CN118043463A - 修饰型转谷氨酰胺酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供加热温度区域内的反应性提高的修饰型转谷氨酰胺酶。在序列号1所示的氨基酸序列中，包含具有第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为特定的三氨基酸残基的组合；第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为特定的三氨基酸残基的组合；和/或，第2位的氨基酸残基被替换为特定的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽的转谷氨酰胺酶，与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，加热温度区域中的反应性提高。

Description

修饰型转谷氨酰胺酶
技术领域
本发明涉及修饰型转谷氨酰胺酶。更具体而言，本发明涉及通过获得在50℃以上的任意温度下的高反应性的突变而被修饰的转谷氨酰胺酶。
背景技术
转谷氨酰胺酶是在多肽中催化谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶，通过使赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体发挥作用，在多肽链的分子内或分子间形成ε-(γ-Gln)-Lys交联键。
即，转谷氨酰胺酶能够通过使蛋白质或肽交联而进行改性。具体而言，来源于链霉菌属的转谷氨酰胺酶(例如参照专利文献1)用于肉的粘结以及香肠、豆腐、面包和面条类的制造。另外，不限于食品领域，还研究了在纤维领域、医疗领域、香味化妆品领域等中的转谷氨酰胺酶的利用。期待这样高的可用性，因此尝试了用于提高转谷氨酰胺酶具有的各特性(耐热性、比活性、底物特异性、稳定性等)的改良(例如参照专利文献2～4、非专利文献1～4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平4-108381号公报
专利文献2：日本特开2002-253272号公报
专利文献3：日本特开2008-194004号公报
专利文献4：国际公开第2019/107288号单行本
非专利文献
非专利文献1：Marx CK et al.,J.Biotechnol.2008Sep 10；136(3-4):156-162.
非专利文献2：Tagami U et al.,Protein Eng.Des.Sel.2009Dec；22(12):747-752.
非专利文献3：Yokoyama K et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2010)87:2087-2096.
非专利文献4：Buettner K et al.,Amino Acids.2012Feb；42(2-3):987-996.
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，迄今为止，对于转谷氨酰胺酶，以提高其各特性为目的而尝试了改良，但鉴于因其高的有用性而期待的用途的进一步扩大的可能性等，期望改良转谷氨酰胺酶的新的选项。特别是在转谷氨酰胺酶的产业上利用中大多使用加热条件，在加热温度区域中的高反应性能够成为特别有用的特性。
因此，本发明的目的在于提供加热温度区域中的反应性提高的修饰型转谷氨酰胺酶。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人进行了深入研究，其结果，作为使转谷氨酰胺酶具备在加热温度区域中的提高的反应性的新突变，发现了(I)序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；(II)第243位～第245位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；和/或，(III)第2位的氨基酸残基替换为特定的氨基酸残基。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供下述揭示的方式的发明。
项1.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(I-1)～(I-3)中任一项所示的多肽：
(I-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为下述表1的(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表1]
(I-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(I-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
项2.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(II-1)～(II-3)中任一项所示的多肽：
(II-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表2的(42)～(60)中任一个所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表2]
(II-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(II-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
项3.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其包含以下(III-1)～(III-3)中任一项所示的多肽：
(III-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第2位的氨基酸残基被替换为(61)L或(62)F的氨基酸序列，
(III-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，所述第2位氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(III-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位的氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括所述第2位的氨基酸残基的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
项4.一种DNA，其编码项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
项5.一种表达盒或重组载体，其包含项4所述的DNA。
项6.一种转化体，其是通过项5所述的表达盒或重组载体对宿主进行转化而得到的。
项7.一种项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶的制造方法，其包括培养项6所述的转化体的工序。
项8.一种酶制剂，其包含项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
项9.一种蛋白质材料的改性剂，其包含项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
项10.一种改性的蛋白质材料的制造方法，其包括使项1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。
项11.根据项10所述的制造方法，其中，所述蛋白质材料为食用的。
发明效果
根据本发明，提供在加热温度区域中的反应性提高的修饰型转谷氨酰胺酶。
附图说明
图1示出比较例1的转谷氨酰胺酶在各温度条件下的酪蛋白交联反应的结果。
图2示出比较例2的转谷氨酰胺酶在各温度条件下的酪蛋白交联反应的结果。
图3示出实施例1的修饰型转谷氨酰胺酶在各温度条件下的酪蛋白交联反应的结果。
图4示出实施例2的修饰型转谷氨酰胺酶在各温度条件下的酪蛋白交联反应的结果。
图5示出实施例43的修饰型转谷氨酰胺酶在各温度条件下的酪蛋白交联反应的结果。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。应予说明，在序列表以外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时用单字符缩写来表述。即，甘氨酸(Gly)为G，丙氨酸(Ala)为A，缬氨酸(Val)为V，亮氨酸(Leu)为L，异亮氨酸(Ile)为I，苯丙氨酸(Phe)为F，酪氨酸(Tyr)为Y，色氨酸(Trp)为W，丝氨酸(Ser)为S，苏氨酸(Thr)为T，半胱氨酸(Cys)为C，蛋氨酸(Met)为M，天冬氨酸(Asp)为D，谷氨酸(Glu)为E，天冬酰胺(Asn)为N，谷氨酰胺(Gln)为Q，赖氨酸(Lys)为K，精氨酸(Arg)为R，组氨酸(His)为H，脯氨酸(Pro)为P。
在本说明书中，表示的氨基酸序列的左端为N末端，右端为C末端。
在本说明书中，“非极性氨基酸”包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。“不带电荷氨基酸”包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。“酸性氨基酸”包含天冬氨酸和谷氨酸。“碱性氨基酸”包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
在本说明书中，“替换”不仅包括通过人工方式导入氨基酸残基替换的情况，还包括通过自然方式而导入了氨基酸残基替换的情况，即原本氨基酸残基就不同的情况。本说明书中，氨基酸残基的替换可以为人工替换，也可以为自然替换，优选人工替换。
1.修饰型转谷氨酰胺酶
本发明的修饰型转谷氨酰胺酶是具有以下替换的多肽：(I)序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；(II)第243位～第245位的三氨基酸残基的组合替换为特定的三氨基酸残基的组合；和/或，(III)第2位的氨基酸残基替换为特定的氨基酸残基。具体而言，本发明的修饰型转谷氨酰胺酶包含以下(I-1)～(I-3)中的任一项、以下(II-1)～(II-3)中的任一项、或、以下(III-1)～(III-3)中的任一项所示的多肽。
(I-1)一种多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表3的(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表3]
(I-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(I-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第249位～第251位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
(II-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表4的(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表4]
(II-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(II-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第243位～第245位的三氨基酸残基的组合未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
(III-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第2位的氨基酸残基被替换为(61)L或(62)F的氨基酸序列，
(III-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，所述第2位氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(III-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位的氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括所述第2位的氨基酸残基的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽(即，除了所述第2位的氨基酸残基未被替换以外，包含与所述序列一致性为70％以上的氨基酸序列相同的氨基酸序列的参照多肽)在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽，其本身为来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的野生型转谷氨酰胺酶(成熟体)的突变体。具体而言，包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽是包含序列号2所示的氨基酸序列的来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的野生型转谷氨酰胺酶(成熟体)的突变体，该突变体具有第2位氨基酸残基(S)、第23位氨基酸残基(S)、第24位氨基酸残基(Y)、第289位氨基酸残基(H)和第294位氨基酸残基(K)分别被替换为P、Y、N、Y、L的5重突变(S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L)。
所述(I-1)～(I-3)、(II-1)～(II-3)和(III-1)～(III-3)所示的多肽不仅包括人工替换而得到的多肽，还包括原本具有这样的氨基酸序列的多肽。
在所述(I-2)、(II-2)和(III-2)的多肽中，导入的氨基酸的修饰可以仅包含替换、添加、插入和缺失中的1种修饰(例如，仅替换)，也可以包含2种以上的修饰(例如，替换和插入)。在所述(I-2)、(II-2)和(III-2)的多肽中，任意不同位点中的不同氨基酸的数量为1个或多个即可，例如可举出1～90个，优选为1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、或1～30个，更优选为1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、或1～4个，进一步优选为1～3个，特别优选为1或2个或者1个。
另外，在所述(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的序列一致性为70％以上即可，可举出优选为75％以上、79％以上、85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，更进一步优选为98.5％以上，特别优选为99％以上、99.5％以上、99.9％以上。
此处，在所述(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽中，相对于序列号1所示的各氨基酸序列的序列一致性是指与序列号1所示的氨基酸序列进行比较而算出的序列一致性。另外，“序列一致性”是指，通过BLASTPACKAGE[sgi32bit edition,Version 2.0.12；availablefrom National Center for Biotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,Vol.174,p247-250,1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gapextension Cost value：1即可。
在所述(I-2)、(II-2)、(III-2)、(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽中，从更进一步提高在加热温度区域的反应性的观点出发，更优选在序列号1所示的氨基酸序列中的第23位的氨基酸残基(Y)、第24位的氨基酸残基(N)和第294位的氨基酸残基(L)中不导入替换或缺失。另外，第64位的氨基酸残基(C)为转谷氨酰胺酶活性中心，因此优选在该位点不导入替换或缺失。另外，包含该转谷氨酰胺酶活性中心的第64位的氨基酸残基(C)、第255位的氨基酸残基(D)和第274位的氨基酸残基(H)属于催化三联体(catalytic triad)，因此也优选不在这些位点中导入替换或缺失。
在所述(I-2)、(II-2)、(III-2)、(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽中，在对序列号1导入氨基酸替换的情况下，作为导入的氨基酸替换的优选的一个方式，可举出保守性替换。即，作为所述(I-2)、(II-2)、(III-2)、(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽中的替换，例如，可举出如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸则替换为其他非极性氨基酸，如果替换前的氨基酸为不带电荷氨基酸则替换为其他不带电荷氨基酸，如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸则替换为其他酸性氨基酸，以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他碱性氨基酸。
所述(I-1)～(I-3)、(II-1)～(II-3)和(III-1)～(III-3)所示的多肽具有转谷氨酰胺酶活性，且在加热温度区域中具有提高的反应性。在本发明中，加热温度区域是指50℃以上的任意温度，可举出优选为55℃以上，更优选为60℃以上，进一步优选为65℃以上，进一步优选为70℃以上的任意温度。作为加热温度区域的上限，没有特别限定，例如可举出90℃以下，优选为85℃以下。
另外，在所述(I-2)、(II-2)、(I-3)和(II-3)的多肽中，“在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高”是指，选自50℃以上的加热温度区域的任意特定温度下的转谷氨酰胺酶活性，与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的参照多肽在该特定温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高即可。作为其提高的程度，没有特别限定，可举出优选为参照多肽在该特定温度下的转谷氨酰胺酶活性的1.1倍以上、1.2倍以上，更优选为1.3倍以上、1.4倍以上，进一步优选为1.5倍以上、1.6倍以上，进一步优选为1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上，更进一步优选为2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上，特别优选为2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上，作为这些范围的上限，没有特别限定，例如可举出5倍以下、4倍以下或3.5倍以下。
在所述(III-2)和(III-3)的多肽中，“在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高”是指，选自60℃以上的加热温度区域的任意特定温度下的转谷氨酰胺酶活性，与包含第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的参照多肽在该特定温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，作为其提高的程度，可举出选自60℃～65℃的加热温度区域中的任意特定温度下的转谷氨酰胺酶活性的提高程度为参照多肽在该特定温度下的转谷氨酰胺酶活性的1.3倍以上，优选为1.4倍以上，更优选为1.5倍以上，进一步优选为1.6倍以上。作为这些范围的上限，没有特别限定，例如可举出5倍以下、4倍以下或3.5倍以下。
应予说明，转谷氨酰胺酶活性以Z-Gln-Gly(苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸)和羟基氯化铵为底物，将1分钟生成1μ摩尔羟肟酸的酶活性作为1单位(1U)。
作为所述(I-2)、(II-2)、(III-2)、(I-3)、(II-3)和(III-3)的多肽的优选例，可举出在包含相对于序列号1的氨基酸序列的序列一致性高的氨基酸序列的以下特定的转谷氨酰胺酶中，包含替换为上述(1)～(60)中至少任一项所示的三氨基酸残基的组合或上述的(61)或(62)所示的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。作为该特定的转谷氨酰胺酶，可举出来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，且包含序列号2所示的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶；来源于白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)，且包含NCBI ReferenceSequence：WP_087929495.1所示的氨基酸序列(相对于序列号1的序列一致性为82.4％)的转谷氨酰胺酶；来源于黄网链霉菌(Streptomyces luteireticuli)，且包含GenBank：AAR31178.1所示的氨基酸序列(相对于序列号1的序列一致性为82.0％)的转谷氨酰胺酶；来源于肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)，且包含GenBank：CAA70055.1所示的氨基酸序列(相对于序列号1的序列一致性为79.6％)的转谷氨酰胺酶；来源于扁平链霉菌(Streptomyces platensis)，且包含GenBank：AAS84612.1所示的氨基酸序列(相对于序列号1的序列一致性为79.9％)的转谷氨酰胺酶；来源于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，且包含GenBank：ATI36569.1所示的氨基酸序列(相对于序列号1的序列一致性为79.9％)的转谷氨酰胺酶等。
2.DNA
本发明的DNA是编码在上述“1.修饰型转谷氨酰胺酶”中描述的修饰型转谷氨酰胺酶的DNA。
本发明的DNA只要是具有编码包含在上述“1.修饰型转谷氨酰胺酶”中描述的(I-1)～(I-3)、(II-1)～(II-3)和(III-1)～(III-3)所示的多肽的修饰型转谷氨酰胺酶的碱基序列的DNA就没有特别限定。作为编码(I-1)～(I-3)、(II-1)～(II-3)和(III-1)～(III-3)所示的多肽的基准序列即序列号1所示的氨基酸序列的DNA的碱基序列，可举出序列号3(编码来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶的5重突变体(S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L)的DNA的碱基序列)。因此，本领域技术人员能够以序列号3为基准序列适当设计本发明的DNA。
作为本发明的DNA的例子，可举出以下[i]～[iii]中任一项所示的DNA。
[i]一种DNA，其包含序列号3所示的碱基序列的第745～753位被替换为下述表5所示的[1]～[41]中任一个碱基序列、序列号3所示的碱基序列的第727～735位被替换为下述表5所示的[42]～[60]中任一个碱基序列、和/或、序列号3所示的碱基序列的第4～6位被替换为下述表5所示的[61]～[62]中任一个碱基序列的碱基序列。
包含序列号3所示的碱基序列的第745～753位被替换为下述表5所示的[1]～[41]中任一个碱基序列的碱基序列的DNA，分别编码包含序列号1所示的氨基酸序列中第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为上述表1、3的(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列的多肽(所述(I-1)所示的多肽)。包含序列号3所示的碱基序列的第727～735位被替换为下述表5所示的[42]～[60]中任一个碱基序列的碱基序列的DNA，分别编码包含序列号1所示的氨基酸序列中第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为上述表2、4的(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列的多肽(所述(II-1)所示的多肽)。包含序列号3所示的碱基序列的第4～6位被替换为下述表5所示的[61]～[62]中任一个碱基序列的碱基序列的DNA，分别编码包含序列号1所示的氨基酸序列中第2位的氨基酸残基被替换为上述(61)～(62)中的任一项所示的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽(所述(III-1)所示的多肽)。
[表5]
[ii]一种DNA,其为编码在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高的多肽的DNA，其在严格条件下与包含与上述[i]所示的DNA互补的碱基序列的DNA杂交。
在此，“严格条件下”是指在包含0.5％SDS、5×Denhartz’s[Denhartz’s、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll400]和100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，在50℃～65℃下保温4小时～一夜的条件。
在严格条件下的杂交，具体通过以下方法进行。即，制成将DNA文库或cDNA文库固定化而成的尼龙膜，在包含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhartz’s、100μg/ml鲑鱼精子DNA的预杂交溶液中，在65℃下封闭尼龙膜。然后，加入用32P标记的各探针，在65℃下保温一夜。将该尼龙膜在6×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的2×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的0.2×SSC中、45℃下清洗30分钟后，采取放射自显影术，能够检测出与探针特异性杂交的DNA。
[iii]编码在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高的多肽的DNA，可举出与上述[i]所示的DNA具有70％以上的同源性的DNA。作为该同源性，可举出优选为75％以上、79％以上、85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，更进一步优选为98.5％以上，特别优选为99％以上、99.5％以上、99.9％以上。
在此，DNA的“同源性”可以使用具有将基准序列作为查询序列进行比较的算法的、公开或市售的软件来计算。具体而言，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(GENETYXCORPORATION制造)等，将它们设定为默认参数使用即可。
本发明的DNA例如能够通过在编码包含序列号1所示的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶的DNA中导入替换为上述(1)～(60)中的任一项所示的三氨基酸残基的组合或上述(61)或(62)所示的氨基酸残基的突变而得到。另外，本发明的DNA也能够通过基因的全合成法而进行人工合成。
在使用包含上述序列号3所示的碱基序列的DNA作为编码包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的DNA的情况下，包含该序列号3所示的碱基序列的DNA能够通过使用PCR的常规方法从来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶的5重突变体(S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L)的基因组DNA中分离。
在碱基序列的特定位点导入特定突变的方法是公知的，例如能够利用DNA的位点特异性突变导入法等。作为变换DNA中的碱基的具体方法，例如可举出市售的试剂盒(QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit：安捷伦科技，KOD-Plus-Mutagenesis kit：东洋纺制造等)的利用等。
在碱基序列中导入突变得到的DNA可使用DNA测序仪确认碱基序列。一旦确定碱基序列，之后通过以化学合成、克隆的探针作为模板的PCR、或以具有该碱基序列的DNA片段作为探针的杂交，可以得到编码所述多肽的DNA。
另外，也可以通过定点诱变法等合成作为编码所述多肽的DNA的突变型的、与突变前具有同等功能的DNA。应予说明，在编码所述多肽的DNA中导入突变时，能够通过Kunkel法、缺口双链诱变法(Gapped duplex)、Mega-primer PCR法等公知的方法进行。
本发明的DNA优选为使密码子使用频率在宿主中最适化的DNA，更优选为使密码子使用频率在大肠杆菌中最适化的DNA。
作为表示密码子使用频率的指标，可以选择各密码子的宿主最适密码子使用频率的总计。最适密码子可定义为对应于同一氨基酸的密码子中使用频率最高的密码子。密码子使用频率只要是在宿主中最适合的密码子就没有特别限定，例如，作为大肠杆菌的最适密码子的一例，可举出以下密码子。F：苯丙氨酸(ttt)、L：亮氨酸(ctg)、I：异亮氨酸(att)、M：蛋氨酸(atg)、V：缬氨酸(gtg)、Y：酪氨酸(tat)、终止密码子(taa)、H：组氨酸(cat)、Q：谷氨酰胺(cag)、N：天冬酰胺(aat)、K：赖氨酸(aaa)、D：天冬氨酸(gat)、E：谷氨酸(gaa)、S：丝氨酸(agc)、P：脯氨酸(ccg)、T：苏氨酸(acc)、A：丙氨酸(gcg)、C：半胱氨酸(tgc)、W：色氨酸(tgg)、R：精氨酸(cgc)、G：甘氨酸(ggc)。
3.表达盒或重组载体
本发明的表达盒或重组载体包含上述“2.DNA”中记载的DNA(以下，记载为“本发明的DNA”)。本发明的表达盒或重组载体可以通过在本发明的DNA中连接启动子和终止子，或者，通过在表达载体中插入本发明的表达盒或本发明的DNA而得到。
在本发明的表达盒或本发明的重组载体中，作为控制因子，除了启动子和终止子以外，还可以根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。这些控制因子只要可作用地连接于本发明的DNA即可。可作用地连接是指，调节本发明的DNA的各种控制因子和本发明的DNA在宿主细胞中能够以可作用的状态连接。
关于本发明的重组载体，作为表达载体，优选由在宿主内可自律性增殖的噬菌体、质粒、或病毒作为基因重组用途而构建的表达载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为能够在商业上获得的表达载体，可举出pQE系载体(QIAGEN株式会社)、pDR540、pRIT2T(GEHealthcare Bio-Science株式会社)、pET系载体(Merck株式会社)等。表达载体只要选择使用与宿主细胞的适当组合即可，例如，在将大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可举出pET系载体与DH5α大肠菌株的组合、pET系载体与BL21(DE3)大肠菌株的组合、或pDR540载体与JM109大肠菌株的组合等。
4.转化体
本发明的转化体是通过上述“3.表达盒或重组载体”中记载的表达盒或重组载体转化宿主而得到的转化体。
作为在转化体的制造中使用的宿主，只要是能够导入基因，表达盒或重组载体稳定且能够自主增殖，能够表达包含本发明的DNA的基因的性状的宿主，就没有特别限制，例如，作为优选例，可举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等的芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等的假单胞菌属等的细菌；酵母等，除此之外，也可以是动物细胞、昆虫细胞、植物等。
本发明的转化体能够通过在宿主中导入本发明的表达盒或本发明的重组载体而得到。导入本发明的DNA的部位只要能够表达目标基因，就没有特别限定，可以在质粒上，也可以在基因组上。作为导入本发明的表达盒或本发明的重组载体的具体方法，例如可举出重组载体法、基因组编辑法。向宿主导入表达盒或重组载体的条件根据宿主的种类等适当设定即可。如果宿主是细菌的情况下，则例如可举出使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法以及电穿孔法等。如果宿主是酵母的情况下，则例如可举出电穿孔法(Electroporation method)、原生质球法和醋酸锂法等。如果是宿主为动物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质体转染法等。如果是宿主为昆虫细胞的情况，则例如可举出磷酸钙法、脂质体转染法和电穿孔法等。如果是宿主为植物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、农杆菌法、粒子枪法和PEG法等。
本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主中的确认能够通过PCR法、Southern杂交法和Northern杂交法等进行。
在通过PCR法确认本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主中的情况下，例如，从转化体中分离、纯化基因组DNA或表达盒或重组载体即可。
表达盒或重组载体的分离、纯化，例如在宿主为细菌的情况下，基于将细菌溶菌而得到的溶菌物进行。作为溶菌的方法，例如利用溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶实施处理，根据需要并用蛋白酶、其他酶以及月桂基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。
进而还可以组合冻融及弗氏压碎处理之类的物理破碎方法。从溶菌物分离、纯化DNA例如能够通过适当组合利用苯酚处理以及蛋白酶处理的除蛋白处理、核糖核酸酶处理、醇沉淀处理以及市售的试剂盒来进行。
DNA的切断可以按照常规方法，例如使用限制酶处理来进行。作为限制酶，例如使用作用于特定的核酸序列的II型限制酶。DNA与表达盒或表达载体的结合，例如使用DNA连接酶进行。
然后，以分离、纯化的DNA为模板，在本发明的DNA上设计特异性引物进行PCR。对通过PCR得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，利用溴化乙锭和SYBR Green液等进行染色，然后将扩增产物作为条带进行检测，由此能够确认转化。
另外，也能够使用预先用荧光色素等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。进而，也可以采用使扩增产物结合于微孔板等固相并通过荧光和酶反应等确认扩增产物的方法。
5.修饰型转谷氨酰胺酶的制造方法
本发明的修饰型转谷氨酰胺酶的制造方法是制造上述“1.修饰型转谷氨酰胺酶”中记载的酶的方法，其包含培养本发明的转化体的工序。应予说明，在修饰型转谷氨酰胺酶中包含的(1)～(62)中的任一项所示的特定的突变被自然导入的情况下，通过包括培养产生修饰型转谷氨酰胺酶的微生物的工序的制造方法，能够得到修饰型转谷氨酰胺酶。
上述培养条件考虑上述转化体或上述微生物的营养生理性质而适当设定即可，优选地可举出液体培养。另外，如果是进行工业制造的情况，则优选通气搅拌培养。
作为培养基的营养源，能够使用上述转化体或上述微生物的生长需要的营养源。作为碳源，只要为能够同化的碳化合物即可，例如可举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。
作为氮源，只要为能够同化的氮化合物即可，例如可举出蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物等。
除了碳源及氮源以外，可根据需要使用例如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰及锌等盐类、特定的氨基酸以及特定的维生素等。
培养温度能够在本发明的上述转化体或上述微生物能够生长且上述转化体或上述微生物产生修饰型转谷氨酰胺酶的范围内适当设定，优选为15～37℃左右。培养只要预估修饰型转谷氨酰胺酶达到最高产量的时期并在适当时期完成即可，通常可举出培养时间为12～48小时左右。
上述转化体或上述微生物的培养后，将培养液通过离心分离等方法回收培养上清或菌体，菌体通过超声波和弗氏压碎器这样的机械方法或溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶实施处理，根据需要使用蛋白酶等酶或月桂基硫酸钠(SDS)等表面活性剂进行可溶化，能够得到包含修饰型转谷氨酰胺酶的水溶性级分。
另外，通过选择适当的表达盒或表达载体和宿主，也能够使表达的修饰型转谷氨酰胺酶分泌到培养液中。
如上所述得到的包含修饰型转谷氨酰胺酶的水溶性级分可以直接供于纯化处理，也可以将该水溶性级分中的修饰型转谷氨酰胺酶浓缩后供于纯化处理。
浓缩例如可通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、基于亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇和丙酮)的分步沉淀法等而进行。
修饰型转谷氨酰胺酶的纯化处理例如能够通过适当组合凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等方法来进行。
如此纯化的修饰型转谷氨酰胺酶能够根据需要通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等进行粉末化而在市场上流通。
6.酶制剂
修饰型转谷氨酰胺酶能够以酶制剂的形式提供。因此，本发明还提供包含上述“1.修饰型转谷氨酰胺酶”中记载的修饰型转谷氨酰胺酶作为有效成分的酶制剂。
作为本发明的酶制剂中的修饰型转谷氨酰胺酶的含量，没有特别限定，例如可举出1U/g以上，优选为10U/g以上，更优选为100U/g以上，进一步优选为250U/g以上，特别优选为500U/g以上、1000U/g以上、2000U/g以上。
本发明的酶制剂，除了修饰型转谷氨酰胺酶以外，在不影响本发明效果的程度，还可以包含其他成分。作为其他成分，可举出修饰型转谷氨酰胺酶以外的其他酶、添加剂、上述制造方法中产生的培养残渣等。
作为其他酶，例如可举出淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、蛋白质脱酰胺酶、普鲁兰酶等。这些其他酶可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。
作为添加剂，可举出赋形剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可举出淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可举出磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可举出丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可举出苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可举出乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。这些添加剂可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。
作为培养残渣，可举出来自培养基的成分、夹杂蛋白质、菌体成分等。
作为本发明的酶制剂的形态，没有特别限定，例如可举出液状、固体状(粉末、颗粒等)等。所述组合物能够通过通常公知的方法来制备。
7.蛋白质材料的改性剂
上述修饰型转谷氨酰胺酶能够用于转谷氨酰胺酶的公知用途。例如，修饰型转谷氨酰胺酶能够以蛋白质材料的改性为目的而使用。因此，本发明还提供包含修饰型转谷氨酰胺酶的蛋白质材料的改性剂。
作为蛋白质材料的改性的具体方式没有特别限定，只要是由蛋白质分子的ε-(γ-Gln)-Lys交联键带来的特性变化即可。具体而言，作为蛋白质材料的改性，可举出蛋白质材料的粘着等。关于蛋白质材料的改性剂的具体使用方法，如后述“8.改性的蛋白质材料的制造方法”描述所示。
8.改性的蛋白质材料的制造方法
如上述所示，修饰型转谷氨酰胺酶能够以蛋白质材料的改性为目的而使用。因此，本发明还提供一种改性的蛋白质材料的制造方法，其包含使上述修饰型转谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。
在本发明的制造方法中，通过在修饰型转谷氨酰胺酶的作用条件下提供包含蛋白质材料和修饰型转谷氨酰胺酶的混合物进行改性蛋白质的反应。
作为蛋白质材料，只要是包含蛋白质的材料就没有特别限定，可以是食用和非食用中的任一者。食用的蛋白质材料能够作为饮食品或用于制造饮食品的原材料而使用。非食用的蛋白质材料能够用作蛋白质实验用的材料、医疗材料、纤维材料、香味化妆品材料等。
作为蛋白质材料的具体例，可举出蛋白质源本身、以及利用公知的方法从蛋白质源进行提高蛋白质含量的处理而得到的制备物，这些可以由本领域技术人员适当选择。例如，作为食用的蛋白质材料，可举出作为植物性蛋白质材料的由含有植物性蛋白质的食品得到的制备物；作为动物性蛋白质材料的含有动物性蛋白质的食品或由其制备的制备物。作为食用的植物性蛋白质，可举出大豆蛋白质、蚕豆蛋白质、豌豆蛋白质、鹰嘴豆蛋白质、绿豆蛋白质、羽扇豆蛋白质等豆蛋白质；小麦蛋白质、黑麦蛋白质、燕麦蛋白质、玉米蛋白质等谷物蛋白质等。作为食用的动物性蛋白质，可举出乳、鱼贝肉、畜肉、肌腱等。作为非食用的蛋白质材料，可举出来自乳、蛋白、血清等生物体试样的酪蛋白、白蛋白、球蛋白等；以及蚕丝、羊毛等。
作为修饰型转谷氨酰胺酶的作用条件中的温度条件，没有特别限定，由于上述修饰型转谷氨酰胺酶的加热温度区域中的转谷氨酰胺酶活性提高，因此温度条件优选为加热条件。作为具体的温度条件，例如可举出50℃以上，优选为60℃以上，更优选为65℃以上，进一步优选为68℃以上，进一步优选为74℃以上，更进一步优选为78℃以上。作为该加热条件的上限，没有特别限定，例如可举出90℃以下、85℃以下或82℃以下。
反应结束后，在进行酶失活处理后进行冷却，根据需要进行后处理，由此得到改性蛋白质材料。
实施例
以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明不被解释为限定于以下实施例。
试验例1
通过以下方法，制备作为包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的转谷氨酰胺酶(比较例1)的突变体即修饰型转谷氨酰胺酶(实施例1～60)。
1.突变株的制备
1-1.突变的导入
[1]适当设计表1(表3)和表2(表4)所示的(1)～(60)的特定的突变导入用的PCR引物。
[2]使用各PCR引物组，以引入有编码比较例1的转谷氨酰胺酶的基因(序列号3)的质粒pET20b为模板进行PCR(具体而言，在98℃进行1分钟的反应后，将在98℃下10秒、在60℃下15秒、在68℃下2分钟的反应进行15个循环，在68℃下反应5分钟，在4℃下放置。)。
[3]在得到的PCR反应液(25μL/管)中添加DpnI(1.5μL/管)进行处理(37℃，3小时以上)。
[4]使用T4激酶进行连接处理(16℃，一夜)。
[5]利用得到的连接反应液(11μL/管)转化大肠杆菌BL21(E.coli BL21)(DE3)，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行培养(37℃，一夜)，由此得到导入有突变的株。
1-2.酶提取液的取得
[1]将突变株接种于含氨苄青霉素的TB培养基，在33℃下培养48小时。在从培养开始起24小时的时间点添加IPTG(最终浓度0.1mM)。
[2]将培养液离心分离(3000g×10分钟)后，除去上清，回收菌体。
[3]添加溶菌剂使菌体溶菌。
[4]将溶菌液离心分离(3000g×10分钟)后，回收上清作为酶提取液。
1-3.成熟体化(除去前肽序列)
[1]将酶提取液与2mg/mL蛋白酶(分散酶(Dispase))溶液等量混合，使其反应(30℃，2小时以上)。
[2]将混合液离心分离(3000g×10分钟)后，回收上清，制成成熟体化酶(修饰型转谷氨酰胺酶)。
2.修饰型转谷氨酰胺酶的纯化
使用TALON Spin columns(Takara Bio公司)、HisTALON Buffer Set(Takara Bio公司)，按照所附的方案对各修饰型转谷氨酰胺酶进行纯化。在突变酶的特性评价时使用纯化的修饰型转谷氨酰胺酶。
3.修饰型转谷氨酰胺酶的特性评价
将2.42g的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇、0.70g的羟基氯化铵、0.31g的还原型谷胱甘肽、1.01g的Z-Gln-Gly(苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸)溶解于蒸馏水中，使总量为100mL(pH6.0)，由此得到底物溶液(R-1)。另一方面，通过将30mL的3M盐酸溶液、30mL的12％三氯乙酸溶液、30mL的5％氯化铁(III)溶液混合，得到显色溶液(R-2)。
利用200mM Tris-HCl(pH6.0)将制备的各修饰型转谷氨酰胺酶(成熟体化酶)稀释为适当的浓度，制成样品溶液。在10μL样品溶液中添加并混合100μL的底物溶液(R-1)后，在37℃下反应10分钟。加入100μL的显色溶液(R-2)使反应停止并且形成Fe络合物后，测定525nm处的吸光度。作为对照，使用预热失活的酶液同样进行反应并测定吸光度，求出与样品溶液的吸光度差。另外，使用L-谷氨酸-γ-单羟肟酸代替酶液制作标准曲线，求出由所述吸光度差生成的羟肟酸的量。将1分钟内生成1μ摩尔羟肟酸的转谷氨酰胺酶活性作为1单位(1U)。
3-1.加热温度条件下的反应性的评价
利用200mM Tris-HCl(pH6.0)将各修饰型转谷氨酰胺酶稀释5倍(样品溶液)，在反应温度50℃、60℃、65℃或70℃下测定转谷氨酰胺酶活性。
导出将比较例1的反应温度60℃下的转谷氨酰胺酶活性设为100％时的各修饰型转谷氨酰胺酶的相对转谷氨酰胺酶活性(％)。将结果示于表6和表7。应予说明，作为比较例2，使用来源于茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(野生型)进行相同的操作。
[表6]
※1：比较例1、2中，在序列号1的第249～251位未导入(1)～(41)的突变。
比较例1：序列号2的S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L 5重突变体(序列号1)
比较例2：茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)野生型转谷氨酰胺酶(序列号2)
[表7]
※2：比较例1、2中，在序列号1的第243～245位未导入(42)～(60)的突变。
比较例1：序列号2的S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L 5重突变体(序列号1)
比较例2：茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)野生型转谷氨酰胺酶(序列号2)
如表6和表7所示，具有(1)～(60)的特定突变的任意修饰型转谷氨酰胺酶与比较例1的转谷氨酰胺酶相比，在50℃以上的至少任意温度下转谷氨酰胺酶活性均提高。
试验例2
通过以下所示的方法，研究表8和表9所示的比较例的转谷氨酰胺酶和实施例的修饰型转谷氨酰胺酶在加热温度条件下的交联活性。
使在水中包含1重量％的酪蛋白(底物)和20μg的修饰型转谷氨酰胺酶的反应混合液在60℃、65℃、70℃、75℃或80℃下反应2小时。将反应后的反应混合液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，进行煮沸处理后，进行冰冷却，利用SDS-PAGE评价交联活性。将在60℃、70℃和80℃下的结果示于表8和表9。另外，对于比较例和部分实施例(实施例1、2、43)，将利用SDS-PAGE经时研究反应中的交联活性的结果示于图1～图5。在图1～图5中，“bla”表示仅在作为底物的酪蛋白(无酶)的情况下的反应的结果，“M”表示电泳标记物(Protein MolecularWeight Markers LMW(蛋白分子量标记物LMW)Global Life Sciences TechnologiesJapan株式会社Code No.17044601)。
[表8]
[表9]
如表8和表9、以及图1～图5所示，具有特定突变的实施例的修饰型转谷氨酰胺酶能够进行比较例的转谷氨酰胺酶无法实现的70℃以上的酪蛋白交联。特别是，根据实施例1和实施例2的修饰型转谷氨酰胺酶，即使在80℃的高温下也显示出优异的交联活性。
试验例3
制备包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽即转谷氨酰胺酶(比较例2)的突变体即修饰型转谷氨酰胺酶(实施例61、62)。具体而言，将基准序列变更为序列号2，除此以外，与试验例1的实施例1、2相同，制备修饰型转谷氨酰胺酶，并进行加热温度条件下的反应性的评价。将结果示于表10。表10中也一并示出试验例1中的比较例1以及实施例1、2的结果。
[表10]
※1：在比较例2、1中，序列号1的第249～251位未导入(1)～(41)的突变。
比较例2(实施例61、62的参照多肽)：茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)野生型转谷氨酰胺酶(序列号2)
比较例1(实施例1、2的参照多肽)：
序列号2的S2P/S23Y/24N/H289Y/K294L 5重突变体(序列号1)
如表10所示，具有(1)、(2)的特定突变的修饰型转谷氨酰胺酶，在该特定突变以外的部分与野生型相同的情况下(实施例61、62)，也与进一步导入其他突变的情况(实施例1、2)相同，与不具有该特定突变的转谷氨酰胺酶(分别为比较例2、比较例1)相比，在50℃以上的至少任意温度下转谷氨酰胺酶活性提高。
试验例4
制备将包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽即转谷氨酰胺酶(比较例2)的第2位氨基酸残基进行替换得到的突变体(比较例3、4和实施例63、64)。具体而言，将基准序列变更为序列号2，将替换位置变更为第2位，除此以外，与试验例1相同，制备修饰型转谷氨酰胺酶。其中，比较例3的第2位氨基酸残基与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相同，替换为P。另外，比较例4和实施例63、64的第2位氨基酸残基分别替换为Y、L、F。由此，准备比较例2、4和实施例63、64作为比较例3的转谷氨酰胺酶(包含相对于序列号1的氨基酸序列的序列一致性高的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶)的第2位氨基酸残基分别被替换为S、Y、L、F的修饰型转谷氨酰胺酶。对于这些修饰型转谷氨酰胺酶，与试验例1相同，进行加热温度条件下的反应性的评价。将结果示于表11。
[表11]
比较例3(实施例63、64，比较例2、4的参照多肽)：序列号2的S2P突变体
比较例2：茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)
野生型转谷氨酰胺酶(序列号2)
如表11所示，第2位具有特定(L或F)突变的修饰型转谷氨酰胺酶(实施例63、64)与不具有该特定突变的转谷氨酰胺酶(比较例3)相比，在60℃以上的至少任意温度下转谷氨酰胺酶活性提高，且在特别显著的程度上确认到在60℃～65℃下的转谷氨酰胺酶活性的提高效果超过1.4倍。应予说明，在具有与特定的突变不同的突变的比较例2、3的修饰型转谷氨酰胺酶中，比较例2的转谷氨酰胺酶的活性反而降低，比较例4的60℃下的比活性稍微提高，除此以外，几乎未确认到转谷氨酰胺酶的活性的提高。即，认为由实施例63、64确认到的显著的转谷氨酰胺酶活性提高效果是第2位具备特定的突变带来的特有效果。
试验例5
制备将包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽即转谷氨酰胺酶(比较例1)的第2位、第101位、第157位、第208位、第249位、第250位、第251位、第275位和第284位进行替换，或者进一步对第289位进行替换得到的突变体即修饰型转谷氨酰胺酶(实施例65、66)。具体而言，除了第249位、第250位、第251位的替换以外，还导入了第2位、第101位、第157位、第208位、第275位、第284位，或者进一步导入第289位的替换，除此以外，与试验例1的实施例2相同，制备修饰型转谷氨酰胺酶，并进行加热温度条件下的反应性的评价。将结果示于表12。
[表12]
比较例1：序列号2的S2P/S23Y/Y24N/H289Y/K294L 5重突变体(序列号1)
如表12所示，在第2位和第249位～第251位具有特定突变的修饰型转谷氨酰胺酶(实施例65、66)与不具有该特定突变的转谷氨酰胺酶(比较例1)相比，在50℃以上的至少任意温度下，特别是在60℃～70℃或65℃～70℃下，转谷氨酰胺酶活性提高。

Claims (11)

1.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其特征在于，包含以下(I-1)～(I-3)中任一项所示的多肽：
(I-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表1的(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表1]
(I-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(I-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第249位～第251位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(1)～(41)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
2.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其特征在于，包含以下(II-1)～(II-3)中任一项所示的多肽：
(II-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为以下表2的(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列，
[表2]
(II-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，导入有所述替换的三氨基酸残基的组合以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(II-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第243位～第245位的三氨基酸残基的组合被替换为所述(42)～(60)中任一项所示的三氨基酸残基的组合的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括导入有所述替换的三氨基酸残基的组合的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述三氨基酸残基的组合未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
3.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其特征在于，包含以下(III-1)～(III-3)中任一项所示的多肽：
(III-1)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第2位的氨基酸残基被替换为(61)L或(62)F的氨基酸序列，
(III-2)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，所述第2位氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高，
(III-3)多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第2位的氨基酸残基被替换为所述(61)或(62)的氨基酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的不包括所述第2位的氨基酸残基的序列一致性为70％以上，且在50℃以上的任意温度下的转谷氨酰胺酶活性与包含所述第2位氨基酸残基未被替换的氨基酸序列的多肽在所述温度下的转谷氨酰胺酶活性相比提高。
4.一种DNA，其特征在于，所述DNA编码权利要求1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
5.一种表达盒或重组载体，其特征在于，所述表达盒或重组载体包含权利要求4所述的DNA。
6.一种转化体，其特征在于，所述转化体是通过权利要求5所述的表达盒或重组载体对宿主进行转化而得到的。
7.一种修饰型转谷氨酰胺酶的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括培养权利要求6所述的转化体的工序。
8.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
9.一种蛋白质材料的改性剂，其特征在于，所述蛋白质材料的改性剂包含权利要求1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。
10.一种改性的蛋白质材料的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括使权利要求1～3中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述蛋白质材料为食用的。
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