单抗的桥联作用，将更多的CD19 CAR-NK细胞紧密结合在肿瘤细胞上，从而增强了CD19 CAR-NK对肿瘤细胞的杀伤作用。

如图12D所示，在整个治疗期间，所有治疗组小鼠均未观察到如脱发、腹泻或体重减轻等不良反应。在治疗10天后，各组间体重差异无统计学意义。

如图12E所示，对心、肝、脾、肺、肾脏等重要器官的HE染色切片进行组织学检查，均未发现明显病理改变。

基于这些结果，可以得出结论，CD19 CAR-NK细胞联合利妥昔单抗治疗具有很高的体内安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞含有以下元件：

2.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：

L-EB-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

EB为胞外结合域；

H为铰链区；

TM为跨膜区；

C为共刺激信号结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

3.如权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述第一CAR具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，和/或所述第二CAR具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞中的元件(a)和/或(b)。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求5所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求4所述的核酸分子。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(a)如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的宿主细胞，或其组合；和

(b)药学上可接受的载体。

8.一种协同药物组合物，其特征在于，所述协同药物组合物含有：

(a)如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的宿主细胞，或其组合；

(b)利妥昔单抗；和

(c)药学上可接受的载体。

9.一种权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的宿主细胞、如权利要求7所述的药物组合物，或如权利要求8所述的协同药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。

10.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的CAR-NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的载体导入免疫细胞内，从而获得所述的CAR-免疫细胞。