CN118028489A - 一种分子组合生物标志物及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分子组合生物标志物及其检测试剂盒,涉及生物技术领域。该分子组合生物标志物为ANXA1基因,LDLR基因和负调控相关的has‑miR‑106a‑5p;其筛选方法为:构建包含甲基化DNA序列的小鼠模型,提取基因组DNA和总RNA,进行DNA甲基化测序、转录组测序、miRNA测序;与临床样品中的测序数据对照,筛选出具有相同趋势的差异表达基因和差异表达的miRNA;miRNA预测的靶基因与差异表达基因联合,筛选出miRNA与mRNA负相关的调控对;检测该分子组合生物标志物的试剂盒及其应用方法。本发明利用高量测序技术,将甲基化组学和转录组学联合,筛选出表达与甲基化呈现负相关的基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种分子组合生物标志物及其检测试剂盒。
背景技术
多囊卵巢综合征(PCOS)是一种最常见的内分泌和代谢紊乱的异质性疾病,在多个方面影响女性健康,PCOS在育龄女性中的患病率为5%~18%。PCOS患者通常伴有各种症状,包括高雄激素血症、胰岛素抵抗、高血压、超重、II型糖尿病等。当前PCOS诊断的标准多采用鹿特丹标准,符合高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、彩超显示多囊卵巢三项中的两项,同时也会结合患者的性激素和其他临床症状进行综合评估。据统计,70%被诊断为多囊症的女性在未来几年内会不孕,鉴于PCOS的复杂性和特异性,临床上对其具体的发病原因及发病的机制尚缺乏明确的结论。当前正缺乏用于快速诊断PCOS的生物标志物,主要原因是没有发现一种专门针对PCOS的特异性志物。
表观遗传学主要的特点是在DNA序列保持不变的情况下,基因功能或活性发生可遗传和可逆的变化。其中,DNA甲基化是表观遗传学中研究最广泛、理解最透彻的之一,涉及许多疾病,包括癌症、印迹基因和重复不稳定性疾病。研究人员在PCOS患者的卵巢组织、脂肪组织、外周血和颗粒细胞中观察到一些基因改变了DNA甲基化,如PRDM1、PPARG、KCTD21和LHCGR。同时,在PCOS患者的卵巢和血液中发现了大量差异甲基化的CpG位点,这些位点被认为与免疫和炎症密切相关。因此,可能在PCOS患者中的某种卵巢细胞中,存在一部分基因特定的DNA甲基化,用于维持PCOS疾病的发生发展。传统诊断中,除了鉴定患者高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、彩超多囊卵巢三项中的两项外,还需排除其他疾病所引起的类似临床症状,诊断过程繁琐,容易误诊。
如何有效筛选出专门针对PCOS诊断的特异性标志物,成为了科研人员亟需解决的科学问题。因此,研发出快速、准确用于诊断PCOS疾病的试剂盒,为以卵巢疾病为代表的生殖系统疾病的诊断提供新的思路。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种特异性联合生物标志物,并研发快速、准确该联合生物标志物的试剂盒。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是如何开发一种特异性分子组合生物标志物,并研发快速、准确该分子组合生物标志物的试剂盒。
为实现上述目的本发明提供了一种分子组合生物标志物的筛选方法,包括以下步骤:
步骤1、构建PCOS的小鼠模型;
步骤2、从步骤1获得的小鼠模型提取基因组DNA和总RNA,
步骤3、对步骤3提取的基因组DNA和总RNA分别进行DNA甲基化测序、转录组测序、miRNA测序;
步骤4、将步骤3得到的DNA甲基化组测序数据、转录组测序数据、miRNA测序数据与PCOS患者临床样品中的测序数据联合分析,筛选出具有相同变化趋势的差异表达基因和差异甲基化基因,即启动子区低甲基化高表达的基因;
步骤5、将步骤4筛选出的启动子区低甲基化高表达的基因进行甲基化特异性PCR验证和RT-qPCR验证,得到表达与甲基化呈现负相关的基因为ANXA1基因。
进一步地,步骤3还包括:
步骤3.1、从步骤2获得的基因组DNA富集全基因组甲基化片段;
步骤3.2、使用步骤4获得的全基因组甲基化片段构建全基因组甲基化文库。
进一步地,步骤3.1利用与生物素偶联的人MBD2蛋白实现甲基化片段的富集。
进一步地,步骤1还包括:对ICR小鼠注射二氢睾酮。
本申请还提供了一种检测分子组合生物标志物的试剂盒,包括反转录部分和扩增特定甲基化区域部分。
本申请还提供了一种分子组合检测生物标志物的试剂盒的应用方法,将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化,总RNA反转录为cDNA,将cDNA再进行qPCR,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平作为内参基因,利用RT-qPCR检测ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p的表达水平,甲基化特异性的PCR检测ANXA1基因启动子区的甲基化水平。
进一步地,RT-qPCR的引物为ANXA1-F和ANXA1-R,所述ANXA1-F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示,所述ANXA1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地,使用甲基化试剂盒对提取后片段化的基因组DNA进行富集,富集后的片段进行DNA甲基化测序文库的构建。
进一步地,分别添加针对ANXA1启动子区未甲基化和甲基化的专用引物进行甲基化特异性的PCR扩增,扩增的产物在进行2%的琼脂糖凝胶电泳。
进一步地,扩增的产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地,通过检测患者颗粒细胞LDLR的负调控miRNA和表达水平、ANXA1基因启动子甲基化和表达水平,达到快速、准确、高效诊断PCOS。
进一步地,通过对ICR小鼠注射二氢睾酮(DHT)作为体外研究的PCOS模型,并对构建的PCOS小鼠模型进行了血清和形态学的鉴定,取下小鼠卵巢组织,提取了基因组DNA,进行DNA甲基化测序。同时,对PCOS患者的颗粒细胞提取了基因组DNA和总RNA,分别进行了DNA甲基化测序、转录组测序、miRNA测序。筛选PCOS诊断标志物的过程中,结合动物模型和临床样品测序数据,将DNA甲基化组学、转录组学、miRNA测序数据进行联合分析,筛选出在动物模型和临床样品中具有相同趋势的差异表达基因。
在本发明的较佳实施方式1中,详细说明构建PCOS小鼠模型的过程;
在本发明的另一较佳实施方式2中,详细说明提取核酸的过程;
在本发明的另一较佳实施方式3中,详细说明MBD蛋白富集全基因组甲基化片段的过程;
在本发明的另一较佳实施方式4中,详细说明构建MBD蛋白富集全基因组甲基化文库的过程;
在本发明的另一较佳实施方式5中,详细说明构建转录组测序(RNA-seq)文库的过程;
在本发明的另一较佳实施方式6中,详细说明构建转录组测序(RNA-seq)文库的过程;
在本发明的另一较佳实施方式7中,详细说明检测ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p的试剂盒的应用过程。
本发明有益的技术效果如下:
本发明构建了PCOS的小鼠模型,方便后续对PCOS的进一步研究。
将PCOS小鼠模型和临床样品甲基化测序联合,鉴定出在模型和临床样品中均特异的差异甲基化基因。利用高量测序技术,将甲基化组学和转录组学联合,筛选出表达与甲基化呈现负相关的基因,将其作为PCOS诊断标志物。
本发明提供了PCOS小鼠模型的构建方法,和一种新的PCOS诊断标志物的筛选技术。所鉴定出的ANXA1基因在临床样品中进行了验证,可以很好的区分PCOS患者和对照组。并且不需要特殊的实验设备和实验材料,成本较低,利于后续诊断试剂盒的推广。
本发明通过检测患者颗粒细胞LDLR的负调控miRNA和表达水平、ANXA1基因启动子甲基化和表达水平,达到了快速、准确、高效诊断PCOS。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例6的PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的MBD-seq的差异甲基化区域分析的聚类热图;
图2是本发明的一个较佳实施例6的PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的RNA-seq的差异表达基因的火山图;
图3是本发明的一个较佳实施例6的PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的miRNA-seq差异表达的火山图;
图4是本发明的一个较佳实施例7的PCOS患者颗粒细胞的甲基化特异性PCR和RT-qPCR对ANXA1基因的验证结果。
图5是本发明的一个较佳实施例7的PCOS患者颗粒细胞的RT-qPCR对LDLR基因和负调控相关的has-miR-106a-5p验证结果。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
以下实施例中使用到的引物序列如表1所示:
表1引物序列
实施例1构建PCOS小鼠模型
购买的ICR小鼠饲养在食物、湿度、光照和通风条件都合适的实验动物中心。让雌鼠与雄鼠交配,并每天检查交配塞。发现交配塞被认为是妊娠第1天,妊娠16~18天时,向雌鼠皮下注射含350μg DHT的70μL芝麻油或只注射70μL芝麻油。经DHT诱导的后代为PCOS小鼠,对照组的后代为对照小鼠。8周龄小鼠用水合氯醛麻醉后安乐死,收集卵巢等实验材料。进行以下步骤:
1)小鼠卵巢组织处理及组织学检查
小鼠安乐死后,解剖卵巢,一部分快速保存于-80℃,另一部分用4%多聚甲醛固定于4℃过夜。固定的卵巢随后保存于70%乙醇中进行组织学检查。固定后的卵巢组织用酒精脱水,二甲苯清除后浸于石蜡熔液中包埋。切至5μm厚的石蜡切片固定在3-亚胺丙基三硫化硅烷镀膜玻片上,用苏木精-伊红(HE)染色观察卵泡生长,计数卵泡数量。
2)颗粒细胞分离和保存
所有受试者在黄体中期(排卵后7天)皮下注射促性腺激素释放激素约15天。用超声和血清雌二醇监测卵泡大小。当两个或多个卵泡直径达到15毫米时,参与者被注射6000IU的人绒毛膜促性腺激素。36小时后,超声引导下经阴道吸取卵母细胞,获取颗粒细胞,然后用Dulbecco改良Eagle培养基离心洗涤两次。分离的颗粒细胞快速转移至液氮,随后在-80℃下保存。
实施例2提取核酸
提取核酸包括以下步骤:
㈠基因组DNA的提取
使用Axygen gDNAExtraction kit进行实施例1得到的颗粒细胞样品进行基因组DNA的提取,实验具体步骤参考protocol指示:
(1)将-20℃保存的细胞沉淀取出,室温解冻后,使用350μL 1×PBS缓冲液将细胞悬浮起来,移液枪轻柔吹打。
(2)向EP管中加入0.8μLRNaseA,中速涡旋15s后室温下静置1min。
(3)向EP管中加入150μLBuffer CL和8μL蛋白酶K(试剂盒提供,注意不要将蛋白酶K与Buffer CL溶液预混;第一次使用时用试剂盒提供的Buffer PK将蛋白酶K溶解后再使用)。涡旋1min,瞬时离心后,56℃水浴孵育10min。
(4)取出后,直接向EP管中加入350μL Buffer PD,于涡旋混匀仪上中速涡旋30s,室温离心,12000×g 10min。
(5)将步骤(4)中的上清液小心吸取至制备管中(注意不要吸到沉淀),放入收集管内,室温离心,12000×g 1min。
(6)弃滤液,制备管内加入500μLBufferW1,室温离心,12000×g 1min。
(7)弃滤液,制备管内加入700μl BufferW2(首次使用时,需按瓶身指示,加入相应体积无水乙醇至母液中),室温离心,12000×g 1min。
(8)重复上步(7)操作,再洗涤一次。
(9)弃滤液,室温离心,12000×g 1min。
(10)将制备管放入洁净的1.5mL离心管中,取30μL EluentBuffer(提前预热至65℃提高洗脱效率)加入制备管膜中央,室温下静置1min。
(11)室温离心,12000×g 1min,洗脱基因组DNA。重复用30μL EluentBuffer再洗脱一次,提高产物得率。
㈡总RNA的提取
使用TRIzol和氯仿抽提的方法进行总RNA的提取,具体操作如下:
(1)将超低温保存的样品取出,冰上解冻,离心机4℃预冷。
(2)向样品中加入200mL氯仿(氯仿避光保存),置于涡旋仪上剧烈混匀30s,室温静置3-5min,12000×g低温离心15min。
(3)离心后小心取出离心管,可见明显分层。小心吸取无色水相,转移至新的1.7mL无核酸酶的离心管中。
(4)向管内上清液中加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀20s,室温静置10min后,12000×g低温离心10min。
(5)离心结束后,小心吸弃上清(管底或有白色沉淀,为RNA)。加入1mL预冷的75%乙醇,颠倒轻弹,使沉淀飘起,7500×g低温离心5min。重复操作一遍。
(6)充分吸弃上清,打开管盖晾干约5min,至沉半透明,加入无核酶水,使RNA沉淀溶解后定量。
(7)使用Nanodrop One对RNA进行定量。总RNA的标准吸光度比值A260/280在2.0~2.2之间,偏低可能是存在蛋白污染,A260/230在2.0~2.5之间,偏低表示可能是盐离子的残留。
(8)使用无核酸酶的电泳器材,使用1%琼脂糖凝胶和0.5×TBE,在120V恒压电泳20min后,在凝胶成像仪上观察RNA的完整性。
实施例3MBD蛋白富集全基因组甲基化片段
实验利用MethylMinerTM Methylated DNA Enrichment Kit对片段化后的基因组DNA进行甲基化富集。本方法的原理是利用与生物素偶联的人MBD2蛋白实现甲基化片段的富集。MBD蛋白能够通过与甲基-CpG结合结构域结合,捕获高CpG甲基化密度的双链DNA片段。同时,甲基-CpG结合结构域通过生物素连接物与DynaM-280链霉素亲和磁珠偶联,可先将甲基化片段从全基因组DNA片段中分离出来,最终用NaCl洗脱缓冲液将甲基化的双链DNA洗脱下来,对富集下来的片段再进行高通量测序的文库构建。
第一步进行磁珠的准备,主要步骤包括预洗磁珠、MBD-biotin蛋白与磁珠的偶联,磁珠的再次清洗:
(1)用移液器轻柔地吹打重悬DynaM-280链霉素亲和磁珠(试剂盒提供),其中为了减少样品的损失,此实验部分枪头和离心管均使用低吸附型号。
(2)取10μL磁珠至1.5mL离心管中,加入1×Binding Buffer补至100μL,用移液器轻柔地吹打混匀。
(3)将离心管置于磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(4)向离心管中加入1×Binding Buffer 100μL重悬磁珠,轻柔吹打混匀。
(5)重复步骤(3)至(4)一次。
(6)用移液器轻柔地吹打混匀MBD-biotin蛋白,吸取3.5μg(7μL)至一个新的1.5mL离心管中。
(7)向离心管中加入1×Binding Buffer补足100μL,轻柔吹打混匀。
(8)将管中MBD-biotin蛋白转移至磁珠管中,使终体积为200μL。
(9)将离心管口用封口膜密封,置于翻转摇匀仪上,转速900rpm,室温下孵育1h。(10)将离心管放在磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(11)向离心管中加入100μL 1×Binding Buffer,轻柔吹打重悬磁珠。
(12)将离心管口用封口膜密封,置于翻转摇匀仪上,转速900rpm,室温下混匀5min。
(13)重复步骤(10)至(12)2次。
(14)将离心管置于磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(15)加入100μL 1×Binding Buffer轻柔吹打混匀,重悬磁珠。
第二步进行MBD-磁珠与超声断裂实施例2的步骤㈠提取的DNA样品的结合,在该部分实验中准备由片段化的K-562细胞基因组(试剂盒提供)与合成双链甲基化DNA(试剂盒提供)、合成双链非甲基化DNA(试剂盒提供)混合成的平行对照组,用于实验后富集效率的质检。
(1)准备平行对照组:准备与样品组DNA量一致的片段化的K-562基因组DNA,按照每1μg K-562DNA加入各10pg的合成双链甲基化DNA和合成双链非甲基化DNA(使用前,将试剂盒中提供的合成双链甲基化和非甲基化DNA 1μL稀释于99μL的ddH2O中,终浓度为10pg/μL,现用现配)。
(2)向1.5mL离心管中加入20μL 5×Binding Buffer。
(3)将DNA片段和平行对照组分别用ddH2O补至90μL,各取10μL作为不进行甲基化富集的Input(起始样品)组,剩余加入步骤(2)的离心管中,吹打混匀,使终体积为100μL。
(4)将离心管中的DNA片段和平行对照组分别转入含有MBD-磁珠的离心管中,使终体积为200μL。
(5)将离心管口用封口膜密封,置于翻转摇匀仪上,转速900rpm,室温下孵育1h或4℃过夜孵育。
第三步进行DNA片段的洗脱,主要步骤包括MBD-磁珠上未结合的非甲基化DNA片段的洗脱,甲基化DNA片段的洗脱和乙醇沉降。
(1)将离心管放在磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上。
(2)弃掉将样品管中上清。将平行对照组上清转移至新的1.5mL离心管,暂存于冰上,标为Unbond(未结合的非甲基化DNA片段,200μL)。
(3)向离心管中加入200μL 1×Binding Buffer,将离心管口用封口膜密封,置于翻转摇匀仪上,转速900rpm,室温下摇匀3min。
(4)将离心管放在磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上。
(5)弃掉将样品管中上清。将平行对照组上清转移至新的1.5mL离心管,暂存于冰上,标为Wash(洗液,200μL)。
(6)重复步骤(3)至(5)一遍,合并上清存于冰上(Wash,400μL)。
(7)向离心管中加200μL 2M NaCl,将离心管口用封口膜密封,置于翻转摇匀仪上,转速900rpm,室温下摇匀3min。
(8)将离心管放在磁架上,静置3min富集磁珠,至磁珠全部吸附在管壁上。
(9)将样品管和平行对照组离心管中的上清分别转移至新的1.5mL离心管中,暂存于冰上,标为Elution(甲基化DNA片段洗脱液,200μL)。
(10)重复步骤(7)至(9)一遍,合并上清存于冰上(Elution,400μL)。
(11)向各离心管中加入2.5×无水乙醇、0.1×NaAC、1μL Glycogen,置于涡旋混匀仪上5s混匀。
(12)将各离心管口用封口膜密封,放入-80℃冰箱中静置2h。
(13)将各离心管放入低温离心机中,4℃下14000g离心1h。
(14)小心吸走上清,加入500mL预冷至-20℃的70%乙醇,4℃下14000g离心5min。
(15)重复步骤(14)一次。
(16)小心吸走上清,打开离心管盖风干3min。
(17)平行对照组各离心管加入10μL ddH2O,样品组各离心管加入57μLddH2O,吹打重悬DNA。
第四步利用聚合酶链式反应(PCR)的方法对平行对照组进行质检。将平行对照组的Input组、Unbond组、Wash组和Elution组,分别用合成双链甲基化DNA和合成双链非甲基化DNA的对应引物进行聚合酶链式反应。
(1)分别取2μL平行对照组-Input、平行对照组-Unbond、平行对照组-Wash和平行对照组-Elution,配置的PCR体系如表2所示:
表2 PCR体系
(2)PCR反应程序如表3所示:
表3 PCR反应程序
(3)PCR反应完成后,采用水平式琼脂糖凝胶电泳的方式进行合成双链甲基化DNA和合成双链非甲基化DNA的检测:配制2%的琼脂糖凝胶,使用0.5×TBE缓冲液作为电泳缓冲液,取10μL PCR样品上样,在120V恒压下电泳30min,之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察。合成双链甲基化DNA和合成双链非甲基化DNA在电泳图中应该在分别呈现出一条65bp和69bp的清晰条带。
实施例4构建MBD蛋白富集全基因组甲基化文库
实验利用UltraTMDNA Library Prep Kitfor/>对实施例3得到的甲基化富集后的颗粒细胞DNA片段进行建库。每个样品均构建两个文库:甲基化富集后的MBD组和作为背景对照未进行甲基化富集的Input组。
第一步进行甲基化富集片段化DNA的末端修复:
(1)在200μL PCR管中混合的成分如表4所示:
表4混合的成分
(2)将200μL移液枪刻度设置为50μl,然后将PCR管中液体上下吹打至少10次,直至完全混匀。
(3)将PCR管置于微型离心机上瞬时离心后放置在PCR仪中,将热盖温度设置为95℃,并运行程序如表5所示:
表5运行的程序
第二步进行测序接头(Adaptor)的连接:
(1)将Adaptor(15μM)用10mM Tris-HCl稀释10倍至最终浓度1.5μM,现用现配。
(2)将以下成分加入末端修复反应混合物中并混合均匀,如表6所示:
表6末端修复反应混合物成分
(3)将200μL移液器刻度设置为80μl,然后将PCR管中液体上下吹打至少10次,直至完全混匀(Blunt/TA Ligase Master Mix呈粘稠状,为确保连接反应必须保证充分混合)。
(4)将PCR管放入PCR仪中,在20℃下孵育15分钟。
(5)向PCR管中进一步加入3μL USERTM酶。
(6)将PCR管中液体上下吹打至混合均匀,放入PCR仪中,将热盖温度设置为47℃,在37℃下孵育15分钟。
第三步使用Ampure XP磁珠进行连接体系的纯化:
(1)将存放在4℃冰箱的AMPure XP磁珠取出,放入超净台中静置至少30min恢复至室温,之后放在涡旋仪上5s混匀。
(2)取1×连接体系体积的磁珠(86.5L)至1.5mL离心管中,加入样品液,置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育5min。
(3)将离心管置于磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(4)向置于磁力架上的离心管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(5)重复步骤(4)一次。
(6)将离心管瞬时离心后放回磁架上,用10μL移液器吸出残留的乙醇,注意不要扰动磁珠。
(7)打开离心管盖,待磁珠表面液体风干,呈磨砂状。
(8)将离心管从磁力架上取下,加入16μL 10mM Tris-HCl(pH=8.0),置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育2min。
(9)将离心管放回磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心将上清转移至新的1.5mL离心管中(注意不要扰动磁珠)。
第四步进行文库的PCR扩增,在此步中同时将测序用的P5/P7接头连接到DNA片段上:
(1)在200μL PCR管中混合以下成分,如表7所示:
表7文库扩增PCR成分
(2)将200μL移液枪刻度设置为40μL,然后将PCR管中液体上下吹打至少10次,直至完全混匀。
(3)将PCR管进行瞬时离心后放置在PCR仪中,将热盖温度设置为95℃,并运行以下程序,如表8所示:
表8文库扩增PCR程序
第五步为了去除文库中的接头二聚体,并且筛选插入片段长度最理想的文库片段,使用跑胶后切胶,利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒来进行胶回收法纯化文库:
(1)配制2%的琼脂糖凝胶,使用0.5×TBE缓冲液作为电泳缓冲液,取全部PCR样品上样,用50bp Ladder作电泳marker在120V恒压下电泳30min,之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察片段大小分布。
(2)在紫外灯切胶台下切下300-600bp范围的胶块(尽量远离二聚体所在位置),用无尘纸吸尽胶块表面液体,洁净刀片切成小碎块后装入1.5mL离心管中。
(3)记录1.5mL离心管重量,再称量装有胶块的1.5mL离心管重量,算出胶块的重量。
(4)依据胶块重量估算胶块体积(100mg=100μL体积),向离心管中加入3×胶块体积的BufferDE-A,混合均匀后置于75℃恒温金属浴中加热,每2min取出上下颠倒混匀,并观察凝胶块是否完全熔化,整个过程约7min)。
(5)向离心管中加入0.5×Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,加入后混合物呈黄色,充分混匀以形成均一的黄色溶液。
(6)将DNA制备管置于2mL收集管(试剂盒内提供)中,吸取并转移步骤(5)中的混合液到制备管中,室温下12000×g离心1min,弃滤液。
(7)将制备管放回收集管中,向管中加入500μL Buffer W1,室温下12000×g离心30s,弃滤液。
(8)将制备管放回收集管中,向管中加入700μL BufferW2(第一次使用前按试剂瓶上的指示加入一定体积无水乙醇),室温下12000×g离心30s,弃滤液。
(9)重复步骤(8)一次。
(10)将制备管置回收集管中,室温下12000×g离心1min后弃滤液。
(11)将制备管置于新的1.5mL收集管(试剂盒内提供)中,向制备膜中央加预热至65℃的Eluent 25μL,室温静置1min。
(12)室温下12000×g离心1min,将除去接头二聚体的合适片段长度的文库DNA洗脱到收集管中。
(13)取2μL样品进行Qubit定量。
(14)取1μL样品进行2100检测文库片段大小分布,实验操作按照说明书进行。主要步骤包括,将染料和凝胶混匀并过滤;取出芯片,将配好的混合物加入芯片中,然后在芯片中再加入DNA Ladder,放在配套的混匀仪上,涡旋混匀;清洗电极,将加好样品和DNAmarker的芯片放入2100仪器中;在电脑上设置好软件参数,开始运行;结束后导出实验结果并注意清洗电极。符合上机要求的文库片段应该不存在120bp大小左右的引物二聚体片段,且为了适应2×150bp测序的要求,文库主体最短不适于短于300bp,最长不适于超过1000bp。
实施例5构建转录组测序(RNA-seq)文库
实验采用KAPA Stranded RNA-seq文库构建试剂盒进行RNA-seq文库的构建,具体步骤参考其说明书。
第一步进行总RNA的片段化。
(1)向PCR管中加入约400ng实施例2中步骤㈡提取的总RNA样品,稀释至总体积为10μL。
(2)向PCR管中加入10μL的2×Fragment,Prime and Elute Buffer,混合均匀后,将管放入PCR仪中,94℃孵育6min。
第二步进行cDNA第一链的合成。
(1)在PCR管中配一链合成体系如表9所示:
表9一链合成体系
(2)取10μL一链合成体系加入现20μL体积的样本管中,总体积30μL。吹打至完全混匀。
(3)将PCR管置于微型离心机上瞬时离心后放置在PCR仪中,将热盖温度设置为95℃,并运行以下程序,如表10所示:
表10一链合成的PCR运行程序
第三步进行cDNA第二链的合成和标记。
(1)在PCR管中配二链合成和标记体系如表11所示:
表11二链合成和标记体系
(2)取30μL二链的合成和标记体系加入现30μL体积的样本管中,总体积40μL,吹打至完全混匀。
(3)将PCR管置于微型离心机上瞬时离心后放置在PCR仪中16℃孵育60min。
(4)将存放在4℃冰箱的AMPure XP磁珠取出,放入超净台中静置至少30min恢复至室温,之后放在涡旋仪上5s混匀。
(5)取1.8×二链的合成和标记体系体积的磁珠(108L)至1.5mL离心管中,加入样品液,置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育5min。
(6)将离心管置于磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(7)向置于磁力架上的离心管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(8)重复步骤(7)一次。
(9)将离心管瞬时离心后放回磁架上,用10μL移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
第四步加dA尾。
(1)在PCR管中配置加dA尾体系如表12所示:
表12加dA尾体系
(2)用30μL加dA尾体系加入装有纯化磁珠的离心管中,置于涡旋仪上5s重悬,瞬时离心(在磁珠开始沉降之前停止离心)后转移至PCR管中。
(3)将PCR管放置在PCR仪中运行程序如表13所示:
表13加dA尾运行程序
第五步进行测序接头连接。
(1)在PCR管中配置测序接头连接体系如表14所示:
表14测序接头连接体系
(2)向PCR管中按表15加入样本:
表15加入样本
(3)用移液器吹打混合均匀后,将PCR管放置在PCR仪中20℃孵育15min。
第六步连接后第一次纯化。
(1)将连接体系转移至1.5mL离心管中。
(2)向离心管中加入70μL PEG/NaCl Solution(1×),置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育5min。
(3)将离心管置于磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(4)向置于磁力架上的离心管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(5)重复步骤(4)一次。
(6)将离心管瞬时离心后放回磁架上,用10μL移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(7)将离心管从磁力架上取下,加入50μL 10mM Tris-HCl(pH=8.0),置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育2min。
第七步连接后第二次纯化
(1)向离心管中加入50μL PEG/NaCl Solution(1×)混匀,置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育5min。
(2)将离心管置于磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(3)向置于磁力架上的离心管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)将离心管瞬时离心后放回磁架上,用10μL移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(6)将离心管从磁力架上取下,加入22μL 10mM Tris-HCl(pH=8.0),置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育2min。
(7)将离心管放回磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后,小心将20μL上清转移至新的PCR管中(注意不要扰动磁珠)。
第八步文库的PCR扩增。
(1)在PCR管中配置PCR扩增体系如表16所示:
表16文库的PCR扩增体系
(2)用移液器吹打混合均匀后取30μL加入样本中。
(3)将PCR管置于微型离心机上瞬时离心后放置在PCR仪中,反应程序如表17所示:
表17文库的PCR反应程序
第九步PCR扩增体系纯化。
(1)向离心管中加入45μL(0.9X)AMPure XP磁珠混匀,置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育5min。
(2)将离心管置于磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)
(3)向置于磁力架上的离心管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)将PCR管瞬时离心后放回磁架上,用10μL移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(6)将离心管从磁力架上取下,加入22μL 10mM Tris-HCl(pH=8.0),置于涡旋仪上5s混匀,瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心),室温下静置孵育2min。
(7)将离心管放回磁力架上,磁力富集至少5min,待溶液澄清后小心将20μL上清转移至新管中(注意不要扰动磁珠)。
(8)取1μL样品进行2100质检,质检合格后送测。
实施例6测序数据联合分析
将PCOS患者和PNA小鼠的miRNA测序数据联合,筛选出在两者中具有相同变化趋势的miRNA,并分析miRNA预测的靶基因;靶基因与两者具有相同变化趋势的差异表达基因联合,筛选出miRNA负向调控的差异表达基因;再将其与两者具有相同趋势的差异甲基化基因联合,筛选出启动子区低甲基化高表达的基因,DNA甲基化、miRNA、mRNA三者之间存在串扰,彼此之间存在一定的联系。
PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的MBD-seq的差异甲基化区域分析的聚类热图,结果如图1所示:图中(A)部分为PNA小鼠差异甲基化区域聚类热图,(B)不分为PCOS患者差异甲基化区域聚类热图。可见PNA小鼠和PCOS患者的颗粒细胞基因组上甲基化模式存在较大差异。
PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的RNA-seq的差异表达基因的火山图,结果如图2所示:图中(A)部分为PNA小鼠差异表达基因火山图,(B)部分为PCOS患者差异表达基因火山图可见PNA小鼠筛选出3338个差异表达基因,其中表达上调有1877个,表达下调有1461个;PCOS患者的颗粒细胞筛选出1107个差异表达基因,其中表达上调有436个,表达下调有671个。
PNA小鼠颗粒细胞和PCOS患者颗粒细胞的miRNA-seq差异表达的火山图,结果如图3所示:图中(A)部分为PNA小鼠差异表达miRNA火山图,(B)部分为PCOS患者差异表达miRNA火山图可见PNA小鼠筛选出18个差异表达miRNA,其中表达上调有9个,表达下调有9个;PCOS患者的颗粒细胞筛选出38个差异表达miRNA,其中表达上调有24个,表达下调有14个。
ANXA1启动子区低甲基化高表达,结果如图4:图中(A)部分为ANXA1甲基化特异性PCR验证,(B)部分为ANXA1的RT-qPCR验证。可见ANXA1在PCOS患者中启动子区低甲基化,在正常对照组中启动子区高甲基化;ANXA1在PCOS患者中相对表达水平较正常对照组中显著提高。
实施例7检测ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p的试剂盒
应用检测ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p的试剂盒的步骤如下:
⑴实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
利用RT-qPCR检测ANXA1基因的表达水平,实验中使用PrimeScript RT MasterMix(RR037,TAKARA,Japan)反转录为总RNA(500ng),来生成互补DNA(cDNA)进行qPCR,has-miR-106a-5p的cDNA用RT-has-miR-106a-5p引物,在42℃条件,15min进行反转录。使用Universal qPCR Mix(M3003S,New England Biolabs,USA)按照制造商的说明书在QuantStudio 3(Applied Biosystems)进行qPCR,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)水平作为内参基因。分别配制以下qPCR反应体系:
表18检测ANXA1基因的样品qPCR反应体系
表19检测LDLR基因的样品qPCR反应体系
表20检测has-miR-106a-5p基因的样品qPCR反应体系
将上述反应体系避光涡旋混匀瞬时离心,每孔吸取10μL混合液至PCR八连管中(每个样品3个复孔),转移至QuantStudio 3反应孔中,运行以下程序:
表21 qPCR的反应程序
⑵应用甲基化特异性PCR(MSP)ANXA1基因启动子甲基化情况
使用EZ DNA甲基化-GoldTM试剂盒(D5006,Zymo Research,USA)对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化,基因组中未甲基化的胞嘧啶在PCR扩增后转化为胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不会发生变化。然后分别添加针对未甲基化和甲基化的DNA专用引物进行PCR扩增,扩增的产物在进行2%的琼脂糖凝胶电泳。
表22样品的MSP反应体系
将上述反应体系涡旋混匀瞬时离心10s,转移至基因扩增仪中,运行程序如表21所示:
表23运行程序
PCOS患者颗粒细胞的甲基化特异性PCR和RT-qPCR对ANXA1基因的验证结果如图4所示,PCOS患者颗粒细胞的RT-qPCR对LDLR基因和负调控相关的has-miR-106a-5p验证结果如图5所示,图中A部分为LDLR的RT-qPCR验证结果,B部分为has-miR-106a-5p的RT-qPCR的验证结果。
本发明可通过分别检测患者颗粒细胞的LDLR的负调控has-miR-106a-5p的表达水平、和实施例7得到的ANXA1基因启动子甲基化和表达水平,达到快速、准确、高效诊断PCOS。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种分子组合生物标志物的筛选方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤1、构建PCOS的小鼠模型;
步骤2、从步骤1获得的小鼠模型提取基因组DNA和总RNA,
步骤3、对步骤3提取的基因组DNA和总RNA分别进行DNA甲基化测序、转录组测序、miRNA测序;
步骤4、将步骤3得到的DNA甲基化测序数据、转录组测序数据、miRNA测序数据与PCOS患者临床样品中的测序数据联合分析,筛选出具有相同变化趋势的差异表达基因和差异甲基化基因,即启动子区低甲基化高表达的基因;
步骤5、将步骤4筛选出的启动子区低甲基化高表达的基因进行甲基化特异性PCR验证和RT-qPCR验证,得到表达与甲基化呈现负相关的基因为ANXA1基因。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3还包括:
步骤3.1、从步骤2获得的基因组DNA富集全基因组甲基化片段;
步骤3.2、使用步骤4获得的全基因组甲基化片段构建全基因组甲基化文库。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤3.1利用与生物素偶联的人MBD2蛋白实现甲基化片段的富集。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1还包括:对ICR小鼠注射二氢睾酮。
5.一种检测分子组合生物标志物的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括反转录部分和扩增特定甲基化区域部分,所述联合生物标志物为ANXA1基因、LDLR基因和has-miR-106a-5p。
6.如权利要求5所述的试剂盒的应用方法,其特征在于,将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化,总RNA反转录为cDNA,将所述cDNA再进行qPCR,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶水平作为内参基因,利用RT-qPCR检测所述ANXA1基因、所述LDLR基因和所述has-miR-106a-5p的表达水平,甲基化特异性的PCR检测所述ANXA1基因启动子区的甲基化水平。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述RT-qPCR的引物为ANXA1-F和ANXA1-R,所述ANXA1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述ANXA1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种如权利要求5所述的试剂盒的应用方法,其特征在于,使用甲基化试剂盒对提取后片段化的基因组DNA进行富集,富集后的片段进行DNA甲基化测序文库的构建。
9.如权利要求8所述的试剂盒的应用方法,其特征在于,分别添加针对ANXA1启动子区未甲基化和甲基化的专用引物进行甲基化特异性的PCR扩增,扩增的产物在进行2%的琼脂糖凝胶电泳。
10.如权利要求9所述的试剂盒的应用方法,其特征在于,所述扩增的产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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