CN118028121A - 一株高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌及其培养方法与应用。本发明提供了一株蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40967。在以蛹虫草CMN013发酵时，可高效生产虫草素和喷司他丁，为生物法制备虫草素和喷司他丁提供了更有效的方法，为后续含虫草素和/或喷司他丁的健康产品或药品开发提供了基础。

Description

一株高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一株高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌及其培养方法与应用。
背景技术
蛹虫草（Cordyceps militaris）是传统的食药用菌，也是新食品原料，是集食用性与安全性于一体的虫草类真菌之一。虫草素是蛹虫草的代表性与标志性成分，具有调节血糖、治疗白血病、抗癌、抗病毒、调节免疫力等多种生物活性作用，是健康产品开发的优质原料。最新研究结果表明虫草素可抑制新冠病毒本身的复制和存活，减轻和缓解新冠病毒感染后的症状，是一种极具开发价值的潜在抗病毒的药物。与此同时，制药企业也在不断采用新的技术改造虫草素结构，使其进入体内不易被降解成无效化合物，而是释放出具有更强抗癌活性的化合物，这一研究发现将极大推动虫草素在抗癌中的应用。
目前，虫草素化学合成工艺复杂，副产物难于分离，尚不能实现工业化生产，因此，虫草素主要是从蛹虫草中提取，提高蛹虫草中虫草素含量，降低生产成本，是虫草素开发利用的先决条件。
虫草素在蛹虫草中合成的过程中有一种重要的化合物喷司他丁，是腺苷脱氨酶的抑制剂，可以有效抑制腺苷脱氨酶的活性，从而保护虫草素免于降解，使得蛹虫草可以合成更多的虫草素。此外，喷司他丁还是一种临床上治疗白血病的处方药品，筛选得到高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌株对于促进蛹虫草的开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高产虫草素和喷司他丁的蛹虫草菌株及其培养方法与应用。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 40967。
本发明提供的蛹虫草CMN013于2023年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为蛹虫草 Cordyceps militaris，保藏编号为CGMCCNo. 40967。
本发明还提供一种菌剂，其含有上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013。
本发明的菌剂可以包含蛹虫草CMN013和其他发酵菌，可以是液体菌剂也可以是固体菌剂。
本发明还提供一种发酵物，其由上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或菌剂发酵获得，优选，所述发酵物为上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或菌剂发酵后的上清液。
本发明研究发现，蛹虫草CMN013的发酵上清液中含有大量的虫草素和喷司他丁，可应用于后续健康产品与药品等的开发。
本发明还提供上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或菌剂在制备虫草素和/或喷司他丁，或提升虫草素和/或喷司他丁生物发酵产率中的应用。
本发明还提供上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或菌剂或发酵物在制备健康产品或药品中的应用；所述健康产品或药品的活性成分包括虫草素和/或喷司他丁。
本发明还提供一种健康产品或药品，其包括上述发酵物中分离获得的物质。
本发明还提供一种发酵上述蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013的方法，发酵底物包括：蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化亚铁和腺嘌呤。
本发明的发酵底物包括：蔗糖20-60g/L，蛋白胨15-40g/L，磷酸二氢钾0.5-5.0g/L，氯化亚铁0.05-0.5g/L，腺嘌呤1.0-5.0g/L。
优选，包括：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，磷酸二氢钾 1.0g/L，氯化亚铁0.1g/L，腺嘌呤2.0g/L。
本发明的有益效果至少在于：
本发明采用离子束注入诱变的方法筛选获得了一株高产虫草素的蛹虫草菌株，并通过对其发酵培养条件的优化，使虫草素产量与出发菌株相比提高9.56倍，且虫草素的保护成分喷司他丁含量比出发菌株提高4.43倍，为生物法制备虫草素和喷司他丁提供了更有效的方法。
附图说明
图1为碳源对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。
图2为氮源对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。
图3为无机盐对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。
图4为碳氮比对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。
图5为核苷类化合物对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
实施例1
本实施例提供了一株新的蛹虫草及其培养方法。具体如下：
1、菌种：
出发菌株：蛹虫草（Cordyceps militaris）编号：CM3（CM-3），北京市科学技术研究院实验室保存，公开于中国专利CN104885931和CN116904326。
2、培养基及试剂：
PDA固体培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，土豆汁1000mL，pH自然，琼脂20g，121℃，灭菌30min。
液体培养基1：葡萄糖30g，胰蛋白胨 4g，酵母粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL，121℃，灭菌30min。
试剂：葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁均为分析纯试剂，购自国药集团北京化学试剂公司；虫草素为高效液相色谱纯级别，购自Sigma公司；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂均为生物培养基级别，购自国药集团北京化学试剂公司。
3、虫草素测定方法
虫草素含量HPLC测定方法如下：采用DAD检测器，检测波长为260nm，色谱柱：XDB-C18，4.6×250mm，5μm，流动相为甲醇：纯水=15：85（v%：v%），流速1mL/min，进样量10μL，柱温箱温度为25℃。
4、突变菌株的获得与培养
以蛹虫草CM3为出发菌株，采用离子束注入方法对蛹虫草孢子进行诱变，经过多次诱变与筛选，获得虫草素产量提高的突变菌株。突变菌株：蛹虫草（Cordyceps militaris）编号：CGMCC No.40967，北京市科学技术研究院实验室保存，其为经过离子束注入诱变筛选得到的高产虫草素突变菌株。于2023年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.40967。
蛹虫草菌株培养方法：将蛹虫草固体菌种接种到装有100mL液体培养基1的250mL三角瓶中，25℃恒温摇床培养7d，摇床转速为150r/min。将蛹虫草培养液吸取到EP管中，8000r/min，离心3min，无菌注射器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱仪（HPLC）的样品瓶中，用于HPLC方法测定虫草素含量。
对出发菌株与突变菌株采用液体培养基1及上述相同的培养条件进行同一批次的培养，然后按照前述方法处理发酵液样品，HPLC方法测定虫草素含量，出发菌株CM3虫草素含量为：78.98mg/L；正突变菌株CGMCC No.40967虫草素含量为298.45mg/L。在采用相同的液体培养基1的条件下，正突变菌株CGMCC No.40967虫草素含量比出发菌株CM3提高2.78倍。
5、突变菌株的稳定性
对筛选得到的上述正突变菌株CGMCC No.40967进行传代稳定性实验，以转接1次为传代1次计算，总计传代8次，每次采用相同的液体发酵培养条件，采用相同的样品处理方法和虫草素含量测定方法，各代之间虫草素产量无显著性差异（P>0.05）。
6、突变菌株培养条件优化
在对蛹虫草菌株CGMCC No.40967培养基组分进行优化的实验中，菌种采用液体菌种，培养方法：将蛹虫草固体菌种接种到装有200mL液体培养基1的500mL三角瓶中，25℃恒温摇床培养5d，摇床转速为150r/min；将同一批次的蛹虫草种子液混合均匀作为同一批次实验的种子液，接种量为5%。培养基优化实验中基础培养基配方为：碳源为葡萄糖20.0g/L，氮源为蛋白胨20.0g/L，无机盐为磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，在此基础上对碳源、氮源和无机盐组分进行筛选优化。所用试剂均为分析纯或生物培养基试剂级别。
（1）碳源筛选
选择葡萄糖、果糖、鼠李糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、糊精、麦芽提取物、可溶性淀粉、柠檬酸钠为碳源，替代基础培养基中的葡萄糖，浓度为20.0 g/L。以不添加碳源作为对照。结果见图1。
根据碳源筛选实验结果可知，添加蔗糖的蛹虫草虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，蔗糖为碳源的虫草素含量与其他相比具有显著性差异，因此选择蔗糖为最佳碳源。
（2）氮源筛选
选择蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酪蛋白胨（Casein Peptone）、酵母粉、牛肉膏、奶粉、大豆粉、蚕蛹粉、硝酸钾、氯化铵、尿素为碳源，替代基础培养基中的蛋白胨，浓度为20.0g/L。以不添加氮源作为对照。结果见图2。
根据氮源筛选实验结果，可知添加蛋白胨的蛹虫草虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，蛋白胨为氮源的虫草素含量与其他相比具有显著性差异，因此选择蛋白胨为最佳氮源。
（3）无机盐筛选
选择不同种类的无机盐替代基础培养基中的磷酸二氢钾和硫酸镁，分别加入1.0g/L的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰，0.1g/L的硫酸铜、硫酸锌、氯化亚铁、氯化铁、氯化钴。考察无机盐对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。以基础培养基作为对照，同时考察培养基中不添加无机盐对虫草素含量的影响。结果见图3。
根据无机盐筛选实验结果，可知添加磷酸二氢钾和氯化亚铁的蛹虫草虫草素含量最高，且统计学分析结果表明，添加上述两种无机盐对虫草素含量的影响与对照差异不显著，与其他无机盐相比具有显著性差异，因此选择磷酸二氢钾和氯化亚铁为最佳无机盐。
（4）碳氮比的优化
在碳源、氮源以及无机盐单因素优化的基础上得到较优的培养基配方：蔗糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化亚铁0.1g/L，碳源和氮源的比例对蛹虫草生长和虫草素合成具有显著影响，因此，对蔗糖和蛋白胨的配比进行优化，以获得最佳培养基配方。蛋白胨为20.0g/L，蔗糖分别为10.0-60.0 g/L，碳氮比例分别为：0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1，考察碳氮比对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。结果见图4。
根据碳氮比优化实验结果可知，随着碳氮比的增加，也就是蔗糖浓度的增加，蛹虫草发酵液中虫草素含量迅速提高，最佳碳氮比为2:1，即蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，此时虫草素含量最高。
（5）核苷类化合物对虫草素含量的影响
通过上述实验得到蛹虫草菌CGMCC No.40967最佳培养基配方为：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化亚铁0.1g/L，将此培养基作为对照培养基，在此基础上添加0.5 g/L的腺苷、一磷酸腺苷（AMP）、尿苷、鸟苷、肌苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤。考察核苷类化合物对虫草素含量的影响。结果见图5。
根据腺苷类化合物的添加实验结果，可知添加腺苷和腺嘌呤能够促进虫草素含量的提高，与对照相比，腺苷对虫草素含量的提高作用差异不显著，腺嘌呤对虫草素含量的提高作用具有显著性差异，因此选择腺嘌呤为最佳添加物。
（6）蛹虫草菌株的静置培养
蛹虫草菌株：CM3与正突变菌株CGMCC No.40967。
优化培养基配方：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，磷酸二氢钾 1.0g/L，氯化亚铁0.1g/L，腺嘌呤2.0g/L，pH 自然，加热溶解，121℃，灭菌30min。
静置培养条件：首先将蛹虫草菌株进行摇床液体培养，250mL三角瓶装上述液体培养基100mL，接种后于摇床25℃恒温培养，转速为150r/min，培养时间为7d。然后将含有蛹虫草菌悬液的三角瓶放置于25℃光照培养箱中静置培养10d，设定白天为8h，黑夜为16h。培养结束后将蛹虫草培养液吸取到EP管中，8000r/min，离心3min，无菌注射器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱仪（HPLC）的样品瓶中，采用HPLC方法测定虫草素含量。
喷司他丁含量采用HPLC-MS/MS方法测定，液相色谱条件：T3色谱柱100mm×2.1mm，5μm，流动相A:10mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸），流动相B:甲醇（含0.02%甲酸）溶液，梯度洗脱（0-2min，A:B为95%:5%；2-10min，A:B由95%:5%变为5%:95%；10-13min，A:B由5%:95%变为0:100%；13-16min，A:B由0:100%变为95%:5%），流速0.3mL/min，柱温25℃，进样量为10μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI 源），正离子模式；分析模式为多离子反应监测模式（MRM模式）；定量离子：m/z 269.17→153.20。
采用上述HPLC和HPLC-MS/MS方法分别测定虫草素和喷司他丁含量，出发菌株CM3虫草素含量为205.12 mg/L，喷司他丁含量为50.2μg/L，正突变菌株CGMCC No.40967虫草素含量为2165.13mg/L，喷司他丁含量为272.8μg/L，虫草素和喷司他丁含量比出发菌株CM3分别提高9.56倍和4.43倍。
7、结论
采用优化的液体培养基培养蛹虫草菌株，经过摇床培养加静置培养，出发菌株CM3虫草素和喷司他丁含量分别为205.12mg/L和50.2μg/L，正突变菌株CGMCC No.40967虫草素和喷司他丁含量分别为2165.13mg/L和272.8μg/L，虫草素含量比出发菌株CM3提高9.56倍，喷司他丁含量比出发菌株CM3提高4.43倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO. 40967。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013。
3.一种发酵物，其特征在于，由权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或权利要求2所述的菌剂发酵获得。
4.权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或权利要求2所述的菌剂在制备虫草素和/或喷司他丁中的应用。
5.权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或权利要求2所述的菌剂在提升虫草素和/或喷司他丁生物发酵产率中的应用。
6.权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵物在制备健康产品或药品中的应用；所述健康产品或药品的活性成分包括虫草素和/或喷司他丁。
7.一种健康产品或药品，其特征在于，包括权利要求3所述的发酵物中分离获得的物质。
8.一种发酵权利要求1所述的蛹虫草（Cordyceps militaris）CMN013的方法，其特征在于，发酵底物包括：蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化亚铁和腺嘌呤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵底物包括：蔗糖20-60g/L，蛋白胨15-40g/L，磷酸二氢钾0.5-5.0g/L，氯化亚铁0.05-0.5g/L，腺嘌呤1.0-5.0g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵底物包括：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，磷酸二氢钾 1.0g/L，氯化亚铁0.1g/L，腺嘌呤2.0g/L。
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