CN118043039A - 用于改善腺相关病毒（aav）递送的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于改善药物组合物向有需要的受试者的中枢神经系统的递送的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。

Description

用于改善腺相关病毒(AAV)递送的方法
技术领域
本披露涉及通过调节类淋巴流入(glymphatic influx)来改善药物组合物向靶组织诸如中枢神经系统的递送。
背景技术
已经开发了多种治疗剂用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病。然而，血脑屏障(BBB)的高度不渗透性和治疗剂向脑的差渗透性严重限制了治疗剂向脑的递送。AAV载体已经作为治疗各种遗传决定的疾病的有前景的方法出现，但是需要递送到特定的组织和细胞类型中并在其中进行转基因表达，以实现功效并避免不希望的毒性。这一过程首先需要将目标组织暴露于载体，随后是载体针对目标靶细胞类型的向性运动。对于需要转导中枢神经系统的疾病，已经尝试了几种递送途径以实现充分的组织暴露，包括全身血管内施用以及直接注射到鞘内和脑室内空间。血管内施用后，载体必须跨过血脑屏障，这似乎限制了许多AAV血清型暴露于脑实质。直接注射到鞘内和脑室内空间绕过了血脑屏障，但载体从脑脊液分布到脑实质的机制仍未确定。
为了进一步阐明鞘内施用AAV载体后的分布机制，在食蟹猴中进行了一项非人灵长类动物研究。结果表明，AAV在脑中的转导水平较低。类淋巴系统，一种促进CSF和间质空间之间流体交换的血管周围空间网络，可用于增强从CSF到实质的药物递送。在睡眠和诱导慢波睡眠样状态的麻醉方案期间，类淋巴流量最高。(Lilius TO等人Dexmedetomidineenhances glymphatic brain delivery of intrathecally administered drugs.[右美托咪定增强鞘内施用的药物的类淋巴脑递送]J Control Release.[控制释放杂志]2019年6月28日；304:29-38)。因此，需要通过调节类淋巴流量来改善AAV向脑的递送。
发明内容
本披露内容提供了通过调节类淋巴流入来改善药物组合物向靶组织诸如中枢神经系统的递送的方法。类淋巴是一种最近被认识到的系统，通过该系统，CSF沿着由邻近星形胶质细胞的血管所形成的动脉周围空间被抽入脑的较深区域，在这些较深区域中，CSF可以与间质液交换，然后在等同的小静脉周围空间中离开脑。该系统被认为在流体的移动和从脑实质中去除大分子方面起主要作用。与AAV载体大小相当的较大颗粒(诸如脂蛋白)移动通过类淋巴系统。研究发现，AAV在脑中的分布模式与载体在脑表面衬膜上的有限扩散以及载体主要通过类淋巴流入进入的情况一致。意外地发现，通过调节类淋巴流入可以改善AAV向脑的递送。增强类淋巴流入还可以减少用包含病毒载体的药物组合物治疗的患者群体中病毒载体的可变脑分布，以及减少与AAV基因疗法相关联的肝和/或DRG毒性。
在一个方面，本披露内容提供了用于改善药物组合物向有需要的受试者的中枢神经系统的递送的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。
在一些实施例中，该药剂与该药物组合物同时或依次施用。在一些实施例中，在施用该药物组合物之前施用该药剂。在一些实施例中，在施用该药物组合物之后施用该药剂。在一些实施例中，该药物组合物通过鞘内(IT)、枕大池内(ICM)和/或脑室内(ICV)施用来施用。在一些实施例中，该药剂通过静脉内输注、静脉内注射、吸入、腹膜内、口服、皮下或肌内途径施用。
在一些实施例中，该药剂促进血脑屏障内的间质液循环，例如，其中该药剂包含水通道蛋白4(AQP4)促进剂，例如TGN-073。在一些实施例中，该药剂包含上调AQP4表达(例如七氟烷)或改变AQP4的亚细胞定位的化合物。
在一些实施例中，该药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定(clonidine)、西扎尼定(cizanidine)或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。在一些实施例中，该药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，该麻醉剂是氯胺酮(ketamine)、右美托咪定或赛拉嗪(xylazine)或其组合。在优选的实施例中，该药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，并随后施用右美托咪定。
在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，随后施用右美托咪定，并随后施用七氟烷。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
在一些实施例中，氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
在一些实施例中，右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。
在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)。然后，在完成氯胺酮和右美托咪定的施用之后，将该受试者维持在下肢抬高的背卧(特伦德伦伯格卧位(Trendelenburg like position))，保持10至15分钟。向该受试者额外施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)，其中给药发生在标准时间8-10AM。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)，随后施用七氟烷吸入麻醉剂。
在一些实施例中，该药剂诱导血浆高渗性。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。在优选的实施例中，该药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。在一些实施例中，高渗盐水是2％ NaCl、3％ NaCl、5％ NaCl、7％ NaCl或23％ NaCl，并且优选地是3％ NaCl。在一些实施例中，3％ NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
在一些实施例中，该药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。在一些实施例中，该药剂选自由以下组成的组：噻加宾(Tiagabine)、加波沙朵(Gaboxadol)、加巴喷丁(Gabapentin)、普瑞巴林(Pregabalin)、GHB、利坦色林(Ritanserin)、依利色林(Eplivanserin)、米氮平(Mirtazapine)、奥氮平(Olanzapine)和曲唑酮(Trazodone)，或其组合。
在一些实施例中，其中该药剂包含VEGF，诸如VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
在一些实施例中，该药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
在一些实施例中，该药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该药物组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
在另一方面，本披露内容提供了治疗神经疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据前述实施例中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物包含编码与该神经疾病相关联的基因的AAV，其中该药物组合物的施用与睡眠周期期间的CSF流入一致。
在一些实施例中，当该受试者入睡(例如，如通过脑电图(EEG)监测所示)时施用该药物组合物。
在一些实施例中，将睡眠增强药物与该药物组合物组合施用于该受试者。
在一些实施例中，该睡眠增强药物选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
在另一方面，本披露内容提供了用于改善神经退行性治疗剂在脑中的转导效率和/或分布的方法，该方法包括在有需要的受试者中将该神经退行性治疗剂与增强类淋巴流入的第二药剂组合施用，从而改善该神经退行性治疗剂在该受试者中的转导效率。
在一些实施例中，该神经退行性治疗剂是靶向CNS的病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
在一些实施例中，该第二药剂与该神经退行性治疗剂同时或依次施用。在一些实施例中，该第二药剂在该神经退行性治疗剂之前施用。在一些实施例中，该第二药剂在该神经退行性治疗剂之后施用。
在一些实施例中，该神经退行性治疗剂通过鞘内(IT)、枕大池内(ICM)和/或ICV施用，通过推注、缓慢推注和/或通过所植入的鞘内或脑室内导管进行输注来施用。
在一些实施例中，该第二药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
在一些实施例中，该第二药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。在一些实施例中，该第二药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
在一些实施例中，该第二药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
在一些实施例中，该第二药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，该麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
在优选的实施例中，其中该第二药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
在一些实施例中，在施用该神经退行性治疗剂之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该神经退行性治疗剂之前约10至15分钟施用氯胺酮。
在一些实施例中，氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
在一些实施例中，右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)。然后，在完成氯胺酮和右美托咪定的施用之后，将该受试者维持在下肢抬高的背卧(特伦德伦伯格卧位)，保持10至15分钟。向该受试者额外施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)，其中给药发生在标准时间8-10AM。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)，随后施用七氟烷吸入麻醉剂。
在一些实施例中，该第二药剂诱导血浆高渗性。在一些实施例中，该第二药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。在一些实施例中，该第二药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。在一些实施例中，高渗盐水是2％ NaCl、3％ NaCl、5％NaCl、7％ NaCl或23％ NaCl，并且优选地是3％ NaCl。在一些实施例中，3％ NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
在一些实施例中，该第二药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。在一些实施例中，该第二药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
在一些实施例中，该第二药剂包含VEGF，诸如VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1至2小时。
在一些实施例中，该神经退行性治疗剂是腺相关病毒(AAV)病毒载体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
在另一方面，本披露内容提供了增加鞘内递送的药物组合物的功效的方法，该方法包括向有需要的受试者施用该药物组合物与增强类淋巴流入的药剂的组合。
在一些实施例中，该药剂与该组合物同时或依次施用。在一些实施例中，在施用该组合物之前施用该药剂。在一些实施例中，在施用该组合物之后施用该药剂。在一些实施例中，该药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
在一些实施例中，该药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
在一些实施例中，该药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
在一些实施例中，该药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定(clonidine)、西扎尼定(cizanidine)或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
在一些实施例中，该药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，其中该麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
在优选的实施例中，该药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，并随后施用右美托咪定。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，随后施用右美托咪定，并随后施用七氟烷。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。在一些实施例中，氯胺酮以100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。在一些实施例中，如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)。然后，在完成氯胺酮和右美托咪定的施用之后，将该受试者维持在下肢抬高的背卧(特伦德伦伯格卧位)，保持10至15分钟。向该受试者额外施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)，其中给药发生在标准时间8-10AM。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)，随后施用七氟烷吸入麻醉剂。
在一些实施例中，该药剂诱导血浆高渗性。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水或甘露醇。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水。在一些实施例中，该高渗盐水是3％NaCl。在一些实施例中，3％ NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
在一些实施例中，其中该药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。在一些实施例中，该药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
在一些实施例中，该药剂包含VEGF，诸如VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
在一些实施例中，该药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
在一些实施例中，该药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
在另一方面，本披露内容提供了减少用包含病毒载体的药物组合物治疗的患者群体中病毒载体的可变脑分布的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。
在一些实施例中，该药剂与该组合物同时或依次施用。在一些实施例中，在施用该组合物之前施用该药剂。在一些实施例中，在施用该组合物之后施用该药剂。
在一些实施例中，该药物组合物通过鞘内(IT)施用和/或通过枕大池内(ICM)来施用。在一些实施例中，该药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
在一些实施例中，该药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
在一些实施例中，该药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
在一些实施例中，该药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定(clonidine)、西扎尼定(cizanidine)或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
在一些实施例中，该药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，该麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
在优选的实施例中，该药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，并随后施用右美托咪定。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，随后施用右美托咪定，并随后施用七氟烷。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。在一些实施例中，氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。在一些实施例中，右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)。然后，在完成氯胺酮和右美托咪定的施用之后，将该受试者维持在下肢抬高的背卧(特伦德伦伯格卧位)，保持10至15分钟。向该受试者额外施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)，其中给药发生在标准时间8-10AM。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)，随后施用七氟烷吸入麻醉剂。
在一些实施例中，该药剂诱导血浆高渗性。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水或甘露醇。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水。在一些实施例中，高渗盐水是2％ NaCl、3％ NaCl、5％ NaCl、7％ NaCl或23％ NaCl，并且优选地是3％ NaCl。在一些实施例中，3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
在一些实施例中，该药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。在一些实施例中，该药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
在一些实施例中，该药剂包含VEGF，诸如VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
在一些实施例中，该药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
在另一方面，本披露内容提供了减少靶向有需要的受试者的CNS的药物组合物的全身暴露以便减少该受试者的肝和/或DRG毒性的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。
在一些实施例中，该药剂与该组合物同时或依次施用。在一些实施例中，在施用该组合物之前施用该药剂。在一些实施例中，在施用该组合物之后施用该药剂。
在一些实施例中，该药物组合物通过鞘内(IT)施用和/或通过枕大池内(ICM)来施用。
在一些实施例中，该药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
在一些实施例中，该药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
在一些实施例中，该药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
在一些实施例中，该药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定(clonidine)、西扎尼定(cizanidine)或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
在一些实施例中，该药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，该麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
在优选的实施例中，该药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，并随后施用右美托咪定。在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，随后施用右美托咪定，并随后施用七氟烷。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。在一些实施例中，氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。在一些实施例中，右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)。然后，在完成氯胺酮和右美托咪定的施用之后，将该受试者维持在下肢抬高的背卧(特伦德伦伯格卧位)，保持10至15分钟。向该受试者额外施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)，其中给药发生在标准时间8-10AM。
在一些优选的实施例中，在给药前10至15天向该受试者施用氯胺酮(10mg/kg)，随后施用右美托咪定(0.02mg/kg)，随后施用七氟烷吸入麻醉剂。
在一些实施例中，该药剂诱导血浆高渗性。在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。在一些实施例中，该药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。在一些实施例中，高渗盐水是2％ NaCl、3％ NaCl、5％ NaCl、7％ NaCl或23％ NaCl，并且优选地是3％ NaCl。在一些实施例中，3％ NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
在一些实施例中，该药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。在一些实施例中，该药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
在一些实施例中，该药剂包含VEGF，诸如VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
在一些实施例中，该药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
在一些实施例中，该药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
以下章节中提供了本发明的额外实施例。
附图说明
图1A-G是示出通过腰椎穿刺鞘内给药3.0×1013vg scAAV9-CB-GFP后1个月时脑中GFP蛋白表达的免疫组织化学的图像。图1A是动物P0304块44的图像。图1B是动物P0303块46的图像。图1C是动物P0304块44的图像。图1D是动物P0302块47的图像。图1E是动物P0503块47的图像。图1F是动物P0303块47的图像。图1G是动物P0301块51的图像。a、b、c、d和e标记表示低倍显微照片中方框内的放大区域。
图2是示出神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和GFP的免疫组织化学的图像，该免疫组织化学证明了共定位。GFP阳性细胞在形态上与星形胶质细胞一致(GFP-DAB，左)并且与GFAP共定位(GFAP-蓝色和GFP-黄色，右)。
图3A和3B分别是图像和散点图，其示出了以DAB阳性像素百分比表示的脊髓、背根神经节和脑区域中GFP表达的定量图像分析。在脊髓的下部运动神经元和背根神经节的神经元中检测到中度至高度表达，而在脑的多个区域中检测到最小和可变的表达。
图4是示出小脑和脑干切片上GFP蛋白的免疫组织化学的图像。观察到浦肯野细胞神经元和深部小脑核内的神经元的最小转导。GFP信号主要存在于伯格曼胶质细胞(Bergman glia)中。
图5是示出GFP蛋白的免疫组织化学的图像。在星形胶质细胞中观察到脑室周围GFP蛋白表达。这种脑室周围表达在个体动物中是可变的，并且限于周围神经毡的邻近500-1000um。
图6是示出枕叶皮质切片上GFP蛋白的免疫组织化学的图像。多灶性蛋白表达存在于血管周围星形胶质细胞中。a、b和c标记表示低倍显微照片中方框内的放大区域。
图7是示出枕叶皮质上GFP蛋白的免疫组织化学的图像。观察到在枕叶皮质中邻近穿支动脉的血管周围星形胶质细胞中的表达与通过类淋巴流入暴露于载体一致。
图8是示出使用免疫组织化学和定量图像分析检测枕叶皮质上的GFP蛋白的图像。观察到邻近动脉血管供应的星形细胞表达的线性模式与通过类淋巴流入暴露于载体一致。
图9是示出在食蟹猴中鞘内给药AAV后载体分布到中枢神经系统和全身组织的模型的图像。由于CSF的快速周转，大多数载体通过分布于全身组织的蛛网膜颗粒和神经根从鞘内空间排出。有限的载体通过类淋巴流入和脑室周围扩散到达脑组织。30天时在脑组织中检测到大约0.01％的鞘内施用剂量，而在肝脏中检测到1.3％的鞘内施用剂量。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本披露内容，在整个具体实施方式中定义了某些术语。除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
通过结合附图，参考以下详细描述可以更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本披露内容的一部分。
在本文通篇，描述涉及组合物及使用这些组合物的方法。在本披露内容披露或声明与组合物相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于使用该组合物的方法或该组合物的用途。同样地，在本披露内容披露或声明与使用组合物的方法相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于该组合物。当表达数值范围时，其包括使用该范围内的任何特定值的实施例。进一步地，对范围中陈述的值的提及包括该范围内的每个值。所有范围均包括其端点并且是可组合的。当值是通过使用先行词“约”表达为近似值时，应当理解，该特定值形成了另一实施例。除非上下文另外明确地指示，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。除非另外指示其具体使用情形，否则“或”的使用将意指“和/或”。出于任何目的，本文引用的所有参考文献均通过援引并入。在参考文献与说明书发生冲突的情况下，以说明书为准。应当理解，出于清楚的目的本文披露于单独实施例的上下文中的披露的组合物和方法的某些特征还可以按组合形式提供于单个实施例中。相反地，出于简洁的目的披露于单个实施例的上下文中的披露的组合物和方法的不同特征还可以分开地或以任何子组合形式提供。
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该/所述(the)”包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。术语“约”或“大约”当在数值和范围的上下文使用时，是指大约或接近所述值或范围的值或范围，使得本实施例可以如预期进行，这对技术人员来说从本文所包含的教导中是显而易见的。在一些实施例中，约意指数值量±10％。
如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”是指与所述参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指落入所述参考值任一方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
如本文所用，术语“类淋巴”或“胶质淋巴”、“类淋巴系统”或“类淋巴途径”是指经由血管周围脑脊液(CSF)流动途径的中枢神经系统(“CNS”)的脑废物清除途径。类淋巴系统依赖于CSF和间质液(ISF)的交换，该交换允许将废物转移到CSF并输送出脑。
如本文所用，术语“药物组合物”意指其中活性成分的生物活性具有治疗效果的组合物，因此该组合物可出于治疗目的施用于受试者，例如人。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内，适合用于与人和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
如本文所用，术语“治疗剂”是指能够被施用以实现所需效果的任何药理学活性物质。
如本文所用，“神经退行性障碍”或“神经退行性疾病”是指中枢神经系统(CNS)障碍，其特征在于神经系统的一个或多个区域中的神经元死亡和受影响各方的后续功能损害。在一些实施例中，神经障碍可以是神经退行性障碍，包括但不限于阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sDisease，AD)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)；亨廷顿氏病(Huntingtin's disease，HD)；弗里德赖希氏共济失调(Friedreich's ataxia，FA)；帕金森氏病(Parkinson Disease，PD)；多系统萎缩症(MSA)；脊髓性肌萎缩症(SMA)、多发性硬化症(MS)；原发性进行性失语症；进行性核上性麻痹；痴呆；脑癌、退行性神经疾病、脑炎、癫痫、引起神经退化的遗传性脑部障碍、色素性视网膜炎(RP)、头部和脑部畸形、脑积水、中风、朊病毒病、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(INCL)(一种由溶酶体酶棕榈酰蛋白硫酯酶-1(PPT1)缺陷引起的儿童神经退行性疾病)等。
如本文所用，“治疗(treatment)”(以及其语法变型诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗的个体的自然过程并且可以为了预防而进行或在临床病理学过程期间进行的临床干预。令人期望的治疗效果包括但不限于预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况以及缓解或改进预后。在一些实施例中，本披露内容的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
药剂例如药物配制品的“有效量”是指以剂量计并且在所需的时间段内有效实现所期望的治疗或预防结果的量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人灵长类动物，诸如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施例中，个体或受试者是人。
如本文所用，术语“鞘内(IT)施用”或“鞘内(IT)注射”是指注射到脊椎管(脊髓周围的鞘内空间)中。可以使用各种技术，包括但不限于通过钻孔或脑池穿刺或腰椎穿刺等进行侧脑室注射。在一些实施例中，根据本披露内容的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指经由腰部或腰区进行IT施用或递送，即，腰部IT施用或递送。如本文所用，术语“腰区”或“腰部”是指第三和第四腰(下背部)椎骨之间的区域，并且更广泛地指脊柱的L2-S区。
如本文所用，术语“枕大池内(ICM)施用”或“枕大池内(ICM)注射”是指经由颅骨和脊柱顶部之间的开口注射到小脑周围和小脑下方的空间中。
如本文所用，术语“脑室内(ICV)施用”或“脑室内(ICV)注射”是指注射到脑中与脊髓的中央管连续的腔中。
如本文所用，术语“AQP4”或“水通道蛋白4”是指在中枢神经系统中起水转运蛋白作用的膜蛋白。它集中在围绕血管并维持血脑屏障完整性的星形胶质细胞的血管周围终足(endfeet)中，并在调节脑水平衡中具有重要作用。
如本文所用，术语“α-2肾上腺素能激动剂”是指有效地作用于α-2肾上腺素能受体或与α-2肾上腺素能受体结合并提供治疗效果的化学实体，诸如化合物、离子、复合物等。
如本文所用，“高渗”和“低渗”是例如与生理渗透压相关的相对术语，但也可以偏离生理渗透压，只要在两个区室(诸如血浆和中枢神经系统间质)之间实现渗透压差或梯度的最终目标，以促进类淋巴流量进入中枢神经系统间质、脑间质和/或脊髓间质。因此，“高渗溶液”是指相对于生理渗透压而言具有高渗性质的任何生理上和/或药学上可接受的溶液，包括高渗盐水或糖溶液。如本文所述，本披露内容中优选的高渗溶液优选地不引起BBB破坏。
如本文所用，术语“慢波睡眠”是指第3阶段睡眠或深度睡眠，其为非快速眼动(NREM)睡眠的最深阶段，并且特征在于δ波(通过EEG测量)。
如本文所用，术语“VEGF-C”是指血管内皮生长因子C，其是血小板衍生生长因子/血管内皮生长因子家族的成员。VEGF-C在以下文献中详细描述：WO 98/33917；Joukov等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],273(12):6599-6602(1998)；和Joukov等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],16(13):3898-3911(1997)，所有这些文献均通过援引以其全文并入本文。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，该多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合对应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“抗体”包括但不限于：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本披露内容的抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“反义寡核苷酸”是指与核酸序列的编码链或mRNA互补的核酸序列，无论其长度如何。可以将反义RNA引入单个细胞、组织或类器官。反义核酸可以含有经过修饰的主链，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他经过修饰的主链，或者可以含有非天然核苷间键。
如本文所用，术语“siRNA”意指干扰特定基因或转录后基因的表达的双链RNA分子。在一些实施例中，siRNA起作用以使用RNA干扰途径干扰或抑制基因表达。可以用以下中的一者或多者实现类似的干扰或抑制效果：短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(mRNA)和/或包含一个或多个经过修饰的核酸残基的核酸(诸如siRNA、shRNA或miRNA)，例如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、未锁定核酸(UNA)或三唑连接的DNA。最佳地，siRNA的长度为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并且在其3'端处具有双碱基的突出端。可以将这些dsRNA引入单个细胞或培养系统。此类siRNA用于下调mRNA水平或启动子活性。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指直径小于1000纳米(nm)的任何颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒具有小于300nm的直径，如美国国家科学基金会所定义的。在一些实施例中，纳米颗粒具有小于100nm的直径，如美国国立卫生研究院所定义的。术语“纳米颗粒”进一步包括具有纳米颗粒大小的脂质体和脂质颗粒。
术语“多腺苷酸化(polyA)信号序列”和“多腺苷酸化序列”是指为转录终止和向RNA转录物的3’末端添加腺苷均聚链提供信号的调节元件。多腺苷酸化信号可以包含终止信号(例如，AAUAAA序列或其他非经典序列)和任选地侧接的辅助元件(例如，富含GU的元件)和/或与有效切割和多腺苷酸化相关的其他元件。多腺苷酸化序列可以包含一系列通过多腺苷酸化附接到mRNA的3’末端的腺苷。特定的polyA信号序列可以包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:89的poly(A)信号。在一些实施例中，DNA调节序列或控制元件是组织特异性调节序列。
术语“转录后调节元件”(“PRE”)是指当转录为mRNA时，在mRNA转录水平调节基因表达的一个或多个调节元件。此类转录后调节元件的实例可以包括编码m微小RNA结合位点、RNA结合蛋白结合位点等的序列。可与本文披露的核酸分子和载体一起使用的转录后调节元件的实例包括土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)、肝炎转录后调节元件(HPRE)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式。它们可以包括一种或多种核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的、或衍生化的核苷酸碱基的聚合物，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白或肽典型地含有至少两个氨基酸或氨基酸变体，并且对可包含蛋白或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸或变体的任何肽或蛋白。这些术语包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
术语“序列同一性”和“序列同源性”在本文中可互换使用，并且如与多核苷酸或多肽结合使用的，是指当比较或比对多肽的多核苷酸的两个序列时，相同且处于相同相对位置的碱基或氨基酸的百分比。序列同一性可以以多种不同的方式确定。例如，可以使用各种方法和计算机程序(例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)比对序列。参见例如,Altschul等人,(1990)J.Mol.Bioi.[分子生物学杂志],215:403-10。
涉及本文讨论的核酸或蛋白的术语“分离的”是指已与在自然环境中通常存在的与其相关的一种或多种组分分开的核酸或蛋白。分开可以包括从较大的核酸(例如，从基因或染色体)或从通常与该核酸或蛋白接触的其他蛋白或分子去除。该术语涵盖但不要求完全分离。
如本文所用，包含“异源核酸序列”的分离的核酸是指包含在天然背景下发现通常不与分离的核酸的一个或多个其他组分可操作地连接的部分(即，异源核酸部分)的分离的核酸。例如，异源核酸可以包含最初未在天然衍生出分离的核酸的其他组分(例如，启动子)的细胞、细菌细胞、病毒、或生物体中发现的核酸序列，或其中未发现分离的核酸的其他组分(例如，启动子)与细胞、细菌细胞、病毒、或生物体中的异源核酸天然地可操作地连接的核酸序列。在一些实施例中，该异源核酸包括转基因。如本文所用，“转基因”是编码最初与核酸分子的一个或多个组分不相关的目的分子(例如，治疗性蛋白、报告蛋白或治疗性RNA分子)的核酸序列。在一些实施例中，异源核酸序列编码人蛋白。在一些实施例中，异源核酸序列编码RNA序列，例如shRNA。
“编码”特定RNA的DNA序列或DNA多核苷酸序列是能够转录为RNA的DNA的序列。DNA多核苷酸可以编码翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可以编码不翻译成蛋白质的RNA(例如，tRNA、rRNA、或指导RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。DNA序列或DNA多核苷酸序列也可以“编码”特定的多肽或蛋白序列，其中，例如，DNA直接编码可翻译成多肽或蛋白序列的mRNA。“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是当置于适当的调节序列的控制下时能够在体外或体内转录为mRNA(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界可以由5’端(N-端)处的起始密码子和3’端(C-端)处的翻译终止无义密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核生物mRNA的cDNA、来自原核或真核生物DNA的基因组DNA序列、以及合成核酸。转录终止序列将通常位于编码序列的3’。
如本文所用，术语“启动子”或“启动子序列”是例如通过结合RNA聚合酶能够促进可操作地连接的编码或非编码序列(例如下游(3’方向)编码或非编码序列)的转录(例如，能够引起可检测水平的转录和/或增加可检测水平的转录(相对于在该启动子不存在的情况下提供的水平))的DNA调节序列。在一些实施例中，启动子序列在其3’末端以转录起始位点为界，并延伸到上游(5’方向)，以包括用最小数目的碱基或元件以启动高于背景的可检测水平的转录。在一些实施例中，启动子序列可以包括转录起始位点、以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域。除了足以启动转录的序列之外，启动子还可以包括参与调节转录的其他调节元件的序列(例如增强子、科扎克序列和内含子)。各种启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子，可用于驱动本文披露的这些载体。本领域中已知的可在一些实施例中(例如，在本文披露的病毒载体中)使用的启动子的实例包括CMV启动子、CBA启动子、smCBA启动子和衍生自免疫球蛋白基因、SV40、或其他组织特异性基因(例如：RLBP1、RPE、VMD2)的启动子。此外，通过混合和匹配已知的调节元件产生功能性启动子的标准技术是本领域已知的。也可使用启动子的片段，例如那些保留至少最小数目的碱基或元件以启动高于背景的可检测水平的转录的片段。
在本文中可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如，短发夹RNA)或编码序列(例如，PGRN)的转录和/或调节编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，诸如启动子、增强子、沉默子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。
如本文所用，“体外”进行的过程是指在正常生物环境之外进行的过程，例如在试管、烧瓶、培养皿、人工培养基中进行的研究。“体内”进行的过程是指在活生物体或细胞内进行的过程，例如，在细胞培养物或小鼠中进行的研究。“离体”进行的研究是指在外部环境(例如，具有对自然条件的最小改变)中在来自生物体的组织中或对来自生物体的组织进行的研究，例如，允许在比体内实验更受控的条件下操作生物体的细胞或组织。
如本文所用，如应用于例如核酸、多肽、细胞、或生物体的术语“天然存在”或“未修饰”，是自然界中发现的核酸、多肽、细胞、或生物体。例如，存在于生物体(诸如病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，无论是存在于该生物体中还是从该生物体的一种或多种组分中分离的。
在一些实施例中，“载体”是任何遗传元件(例如，DNA、RNA、或其混合物)，该遗传元件含有能够在宿主细胞中表达的目的核酸(例如，转基因)，例如，在适用于递送至细胞、组织和/或生物体的较大核酸序列或结构中的目的核酸，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。例如，载体可以包含插入物(例如，包含编码待表达的基因的转基因或该基因的开放阅读框的异源核酸)以及一个或多个额外的元件，和/或适用于递送或控制该插入物的表达的元件。例如当与适当的控制元件相关时，载体可以能够复制和/或表达，并且其可以能够在细胞之间转移遗传信息。在一些实施例中，载体可以是适用于在宿主细胞中表达的载体，例如AAV载体。在一些实施例中，载体可以是适用于例如在细胞或生物反应器中表达和/或复制的质粒。在一些实施例中，特别地设计用于在靶细胞中表达异源核酸序列(例如，编码目的蛋白、shRNA等的转基因)的载体可以称为表达载体，并且通常具有驱动该转基因表达的启动子序列。在其他实施例中，载体(例如，转录载体)可以能够被转录但不被翻译：它们可以在靶细胞中复制但不表达。转录载体可以用于扩增它们的插入物。
术语“质粒”是指包含完整“复制子”的非染色体(并且典型地为双链)DNA序列，使得质粒在宿主细胞中复制。质粒可以是环状核酸。当将质粒放置在单细胞生物体内时，该质粒的DNA导致该生物体的特征发生改变或转化。例如，携带四环素抗性(TcR)基因的质粒将先前对四环素敏感的细胞转化为对其具有抗性的细胞。
如本文所用，术语“重组病毒”旨在意指包含转基因或其他异源核酸的非野生型和/或人工产生的重组病毒(例如，细小病毒、腺病毒、慢病毒或腺相关病毒等)。重组病毒可以包含包装在病毒(例如：AAV)衣壳内的重组病毒基因组。重组病毒的特定类型可以是“重组腺相关病毒”或“rAAV”。包装在病毒衣壳中的重组病毒基因组可以是病毒载体。在一些实施例中，本文披露的重组病毒包含病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、DNA病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
在另一实施例中，术语“转染”用以指细胞对外来DNA的摄取，使得一旦已将外源DNA引入细胞膜内侧，这些细胞就已被“转染”了。参见例如，Graham等人,(1973)Virology[病毒学],52:456；Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratories,New York[冷泉港实验室，纽约]；Davis等人,(1986)Basic Methods in Molecular Biology[分子生物学基本方法],Elsevier[爱思唯尔公司]；Chu等人,(1981)Gene[基因],13:197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞中。在一些实施例中，术语“转导”用以指细胞对外来DNA的摄取，其中该外来DNA由病毒或病毒载体提供。因此，当已将外源DNA引入细胞膜内侧时，细胞就已被“转导”。在一些实施例中，术语“转化”用以指细菌细胞对外来DNA的摄取。
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外继续或延长生长和分裂的细胞群。在某些情况下，在储存或转移此类克隆群期间，核型可能发生自发或诱导的变化。因此，衍生自所指细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指细胞系包括此类变体。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。典型地，该术语是指转录调节序列与待转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列例如在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与序列可操作地连接的启动子转录调节序列与该序列邻接或由短间隔子序列分开，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列诸如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。
如本文所用，术语“AAV载体”是指衍生自或包含腺相关病毒血清型的一个或多个核酸序列的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV-9病毒载体。AAV载体可具有一个或多个AAV野生型基因的整体或部分缺失，例如rep和/或cap基因，同时保留例如功能性侧接反向末端重复(“ITR”)序列。在一些实施例中，AAV载体可以包装在例如包含一个或多个AAV衣壳蛋白的蛋白壳或衣壳中，该外壳或衣壳可提供用于将载体核酸递送至靶细胞的细胞核的媒介物。在一些实施例中，AAV载体包含一个或多个AAV ITR序列(例如，AAV2 ITR序列)。在一些实施例中，AAV载体包含一个或多个AAV ITR序列(例如，AAV2 ITR序列)，但不含有任何另外的病毒核酸序列。在一些实施例中，这些AAV载体组分(例如，ITR)衍生自与rAAV衣壳不同的血清型病毒(例如，AAV载体可包含衍生自AAV2的ITR，并且AAV载体可包装到AAV9衣壳中)。这些载体构建体的实施例提供于例如WO/2019/094253(PCT/US2018/058744)中，将其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，“scAAV”是自互补的腺相关病毒(scAAV)。scAAV被称为“自互补”，因为scAAV的载体的至少一部分(例如，编码区的至少一部分)形成分子内双链DNA。在一些实施例中，该rAAV是scAAV。在一些实施例中，病毒载体从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化以提供用于基因疗法的scAAV。这些载体构建体的实施例以及其制备和纯化方法提供于例如WO/2019/094253(PCT/US2018/058744)中，将其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，“ssAAV”是单链的腺相关病毒(ssAAV)。ssAAV被称为“单链的”，因为ssAAV的载体的至少一部分(例如，编码区的至少一部分)是单链DNA。在一些实施例中，该rAAV是ssAAV。在一些实施例中，病毒载体从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化以提供用于基因疗法的ssAAV。
如本文所用，“病毒”或“病毒粒子”指示包含病毒载体(例如，单独或与一种或多种另外的组分(诸如一种或多种病毒衣壳)组合)的病毒颗粒。例如，AAV病毒可以包含例如与AAV衣壳蛋白外壳相关的线性单链AAV核酸基因组。
在一些实施例中，“病毒”、“病毒粒子”、“AAV病毒”、“重组AAV病毒粒子”、“rAAV病毒粒子”、“AAV载体颗粒”、“完全衣壳”及“完全颗粒”等术语是指感染性、复制缺陷型病毒，例如包含AAV蛋白壳的那些，该AAV蛋白壳包裹例如在一侧或两侧上由AAV ITR侧接的病毒载体中的目的异源核苷酸序列。rAAV病毒粒子可以在适合的宿主细胞中产生，该适合的宿主细胞包含单独或与编码AAV辅助功能和附带功能(诸如cap基因)的核酸组合(例如在相同或另外的质粒上)的指定AAV载体的序列(例如一个或多个质粒)。在一些实施例中，使得宿主细胞能够编码AAV多肽，这些多肽用于实现将AAV载体(含有目的重组核苷酸序列)包装至感染性重组病毒粒子颗粒中以用于后续基因递送。
术语“反向末端重复”或“ITR”是指可以例如在腺相关病毒(AAV)和/或重组腺相关病毒载体(rAAV)中形成T形回文结构的一段核苷酸序列。Muzyczka等人,(2001)FieldsVirology[费氏病毒学],第29章,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版社]。在重组AAV载体中，这些序列在基因组包装和第二链合成中发挥功能性作用。
术语“宿主细胞”表示包含目的外源核酸的细胞，例如，一种或多种微生物、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。例如，宿主细胞可包含AAV辅助构建体、AAV载体质粒、附属功能载体和/或其他转移DNA。该术语包括已转染的原始细胞的子代。由于自然的、偶然的或故意的突变，单个亲本细胞的子代在形态或基因组或总DNA互补方面不一定与原始亲本完全相同。
术语“AAV辅助功能”是指可被表达以提供AAV基因产物的AAV衍生的编码序列，例如反式发挥功能以用于生产性AAV复制的那些。例如，AAV辅助功能可以包括两种主要的AAV开放阅读框(ORF)：rep和cap。已证明Rep表达产物具有许多功能，其中包括：AAV的DNA复制起点的识别、结合和切断；DNA解旋酶活性；以及来自AAV(或其他异源)启动子的转录的调节。Cap表达产物提供必要的包装功能。在本文中，AAV辅助功能可用于以反式补充AAV载体中缺失的AAV功能。
术语“AAV辅助构建体”一般是指包括提供或编码以下蛋白质或核酸的核苷酸序列的核酸分子，这些蛋白质或核酸提供从AAV载体中缺失的AAV功能，例如，用于将目的核苷酸序列递送至靶细胞或组织的载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充AAV复制所缺失的AAV功能。典型地，辅助构建体缺乏AAV ITR，并且既不能复制也不能包装自己。AAV辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒、或病毒粒子的形式。已经披露了许多AAV辅助构建体，诸如编码Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和plM29+45。参见例如，Samulski等人,(1989)J.Virol.[病毒学杂志],63:3822-3828；McCarty等人,(1991)J.Virol.[病毒学杂志],65:2936-2945。已经披露了许多其他编码Rep和/或Cap表达产物的载体。参见例如，美国专利号5,139,941和6,376,237。这些载体构建体的实施例以及其制备和纯化方法提供于例如WO/2019/094253(PCT/US2018/058744)中，将其通过援引以其全文并入本文。
类淋巴流量
在一个方面，本披露内容提供了用于通过调节类淋巴流入来改善药剂向靶组织(例如脑)的AAV递送的方法。类淋巴是一种最近被认识到的系统，通过该系统，CSF沿着由邻近星形胶质细胞的血管所形成的动脉周围空间被抽入脑的较深区域，在这些较深区域中，CSF可以与间质液交换，然后在等同的小静脉周围空间中离开脑。该系统被认为在流体的移动和从脑实质中去除大分子方面起主要作用。与AAV载体大小相当的较大颗粒(诸如脂蛋白)移动通过类淋巴系统。研究发现，AAV的分布模式与载体在脑表面衬膜上的有限扩散以及载体主要通过类淋巴流入进入的情况一致。意外地发现，AAV向中枢神经系统间质、脑间质和/或脊髓间质的递送可以通过增强类淋巴流入来实现。具体地，本披露内容指出：增强类淋巴流入可用于i)改善药物组合物向有需要的受试者的中枢神经系统的递送；ii)为有需要的受试者治疗神经疾病的方法，其中该药物组合物包含编码与该神经疾病相关联的基因的AAV；iii)改善神经退行性治疗剂在脑中的转导效率和/或分布的方法；iv)增加鞘内递送的药物组合物的功效的方法；v)减少用包含病毒载体的药物组合物治疗的患者群体中病毒载体的可变脑分布的方法；以及vi)减少靶向有需要的受试者的CNS的药物组合物的全身暴露以便减少该受试者的肝和/或DRG毒性的方法。
可以经由多种方式增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过将载体施用定时为与睡眠周期期间的CSF流入一致来增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过施用AQP4促进剂(例如TGN-073)来增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过AQP4上调(例如通过七氟烷麻醉)来增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过α-2肾上腺素能激动剂，例如右美托咪定(Precedex或Dexdomitor)来增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过氯胺酮和赛拉嗪的组合来增强类淋巴流入。在一些实施例中，可以通过用高渗盐水或甘露醇诱导血浆高渗性来增强类淋巴流入。
AQP4
水通道蛋白4(AQP4)，一种水通道亚型，在脑中高度表达。CSF和ISF的互换依赖于包裹脑血管的星形胶质细胞终足上的水通道蛋白4(AQP4)水通道。AQP4表达或极化的变化(指AQP4在终足与细胞其余部分中的差异分布)与类淋巴功能紊乱有关。与类淋巴系统可以清除淀粉样蛋白-b的观察一致，在阿尔茨海默氏病的动物模型中由Aqp4基因的缺失引起的降低的类淋巴功能导致淀粉样蛋白-b2和tau16的积累增加。在阿尔茨海默氏病患者中也观察到AQP4极化的异常，这提供了一些证据表明类淋巴功能也可能在人类阿尔茨海默氏病中发挥作用。Kylkilahti等人,Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism[脑血流与代谢杂志],0(0):1-13(2021)。
在一些实施例中，通过促进血脑屏障内的间质液循环的药剂来增强类淋巴流入，例如，其中该药剂包含水通道蛋白4(AQP4)促进剂，例如TGN-073(N-(3-苄氧基吡啶-2-基)-苯磺酰胺)。在一些实施例中，该药剂包含上调AQP4表达(例如七氟烷)或改变AQP4的亚细胞定位的化合物。在另一实施例中，该药剂可以是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂，诸如JNJ-l 7299425或JNJ-17306861。
α-2肾上腺素能激动剂和麻醉剂
在促进慢波振荡的睡眠或麻醉期间，类淋巴途径主要处于活跃状态。CNS去甲肾上腺素能张力降低是深度NREM睡眠的一个重要特征，它与高的类淋巴流入有关，因为它通过增大间质空间体积来降低对间质液流动的阻力。α2-肾上腺素能激动剂是已知的镇静剂，就脑电图(EEG)中增加的慢波δ振荡和显著降低的去甲肾上腺素能张力而言，其诱导类似于II-III期NREM睡眠的镇静状态。研究已经表明，右美托咪定，一种选择性α2-肾上腺素能激动剂，通过调节类淋巴流量，增强EEG慢波活性，增加小鼠和大鼠中鞘内施用的药物的脑和脊髓药物暴露。T.O.Lilius等人,Journal of Controlled Release[控释杂志],304:29-38(2019)。在小鼠睡眠或氯胺酮/赛拉嗪(K/X)麻醉期间，类淋巴系统活性增加，并且与高EEGδ功率和低心率相关。Hablitz等人,Sci Adv.[科学进展]5(2):eaav5447(2019)。
在一个实施例中，该药剂是α2-肾上腺素能受体(α2-AR)激动剂。在一个实施例中，该α2-AR激动剂是右美托咪定。参见例如，Lilius TO等人Dexmedetomidine enhancesglymphatic brain delivery of intrathecally administered drugs.[右美托咪定增强鞘内施用的药物的类淋巴脑递送]JControl Release.[控制释放杂志]2019年6月28日；304:29-38，该文献通过援引以其全文并入。在一些实施例中，该药剂包含选自由以下组成的组的α-2肾上腺素能激动剂：可乐定、西扎尼定和右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
在一个实施例中，该药剂增强类淋巴流量。在一个实施例中，该药剂增强类淋巴流入。在一个实施例中，该药剂是麻醉剂，例如，全身麻醉剂。在一个实施例中，该麻醉剂选自由以下组成的组：丙泊酚、磷丙泊酚、氯胺酮、巴比妥类(例如，硫喷妥(thiopental)、硫喷妥(thiopentone)和美索比妥(methohexital))、苯二氮卓类(例如，咪达唑仑(midazolam))、依托咪酯(etomidate)、异氟烷(isoflurane)、地氟烷(desflurane)和七氟烷。参见例如，Hablitz LM等人Increased glymphatic influx is correlated with high EEG deltapower and low heart rate in mice under anesthesia.[在麻醉的小鼠中，增加的类淋巴流入与高EEGδ功率和低心率相关]Sci Adv.[科学进展]2019年2月27日；5(2):eaav5447，该文献通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，该药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。在一些实施例中，该麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。在优选的实施例中，该药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
在一些实施例中，首先向该受试者施用氯胺酮，随后施用该药物组合物，并随后施用右美托咪定。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用该药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
在一些实施例中，氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
在一些实施例中，右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
在一些实施例中，在施用右美托咪定之后向该受试者额外施用七氟烷。
在一些实施例中，七氟烷作为吸入剂施用。
诱导血浆高渗性
在另一方面，可以通过诱导血浆高渗性来实现增强类淋巴流入。如本文所用，“高渗”和“低渗”是例如与生理渗透压相关的相对术语，但也可以偏离生理渗透压，只要在两个区室(诸如血浆和中枢神经系统间质)之间实现渗透压差或梯度的最终目标，以促进类淋巴流量进入中枢神经系统间质、脑间质和/或脊髓间质。因此，“高渗溶液”是指相对于生理渗透压而言具有高渗性质的任何生理上和/或药学上可接受的溶液，包括高渗盐水或糖溶液。如本文所述，本披露内容中优选的高渗溶液不引起BBB破坏。
在一些实施例中，该药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。在优选的实施例中，该药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。在一些实施例中，高渗盐水是2％ NaCl、3％ NaCl、5％NaCl、7％ NaCl或23％ NaCl，并且优选地是3％ NaCl。在一些实施例中，3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
在一些实施例中，在施用该药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用该药剂，并且任选地其中可重复该施用。
睡眠
研究表明，在睡眠期间，类淋巴功能增加，并因睡眠障碍而受损。Xie等人,Science[科学]342:373-377(2013)。睡眠不足导致AQP4表达的改变。Kylkilahti等人,Journal ofCerebral Blood Flow&Metabolism[脑血流与代谢杂志]0():1-13(2021)。
在一个实施例中，该药剂是增加慢波睡眠的非麻醉剂。在一个实施例中，该药剂选自由以下组成的组：GAT-1抑制剂、选择性突触外GABAA激动剂、电压门控钙离子通道上的α2-δ位点、GABAB/GHB激动剂、部分选择性5HT2A受体拮抗剂和血清素2A受体拮抗剂(ASTAR)。在一个实施例中，该药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮。增加慢波睡眠的额外药剂描述于以下文献中：Walsh,J.K.Enhancement of Slow Wave Sleep:Implications for Insomnia.[慢波睡眠增强：对失眠的影响]Journal of Clinical Sleep Medicine.[临床睡眠医学杂志]2009,5(2):S27-S32，该文献通过援引以其全文并入。
增强VEGF-C
研究表明，血管内皮生长因子C(VEGF-C)结合淋巴内皮细胞上的受体，并且还影响血管内皮。Joukov等人EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]15(2):290-298(1996)。Expression of VEGF-C in mice leads to gowths of lymphatic vessels.[VEGF-C在小鼠中的表达导致淋巴管皱襞]Da Mesquita等人,Nature[自然]560(7717):185-191(2018)。
在一些实施例中，增强类淋巴流入的药剂包含VEGF-C。在一些实施例中，该VEGF-C包含：(i)表1中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:1进行编号的C137A的氨基酸取代。
表1VEGF-C及其变体
以下序列对应于单体。当二聚体形成时，2个相同的序列通过半胱氨酸桥组装在一起。应注意，his标签用于实验目的，但并非在所有实施例中都是必需的。
研究表明，将成年猕猴以特伦德伦伯格卧位(其中身体仰卧在斜躺桌上，头部在脚下约30°)放置5或10分钟，在鞘内输注AAV9后，相对于腰椎脊髓，颈椎的转导增加。这表明重力影响载体分布，并且将头部定位在脚下可改善向脑的递送。Castle等人,Sci Adv[科学进展]4(11):eaau9859(2018)。
在一些实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约5-10分钟、约10-30分钟、约30分钟至1小时、约1至2小时、约2-3小时或约3-4小时。在优选的实施例中，在施用该药物组合物后，将该受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1至2小时。
在一个方面，本披露内容提供了用于改善药物组合物向中枢神经系统的递送的方法。在一些实施例中，该药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
在一些实施例中，该载体是病毒载体。在一些实施例中，该载体是用于将一个或多个转基因序列递送至神经元细胞或组织的病毒载体。用于载体的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、和其他杂合病毒。在一些实施例中，该病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、DNA病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
不受理论的束缚，本文披露的病毒载体可以将它们的基因组插入它们感染的宿主细胞中，从而将其核酸序列递送至宿主。插入的病毒基因组可以是附加体(episomal)或可以在可以是随机或靶向的位点处整合到宿主细胞的染色体中。在一个实施例中，该载体是用于将转基因序列递送至细胞的病毒载体。用于载体的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、和其他杂合病毒。Warnock等人,(2011)MethodsMol.Biol.[分子生物学方法],737:1-25。慢病毒是逆转录病毒属，其可以将大量病毒DNA整合到宿主细胞中，使它们成为基因递送的高效方法。另一方面，腺病毒引入不整合到宿主细胞的染色体中的遗传物质，从而降低破坏宿主细胞的风险。在一些实施例中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、DNA病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
在一些实施例中，包含该转基因的载体是或衍生自腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，该载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)。rAAV基因组可以包含一个或多个侧接转基因序列的AAV ITR，该转基因序列编码多肽(包括但不限于hPGRN多肽)或编码针对突变蛋白或它们的基因的控制序列的siRNA、shRNA、反义和/或miRNA。转基因序列可操作地连接，并且可以通过编码一个或多个蛋白酶切割位点的序列或编码一个或多个自切割肽的序列或其组合连接。在一个实施例中，这些载体另外地包含其他转录控制元件，诸如本文披露的那些，例如在靶细胞中具有驱动转基因序列的表达的功能的启动子、增强子、PRE、和/或polyA序列。该转基因序列还可包括内含子序列，以在哺乳动物细胞中表达时促进RNA转录物的加工。
在各个实施例中，该AAV载体(例如，rAAV载体)是自互补AAV载体(scAAV)。如本文所用，“自互补”意指编码区已设计为例如在一个或多个反向末端重复(ITR)中形成分子内双链模板。不受理论的束缚，针对AAV基因组的限速步骤通常涉及第二链合成，因为典型的AAV基因组是单链的DNA模板。Ferrari等人,(1996)J.Virology[病毒学杂志],70(5):3227-34；Fisher等人,(1996)J.Virology[病毒学杂志],70(1):520-32。然而，对于scAAV基因组，在感染后，scAAV的互补的两半可能结合形成可立即用于复制和转录的一个双链DNA(dsDNA)单元，而不是等待细胞介导的第二链的合成。在一些实施例中，本文披露的rAAV载体是scAAV载体并且提供更快和/或增加的表达。
在一些实施例中，本文披露的rAAV载体缺乏一个或多个(例如，所有)AAV rep和/或cap基因。AAV载体可以(例如，在其ITR中)包含来自任何适合的AAV血清型的核酸序列(例如，DNA)。合适的AAV血清型包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAVrh8、AAVrh10、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV-DJ、和AAV-DJ/8、AAVrh37、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB和AAV-PHP.S。例如，AAV载体(例如，scAAV载体)可以包含来自AAV2的核酸序列，例如来自AAV2的ITR序列。AAV载体(例如，scAAV载体)还可包含来自一种以上血清型的核酸。AAV血清型的基因组的核苷酸序列为本领域已知的。例如，AAV1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV2的完整基因组在GenBank登录号NC001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；AAV3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；至少部分AAV7和AAV8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV9基因组在Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；AAV10基因组在Williams,(2006)Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且AAV11基因组在Mori等人,(2004)Virology[病毒学],330(2):375-383中提供。
在一些实施例中，功能性反向末端重复(ITR)序列可用于支持例如AAV病毒粒子的拯救、复制和包装。因此，本文披露的AAV载体可包括用于实现病毒的复制及封装的呈顺式(例如功能性ITR)的序列。这些ITR可以但无需为野生型核苷酸序列且可变化，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要这些序列实现功能性拯救、复制及封装即可。这些ITR可来自能够衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。AAV血清型的基因组的核苷酸序列为本领域已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC 001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,(2004)J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388中提供；AAV-10基因组在Williams,(2006)Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且AAV-11基因组在Mori等人,(2004)Virology[病毒学],330(2):375-383中提供。在一个实施例中，该载体为AAV-9载体，其具有AAV-2衍生的ITR。
在一些实施例中，本文披露的rAAV载体包含一个或多个ITR，例如两个ITR，一个在转基因和/或上文讨论的其他核酸元件的上游并且另一个在其下游。在一些实施例中，本文披露的核酸(例如，在scAAV载体中)包含设置在启动子、转基因、转录后调节元件和/或polyA的5'的第一ITR和设置在其3'的第二ITR，例如，其中这些ITR独立地是在其他元件的5'和/或3’的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、150、200、250个核苷酸。ITR序列可以是野生型的，或者它可以包含一个或多个突变，例如，只要它保留野生型ITR的一个或多个功能即可。在一些实施例中，野生型ITR可以被修饰以包含末端解析位点的缺失。在一些实施例中，如本文披露的scAAV可以包含两个ITR序列，其中两个都是野生型、变体、或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列为野生型、变体或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，这两个ITR序列均为野生型、变体或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，“左侧”或5’-ITR为经修饰的AAV ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“右侧”或3’-ITR为野生型AAV ITR序列。在一些实施例中，“右侧”或3’-ITR为经修饰的AAV ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“左侧”或5’-ITR为野生型AAVITR序列。在一些实施例中，这些ITR序列为野生型、变体、或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列为野生型、变体或修饰AAV2 ITR序列。在一些实施例中，这两个ITR序列均为野生型、变体或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“左侧”或5’-ITR为经修饰的AAV2 ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“右侧”或3’-ITR为野生型AAV2ITR序列。在一些实施例中，“右侧”或3’-ITR为经修饰的AAV2 ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“左侧”或5’-ITR为野生型AAV2 ITR序列。本文描述了可用于一个或多个ITR的示例性序列。在一些实施例中，该AAV载体包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23。在一些实施例中，该AAV载体包含SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:90。WO/2019/094253(PCT/US2018/058744)(将其通过援引以其全文并入本文)中提供的AAV ITR的实施例也可用于本文披露的任何AAV ITR。
在一些实施例中，该rAAV载体缺乏一个或多个(例如，所有)AAV rep和/或cap基因。AAV载体可以(例如，在其ITR中)包含来自任何适合的AAV血清型的核酸序列(例如，DNA)。适合的AAV血清型包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。例如，AAV载体(例如，scAAV载体)可以包含来自AAV-2的核酸序列，例如来自AAV-2的ITR序列。AAV载体(例如，scAAV载体)还可包含来自一种以上血清型的核酸。GenBank登录号NC 001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45；555-564{1983)；GenBank登录号NC_1829；GenBank登录号NC_001829；GenBank登录号AF085716；GenBank登录号NC_001862；GenBank登录号AX753246和AX753249；Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)；Williams,(2006)Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76；以及Moris等人,(2004)Virology[病毒学],330(2):375-383。
在一些实施例中，包含转基因的病毒载体中的功能性反向末端重复(ITR)序列可用于支持例如AAV病毒粒子的拯救、复制和包装。因此，本文披露的AAV载体可包括用于实现病毒的复制及封装的呈顺式(例如功能性ITR)的序列。这些ITR无需为野生型核苷酸序列且可变化，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要这些序列实现功能性拯救、复制及封装即可。这些ITR可来自能够衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。GenBank登录号NC_002077；GenBank登录号NC 001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45；555-564{1983)；GenBank登录号NC_1829；GenBank登录号NC_001829；GenBank登录号AF085716；GenBank登录号NC_00 1862；GenBank登录号分别为AX753246和AX753249；Gao等人,(2004)J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388；Williams,(2006)Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76；以及Moris等人,(2004)Virology[病毒学],330(2):375-383。在一个实施例中，该载体为AAV-9载体，其具有AAV-2衍生的ITR。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
在一些实施例中，该AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
在一些实施例中，该药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
在一些实施例中，该药物组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
在各个实施例中，本文讨论的核酸和载体可以存在于一种或多种病毒颗粒(诸如重组病毒颗粒)中。重组病毒是通过重组方式生成的病毒。可以使用各种不同的病毒类型，例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、AAV、鼠白血病病毒等。不受理论的束缚，从逆转录病毒(诸如慢病毒)递送的载体可以提供长期基因转移，因为它们允许转基因长期稳定的整合及其在子细胞中的增殖，并且也可能提供低免疫原性。其他适合的逆转录病毒包括γ逆转录病毒。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology andApplication[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713中。在一些实施例中，该病毒是包含本文披露的核酸或载体的重组腺病毒。在一些实施例中，该病毒是包含本文披露的核酸或载体的重组AAV。
在一些实施例中，本文披露的核酸或载体用于制造重组病毒。在一些实施例中，本文披露的核酸或载体用于制造rAAV。因此，在各个实施例中，本文还披露了病毒组合物(也称为病毒粒子)，例如，包含上文披露的病毒载体或核酸的rAAV病毒组合物。在一些实施例中，该重组病毒是腺相关病毒(AAV)或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是嵌合AAV或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是腺病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是逆转录病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是慢病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是DNA病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是单纯疱疹病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，该重组病毒是杆状病毒或其任何突变体或衍生物。
在一些实施例中，本文披露的AAV可以包含一种或多种AAV衣壳蛋白。AAV衣壳蛋白可以来自能够衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAVrh8、AAVfh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB、和AAV-PHP.S。在一些实施例中，AAV中的一种或多种衣壳蛋白来自AAV-9。不受理论的束缚，典型地在AAV中，三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3多聚化以形成衣壳。这些衣壳蛋白的多肽序列是本领域已知的，并且也可衍生自该AAV的基因组。这些可用作本文披露的AAV病毒组合物中的示例性衣壳。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC 001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Williams,(2006)Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且AAV-11基因组在Mori等人,(2004)Virology[病毒学],330(2):375-383中提供。衣壳蛋白AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB、或AAV-PHP.S在Deverman等人,(2016)Nat.Biotech.[自然生物技术],34:204-209和Chan等人,(2017)Nat.Neurosci.[自然神经科学],20:1172-1179中提供。在一些实施例中，该重组病毒是包含一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、和AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2、AAV-PHP.B3、AAV-PHP.A、AAV-PHP.eB、或AAV-PHP.S衣壳血清型或其功能变体的AAV。在一些实施例中，该重组病毒是包含来自一种以上的AAV血清型的衣壳的组合的AAV。
在一些实施例中，本文披露的AAV组合物包含指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的一种或多种顺式作用序列，这些序列包含在ITR内。在一些实施例中，这些序列中的一个或多个也可以以反式而不是顺式存在，例如，在宿主细胞中的病毒制造过程期间存在于单独的质粒上。典型地，三个AAV启动子(针对其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框在野生型病毒中的表达。在一些实施例中，一个或多个这些启动子和/或开放阅读框顺式存在于本文披露的AAV载体和/或AAV病毒粒子中，或例如在产生病毒的宿主细胞中在AAV病毒制造过程中存在于单独的质粒上。两个rep启动子(p5及p19)与单个AAV内含子的差异性剪接(在核苷酸2107及2227处)偶联可引起自rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶学特性。该cap基因典型地由p40启动子表达，且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2及VP3。可变剪接及非共有翻译起始位点负责产生三种相关衣壳蛋白。单个共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,(1992)Curr.Topics Microbiol.Imm.[微生物学和免疫学的当前主题],158:97-129中进行了综述。
在一些实施例中，本文披露的AAV组合物包含对人CNS或PNS具有增强的向性的工程化衣壳。可以使用多种方法对衣壳蛋白进行工程化，这些方法包括但不限于突变方法、DNA条形码、定向进化、随机肽插入和衣壳改组和/或嵌合体。
已经使用合理的工程化和突变方法将AAV导向靶组织。在合理的设计中，结构-功能关系用于确定衣壳序列可能发生改变的区域。作为非限制性实例，表面环结构、受体结合位点和/或肝素结合位点可被突变或以其他方式改变，用于合理设计重组AAV衣壳以增强对靶组织的靶向。在合理设计的一个实例中，通过将表面暴露的酪氨酸突变为苯丙氨酸来修饰AAV衣壳，以规避泛素化、减少蛋白酶体降解并允许增加AAV颗粒和病毒基因组表达(Lochrie M A等人,J Virol.[病毒学杂志]2006年1月；80(2):821-34；Santiago-Ortiz JL和Schaffer D V,J Control Release[控释杂志],2016年10月28日；240:287-301，其中每一篇的内容通过援引以其全文并入)。合理的设计还涵盖向亲本AAV衣壳序列中添加靶向肽，其中该靶向肽可对靶组织内的目的受体具有亲和力。
在某些实施例中，合理的工程化和/或突变方法用于鉴定具有增强的靶组织(例如，CNS或PNS)转导的AAV衣壳和/或靶向肽。
衣壳改组和/或嵌合体描述了一种方法，在该方法中，将至少两个亲本AAV衣壳的片段组合以生成新的重组衣壳蛋白，所用亲本AAV衣壳的数目可以是2-20，或大于20。
在某些实施例中，衣壳改组用于鉴定具有增强的靶组织(例如，CNS或PNS)转导的AAV衣壳和/或靶向肽。
定向进化涉及通过多种诱变技术中的任一种生成AAV衣壳文库(～104-108)以及基于通过目的性质(例如，向性)对选择压力的响应选择先导候选物。AAV衣壳的定向进化允许从各种突变体的池中进行阳性选择，而不需要对突变体文库进行广泛的预先表征。定向进化文库可以通过本领域已知的并且可以包括DNA改组、随机点诱变、插入诱变(例如，靶向肽)、随机肽插入或祖先重建的任何分子生物学技术生成。可以使用定向进化对AAV衣壳文库进行多于一轮的选择，以进一步优化。定向进化方法最常用于鉴定具有增强的靶组织转导的AAV衣壳蛋白。已经鉴定出具有增强的靶组织转导的衣壳，用于靶向人气道上皮、神经干细胞、人多能干细胞、视网膜细胞以及其他体外和体内细胞。
在某些实施例中，定向进化方法用于鉴定具有增强的靶组织(例如，CNS或PNS)转导的AAV衣壳和/或靶向肽。
针对高通量表征大量AAV血清型表型描述的一种方法被称为AAV条形码测序(Adachi K等人,Nature Communications[自然通讯]5:3075(2014)，其内容通过援引以其全文并入本文)。在这种基于下一代测序(NGS)的方法中，产生了包含DNA条形码标签的AAV文库，其可以通过多重的Illumina条形码测序来评估。该方法可用于鉴定与野生型或非变体序列相比具有改变的受体结合、向性、中和和/或血液清除的AAV变体。对这些功能重要的AAV衣壳的氨基酸也可以以这种方式鉴定。
如Adachi等人2014所述，生成了AAV衣壳文库，其中每个突变体携带野生型AAV2rep基因和衍生自一系列变体或突变体的AAV cap基因，以及一对位于AAV2聚腺苷酸化信号(pA)下游的左右12个核苷酸长的DNA条形码。以这种方式，生成了7种不同的DNA条形码AAV衣壳文库。然后向小鼠提供衣壳文库。在预设的时间点，收集样品，提取DNA并使用AAV克隆特异性病毒条形码和附着样品特异性条形码的PCR引物进行PCR扩增。对所有病毒条形码PCR扩增子进行Illumina测序并通过计算算法转化为原始序列读码数据。条形码测序方法的核心是包含上述DNA条形码(左和右)、三个PCR引物结合位点和两个限制酶位点的96-核苷酸盒。作为实例，使用了AAV rep-cap基因组，但是该系统可以应用于任何AAV病毒基因组，包括缺乏rep和cap基因的AAV病毒基因组。条形码测序方法的优点是收集大数据集，并在短时间内以很少的重复次数与期望的表型相关联。
DNA条形码测序方法可类似地应用于RNA。
在某些实施例中，条形码测序方法用于鉴定具有增强的靶组织(例如，CNS或PNS)转导的AAV衣壳和/或靶向肽。
在一些实施例中，将靶向肽插入亲本AAV衣壳序列可用于增强对CNS或PNS组织的靶向。本文披露了靶向肽和相关的AAV颗粒，其包含具有一个或多个靶向肽插入物的衣壳蛋白，用于增强或改善靶组织(例如，CNS或PNS的细胞)的转导。
在某些实施例中，靶向肽可将AAV颗粒导向CNS的细胞或组织。CNS的细胞可以是但不限于神经元(例如，兴奋性、抑制性、运动性、感觉性、自主性、交感、副交感、浦肯野、贝兹等)、神经胶质细胞(例如，小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)和/或脑的支持细胞，诸如免疫细胞(例如，T细胞)。CNS的组织可以是但不限于皮质(例如，额叶、顶叶、枕叶、颞叶)、丘脑、下丘脑、纹状体、壳核、尾状核、海马、内嗅皮质、基底神经节或深部小脑核。
本披露内容的靶向肽可通过本领域已知的任何方法鉴定和/或设计。作为非限制性实例，如Deverman等人(Nature Biotechnology[自然生物技术]34(2):204-209(2016))和国际专利申请公开号WO 2015038958和WO 2017100671(其中每一篇的内容通过援引以其全文并入本文)中所述的CREATE系统可以在小鼠或其他研究动物(诸如但不限于非人灵长类动物)中用作鉴定靶向肽的手段。
对CNS或PNS组织的靶向增强的工程化AAV的非限制性实例可见于US20180021364、US20210207167、US20210214749、US20210230632和US20210277418中，这些文献通过援引以其全文并入本文。
疾病的治疗
在各个实施例中，术语“治疗”包括向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的组合物的步骤，该组合物包含如本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物。如果在障碍/疾病发展前施用该剂量，则该施用是预防性的。若在障碍/疾病发展之后施用该剂量，则该施用是治疗性的。在一个实施例中，有效剂量为可检测地缓解(消除或减少)至少一种与所治疗的障碍/疾病病况相关的症状的剂量、减缓或防止进展至障碍/疾病病况的剂量、减缓或防止障碍/疾病病况进展的剂量、减轻疾病程度的剂量、引起疾病缓解(部分或全部)的剂量、和/或延长存活期的剂量。该术语涵盖但不要求完全治疗(即，治愈)和/或预防。在一些实施例中，有效剂量包含1×1010至1×1015个载体基因组/毫升(vg/ml)如本文披露的病毒。在一些实施例中，有效剂量包含1×106至1×1010个空斑形成单位/毫升(pfu/ml)如本文披露的病毒。在一些实施例中，有效剂量包含1×106至1×109个转导单位/毫升(TU/ml)如本文披露的病毒。本文中阐述了预期治疗的疾病病况的实例。
在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的核酸。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的载体。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的重组病毒。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的药物组合物。在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物在制造针对治疗有需要的受试者的药物中使用。
在各个实施例中，本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过以下递送至有需要的受试者：静脉内施用、直接脑施用(例如，鞘内、脑内、和/或脑室内施用)、鼻内施用、耳内施用、或眼内途径施用，或其任何组合。在一些实施例中，该核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过鞘内施用进行递送。在一些实施例中，该核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过脑内或脑室内施用途径进行递送。在一些实施例中，施用的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物在施用至单独的组织或流体(例如，血液)后，直接或通过转移最终递送至脑、脊髓、外周神经系统、和/或CNS。
在一个方面，这些方法和材料适用于治疗神经系统疾病或神经退行性疾病，诸如雷特综合征(Rett Syndrome)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病，或用于治疗神经系统损伤，包括脊髓和脑创伤损伤、中风和脑癌。在一个实施例中，这些方法和材料适用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)。
存在四种类型的SMA，其通常根据发病年龄和所实现的最高运动功能来分类。SMA的所有形式均为常染色体隐性遗传并由存活运动神经元1(SMN1)基因的突变引起。人类还具有SMN基因的第二、几乎一致的拷贝，称为SMN2。Lefebvre等人“Identification andcharacterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.[脊髓性肌萎缩症决定基因的鉴定和表征]”Cell[细胞],80(l):1 55-65。Monani等人“Spinal muscularatrophy:a deficiency in a ubiquitous protein；a motor-neuron specific disease[脊髓性肌萎缩症：缺乏普遍存在的蛋白质；运动神经元特异性疾病]”Neuron[神经元],48(6):885-896。SMN I和SMN2基因均表达SMN蛋白质，然而SMN2在外显子7中含有翻译缄默突变，其引起SMN2转录物中的外显子7的含量不足。因此，SMN2产生全长SMN蛋白质及不具有外显子7的SMN的截短版本，其中截短版本为主要形式。结果，由SMN2产生的功能性全长蛋白质的量远远少于(少70-90％)由SMN产生的功能性全长蛋白质的量。Lorson等人“A singlenucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinalmuscular atrophy.[SMN基因中的单个核苷酸调节剪接并导致脊髓性肌萎缩症]”PNAS[美国国家科学院院刊],96(11)6307-63 1。Monani等人,“A single nucleotide differencethat alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1from the copygene SMN2.[改变剪接模式的单核苷酸差异将SMA基因SMN1与复制基因SMN2区分开来]”HumMol Genet[人类分子遗传学]8(7):177-83。尽管SMN2不能完全补偿SMN1基因的损失，但具有SMA的较轻度的形式的患者通常具有更高的SMN2拷贝数。Lefebvre等人,“Correlationbetween severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy[脊髓性肌萎缩症的严重程度与SMN蛋白水平之间的相关性]”Nat Genet[自然遗传]6(3):265-269。Park等人,“Spinal muscular atrophy:new and emerging insights from model mice.[脊髓性肌萎缩症：来自模型小鼠的新的和新兴的洞察]”Curr Neurol Neurosci Rep[当代神经病学与神经科学报告]10(2):108-117。一项说明为SMN2拷贝数并非唯一的表现型修饰物。具体地，已报导SMN2基因的外显子7中的c 859G C变体为阳性疾病修饰物。具有此特定突变的患者具有严重性较低的疾病表现型。Prior等人,“A positive modified of spinalmuscular atrophy in the SMN2gene.[SMN2基因中脊髓性肌萎缩症的阳性修饰]”Am JHum Genet[美国人类遗传学杂志]85(3):408-413。
I型SMA(也称为婴儿发作或韦-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))为在出生或年龄为6个月时存在SMA症状。在此类型中，婴儿典型地具有低肌肉张力(低张症)、哭泣无力及呼吸窘迫。其通常具有吞咽及吮吸困难，且未达到能够在无需帮助的情况下坐立的发育重要事件。其通常展示选自以下的SMA症状中的一者或多者：低张症、运动技能迟缓、头部控制不良、圆肩姿势及关节过度活动。典型地，这些婴儿具有SMN2基因的两个拷贝，每条5号染色体上一个。所有新SMA病例的一半以上为SMA类型。
11型或中度SMA为在年龄为7个月与之间且在儿童可独立站立或行走之前发作的SMA。患有2型SMA的儿童通常具有至少三个SMN2基因。迟发型SMA(也称为III型及IV型SMA、轻度SMA、成年发病型SMA及库-威二氏病(Kugelberg-Welander disease))引起不同程度的无力。III型SMA在18个月之后发作，且儿童可独立站立及行走，尽管可能需要帮助。IV型SMA在成人期发作，且人在其成年期间能够行走。患有III型或IV型SMA的人通常具有四至八个SMN2基因，由其可产生大量的全长SMN蛋白质。
在一个实施例中，术语“治疗”包括将有效剂量(或有效的多个剂量)的包含如本文所披露的rAAV的组合物静脉内或经由鞘内途径施用至有需要的动物(包括人类)的步骤。如果在障碍/疾病发展前施用该剂量，则该施用是预防性的。若在障碍/疾病发展之后施用该剂量，则该施用是治疗性的。在一个实施例中，有效剂量为缓解(消除或减少)至少一种与所治疗的障碍/疾病病况相关的症状的剂量、减缓或防止进展至障碍/疾病病况的剂量、减缓或防止障碍/疾病病况进展的剂量、减轻疾病程度的剂量、引起疾病缓解(部分或全部)的剂量、和/或延长存活期的剂量。本文中阐述了预期治疗的疾病病况的实例。
在一个实施例中，将包含本披露内容的rAAV的组合物静脉内施用于有需要的某一SMA类型的患者。在另一个实施例中，将包含本披露内容的rAAV的组合物鞘内施用于有需要的患有II、III或IV型SMA的患者。
一种通过经由本文披露的鞘内或静脉内途径施用AAV9病毒载体来治疗有需要的患者的1型SMA的方法。在一些实施例中，患者年龄为0-9个月。在一些其他实施例中，患者年龄为0-6个月。在病毒载体用于治疗患者的SMA类型的一些实施例中，确定患者的体重。在一些实施例中，患者的体重低于8.5kg。在一些实施例中，患者的体重超过2.6kg。在一些实施例中，患者的体重为2.6-8.5kg。
在一些实施例中，患者在SMN1基因的一个拷贝中具有突变，例如无效突变(涵盖任何使所编码的SM 1成为非功能性的突变)。在一些实施例中，患者在SMN1基因的两个拷贝中具有突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在SMN1基因的所有拷贝中具有突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在SM 1基因的一个拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者在SMN1基因的两个拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者具有双等位基因SMN1突变，即，染色体的两个等位基因中SMNl的缺失或取代。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少一个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少两个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少两个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少三个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少四个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少五个功能性拷贝。在一些实施例中，患者在SMN2基因的至少一个拷贝的外显子7中不具有c.859G>C取代。在一些实施例中，可通过全基因组测序(full genome sequencing)来确定SMNl或SMN2基因的遗传序列。在其他实施例中，可通过高通量定序来确定SMNl或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过微数组分析来确定SMNl或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过桑格定序(Sanger sequencing)来确定SMN1或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过荧光原位杂交(FISH)来确定SMN1或SMN2基因的拷贝数。
在一些实施例中，患者显现出一种或多种SMA症状。SMA症状可包括低张症、运动技能迟缓、头部控制不良、圆肩姿势及关节过度活动。在一些实施例中，通过在肩部(前部及后部)提供帮助的情况下使患者处于环形坐姿来测定头部控制不良。通过患者保持头部直立的能力来评估头部控制。在一些实施例中，在患者处于仰卧位时观测自发性移动，且通过患者抬起肘部、膝部、手部及足部离地来评估运动技能。在一些实施例中，通过将手指置放于患者的手掌中且提升患者直至其肩部离地来量测患者的握力。通过患者保持抓握的速度/时间长度来量测低张症及握力。在一些实施例中，通过使患者的头部处于可实现的最大旋转且量测患者使头部转回正中位置的能力来评估头部控制。在一些实施例中，可通过使患者在具有头部及躯干支撑的情况下坐下，且观测患者是否弯曲肘部或肩部以拿取刺激物来评估肩部姿势，该刺激物以手臂长度与肩部齐平放置。在一些实施例中，还可通过使患者处于侧卧位，且观测患者是否弯曲肘部或肩部以拿取刺激物来评估肩部姿势，该刺激物以手臂长度与肩部齐平放置。在一些实施例中，通过观测患者在其足部被抚摸、胳肢或掐捏时是否弯曲其髋部或膝部来评估运动技能。在一些实施例中，可通过已知的临床措施(例如CHOPINTEND)来评估肩部弯曲、肘部弯曲、髋部内收、颈部弯曲、头部伸出、颈部伸出和/或脊柱弯曲。可根据已知的临床措施(例如CHOP INTEND评估)其他SMA症状。
在一些实施例中，在患者表现出I型SMA的症状(例如，一种或多种症状)之后治疗患者，这些症状是使用本文所述的测试之一所确定的。在一些实施例中，在患者表现出I型SMA的症状之前治疗患者。在一些实施例中，在患者出现症状之前，基于遗传测试诊断出患者患有I型SMA。本文还设想了组合疗法。如本文中所使用的组合包含同时治疗或依序治疗。方法的组合可包括添加某些标准医学治疗(例如含利鲁唑(riluzole)的ALS)，其与新颖疗法的组合。例如，其他用于SMA的疗法包括反义寡核苷酸(ASO)，其改变与前体mRNA的结合且改变其剪接模式。Singh等人“A multi-exon-skipping detection assay revealssurprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes.[多种外显子跳跃检测方法揭示了令人惊讶的脊髓性肌萎缩基因剪接亚型的多样性]”PlosOne[公共科学图书馆综合],7(ll):e49595。在一个实施例中，可使用诺西那生(美国专利8,361,977及US 8,980,853，其通过援引并入本文中)。诺西那生为经批准的ASO，其靶向SM 2前体mRNA的内含子6、外显子7或内含子7，调节SMN2的剪接以更有效地产生全长SMN蛋白质。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与肌肉增强剂组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与神经保护剂组合施用。在一些实施例中，该治疗方法包括与靶向SMN的基于反义寡核苷酸的药物组合施用AAV9病毒载体。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与诺西那生组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与肌肉生长抑制素抑制药物组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与司他莫鲁(stamulumab)组合施用。
尽管设想了在出生后递送至有需要的个体，但是也设想了子宫内递送至胎儿。
设想了使用包含病毒载体的药物组合物治疗I型SMA患者的方法。在一些实施例中，病毒载体以约1-8×1013个AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)的浓度配制。在一些实施例中，病毒载体以约1.7-2.3×1013vg/mL的浓度配制。在一些实施例中，病毒载体以约1.9–2.1×1013vg/mL的浓度配制。在一些实施例中，病毒载体以约2.0×10 13v mL的浓度配制。
在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将AAV病毒载体(例如AAVSMN)以约1.0-2.5×1014vg/kg的剂量施用于患者。在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将AAV病毒载体以约1.0 14vg/kg的剂量施用于患者。在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将AAV病毒载体输注到患者中超过约45-70inin。在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将AAV病毒载体在约60min内输注到患者体内。在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，使用输注泵、蠕动泵或本领域已知的任何其他设备将AAV病毒载体输注到患者中。在病毒载体用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，使用注射泵将AAV病毒载体输注到患者中。
在一个实施例中，本文所述的方法和材料可用于治疗神经发育障碍，诸如雷特综合征。雷特综合征是一种罕见的神经障碍，最初在婴儿期被发现，在90-95％的病例中由X染色体上的MECP2基因突变引起。Ruthie等人,“Rett syndrome is caused by mutations inX-linked MECP2,encoding methyl-CpG-bindin protein 2.[雷特综合征是由编码甲基-CpG结合蛋白2的X连锁MECP2中的突变引起的]”Nature Genetics[自然遗传学],23:185-188。只有一个X染色体拷贝的男孩典型地在出生后不久死亡，而有两个X染色体拷贝的女孩通常具有基因的一个功能性拷贝。他们在6-18个月之间开始出现症状，标志性症状如手绞拧或挤压、拍手、搓手、洗手或手放在嘴边的动作。该疾病是进行性的，会造成严重残疾，可以包括自闭症样行为、呼吸不规律、进食和吞咽困难、生长迟缓和癫痫发作。目前已知的MECP2基因突变有200种，并且取决于X失活和剂量补偿的水平，不同患者的病情严重程度差异很大。小鼠研究显示，MECP2突变不会引起神经元死亡，这表明其不是神经退行性障碍。Guy等人“Reversal of Neurological Defects in a Mouse Model of Rett Syndrome.[在雷特综合征的小鼠模型中逆转神经系统缺陷]”Science[科学],315(5815)1:143-1147。
对于涉及雷特综合征的实施例，rAAV(例如rAAV9)基因组可以编码例如甲基胞嘧啶结合蛋白2(MeCP2)。在美国专利号9,415,121中提供了包含编码MeCP2的多核苷酸的示例性AAV，例如scAAV9构建体，该美国专利的内容特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，可以使用本文披露的方法制备包含编码MeCP2的多核苷酸的AAV构建体。在一些实施例中，这些AAV构建体可用于治疗雷特综合征。在一些实施例中，MeCP2 AA V表现出少于10％，例如少于7％、5％、4％、3％、2％或1％的空衣壳。在一些实施例中，MeCP2 AAV表现出低量的残留宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素，例如，本文讨论的AAV载体制备和纯化水平。
在一个实施例中，本文所述的方法和材料可用于治疗ALS。ALS是一种神经退行性疾病，其导致脑和脊髓中运动神经元的进行性丧失，症状包括说话、进食、运动和最终呼吸能力的丧失。该疾病典型地在诊断后3-5年内导致死亡。虽然90％-95％的ALS原因是未知的，但是ALS的一个亚组是由超氧化物歧化酶1(SOD l)基因的遗传突变引起的，其中突变引起毒性显性功能增益。小鼠研究表明，SOD敲除不会导致疾病，因此敲低突变SODl水平的疗法被认为可减轻疾病症状。
在一些实施例中，AAV载体编码靶向ALS的SOD l的shRNA。在WO201 503 1392和US2016272976中提供了编码用于SODl的shRNA的示例性AAV，例如scAAV9构建体，该文献的内容特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，编码用于SOD的shRNA的AAV构建体可使用本文披露的方法制备。在一些实施例中，这些AAV构建体可用于治疗ALS。在一些实施例中，SODl AAV表现出少于10％，例如少于7％、5％、4％、3％、2％或1％的空衣壳。在一些实施例中，SODl AAV表现出低量的残留宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素，例如，本文讨论的AAV载体制备和纯化水平。
在一些实施例中，本文所述的方法和材料可用于治疗神经退行性和/或神经发育障碍，并改进如表2中所示的临床试验。
表2用于神经退行性障碍的基因疗法
AAV毒性
虽然AAV9载体已经显示出在全身递送后递送至CNS的显著潜力，从而导致患有脊髓性肌萎缩症的儿科患者的临床成功1，但全身注射高剂量的AAV载体可导致诱导可消除转导细胞的T细胞应答2。在猴子中，有一篇报道指出，高全身剂量的AAV9样载体导致动物的毒性和死亡，这归因于全身性炎症。Hinderer等人,Hum.Gene.Ther.[人类基因疗法]29(3):285-298(2018)。需要高剂量的原因是因为AAV在每个载体基因组拷贝基础上的相对低的效率，无法在大量靶细胞中提供足够的转基因表达。如本文所披露的，AAV的低效率可以通过增强类淋巴流入来补救。因此，本披露内容中描述的方法允许在较低剂量下更有效的转导并且将导致更好的治疗功效，同时降低安全性问题，诸如免疫毒性。在一个方面，本披露内容提供了减少靶向有需要的受试者的CNS的药物组合物的全身暴露以便减少该受试者的肝和/或背根神经节(DRG)毒性的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。
减少可变脑分布
如本文所述，施用编码GFP的AAV9的动物中GFP表达的免疫组织化学显示出脑切片中可变水平的表达。通过在鞘内给药时增强类淋巴流入，将实现间质液中更高水平的载体，从而改善靶细胞类型的转导并使其更均匀。
在一个方面，本披露内容提供了减少用包含病毒载体的药物组合物治疗的患者群体中病毒载体的可变脑分布的方法，该方法包括向该受试者施用增强类淋巴流入的药剂与该药物组合物的组合。
药物组合物
在各个实施例中，披露了药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含本文披露的一个或多个核酸、载体和/或病毒。在一些实施例中，该药物组合物包含药学上可接受的载剂。
可配制根据本披露内容的核酸、载体、和/或重组病毒(例如，病毒颗粒)以制备药学上有用的组合物。示例性配制品包括例如在美国专利号9,051,542和美国专利号6,703,237中披露的那些，将这些专利通过援引以其全文并入。可配制本披露内容的这些组合物用于向哺乳动物受试者(例如，人)施用。在一些实施例中，可配制递送系统用于肌内、皮内、粘膜、皮下、静脉内、鞘内、可注射贮库型装置、或局部施用。
在一些实施例中，当该递送系统配制为溶液或悬浮液时，该递送系统在可接受的载剂(例如，水性载剂)中。可以使用多种水性载剂，例如，水、缓冲水、0.8％生理盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可经灭菌和/或无菌过滤。可以将所得水性溶液直接包装使用或冻干。在一些实施例中，将冻干制剂在施用前与无菌溶液组合。
在一些实施例中，这些组合物(例如，药物组合物)可含有药学上可接受的助剂物质以模拟生理学条件，诸如pH值调节剂及缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺等。在一些实施例中，该药物组合物包含防腐剂。在一些其他实施例中，该药物组合物不包含防腐剂。
本披露内容的一个或多个实施例的细节陈述于上文所附的说明书中。现在描述优选方法和材料，但类似或等效于本文所述的任何方法和材料也可以用于本披露内容的实践或测试。根据说明书并且根据权利要求书，本披露内容的其他特征、目标和优点将是清楚的。在说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另外明确说明，否则单数形式包括复数指代物。除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本披露内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。除非另外说明，否则适用时本说明书中引用的所有专利和出版物均通过援引并入。提供以下实例以便更充分地说明本披露内容的优选实施例。这些实例决不应被解释为限制由所附权利要求书限定的披露的主题的范围。
实例
实例1：非人灵长类动物中的AAV生物分布
方法
评价的样品
从通过经腰椎穿刺(LP)或颅内大孔(ICM)施用的鞘内(IT)途径给药3.0×1013vgscAAV9-CB-GFP的食蟹猴收集组织，并与媒介物对照动物进行比较。对于给药，将动物置于氯胺酮/右美托咪定的麻醉下并维持在特伦德伦伯格卧位持续10分钟，随后施用阿替美唑(α-2肾上腺素能拮抗剂)作为逆转剂。在尸检时收集组织并固定在福尔马林中，然后进行石蜡常规处理，以进行组织学评价和分子定位研究。
免疫组织化学
在Ventana Discovery XT自动染色仪上，使用标准Ventana Discovery XT试剂(文塔纳公司(Ventana)，印第安纳波利斯，印第安纳州)对GFP进行免疫组织化学染色，包括脱蜡和抗原修复步骤。将载玻片脱蜡，然后根据标准文塔纳公司修复方案，用细胞调节(Cell Conditioning)1(CC1/pH8)溶液覆盖载玻片进行热诱导抗原修复。将载玻片与如表3所示的一抗(0.372ug/mL的兔单克隆抗GFP抗体克隆EPR14104-89)或非免疫同种型匹配的对照(0.372ug/ml的兔单克隆IgG克隆DA1E)一起孵育一小时。通过与如下所示的适当的Ventana Discovery OmniMap HRP试剂孵育，随后与Ventana Discovery ChromoMap 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)孵育，获得可视化。使用文塔纳公司的苏木精和文塔纳公司的发蓝试剂(Bluing reagent)进行复染，每者4分钟。将载玻片脱水，清洁，并用合成的封固培养基封片。对免疫组织化学载玻片进行审查，并基于染色不存在、<1％染色面积、1-10％染色组织、11-50％染色组织或大于50％染色组织分别分配阴性、极轻微、中度或强反应性评分。
表3免疫组织化学抗体
GFP免疫组织化学染色的图像分析
使用Indica Labs公司的HALO平台(v3.0.311.149)对在Aperio AT2扫描仪(徕卡生物系统公司(Leica Biosystems))上扫描的20x图像进行图像分析。手动注释组织以去除非特异性背景染色。将使用基于像素的去卷积的面积定量算法v2.1.3相对于阳性GFP免疫组织化学信号进行优化，并在经注释的图像上运行。结果基于相对于总组织面积归一化的阳性信号，从而得到％阳性信号/总面积。在GraphPad Prism版本8.1.2上进行分析和绘图。使用组分析的多重曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)比较IT组和ICM组之间的像素阳性面积百分比的差异。
用于载体序列的原位杂交
使用高级细胞诊断公司(Advanced Cell Diagnostics，ACD)(加利福尼亚州海沃德市(Hayward，CA))和文塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems)(罗氏公司(Roche)，亚利桑那州杜桑市(Tuscon AZ))提供的试剂和设备在选择块上进行原位杂交以检测AAV载体中编码的GFP反义(AS)和有义(S)序列以及食蟹猴(Mf)-PPIB(AS)(阳性对照和组织质量对照)和DapB(AS)(阴性对照)基因。原位杂交探针由ACD公司设计。探针列表见表4。阳性PPIB和阴性DAPB对照探针组包括在内，以分别确保mRNA质量和特异性。杂交方法遵循由ACD公司和文塔纳系统公司(Ventana systems)建立的使用VentanamRNA Red色原的方案。简而言之，将5μm切片在60度烘烤60分钟并用于杂交。使用Sakura组织-Tek DR5染色器进行脱蜡和再水化方案，步骤如下：3次二甲苯，每次持续5分钟；2次100％乙醇，持续2分钟；空气干燥5分钟。在98至104摄氏度下在1X修复缓冲液中进行离线手动预处理15分钟。通过首先评估PPIB和DAPB杂交信号，随后对所有载玻片使用相同的条件来进行优化。预处理后，将载玻片转移至Ventana Ultra自动染色器，以完成ISH程序，包括蛋白酶预处理；在43摄氏度杂交2小时，随后进行扩增；以及用HRP和苏木精复染进行检测。
表4原位杂交探针
结果
对脑、脊髓、腰椎背根神经节(DRG)和全身组织的选择块进行GFP蛋白表达的免疫组织化学，并对GFP免疫组织化学染色的程度进行评分(表5)。对照组织的染色没有产生信号，并且用兔IgG对照抗体DA1E没有观察到非特异性信号。与DRG和脊髓相比，在所评价的施用了scAAV9-CB-GFP的所有动物的脑切片中检测到总体较低且变化较大的表达水平(图1A至G)。GFP蛋白检测呈多灶性分布，脑实质中有相当大的区域没有显示表达。在一些区域中，在pia中观察到强表达，但在下面的神经毡中不存在强表达。在全身组织(诸如肝和骨骼肌)中观察到强GFP表达。尽管通过鞘内途径将载体直接施用到CSF中，但这些发现与载体向脑实质间质液的分布(这是在载体可与靶细胞类型表面上的聚糖和蛋白质受体相互作用之前所需的步骤)中的显著屏障一致。
从形态上看，大多数表达GFP蛋白的细胞似乎与星形胶质细胞一致。为了验证这种解释，对星形胶质细胞标志物GFAP和GFP报告基因进行双标记免疫组织化学实验(图2)。这些结果证实了形态学解释，并证实了主要是星形胶质细胞的转导和蛋白质表达。通过免疫组织化学对针对GFP染色的脑、脊髓和DRG切片进行定量图像分析，并报告为GFP阳性像素的百分比(图3)。在脊髓和DRG中检测到最高水平的表达，并且在脑中检测到较低水平的表达。在所评价的区域中，以3.0×1013vg/动物给药的LP IT和ICM动物之间无统计学显著差异。与这些发现一致，在浦肯野神经元和深部小脑核神经元中观察到有限的GFP蛋白表达(图4)。
为了证实蛋白质表达模式，用GFP有义和反义探针进行原位杂交以检测脑选择区域中的载体序列。与GFP的免疫组织化学相比，原位杂交检测到类似的载体定位模式，并且经常在血管和血管周围模式中显示信号。未观察到LP IT和ICM给药的动物之间的差异。
除了多灶性血管周围分布之外，在一些动物中明显存在有限的脑室周围GFP蛋白表达。在该模式中，主要在星形胶质细胞中检测到蛋白质表达，并且蛋白质表达通常限于神经毡的邻近500-1000um(图5)。这些发现与来自脑室CSF的载体的有限扩散一致。
对多灶性GFP表达模式的进一步评价揭示，阳性星形胶质细胞经常显示出沿穿支动脉血管的血管周围分布(图6和7)。通过图像分析检测GFP免疫组织化学阳性细胞突出了沿着这些血管的分布和表达的线性性质(图8)。星形胶质细胞的这种血管周围转导与鞘内施用的载体通过类淋巴流入到达脑实质间质液的情况一致。
表5对来自对照动物P0001以及通过IT LP和ICM途径具有3.0×1013vg/动物的scAAV9-CB-GFP的动物的脊髓、DRG和脑切片的GFP免疫组织化学评分。
LP IT，鞘内；ICM，颅内大孔；neg，阴性；L SC，腰椎脊髓；SDRG，骶背根神经节；PFC，前额皮质；TC，颞叶皮质；PUT，壳核；CG，扣带回；CC，胼胝体；TH，丘脑；HT，下丘脑；HC，海马体；AMD，杏仁核；SN，黑质；PN，脑桥；CB，小脑；DCN，深部小脑核；OC：枕叶皮质；n/p，不存在；neg，阴性。
类淋巴是一种最近被认识到的系统，通过该系统，CSF沿着由邻近星形胶质细胞的血管所形成的动脉周围空间被抽入脑的较深区域，在这些较深区域中，CSF可以与间质液交换，然后在等同的小静脉周围空间中离开脑。该系统被认为在流体的移动和从脑实质中去除大分子方面起主要作用。与AAV载体大小相当的较大颗粒(诸如脂蛋白)移动通过类淋巴系统。本研究中观察到的GFP分布模式与载体在脑表面衬膜上的有限扩散以及载体主要通过类淋巴流入进入的情况一致。
基于这些发现，可以在IT施用后提出AAV载体CNS和全身分布的模型(图9)。CSF持续产生，并且在食蟹猴中的半衰期为约5小时，然后通过蛛网膜颗粒和神经根从鞘内空间排出，此时其进入脑膜淋巴管，并随后进入体循环。基于组织中定量的载体DNA拷贝数，与IT递送后肝脏中的1.3％相比，给药后1个月时脑中仅可检测到总3.0×1013载体剂量的0.01％。这与大多数载体在通过类淋巴流入与脑实质中的间质液交换之前从鞘内空间排出到体循环的情况是一致的。通过在鞘内给药时增强类淋巴流入，将实现间质液中更高水平的载体，从而改善靶细胞类型的转导并使其更均匀。此外，减少载体向全身器官的分布可减少这些组织中的安全性问题。
实例2：在食蟹猴中单次鞘内注射后类淋巴流量调节对AAV9脑转导的影响，观察期为4周
先前的非临床NHP研究已经证明了在鞘内给药AAV基因疗法载体后脑实质的低和可变转导。使用互补分子定位方法(免疫组织化学和原位杂交)来评估脑转导，在实质中检测到的绝大多数转导细胞似乎是邻近血管周围空间定位的星形胶质细胞，这表明载体可通过类淋巴系统进入脑实质。许多驱动因素可能影响类淋巴流入，诸如相对于睡眠周期的施用时间、麻醉方案、动脉脉搏波和外周渗透压，并影响载体颗粒进入脑实质的间质空间。这些因子的操作可提高脑中靶细胞类型的转导水平并降低总体变异性。此外，增加向CNS组织的分布和CNS组织的转导也可减少全身分布和相关的安全信号，诸如肝和背根神经节毒性。
因此，本研究的目的是探索剂量时机、麻醉方案和血浆高渗透性，以降低鞘内注射AAV载体后对食蟹猴单次给药时脑转导的变异性和提高脑转导水平。将通过EEG监测脑电波活动，以评估麻醉深度，并相对于低频高振幅δ波模式改善剂量施用的时机。给药后，将对动物进行至少4周的给药后观察，并将变化与以标准方式施用载体的对照组进行比较。
表6组分配和剂量水平
TBD＝待确定注意：将动物分为3个队列。队列1将由第1组中的所有动物组成，队列2将由第2组中的所有动物组成，并且队列3将由第3组中的所有动物组成
a所有组均给药供试品(scAAV9-CB-GFP)。
b动物将以2mL/动物的体积给药
剂量施用原理
选择鞘内注射施用途径是因为它是预期的人类治疗途径。它是实现中枢神经系统广泛转导同时限制全身暴露的首选施用途径。
剂量确定依据
3e13vg/动物的剂量先前已用于表征AAV9-CB-GFP在脑实质内的转导谱，因此将其用作基准。在使用类似供试品的既往研究中，该剂量水平通常耐受良好，并且未报告严重不良事件。在该剂量下，以前的不耐受发现包括观察到肝酶升高和背根神经节中的神经病理学变化(已被鉴定为与AAV平台相关的发现)。
物种选择
食蟹猴历来用于AAV生物分布和安全性评价研究，并且从科学观点来看是一种非临床模型选择。由于猴和人之间CNS解剖结构的相似性，选择食蟹猴作为相关物种。
表7剂量施用
麻醉方法
用于队列1的方法
给药前，将动物在给药前10至15天用氯胺酮(10mg/kg)麻醉，随后用右美托咪定(0.02mg/kg)麻醉。在完成剂量施用后，将使动物维持背卧位，下肢抬高(特伦德伦伯格卧位)，保持10至15分钟。将向动物施用阿替美唑(0.2mg/kg IM)。给药将在标准时间8:00-10:00AM进行。
用于队列2和3的方法
给药前，将动物在给药前10至15天用氯胺酮(10mg/kg)麻醉，随后用右美托咪定(0.02mg/kg)麻醉，然后进行七氟烷吸入麻醉。
将通过EEG监测麻醉深度，并在达到深度麻醉状态(最大δ功率和最小α功率)时进行给药。
对于队列3，将进行高渗盐水(HTS)(NaCl 3％ AT 2-3.5ml/kg)的静脉内注射，并在HTS施用后5分钟进行给药。施用所有高渗流体时都需要监测流体和电解质，特别要注意血清钠、钾和流体输入/输出。
在完成剂量施用后，将使动物维持背卧位，下肢抬高(特伦德伦伯格卧位)，并在给药后1至2小时的总手术时间内保持麻醉。
给药将在2:00-4:00PM进行。
临床观察结果
动物健康监测-每天至少两次(上午和下午)；转运/终止日至少一次。
笼边观察-在给药前和给药阶段期间每天一次。
给药后检查-每只给药动物给药当天。时间点为给药后1小时。将根据每只动物的给药完成时间进行观察。
体重-给药前阶段：至少一次。给药阶段：第1天、第8天、第15天、第22天和第28天各一次。
食物消耗-在给药前和给药阶段每天，但动物抵达/转运当日除外，或在其他研究程序中酌情禁食。
抗AAV9衣壳免疫原性分析
将在给药前阶段、以及第1天给药前至少收集一次血清样品，并在给药阶段期间第8天、第15天和第22天以及在计划安乐死当天(仅计划在当天处死的动物)收集一次。
当获得足够的样品时，将分析血清样品的抗AAV9衣壳免疫原性。如果无法完成计划的测试，将记录原因。
生物分布分析
将在第1天给药前收集血液样品，并在给药阶段期间第8天以及在计划安乐死当天(仅计划在当天处死的动物)收集一次。
当样品量足够大时，将通过使用非GLP方法来分析血液细胞团和血浆中的DNA(载体基因组)。将记录用于分析的样品量不足的情况。
Nfl和GFAP分析
将在第1天给药前收集血浆样品，并在给药阶段期间第8天、第15天、第22天和第28天收集一次。
当样品量足够大时，将通过使用针对NfL的非GLP方法和GFAP分析来分析血浆。将记录用于分析的样品量不足的情况。
用于抗AAV9衣壳免疫原性、生物分布以及NfL和GFAP分析的脑脊液
将在第1天给药前并在给药阶段期间在计划安乐死当天(仅计划在当天处死的动物)收集CSF样品。
管1：当样品量足够大时，将通过使用非GLP方法来分析CSF样品中的DNA(载体基因组)。将记录用于分析的样品量不足的情况。
管2：当样品量足够大时，将通过使用针对NfL的非GLP方法和GFAP分析来分析CSF样品。将记录用于分析的样品量不足的情况。
管3和4：当获得足够的样品时，将分析CSF样品的抗AAV9衣壳免疫原性(方法信息将通过修正案添加)。如果无法完成计划的测试，将记录原因。
应理解，本文描述的实例和方面仅出于说明的目的，并且根据其进行的各种修改或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。
另外，在本披露内容的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本披露因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
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Claims (191)

1.一种用于改善药物组合物向有需要的受试者的中枢神经系统的递送的方法，所述方法包括向所述受试者施用增强类淋巴流入的药剂与所述药物组合物的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述药剂与所述药物组合物同时或依次施用。
3.如权利要求2所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前施用所述药剂。
4.如权利要求2所述的方法，其中在施用所述药物组合物之后施用所述药剂。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过鞘内(IT)、枕大池内(ICM)和/或脑室内(ICV)施用来施用。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂通过静脉内输注、静脉内注射、吸入、腹膜内、口服、皮下或肌内途径施用。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂促进血脑屏障内的间质液循环，例如，其中所述药剂包含水通道蛋白4(AQP4)促进剂，例如TGN-073。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂包含上调AQP4表达(例如七氟烷)或改变AQP4的亚细胞定位的化合物。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
13.如权利要求12所述的方法，其中首先向所述受试者施用氯胺酮，随后施用所述药物组合物，并随后施用右美托咪定。
14.如权利要求13所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用所述药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
16.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中在施用右美托咪定之后向所述受试者额外施用七氟烷。
18.如权利要求17所述的方法，其中七氟烷作为吸入剂施用。
19.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂诱导血浆高渗性。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述高渗盐水是2％NaCl、3％NaCl、5％NaCl、7％NaCl或23％NaCl，并且优选地是3％NaCl。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用所述药剂，并且任选地其中能够重复所述施用。
25.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
27.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述药剂包含VEGF-C。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，将所述受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
34.如权利要求30-32所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
35.如权利要求30-32所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
38.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
39.一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包含编码与所述神经疾病相关联的基因的AAV，其中所述药物组合物的所述施用与睡眠周期期间的CSF流入一致。
40.如权利要求39所述的方法，其中当所述受试者入睡时，例如，如通过脑电图(EEG)监测所示，施用所述药物组合物。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中将睡眠增强药物与所述药物组合物组合施用于所述受试者。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述睡眠增强药物选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
43.一种用于改善神经退行性治疗剂在脑中的转导效率和/或分布的方法，所述方法包括在有需要的受试者中将所述神经退行性治疗剂与增强类淋巴流入的第二药剂组合施用，从而改善所述神经退行性治疗剂在所述受试者中的转导效率。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述神经退行性治疗剂是靶向CNS的病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述第二药剂与所述神经退行性治疗剂同时或依次施用。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述第二药剂在所述神经退行性治疗剂之前施用。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述第二药剂在所述神经退行性治疗剂之后施用。
48.如权利要求43-47中任一项所述的方法，其中所述神经退行性治疗剂通过鞘内(IT)、枕大池内(ICM)和/或ICV施用，通过推注、缓慢推注和/或通过所植入的鞘内或脑室内导管进行输注来施用。
49.如权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述第二药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
51.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
52.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
53.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述第二药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
56.如权利要求55所述的方法，其中在施用所述神经退行性治疗剂之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用所述神经退行性治疗剂之前约10至15分钟施用氯胺酮。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
58.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中在施用右美托咪定之后向所述受试者额外施用七氟烷。
60.如权利要求59所述的方法，其中七氟烷作为吸入剂施用。
61.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂诱导血浆高渗性。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述第二药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述第二药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述高渗盐水是2％NaCl、3％NaCl、5％NaCl、7％NaCl或23％NaCl，并且优选地是3％NaCl。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
66.如权利要求61-65中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用所述药剂，并且任选地其中能够重复所述施用。
67.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述第二药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
69.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述第二药剂包含VEGF-C。
70.如权利要求43-69中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，将所述受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1至2小时。
71.如权利要求43-70所述的方法，其中所述神经退行性治疗剂是腺相关病毒(AAV)病毒载体。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
75.如权利要求71-73所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
76.如权利要求71-73所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
77.如权利要求71-76中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
78.如权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
79.如权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
80.一种增加鞘内递送的药物组合物的功效的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述药物组合物与增强类淋巴流入的药剂的组合。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述药剂与所述组合物同时或依次施用。
82.如权利要求81所述的方法，其中在施用所述组合物之前施用所述药剂。
83.如权利要求81所述的方法，其中在施用所述组合物之后施用所述药剂。
84.如权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
85.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
86.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
87.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
88.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
91.如权利要求90所述的方法，其中首先向所述受试者施用氯胺酮，随后施用所述药物组合物，并随后施用右美托咪定。
92.如权利要求91所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用所述药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
93.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中氯胺酮以100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
94.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
95.如权利要求90-94中任一项所述的方法，其中在施用右美托咪定之后向所述受试者额外施用七氟烷。
96.如权利要求95所述的方法，其中七氟烷作为吸入剂施用。
97.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述药剂诱导血浆高渗性。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水或甘露醇。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述高渗盐水是3％NaCl。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
102.如权利要求97-101中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用所述药剂，并且任选地其中能够重复所述施用。
103.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
105.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述药剂包含VEGF-C。
106.如权利要求80-105中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，将所述受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
107.如权利要求80-106中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
111.如权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
112.如权利要求108-110所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
113.如权利要求108-110所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
114.如权利要求108-113中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
115.如权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
116.如权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
117.一种减少用包含病毒载体的药物组合物治疗的患者群体中病毒载体的可变脑分布的方法，所述方法包括向所述受试者施用增强类淋巴流入的药剂与所述药物组合物的组合。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述药剂与所述组合物同时或依次施用。
119.如权利要求118所述的方法，其中在施用所述组合物之前施用所述药剂。
120.如权利要求118所述的方法，其中在施用所述组合物之后施用所述药剂。
121.如权利要求117-120中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过鞘内(IT)施用和/或通过枕大池内(ICM)来施用。
122.如权利要求117-121中任一项所述的方法，其中所述药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
123.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
124.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
125.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
126.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
128.如权利要求126所述的方法，其中所述药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
129.如权利要求128所述的方法，其中首先向所述受试者施用氯胺酮，随后施用所述药物组合物，并随后施用右美托咪定。
130.如权利要求129所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用所述药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
131.如权利要求128-130中任一项所述的方法，其中氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
132.如权利要求128-130中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
133.如权利要求128-132中任一项所述的方法，其中在施用右美托咪定之后向所述受试者额外施用七氟烷。
134.如权利要求133所述的方法，其中七氟烷作为吸入剂施用。
135.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂诱导血浆高渗性。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水或甘露醇。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述高渗盐水是2％NaCl、3％NaCl、5％NaCl、7％NaCl或23％NaCl，并且优选地是3％NaCl。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
140.如权利要求135-139中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用所述药剂，并且任选地其中能够重复所述施用。
141.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
143.如权利要求117-122中任一项所述的方法，其中所述药剂包含VEGF-C。
144.如权利要求117-143中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，将所述受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
145.如权利要求117-144中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
148.如权利要求145-147中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
149.如权利要求145-147所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
150.如权利要求145-147所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
151.如权利要求145-147中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
152.如权利要求145-151中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
153.如权利要求145-151中任一项所述的方法，其中所述组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
154.一种减少靶向有需要的受试者的CNS的药物组合物的全身暴露以便减少所述受试者的肝和/或DRG毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用增强类淋巴流入的药剂与所述药物组合物的组合。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述药剂与所述组合物同时或依次施用。
156.如权利要求155所述的方法，其中在施用所述组合物之前施用所述药剂。
157.如权利要求155所述的方法，其中在施用所述组合物之后施用所述药剂。
158.如权利要求154-157中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过鞘内(IT)施用和/或通过枕大池内(ICM)来施用。
159.如权利要求154-158中任一项所述的方法，其中所述药剂通过静脉内输注、静脉内注射和/或吸入来施用。
160.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂包含AQP4促进剂，例如TGN-073。
161.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂包含上调AQP4的化合物，例如七氟烷。
162.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂包含α-2肾上腺素能激动剂，例如可乐定、西扎尼定或右美托咪定(例如Precedex或Dexdomitor)。
163.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂包含一种或多种FDA批准的增强类淋巴流入的麻醉剂。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述麻醉剂是氯胺酮、右美托咪定、或赛拉嗪或其组合。
165.如权利要求163所述的方法，其中所述药剂包含氯胺酮和右美托咪定的组合。
166.如权利要求165所述的方法，其中首先向所述受试者施用氯胺酮，随后施用所述药物组合物，并随后施用右美托咪定。
167.如权利要求166所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，并且优选在施用所述药物组合物之前约10至15分钟施用氯胺酮。
168.如权利要求165-167中任一项所述的方法，其中氯胺酮以约100mg/kg、约90mg/kg、约80mg/kg、约70mg/kg、约60mg/kg、约50mg/k、约40mg/kg、约30mg/kg、约20mg/kg、约10mg/kg、约9mg/kg、约8mg/kg、约7mg/kg、约6mg/kg、约5mg/kg、约4mg/kg、约3mg/kg、约2mg/kg、约1mg/kg施用，优选以约10mg/kg施用。
169.如权利要求165-167中任一项所述的方法，其中右美托咪定以约1mg/kg、约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/k、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg、约0.1mg/kg、约0.09mg/kg、约0.08mg/kg、约0.07mg/kg、约0.06mg/kg、约0.05mg/kg、约0.04mg/kg、约0.03mg/kg、约0.02mg/kg、约0.01mg/kg、约0.009mg/kg、约0.008mg/kg、约0.007mg/kg、约0.006mg/kg、约0.005mg/kg施用，并且优选以约0.02mg/kg施用。
170.如权利要求165-169中任一项所述的方法，其中在施用右美托咪定之后向所述受试者额外施用七氟烷。
171.如权利要求170所述的方法，其中七氟烷作为吸入剂施用。
172.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂诱导血浆高渗性。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述药剂包含高渗盐水(例如，含有或不含乙酸钠的氯化钠)或甘露醇。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述药剂包含含有或不含乙酸钠的高渗盐水。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述高渗盐水是2％NaCl、3％NaCl、5％NaCl、7％NaCl或23％NaCl，并且优选地是3％NaCl。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述3％NaCl以约2-3.5ml/kg施用。
177.如权利要求172-176中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20分钟，优选约5分钟通过静脉内或输注注射施用所述药剂，并且任选地其中能够重复所述施用。
178.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂通过增加慢波睡眠来增强类淋巴流入。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：噻加宾、加波沙朵、加巴喷丁、普瑞巴林、GHB、利坦色林、依利色林、米氮平、奥氮平和曲唑酮，或其组合。
180.如权利要求154-159中任一项所述的方法，其中所述药剂包含VEGF-C。
181.如权利要求154-180中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，将所述受试者维持在下肢抬高的位置，例如特伦德伦伯格卧位，保持约1-2小时。
182.如权利要求154-181中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含病毒载体、抗体、反义寡核苷酸或纳米颗粒。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述药物组合物包含腺相关病毒(AAV)病毒载体。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自以下的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV 12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-lb、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-l l/rh.53、AAV4-8/r 11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAV A3.3、AAV A3.4、AAVA3.5、AAV A3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5Rl、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC 12、AAV-2-pre-miRNA-lOl、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.l l、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPEN AAV 10和/或日本AAV 10血清型，及其变体。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含衍生自AAV9的衣壳蛋白。
186.如权利要求183-185中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码存活运动神经元(SMN)蛋白的多核苷酸。
187.如权利要求183-185所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
188.如权利要求183-185所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
189.如权利要求183-185中任一项所述的方法，其中载体包含两个ITR(例如经修饰的AAV2 ITR和未经修饰的AAV2 ITR)、启动子(例如鸡β-肌动蛋白(CB)启动子)、增强子(例如巨细胞病毒(CMV)立即/早期增强子)、内含子(例如经修饰的SV40晚期16s内含子)、聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号)。
190.如权利要求183-189中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含介于1×1010个与1×1015个之间的病毒载体基因组，诸如1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个病毒载体基因组。
191.如权利要求183-189中任一项所述的方法，其中所述组合物包含每毫升介于1×1010个至1×1015个之间的载体基因组(vg/ml)，诸如每毫升1×1012个、5×1012个、1×1013个、5×1013个、1×1014个、5×1014个、1×1015个载体基因组(vg/ml)。
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