CN118021845A - hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用 - Google Patents

hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用 Download PDF

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CN118021845A CN202410212421.4A CN202410212421A CN118021845A CN 118021845 A CN118021845 A CN 118021845A CN 202410212421 A CN202410212421 A CN 202410212421A CN 118021845 A CN118021845 A CN 118021845A
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Abstract

本发明公开了hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用，属于药物制剂技术领域。本发明公开的hiMG来源的外泌体，能够保护视网膜神经节细胞，减轻各种原因导致的视网膜神经节细胞凋亡/死亡，促进视网膜神经节细胞轴突生长和功能的恢复。

Description

hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/ 死亡制剂中的应用
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，更具体的说是涉及hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用。
背景技术
视觉信息进入人眼后在视网膜通过三级神经元的传导最终到达大脑产生视觉。视网膜中三级神经元分别为光感受器、双极细胞、神经节细胞。其中神经节细胞的轴突汇聚到一起穿出视网膜，形成视神经。视神经是视觉传导的唯一通路。眼部和大脑疾病(如青光眼、创伤性视神经病变等)均可累及视神经，对视神经轴突造成损伤导致视网膜神经节细胞的死亡丢失。作为中枢神经系统的一部分，视神经损伤后，难以治愈，可以导致不可逆的视觉受损甚至失明。
小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在视网膜及视神经中广泛分布。除了通过吞噬作用对微环境进行检测外，小胶质细胞还通过分泌多种因子发挥作用。在视网膜发育过程中，小胶质细胞通过分泌神经营养因子促进视网膜的发育。在视网膜及视神经病变过程中，小胶质细胞一方面可以分泌抗炎因子促进神经系统的恢复，一方面过度激活的小胶质细胞可以分泌促炎因子介导继发性的神经损伤。基于小胶质细胞在视网膜发育中的促进功能和在疾病发生发展中的免疫调节功能，我们认为小胶质细胞可能是一种对于视神经损伤后对视网膜神经节细胞发挥保护作用的重要靶点。另外，细胞移植所产生的免疫排斥反应及致瘤风险结合小胶质细胞的分泌特性，小胶胶质细胞来源外泌体可以成为一种优于小胶质细胞本身的治疗方式。
但是，由于伦理方面的原因，发育期的小胶质细胞难以获得，而人干细胞诱导分化来的小胶质细胞已经被证实具有发育期小胶质细胞的特异性基因表达。因此，人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞来源外泌体为视神经损伤后对视网膜神经节细胞发挥保护作用带来希望。
目前公开的发明(申请号：CN202010290750.2)，使用小鼠骨髓干细胞来源外泌体，并且在细胞水平验证了其对大鼠视网膜细胞系R28细胞保护作用。在物种方面，小鼠、大鼠和人之间存在着物种差异，比如，小鼠、大鼠视网膜中感光细胞以视杆细胞为主而人的视网膜以视锥细胞为主。在细胞来源方面，人诱导多能干细胞是从终末分化的体细胞诱导分化而来的细胞，通过采集血液就可以获得，相较于骨髓干细胞更易获得。在研究水平方面，本研究在体内水平验证了外泌体对网膜神经节细胞的存活、视神经再生、视觉功能等方面的保护和促进作用，相对于体外实验，在体实验使外泌体发挥作用的方式更加接近人体疾病状态时发挥作用的方式。更加直观验证了人干细胞来源细胞外泌体对于人视网膜疾病治疗的应用前景。
因此，提供hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用。本发明hiMG来源的外泌体能减轻各种原因导致的视网膜神经节细胞凋亡/死亡，促进其轴突的生长和功能恢复。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用。
进一步，所述hiMG来源的外泌体的制备方法如下：
(1)干细胞培养：将人诱导多能干细胞hiPSC利用ncTarget培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，细胞密度达到85％时，得到细胞克隆团；
(2)悬浮培养：使用EDTA进行消化，当细胞克隆团边缘卷起时终止消化，加入拟胚体培养基，使用细胞刮刀将细胞刮起，并将细胞悬液转移到六孔板中，在37℃、5％CO2环境中培养直到看到拟胚体；
(3)髓系祖细胞诱导：将拟胚体转移到含有髓系细胞培养基的10cm培养皿中，在37℃、5％CO2环境中培养，避免摇晃，直到拟胚体贴壁生长得到髓系祖细胞；
(4)单核细胞诱导：髓系祖细胞每隔7天换液，直到发现大量悬浮细胞即为单核细胞；
(5)小胶质细胞诱导：收集所述单核细胞，转移至小胶质细胞诱导分化培养基，在37℃、5％CO2环境中培养7d，得到贴壁hiPSC分化的小胶质细胞(hiPSC-derivedmicroglia，hiMG)，其培养基用于外泌体提取；
(6)收集hiPSC分化的小胶质细胞培养基，提取外泌体(如果不直接提取，可以经过300×g离心10min去除死细胞，3000×g离心10min去除细胞碎片后-80℃储存)：将hiPSC分化的小胶质细胞培养基收集至50ml离心管中，按下述顺序离心：
A)300×g 4℃10分钟，将上清转移到新的离心管中；
B)3000×g 4℃10分钟，将上清转移的新的离心管中；
C)10000×g 4℃30分钟，将上清转移到超离管中，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
D)弃上清，PBS进行重悬，重复2-3次，将重悬液置于超离管内，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
E)弃上清，无菌PBS重悬，获得hiPSC分化的小胶质细胞产生的外泌体，使用BCA蛋白定量试剂盒检测外泌体总蛋白浓度，将外泌体分装保存于-80℃。
进一步，步骤(3)所述的拟胚体培养基组成如下：Advanced DMEM/F1244ml/50ml；KnockOut SR 5ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml。
进一步，步骤(4)所述的髓系细胞培养基组成如下：X-vivo 15plus48ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep 100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml；IL-3425μg/ml，50μl/50ml；M-CSF 50μg/ml，50μl/50ml。
进一步，步骤(6)所述的小胶质细胞诱导分化培养基组成如下：DMEM/F1224ml/50ml；Neurobasal medium 24ml/50ml；GlutaMAX 100×，50μl/50ml；β-巯基乙醇55μl/50ml；B27 supplement 50×，500μl/50ml；N2supplement 100×，250μl/50ml。
hiPSC分化的小胶质细胞来源外泌体(hiMG-Exo)是由干细胞来源的小胶质细胞产生的一种包裹了蛋白质、RNA等成分的细胞外囊泡。研究证实，hiMG-Exo可以保护视网膜神经节细胞，减少视网膜神经节细胞的凋亡/死亡，促进神经节细胞轴突的生长和功能恢复。而且hiMG-Exo避免了细胞移植带来的免疫排斥反应，因此在预防及保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡方面具有广阔的研究前景。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种外泌体制剂及其制备方法和在预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡中的应用，本发明制备的外泌体制剂可以明显保护视神经损伤后的视网膜神经节细胞的凋亡，促进神经节细胞轴突(即视神经)的再生，并且能够促进功能的恢复。
具体具有以下有益效果：
(1)本发明分化小胶质细胞采用的是人诱导多能干细胞(hiPSC)，相较于其他细胞，hiPSC来源更广泛、更易获得。
(2)本发明提供了人诱导多能干细胞分化小胶质细胞来源外泌体，通过诱导hiPSC分化小胶质细胞(hiMG)获得具有小胶质细胞特异性、功能更加专一的外泌体。
(3)本发明已经在体内水平验证了hiMG来源外泌体对视网膜神经节细胞死亡的保护作用，证实了其应用前景。
(4)本发明使用hiMG来源外泌体，避免了细胞移植带来的免疫排除反应，相较于细胞治疗更具有安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明人多能干细胞分化来源小胶质细胞形态图；
图2附图为本发明提取外泌体示意图；
图3附图为本发明提取外泌体的蛋白免疫印迹结果图；
图4附图为本发明将提取的外泌体移植治疗小鼠视神经损伤模型示意图；
图5附图为本发明使用外泌体制剂后视网膜神经节细胞存活对比图；
其中，左图为使用外泌体和使用PBS对照组视网膜神经节细胞存活示意图；比例尺20μm；右图为统计结果；
图6附图为本发明使用外泌体制剂后视神经再生轴突对比图；
其中，左图为使用外泌体和使用PBS对照组视神经再生情况示意图；比例尺200μm；右图为最长再生轴突长度统计结果；
图7附图为本发明使用外泌体制剂后小鼠视觉诱发电位对比图；
其中，左图为视神经损伤前、损伤后使用外泌体和PBS对照组视觉诱发电位(VEP)结果示意图；N1-P1振幅为测量对象；右图为统计结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种hiMG来源的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)干细胞培养：将人诱导多能干细胞hiPSC(购自中盛溯源生物科技有限公司)利用ncTarget培养基(购自中盛溯源生物科技有限公司)在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，细胞密度达到85％时，得到细胞克隆团；
(2)悬浮培养：使用EDTA进行消化，当细胞克隆团边缘卷起时终止消化，加入拟胚体培养基，使用细胞刮刀将细胞刮起，并将细胞悬液转移到六孔板中，在37℃、5％CO2环境中培养直到看到拟胚体；
(3)髓系祖细胞诱导：将拟胚体转移到含有髓系细胞培养基的10cm培养皿中，在37℃、5％CO2环境中培养，避免摇晃，直到拟胚体贴壁生长得到髓系祖细胞；
(4)单核细胞诱导：髓系祖细胞每隔7天换液，直到发现大量悬浮细胞即为单核细胞；
(5)小胶质细胞诱导：收集所述单核细胞，转移至小胶质细胞诱导分化培养基，在37℃、5％CO2环境中培养7d，得到贴壁hiPSC分化的小胶质细胞(hiPSC-derivedmicroglia，hiMG)，其培养基用于外泌体提取(图1)；
(6)收集hiPSC分化的小胶质细胞培养基，提取外泌体(图2)：将hiPSC分化的小胶质细胞培养基收集至50ml离心管中，按下述顺序离心：
A)300×g 4℃10分钟，将上清转移到新的离心管中；
B)3000×g 4℃10分钟，将上清转移的新的离心管中；
C)10000×g 4℃30分钟，将上清转移到超离管中，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
D)弃上清，PBS进行重悬，重复2-3次，将重悬液置于超离管内，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
E)弃上清，无菌PBS重悬，获得hiPSC分化的小胶质细胞产生的外泌体，使用BCA蛋白定量试剂盒检测外泌体总蛋白浓度，将外泌体分装保存于-80℃。
拟胚体培养基组成如下：Advanced DMEM/F1244ml/50ml；KnockOut SR 5ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep 100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml。
髓系细胞培养基组成如下：X-vivo 15plus(购自LONZA)48ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep 100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml；IL-3425μg/ml，50μl/50ml；M-CSF 50μg/ml，50μl/50ml。
小胶质细胞诱导分化培养基组成如下：DMEM/F1224ml/50ml；Neurobasal medium24ml/50ml；GlutaMAX 100×，50μl/50ml；β-巯基乙醇55μl/50ml；B27supplement 50×，500μl/50ml；N2 supplement 100×，250μl/50ml。
使用BCA蛋白定量试剂盒(Promega)检测外泌体总蛋白浓度，步骤如下：
将BCA蛋白定量试剂盒中的A液和B液按50：1进行配制，共配制2400μl。将提取的外泌体使用PBS稀释20倍。将0.5mg/ml的蛋白标准品稀释成0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.025mg/ml和0mg/ml。在96孔板中依次加入20μl标准品和三个孔的稀释后样品。再加入200μl A和B的混合液。吹打混匀后，将96孔板放到37℃恒温摇床孵育30min。使用酶标仪进行蛋白浓度测量。外泌体总蛋白浓度为2μg/μl。
实施例2
参见图3提取外泌体的免疫印迹鉴定。使用hiMG作为细胞对照组。使用PBS将50，0000个hiMG清洗两遍，加入500μl含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(高效RIPA组织/细胞快速裂解液：蛋白酶抑制剂混合物：磷酸酶抑制剂混合物＝48：1：1，均购自Solarbio)，将细胞全部吹下，转移到EP管内，在冰上裂解30min。在提取的外泌体中加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(8μl外泌体加入92μl含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液)，在冰上裂解30min。裂解之后，使用离心机进行1200×g离心10min。取上清使用BCA试剂盒进行蛋白定量，使用超纯水和5×loadingbuffer进行配平。100℃金属浴10min。使用10％预制胶进行70V恒压电泳。之后使用300mA恒流进行转膜60min。将转膜好的硝酸纤维素膜浸入5％脱脂牛奶中室温封闭2h，使用TBST洗膜。使用CD63(外泌体特异性蛋白，是调控细胞外囊泡产生和胞内体货物分选的关键因子)、CD9(外泌体的标志蛋白，是一种具有四个跨膜结构域的细胞表明糖蛋白，在细胞的分化、黏附和信号转导中发挥作用)、TSG101(外泌体的标志蛋白，是一组明显无活性的泛素结合酶的同源物，在细胞生长和分化中起到负性生长调节作用)、GAPDH(糖酵解反应中的酶，广泛分布在各种组织的细胞中，在外泌体中很少表达)抗体在4℃孵育过夜。之后使用对应二抗进行常温孵育2h。使用ECL超敏曝光液进行曝光。hiMG-Exo组表达外泌体相关标记物CD63、CD9、TSG101而不表达GAPDH。
实施例3
小鼠视神经损伤：使用20mg/ml三溴乙醇20ml/kg体重进行小鼠腹腔麻醉，待小鼠深度麻醉后，在眼表滴入丙美卡因滴眼液进行表面麻醉。使用弯镊剥离上睑结膜、球结膜、上直肌暴露视神经，在距视乳头2-5mm处使用电镜透射自锁镊(ideol-tek，5X.SA)夹闭15秒。
玻腔移植外泌体：使用微量进样器(Hamilton，7641-01)将外泌体注射到小鼠玻璃体腔内，每眼注射1μl(图4)；采用PBS作为对照。
实施例4
参见图5，小鼠视神经损伤之后，对比使用外泌体和PBS对照组的小鼠视网膜神经节细胞存活情况。小鼠麻醉后，颈椎脱臼处死，取下视网膜剪成四叶草样四瓣，使用RBPMS(神经节细胞的标记物，在多种哺乳动物视网膜中特异性识别神经节细胞和移位的神经节细胞。)对视网膜进行免疫荧光染色，并使用LSM 900共聚焦显微镜对小鼠视网膜距离视乳头相同位置区域内小鼠神经节细胞数量进行统计，统计发现，使用外泌体之后，小鼠视网膜神经节细胞数量显著高于PBS对照组，表明外泌体促进了视网膜神经节细胞的存活。
实施例5
参见图6，小鼠视神经损伤之后，对比使用外泌体制剂和PBS对照组的小鼠视神经再生情况。小鼠麻醉后，颈椎脱臼处死，取下小鼠视神经使用30％蔗糖溶液进行脱水、使用OCT包埋剂进行包埋、冷冻切片机将视神经切成15μm厚度切片，使用GPA43(再生神经的标记物，在发育和轴突再生过程中，GAP43在神经元生长锥中大量表达，被认为是神经细胞有效再生的重要组成部分)免疫染色发现，使用外泌体制剂之后，相较于PBS对照组，小鼠视神经有明显再生；表明外泌体促进了视神经轴突的再生。
实施例6
参见图7，小鼠视神经损伤之后，对比使用外泌体制剂和PBS对照组的小鼠视神经功能。视觉诱发电位是了解整个视觉通路功能完整想的检测方法。在视野范围内，使用1.3Hz的白光刺激视网膜，可以在视觉皮层记录到电位变化。使用复方托吡卡胺滴眼液对小鼠进行散瞳，使用三溴乙醇对小鼠进行腹腔麻醉，将罗兰电生理设备的接地电极、参考电极和记录电极分别连接到小鼠尾部、面颊和小鼠后囟前缘中点，使用眼罩遮住一只眼睛，对未遮眼进行视觉诱发电位检测。使用外泌体制剂之后，相较于PBS对照组，小鼠视觉功能有明显提升；表明外泌体促进了视觉功能的恢复。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.hiMG来源的外泌体在制备预防/保护视网膜神经节细胞凋亡/死亡制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述hiMG来源的外泌体的制备方法如下：
(1)干细胞培养：将人诱导多能干细胞hiPSC利用ncTarget培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，细胞密度达到85％时，得到细胞克隆团；
(2)悬浮培养：使用EDTA进行消化，当细胞克隆团边缘卷起时终止消化，加入拟胚体培养基，使用细胞刮刀将细胞刮起，并将细胞悬液转移到六孔板中，在37℃、5％CO2环境中培养直到看到拟胚体；
(3)髓系祖细胞诱导：将拟胚体转移到含有髓系细胞培养基的10cm培养皿中，在37℃、5％CO2环境中培养，避免摇晃，直到拟胚体贴壁生长得到髓系祖细胞；
(4)单核细胞诱导：髓系祖细胞每隔7天换液，直到发现大量悬浮细胞即为单核细胞；
(5)小胶质细胞诱导：收集所述单核细胞，转移至小胶质细胞诱导分化培养基，在37℃、5％CO2环境中培养7d，得到贴壁hiPSC分化的小胶质细胞，其培养基用于外泌体提取；
(6)收集hiPSC分化的小胶质细胞培养基，提取外泌体：将hiPSC分化的小胶质细胞培养基收集至50ml离心管中，按下述顺序离心：
A)300×g 4℃10分钟，将上清转移到新的离心管中；
B)3000×g 4℃10分钟，将上清转移的新的离心管中；
C)10000×g 4℃30分钟，将上清转移到超离管中，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
D)弃上清，PBS进行重悬，重复2-3次，将重悬液置于超离管内，每管重量相差在±0.001g，将超离管放入预冷的转子中，将转子放入超高速冷冻离心机内离心，120000×g 4℃80分钟；
E)弃上清，无菌PBS重悬，获得hiPSC分化的小胶质细胞产生的外泌体，检测外泌体总蛋白浓度，将外泌体分装保存于-80℃。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述的拟胚体培养基组成如下：Advanced DMEM/F1244ml/50ml；KnockOut SR 5ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep 100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述的髓系细胞培养基组成如下：X-vivo 15plus 48ml/50ml；GlutaMAX 100×，500μl/50ml；Pen/Strep 100×，500μl/50ml；β-巯基乙醇27.5μl/50ml；IL-3425μg/ml，50μl/50ml；M-CSF 50μg/ml，50μl/50ml。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述的小胶质细胞诱导分化培养基组成如下：DMEM/F1224ml/50ml；Neurobasal medium24ml/50ml；GlutaMAX 100×，50μl/50ml；β-巯基乙醇55μl/50ml；B27supplement 50×，500μl/50ml；N2 supplement 100×，250μl/50ml。
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