WO2020256520A1 - 전기자극에 의한 엑소좀 제조 방법 - Google Patents

전기자극에 의한 엑소좀 제조 방법 Download PDF

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WO2020256520A1
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exosomes
exosome
radio wave
producing
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김경규
수카모이고라이
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성균관대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing exosomes by electrical stimulation, more specifically (a) applying radio wave electrical stimulation to cells and culturing them; And (b) it relates to a method for producing an exosome comprising the step of separating the exosome from the cell and a culture medium containing the same.
  • Exosomes are small vesicles with a membrane structure secreted from several types of cells. It is reported that the diameter of exosomes is approximately 30 to 300 nm. It was observed that exosomes originate in specific compartments within cells called multivesicular bodies (MVBs), and are released and secreted out of cells, rather than directly detaching from the plasma membrane in the study by electron microscopy. That is, when the polycystic body and the plasma membrane are fused, the vesicles are released into the extracellular environment, which is called an exosome.
  • MVBs multivesicular bodies
  • the present invention comprises the steps of (a) applying radio wave electric stimulation to cells and culturing them; And (b) separating the exosomes from the cells and the culture medium containing the same, to provide a method for producing an exosome.
  • the present invention is a radio frequency (RF) generator for applying 3 KHz to 300 GHz; Culture chamber; And it is an object to provide an exosome culture apparatus comprising electrodes attached to both ends of the culture chamber.
  • RF radio frequency
  • the present invention comprises the steps of: (a) applying and culturing radio wave electrical stimulation to cells; And (b) it provides a method for producing an exosome comprising the step of separating the exosome from the cell and a culture medium containing the same.
  • the present invention provides a method of improving the production and secretion of exosomes by applying radio wave (RF) electrical stimulation to cells.
  • RF radio wave
  • the cell may be an animal cell or a plant cell, and in the case of an animal cell, it may mean a (separated) cell derived from a mammal including a human or a plant, and the mammal is a human, a monkey, etc. It means a mammal, including rodents such as primates, rats, mice, etc., and may mean a rabbit, dog, monkey, horse, cat, goat, mouse, rat, pig, or human, and the mammal
  • the cells of may be somatic cells, germ cells, or cancer cells, and the plant may refer to corn, rice, cotton, wheat, etc., but is not limited thereto.
  • the cells are neurospheres, fibroblasts, epithelial cells, muscle cells, heart cells, kidney cells, nerve cells, hair cells, hair root cells, hair follicle cells, oral epithelial cells, beta Somatic cells derived from human tissues including cells, gastric mucosa cells, goblet cells, G cells, immune cells, epithelial cells, and the like; Cells extracted from solutions discharged from the human body such as urine, saliva, sweat, and blood; Stem cells derived from bone marrow such as nerve cord blood; Adipose-derived stem cells; Adult stem cells; It may be one or more selected from the group consisting of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • the neurosphere may be one or more selected from the group consisting of Schwann cells, neurons, glial cells (Glia), astrocytes, and oligodendrocytes, It is not limited thereto.
  • the radio wave electrical stimulation may be 0.05 to 3 MHz, 50 to 1000 kHz, 100 to 1000 kHz, 200 to 800 kHz, 200 to 600 kHz, 200 to 500 kHz, 250 to 500 kHz, 300 to 400 kHz, or may be 330 to 370 kHz, but is not limited thereto. In an embodiment of the present invention, 350 kHz was applied.
  • the separation of exosomes includes density gradient method, ultracentrifugation, filtration, dialysis, free flow electrophoresis, polymer-based precipitation including PEG, trapping on ELISA places, antibody-coated beads, and It may be one or more methods selected from the group consisting of the Exoquick method.
  • the isolated exosome may be one in which the activity of the exosome is enhanced by radio wave electric stimulation, but is not limited thereto.
  • the present invention is a radio wave electric stimulation (RF) generator applying 3 KHz to 300 GHz; Culture chamber; And it provides an exosome culture apparatus including electrodes attached to both ends of the culture chamber.
  • RF radio wave electric stimulation
  • the culture device may improve the production and secretion of exosomes in cells, but is not limited thereto.
  • the "exosomal culture device” further includes at least one selected from the group consisting of an oscillograph, a temperature sensor, a pH sensor, a DO sensor, a CO 2 sensor, an O 2 sensor, and a humidity sensor. It may include, but is not limited thereto.
  • the radio wave electric stimulation (RF) generator may be a CRET (Capacitive-Resistance Electric Transfer) system, but is not limited thereto.
  • CRET Capacitive-Resistance Electric Transfer
  • the radio wave electric stimulation generator may be capable of generating a radio wave having a frequency of 0.05 to 3 MHz.
  • the present inventors developed a technology to produce a large amount of exosomes by promoting the production and secretion of exosomes without damaging the cells, and thus produced exosomes are higher than the exosomes naturally made in cells. Since it has a cell-activating function, it has the advantage that it can be used as a therapeutic agent for various diseases.
  • the culture apparatus is a CRET (Capacitive-Resistance Electric Transfer) system that generates RF, an oscillograph, a temperature sensor, an electrode, and a culture chamber (length 8 cm, diameter 2 cm).
  • CRET Capacitive-Resistance Electric Transfer
  • Figure 2a shows the yield of exosomes when purified by ultracentrifugation (UC), PEG method (PEG), and commercial kit (Kit) method.
  • 2B shows the yield of exosomes of the RF-treated group (RF) and the RF untreated group (W/O RF).
  • 3A is a result of confirming the shape of an exosome by a TEM image.
  • 3C is a Western blot result confirming whether exosomes express CD63 and CD81.
  • Figure 5a is a result of observing the neurite growth of the NSC34 cell line in the condition medium and Control medium containing the exosomes derived from Schwann cells isolated by different methods. The degree of growth of the neurite was confirmed through the length of the neurite measured through a microscope.
  • Figure 5b is a result of comparing the neurite growth rate of the NSC34 cell line in the condition medium and Control medium containing the exosomes derived from Schwann cells separated by different methods.
  • Figure 5c is a result showing the change in the length of the neurite when treated with exosomes separated by different methods (x-axis: length distribution (micrometer ( ⁇ m)), y-axis: having a neurite corresponding to the length distribution Number of cells).
  • Figure 6a is a diagram showing the results of a quantification test for exosomes derived from Schwann cells produced under RF treatment (RF) and RF untreated conditions (W/O RF).
  • 6B is a result of confirming the neurite growth of NSC34 cells by exosomes derived from Schwann cells produced under RF treatment (RF) and RF untreated conditions (W/O RF) (x-axis: length distribution (micrometer ( ⁇ m)) ), y-axis: the number of cells with neurites corresponding to the length distribution).
  • RF RF treatment
  • W/O RF RF untreated conditions
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of a quantification test for exosomes derived from HEK293 cells produced under RF treatment (RF) and RF non-treatment conditions (W/O RF).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of a quantification test for exosomes derived from L929 cells produced under RF treatment (RF) and RF untreated conditions (W/O RF).
  • the present invention comprises the steps of (a) applying radio wave electric stimulation to cells and culturing them; And (b) it provides a method for producing an exosome comprising the step of separating the exosome from the cell and a culture medium containing the same.
  • the present invention comprises the steps of (a) applying radio wave electric stimulation to cells and culturing them; And (b) it provides a method for producing an exosome comprising the step of separating the exosome from the cell and a culture medium containing the same.
  • the cell may be an animal cell or a plant cell, and in the case of an animal cell, it may mean a (separated) cell derived from a mammal including a human or a plant, and the mammal is a human, a monkey, etc. It means a mammal, including rodents such as primates, rats, mice, etc., and may mean a rabbit, dog, monkey, horse, cat, goat, mouse, rat, pig, or human, and the mammal
  • the cells of may be somatic cells, germ cells, or cancer cells, and the plant may refer to corn, rice, cotton, wheat, etc., but is not limited thereto.
  • the cells are neurospheres, fibroblasts, epithelial cells, muscle cells, heart cells, kidney cells, nerve cells, hair cells, hair root cells, hair follicle cells, oral epithelial cells, beta cells, Somatic cells derived from human tissues, including gastric mucosa cells, goblet cells, G cells, immune cells, epithelial cells, and the like; Cells extracted from solutions discharged from the human body such as urine, saliva, sweat, and blood; Stem cells derived from bone marrow such as nerve cord blood; Adipose-derived stem cells; Adult stem cells; It may be one or more selected from the group consisting of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • the neurosphere may be at least one selected from the group consisting of Schwann cells, neurons, glial cells (Glia), astrocytes, and oligodendrocytes, but is limited thereto. It is not.
  • exosomes were secreted by applying radio wave electrical stimulation to Schwann cells and HEK293 cells, and the amount of exosome secretion was significantly increased compared to the radio wave AC current untreated group.
  • exosomes secreted by radio wave electrical stimulation treatment in Schwann cells promote the growth of neurites of motor neurons by exosomes secreted under untreated conditions.
  • the present invention effectively induces physiological or physical changes in cells through electromagnetic and physical stimulation by applying radio wave electrical stimulation to produce exosomes and Can induce secretion.
  • the increase in the production and secretion of exosomes according to the present invention is a physical stimulation by radio waves generated when radio waves are applied, stimulation by energy generated by electromagnetic conversion in an electric field generated upon application, and the resulting electric field.
  • the production and secretion of exosomes can be promoted by genetic and physiological changes inside cells according to polarity changes.
  • electromagnetic energy in the electric field When radio wave electric stimulation is applied, an electric field is formed around cells, and electromagnetic energy in the electric field may be generated.
  • the electromagnetic energy can induce movement according to the polarity of various substances in the cell by generating an energetic flow similar to the movement characteristics of electrons even when electrons do not pass directly, and the radiation waves generated by radio waves themselves are also substances in the cell.
  • Can induce a change in Such electromagnetic and physical energy induce changes in genetic and physiological substances in the cell, thereby changing the biochemical and physiological properties of the cell, thereby promoting the production of exosomes and promoting the secretion of the generated exosomes.
  • Schwann cells are glial cells of the peripheral nervous system that not only play an important role in the generation and differentiation of nerves, but also play an essential role in regeneration and remyelination of axons when the nerves are damaged.
  • the cluster of axons is called nerve fiber.
  • Schwann cells form the outermost membrane surrounding the axon, nerve fibrous sheath, and myelinated myelinated nerve fibers by Schwann cells act as insulators of myelin sheath. While it can have a fast nerve conduction speed, if there is damage to the myelin sheath, the conduction speed may be slowed down and secondary damage to axons due to demyelinating may be caused.
  • the medium for cultivation of the present invention a basic medium known in the art may be used without limitation.
  • the basal medium may be artificially synthesized and prepared, or a commercially prepared medium may be used.
  • commercially produced media include DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) and Isocove's Modified Dulbecco's Medium, but are not limited thereto, and may be a DMEM medium.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal essential Medium
  • G-MEM Gasgow's Minimal Essential Medium
  • the culture medium or medium for cell culture of the present invention includes all of the medium or culture medium commonly used for cell culture in the art.
  • the culture medium used for cultivation generally contains a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component.
  • culture refers to any action performed to grow cells or microorganisms in an appropriately artificially controlled environmental condition.
  • the optimum temperature for cultivation may be 30 to 50°C, preferably 30 to 45°C, and most preferably, it may be cultured at a temperature of 35 to 40°C, but is not limited thereto.
  • the incubation time may be 36 to 60 hours, preferably 40 to 56 hours, more preferably 44 to 52 hours, 46 to 50 hours, but is not limited thereto.
  • the medium was collected 48 hours after culturing after applying radio wave electric stimulation.
  • an'exosome' is a membrane-structured vesicle secreted from various types of cells, and is known to play various roles, such as binding to other cells and tissues to transfer membrane components, proteins, and RNA. .
  • the exosome may be produced by applying radio wave electrical stimulation to a cell, and the functionality or activity of the exosome may be enhanced, but is not limited thereto.
  • the neurite growth ability of the exosomes derived from Schwann cells produced by applying radio wave electric stimulation was superior compared to the exosomes produced without applying radio wave electric stimulation. It was confirmed that the activity of the derived exosomes was enhanced. That is, the isolated exosome may be one with enhanced exosome activity, but is not limited thereto.
  • radio wave electrical stimulation is collectively referred to as radio frequency and RF (Radio Frequency), and means an electromagnetic wave having a frequency of 3 KHz to 300 GHz, or a wavelength of 100 km to 1 mm.
  • Radio wave electrical stimulation corresponding to the radio frequency is used as an alternating current frequency for transmitting and receiving radio waves and various wireless communication signals used in broadcasting, but the use for generating a large amount of high-functional exosomes was first developed by the present inventors. .
  • Radio wave electric stimulation can be subdivided according to frequency as follows.
  • the radio wave alternating current of the present invention may be a long wave or a heavy pile, and preferably a heavy pile.
  • 0.05 to 3 MHz, 50 kHz to 1000 kHz, 100 to 1000 kHz, 200 to 800 kHz, 200 to 600 kHz, 200 to 500 kHz, 250 to 500 kHz, 300 to 400 kHz, or 330 to 370 kHz May be, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, 350 kHz was applied.
  • the step of separating exosomes is a density gradient method, ultracentrifugation, filtration, dialysis, free flow electrophoresis, polymer-based precipitation including PEG, trapping on an ELISA place, antibody-coated beads, and Exoquick method. It may be one or more methods selected from the group consisting of.
  • PEG polyethylene glycols
  • the present inventors examined the optimal separation/purification method using ultracentrifugation, PEG method, and ExoQuick method, and as a result, it was confirmed that the PEG method is most suitable in terms of cost and efficiency.
  • the present invention is a radio wave electrical stimulation (RF) generator for applying 3 KHz to 300 GHz; Culture chamber; And it provides an exosome culture apparatus including electrodes attached to both ends of the culture chamber.
  • RF radio wave electrical stimulation
  • the device may be characterized by improving the production and secretion of exosomes in cells, but is not limited thereto.
  • the exosome culture apparatus may further include at least one selected from the group consisting of an oscillograph, a temperature sensor, a pH sensor, a DO sensor, a CO2 sensor, an O2 sensor, and a humidity sensor, but is not limited thereto.
  • oscilloscope is a device that observes and records changes in current, voltage, and frequency over time, and includes electromagnetic type and cathode linear type, etc. Indicate.
  • the figure recorded on the oscilloscope is called an oscillogram.
  • an oscilloscope is used to record the frequency and output (power).
  • the “radio wave electric stimulation generator” is a device that generates an alternating current of a radio wave frequency.
  • Generation of radio wave electric stimulation of the present invention may use a CRET (Capacitive Resistance Electric Transfer) system, but is not limited thereto.
  • the radio wave electrical stimulation (RF) generator of the present invention may be a CRET system, but is not limited thereto.
  • the radio wave electrical stimulation may be 0.05 to 3 MHz, 100 to 1000 kHz, 200 to 800 kHz, 200 to 600 kHz, 200 to 500 kHz, 250 to 500 kHz, 300 to 400 kHz, or 330 To 370 kHz, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, 350 kHz was applied.
  • an RF generator having a frequency range of 0.05-3 MHz and an output range of 10-50 W was used.
  • the "temperature sensor” is a device for observing/detecting the temperature of the culture chamber.
  • the "culture chamber” is a place where cells are cultured, and culture can be performed while applying radio wave electric stimulation.
  • Cells cultured in the culture chamber are neurospheres, fibroblasts, epithelial cells, muscle cells, heart cells, kidney cells, nerve cells, hair cells, hair root cells, hair follicle cells, oral epithelial cells, beta cells, Somatic cells derived from human tissues, including gastric mucosa cells, goblet cells, G cells, immune cells, epithelial cells, and the like; Cells extracted from solutions discharged from the human body such as urine, saliva, sweat, and blood; Stem cells derived from bone marrow such as nerve cord blood; Adipose-derived stem cells; Adult stem cells; It may be one or more selected from the group consisting of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and iPSCs, but is not limited thereto.
  • the culture chamber may be designed to have a constant working volume.
  • the culture chamber is not limited in shape, but may be preferably cylindrical.
  • Electrodes attached to both ends of the culture chamber may be attached to the culture chamber for the purpose of applying radio wave electrical stimulation.
  • the electrode may be at least one selected from the group consisting of platinum, gold, copper, palladium, and titanium, but is not limited thereto.
  • electrodes attached to both ends of the culture chamber may be coated with polyamide for the purpose of heat transfer, but is not limited thereto.
  • the present invention as a result of culturing cells by applying radio wave electric stimulation using the exosome culture apparatus of the present invention, it was confirmed that not only the yield of exosomes was significantly increased, but also the activity of the produced exosomes was excellent. .
  • CRET radiofrequency
  • TM303 modified E-motion Plus TM303 system (Plus, Seoul, Korea) and used as CRET, and this system has a frequency range of 0.05-0.50 MHz and an output range of 10-50 W.
  • This RF generator is basically similar to the Indiva Active HCR 902 (INDIBA, Barcelona, Spain) device commonly used in medical treatment, and the frequency and power of the RF generator were measured on a Tektronix oscilloscope TDS 210 (Beaverton, OR, USA).
  • Electrodes attached to both ends of the culture chamber consisting of a glass cylinder having a length of 8 cm and a diameter of 2 cm are coated with polyamide for the purpose of heat transfer, and this electrode is connected to an RF generator. .
  • Exosomes were isolated and purified from collected conditioned media using three different purification methods (supercentrifugation, previously reported polyethyleneglycol-6000 and ExoQuick-TC PLUSTM kit). The initial purification steps were the same for all methods.
  • the conditioned medium was sequentially centrifuged at 4° C. for 30 minutes at 300 g for 10 minutes, 1,000 g for 10 minutes, and 10,000 g to remove live cells, dead cells and debris. After centrifugation, the supernatant was collected and the exosomes were concentrated by high-speed ultracentrifugation (70Ti rotor, using Beckman coulter) at 100,000 g for 90 minutes at 4°C. The pellet was collected, washed with PBS and the same centrifugation step was repeated. Finally, for long-term use of the desired pellet, it was resuspended in 100 ⁇ l of ice-cold PBS and stored at -80°C.
  • Exo-Quick-TC PLUSTM method (Kit method) is very simple. Exosomes were concentrated according to the protocol provided with the kit. The conditioned medium was collected and the same initial centrifugation step as before was performed to remove cell debris and dead cells. Then, an exo-precipitation solution was added to the conditioned medium and incubated overnight at 4°C. Then, the solution was centrifuged and exosomes down-pelletized. The pellet was maintained in resuspension buffer and added to the beads for further purification. Finally, the supernatant was collected after centrifugation (8,000 g, 5 minutes).
  • Exosomal marker proteins were detected using Western blot according to standard protocols (Lopez-Verrilli, Picou, & Court, 2013). Purified exosomes were destroyed using a radio immunoprecipitation assay (RIPA) buffer supplemented with 1 mM protease inhibitor PMSF. The solution was incubated at room temperature for 30 minutes. For Western blot analysis, exosome samples were separated by 10% SDS-PAGE and transferred to a PVDF (Polyvinylidene fluoride) membrane. The membrane was blocked in Tris buffered saline (TBST) containing 5% non-fat skim milk at room temperature for 1 hour and then washed.
  • TST Tris buffered saline
  • the membrane was incubated with antibodies containing CD63, CD81 and TSG101 overnight at 4° C., and then washed three steps with TBST buffer. The membrane was then incubated with the appropriate anti-HRP conjugate, and the band was visualized with a chemiluminescent reagent and detected using the ChemiDoc system.
  • the size distribution of the purified exosomes was measured using dynamic light scattering (DynaPro, NanoStar). 10 ⁇ l of the diluted exosome solution was put into a cuvette, and a size distribution experiment of each exosome preparation was performed.
  • exosomes were analyzed using TEM. Sample preparation was performed according to standard protocols. 4% paraformaldehyde was added to 10 ⁇ l of the exosome solution. 5 ⁇ l of the solution was placed on a grid coated with Formvar-carbon and incubated for 20 minutes in a dry environment. The grid was transferred to a drop of PBS using clean forceps to wash off excess solution. Then the grid was transferred to 50 [mu]l of glutaraldehyde and washed several times (7-10 times) with water.
  • uranyl-oxalate solution 50 ⁇ l was placed on a grid and incubated for 5 minutes, and then inserted into a mixture of 4% uranyl acetate and 2% methyl cellulose (1:9 ratio). Finally, the grid was incubated with methylcellulose solution for 10 minutes on ice, and stored in a dry place to dry completely.
  • exoGlowTM-Membrane EV labeling kit 2 [mu]l red dye was mixed with 12 [mu]l reaction buffer. The dyes were uniformly mixed by vortexing, and the mixture was directly added to 50 ⁇ g exosome solution and incubated for 30 minutes. Free dye was removed by desalting the spin column for 1 minute at 10,000 rpm. 10 ⁇ l of the labeled exosomes were collected and added directly to NSC34 cells to monitor for internalization. After 6 hours, the medium was removed and fresh medium was added. Internalized exosomes were visualized using a fluorescence microscope.
  • Exocet Quantification Assay kit Exocet 96A-1, System Biosciences
  • 20-30 ⁇ g of total protein containing exosomes were lysed using the lysis buffer provided with the kit.
  • the mixture solution was heated at 37° C. for 5 minutes to liberate exosome proteins.
  • the mixture solution was centrifuged at 1500 ⁇ g for 5 minutes.
  • the resulting supernatant was collected in a separate tube.
  • 50 ⁇ l of the sample was mixed with 50 ⁇ l of reaction buffer (A + B) and incubated in a 96 well plate at room temperature for 20 minutes. After incubation, the absorbance was measured with a spectrophotometer at 405 nm.
  • standard curves were prepared using the standard solution provided with the kit.
  • the exosome purification method was optimized in terms of the quality, size distribution and yield of exosomes.
  • UC ultracentrifugation
  • PEG-6,000 polyethylene glycol for purification of exosomes
  • Kit commercially available kit
  • exosome quantification As shown in Figure 2a , exosome quantification (Exosome quantification) compared to the exosome purified by the UC method, the commercial kit and the PEG method showed 4 times and 3 times greater yield, respectively.
  • the RF frequency was applied to 350 KHz and purified using the PEG method to confirm the yield of exosomes.
  • the RF-treated group showed a yield of about 1.7 times greater than that of the RF untreated group.
  • each exosome preparation was determined using dynamic light scattering (DLS) measurement.
  • the size of the purified exosomes was uniquely homogenized by the Kit method, and the other two methods showed a fairly uneven distribution within the reported size range (30-200 nm).
  • Purified exosomes were labeled with a commercial EV membrane staining kit, ExoGlowTM, and further incubated with NSC34 at 37° C. for 6 hours.
  • the exosomes prepared by the UC, PEG and kit method showed 1.81, 1.83 and 1.93 times the neurite growth compared to the control, which is similar to the kit-like activity in the preparation of exosomes of UC and PEG methods. It means to have.
  • the PEG-method showed a similar yield to that of the kit at minimal cost, the PEG method was used to prepare all exosome samples for subsequent experiments.
  • hSc Human Schwann cells
  • radiofrequency known as a physical stress inducer
  • RF stimulation (frequency 350 ⁇ 3KHz, power 42W) was applied to hSc cells at 37° C. for 15 minutes, followed by incubation in hSc growth medium for 48 hours, and exosomes using ExoCet kit. Quantified
  • radiofrequency (RF)-treated cells secreted 1.5 and 1.35 times more exosome-containing proteins and RNA than untreated (non-RF) cells.
  • the RF-treated cells showed ⁇ 1.75 times more exosome release than the null experiment.
  • RF stimulation (frequency 350 ⁇ 3 KHz) was applied to HEK293 cells at 37° C. for 15 minutes and then cultured in HEK293 cell growth medium for 48 hours, and exosomes were quantified using ExoCet kit. I did.
  • radiofrequency (RF)-treated cells secrete 2.3 times more exosomes than non-treated (non-RF) cells.
  • Example 4-3 In L929 cells Exosomes Secretion induction
  • RF stimulation (frequency 350 ⁇ 3KHz) was applied to mouse-derived L929 cells at 37°C for 15 minutes, and then cultured in L929 cell growth medium for 48 hours, and exosomes were prepared using ExoCet kit. Quantified.
  • radiofrequency (RF)-treated cells secrete 1.7 times more exosomes than untreated (non-RF) cells.

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Abstract

본 발명은 전기자극에 의한 엑소좀 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

전기자극에 의한 엑소좀 제조 방법
본 발명은 전기자극에 의한 엑소좀 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법에 관한 것이다.
엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30 내지 300 nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T 림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다.
열, 음파, 레이저, 산화 스트레스, LED 빛 등 물리적 신호가 생물학적 세포에서 상대적인 유전자와 단백질 발현을 바꿀 수 있다는 것이 알려져 있다. 따라서 예시의 물리적 자극에 의해 엑소좀의 분비나 기능성에 변화가 있을 수 있다. 예를 들면 열 충격에 의한 heatshock 단백질 Hsp/c70의 상향조절에 의해 별아교세포(astrocyte)에서 엑소좀 분비를 향상시킬 수 있다고 보고되었다.
하지만, 전기자극을 세포나 조직에 가하여 엑소좀 분비 및 기능성을 향상시키는 기술은 아직 미비한 실정이며, 엑소좀 생산 및 분비를 증가시키는 기술이 필요하다.
본 발명에서는 세포에 라디오파 전기자극을 인가함으로써 세포에서 엑소좀의 생산효율 및 기능성이 강화됨을 확인하였다.
본 발명은 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 3 KHz 내지 300 GHz를 인가하는 라디오파 전기자극(Radio Frequency, RF) 생성기; 배양챔버; 및 배양챔버의 양 말단에 부착된 전극을 포함하는 엑소좀 배양 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 라디오파(RF) 전기자극을 세포에 인가하여 엑소좀의 생산 및 분비를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있으며, 동물 세포의 경우, 인간을 포함한 포유동물 혹은 식물에서 유래한(분리된) 세포를 의미할 수 있으며, 상기 포유동물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물을 의미하고, 바람직하게는 토끼, 개, 원숭이, 말, 고양이, 염소, 마우스, 래트, 돼지 또는 인간을 의미할 수 있으며, 상기 포유동물의 세포는 체세포, 생식세포, 또는 암세포일 수 있으며, 상기 식물은 옥수수, 벼, 목화, 밀 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 세포는 신경구(Neurosphere), 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 심장세포, 신장세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 베타세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, 면역세포, 주피세포 등을 포함하는 인체조직 유래 체세포; 소변, 타액, 땀, 피 등 인체 배출되는 용액에서 추출한 세포; 신경 제대혈 등의 골수 유래 줄기세포; 지방 유래 줄기세포; 성체 줄기세포; 배아줄기세포, iPSC 등의 만능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 신경구는 슈반 세포, 신경세포(neuron), 신경교세포(Glia), 성상교세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 라디오파 전기자극은 0.05 내지 3 MHz 일 수 있으며, 50 내지 1000 kHz, 100 내지 1000 kHz, 200 내지 800 kHz, 200 내지 600 kHz, 200 내지 500 kHz, 250 내지 500 kHz, 300 내지 400 kHz, 또는 330 내지 370 kHz 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 350 kHz를 인가하였다.
본 발명의 다른 구현예로, 엑소좀의 분리는 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 자유유동전기 이동법, PEG를 포함하는 중합체 기반 침전, ELISA 플레이스 상의 트래핑, 항체-코팅 비드, 및 Exoquick 방법으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 분리된 엑소좀은 라디오파 전기자극에 의해 엑소좀의 활성이 증진된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 3 KHz 내지 300 GHz를 인가하는 라디오파 전기자극(RF) 생성기; 배양챔버; 및 배양챔버의 양 말단에 부착된 전극을 포함하는 엑소좀 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 배양 장치는 세포에서 엑소좀의 생산 및 분비를 향상시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로, “엑소좀 배양장치”는 오실로그래프(oscillograph), 온도 센서, pH 센서, DO 센서, CO2 센서, O2 센서, 및 습도 센서로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 라디오파 전기자극(RF) 생성기는 CRET (Capacitive-Resistance Electric Transfer) 시스템일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 라디오파 전기자극 생성기는 0.05 내지 3 MHz의 주파수의 라디오파를 발생시킬 수 있는 것일 수 있다.
본 발명자들은 세포에 손상을 주지 않는 상태에서 엑소좀의 생산 및 분비를 촉진하여 엑소좀을 다량으로 생산하는 기술을 개발하였고, 이렇게 생산된 엑소좀이 세포에서 자연적으로 만들어지는 엑소좀에 비해 더 높은 세포 활성 기능을 가지고 있기 때문에, 다양한 질환의 치료제로 이용 할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 엑소좀 배양장치를 도시하고 있으며 배양장치는 RF를 생성하는 CRET(Capacitive-Resistance Electric Transfer) 시스템, Oscillograph, 온도 센서(Temperature sensor), 전극(electrode) 및 배양 챔버(길이 8cm, 직경 2 cm)로 구성된다.
도 2a는 초원심분리(UC), PEG방법(PEG), 및 시판 키트(Kit) 방법으로 정제 시 엑소좀의 수율을 나타낸 것이다.
도 2b는 RF 처리군(RF) 및 RF 미처리군(W/O RF)의 엑소좀의 수율을 나타낸 것이다.
도 3a는 TEM 이미지로 엑소좀 모양을 확인한 결과이다.
도 3b는 동적 광산란(DLS)를 이용하여 엑소좀의 크기 분포를 확인한 결과이다.
도 3c는 엑소좀이 CD63 및 CD81을 발현하는지 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 슈반세포에서 만들어진 엑소좀이 NSC34 운동신경세포주에 내재화되었는지 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 5a는 서로 다른 방법으로 분리한 슈반세포 유래 엑소좀이 포함된 조건배지 및 Control 배지에서 NSC34 세포주의 신경돌기 성장을 관찰한 결과이다. 신경돌기의 성장정도는 현미경을 통해 측정한 신경돌기의 길이를 통해 확인하였다.
도 5b는 서로 다른 방법으로 분리한 슈반세포 유래 엑소좀이 포함된 조건배지 및 Control 배지에서 NSC34 세포주의 신경돌기 성장률을 비교한 결과이다.
도 5c는 서로 다른 방법으로 분리한 엑소좀을 처리하였을 때 신경돌기의 길이 변화를 보여주는 결과이다(x축: 길이분포(마이크로 미터(㎛)), y축: 길이 분포에 해당하는 신경돌기를 갖는 세포의 수).
도 6a는 RF 처리(RF) 및 RF 미처리 조건(W/O RF)에서 생산된 슈반세포 유래 엑소좀 정량화 시험 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 RF 처리(RF) 및 RF 미처리 조건(W/O RF)에서 생산된 슈반세포 유래 엑소좀에 의한 NSC34 세포의 신경 돌기 성장을 확인한 결과이다(x축: 길이분포(마이크로 미터(㎛)), y축: 길이 분포에 해당하는 신경돌기를 갖는 세포의 수).
도 7은 RF 처리(RF) 및 RF 미처리 조건(W/O RF)에서 생산된 HEK293 세포 유래 엑소좀 정량화 시험 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 RF 처리(RF) 및 RF 미처리 조건(W/O RF)에서 생산된 L929 세포 유래 엑소좀 정량화 시험 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및 (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있으며, 동물 세포의 경우, 인간을 포함한 포유동물 혹은 식물에서 유래한(분리된) 세포를 의미할 수 있으며, 상기 포유동물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물을 의미하고, 바람직하게는 토끼, 개, 원숭이, 말, 고양이, 염소, 마우스, 래트, 돼지 또는 인간을 의미할 수 있으며, 상기 포유동물의 세포는 체세포, 생식세포, 또는 암세포일 수 있으며, 상기 식물은 옥수수, 벼, 목화, 밀 등을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 신경구(Neurosphere), 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 심장세포, 신장세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 베타세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, 면역세포, 주피세포 등을 포함하는 인체조직 유래 체세포; 소변, 타액, 땀, 피 등 인체 배출되는 용액에서 추출한 세포; 신경 제대혈 등의 골수 유래 줄기세포; 지방 유래 줄기세포; 성체 줄기세포; 배아줄기세포, iPSC 등의 만능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신경구는 슈반 세포, 신경세포 (neuron), 신경교세포(Glia), 성상교세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세히 설명한다.
<(a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계>
본 발명의 일실시예에서는, 슈반 세포 및 HEK293 세포에 라디오파 전기자극을 인가하여 엑소좀을 분비시켰으며, 라디오파 교류 전류 미처리군과 비교하여 엑소좀 분비량이 현저히 증가하였음을 확인하였다.
또한 슈반세포에서 라디오파 전기자극 처리에 의해 분비된 엑소좀이 미처리 조건에서 분비된 엑소좀에 의해 운동신경세포의 신경 돌기 성장을 촉진한다는 사실을 확인하였다.
종래의 자극은 각각의 물리적 특성에 의한 단일의 자극을 이용한 반면, 본 발명은 라디오파 전기자극을 인가함으로써 전자기적 및 물리적 자극을 통하여 세포 내 생리적 또는 물리적 변화를 효과적으로 유발하여 세포의 엑소좀 생산 및 분비를 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 엑소좀의 생산 및 분비의 증가는 라디오파의 인가 시 발생하는 라디오파에 의한 물리적 자극과, 인가 시 발생하는 전기장 내의 전자기적 변환에 의해 발생하는 에너지에 의한 자극 및 이로 인한 전기장 내 극성 변화에 따른 세포 내부의 유전적 및 생리적 변화에 의해 엑소좀의 생산 및 분비가 촉진될 수 있다.
라디오파 전기자극을 인가하는 경우, 세포 주위에 전기장을 형성하여 전기장내의 전자기적 에너지가 발생할 수 있다. 상기 전자기적 에너지는 전자가 직접 통과하지 않아도 전자의 이동 특성과 유사한 에너지적 흐름을 발생시켜 세포 내 다양한 물질의 극성에 따른 이동을 유도 할 수 있고, 라디오파 자체가 만들어내는 방사파 또한 세포 내 물질의 변화를 유도 할 수 있다. 이러한 전자기적 및 물리적 에너지는 세포 내 유전적, 생리적 물질들의 변화를 유도하여 세포의 생화학적 및 생리적 특성을 바꿔 엑소좀의 생성을 촉진하게 되고 생성된 엑소좀의 분비를 촉진한다.
본 발명에 있어서, 슈반 세포란 말초 신경계의 신경교세포로 신경의 발생, 분화에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 신경이 손상된 경우 축삭의 재생과 재수초화(remyelination)에 필수적인 역할을 하는 세포를 의미한다. 특히, 축삭이 모여 다발을 이룬 것을 신경 섬유라고 부르는데, 슈반세포는 축삭을 둘러싸는 가장 바깥쪽의 막인 신경섬유초를 형성하며, 슈반세포에 의해 수초화를 이룬 유수신경섬유는 수초의 절연체 역할에 의해 빠른 신경전도 속도를 가질 수 있는 반면 수초에 손상이 있을 경우 전도 속도가 느려지고 비수초화에 의한 축삭의 이차적 손상을 야기 시킬 수 있다.
본 발명의 배양을 위한 배지는 당 업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM 배지일 수 있다.
본 발명의 세포 배양을 위한 배양액 또는 배지는 당해 분야에서 세포배양에 통상적으로 사용되는 배지 또는 배양액을 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
본 명세서에서 “배양”이란 세포 또는 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 배양의 최적 온도는 30 내지 50 ℃, 바람직하게는 30 내지 45 ℃일 수 있으며, 가장 바람직하게 35 내지 40 ℃의 온도에서 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양 시간은 36 내지 60 시간일 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 56 시간, 보다 바람직하게는 44 내지 52 시간, 46 내지 50 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 라디오파 전기자극 인가 후 배양하여 48 시간 후 배지를 수집하였다.
본 명세서에서 '엑소좀(exosome)'은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서, 상기 엑소좀은 세포에 라디오파 전기자극을 인가함으로서 생산된 것일 수 있으며, 엑소좀의 기능성 또는 활성이 증진된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 라디오파 전기자극을 인가함으로써 생산된 슈반세포 유래 엑소좀의 신경돌기 성장능이 라디오파 전기자극을 인가하지 않으면서 생산된 엑소좀과 비교하여 우수함을 확인 하였는 바, 특정 세포 유래 엑소좀의 활성이 강화되는 것을 확인하였다. 즉, 분리된 엑소좀은 엑소좀의 활성이 증진된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “라디오파 전기자극”은 무선주파수, RF(Radio Frequency)로 통칭되며, 진동수 3 KHz 내지 300 GHz, 또는 파장 100 km 내지 1 mm의 범위의 전자기파를 의미한다. 무선주파수에 해당하는 라디오파 전기자극은 방송에 사용되는 전파 및 각종 무선 통신 신호를 송수신하는 교류 전류 진동수로 활용되고 있으나, 고기능의 엑소좀을 다량으로 생성하기 위한 용도는 본 발명자들이 최초로 개발한 것이다. 라디오파 전기자극은 주파수에 따라 다음과 같이 세분류될 수 있다.
주파수 파장 명칭 영문 명칭 약어
3 ~ 30 kHz 100 ~ 10 km 초장파 Very low frequency VLF
30 ~ 300 kHz 10 ~ 1 km 장파 Low frequency LF
300 kHz ~ 3 MHz 1 km ~ 100 m 중파 Medium frequency MF
3 ~ 30 MHz 100 ~ 10 m 단파 High frequency HF
30 ~ 300 MHz 10 ~ 1 m 초단파 Very high frequency VHF
300 MHz ~ 3 GHz 1 m ~ 10 cm 극초단파 Ultra high frequency UHF
3 ~ 30 GHz 10 ~ 1 cm 초고주파 Super high frequency SHF
30 ~ 300 GHz 1 cm ~ 1 mm 마이크로파 Extremely high frequency EHF
본 발명의 라디오파 교류 전류는 장파 또는 중파일 수 있으며, 바람직하게는 중파일 수 있다.
바람직하게는, 0.05 내지 3 MHz, 50 kHz 내지 1000 kHz, 100 내지 1000 kHz, 200 내지 800 kHz, 200 내지 600 kHz, 200 내지 500 kHz, 250 내지 500 kHz, 300 내지 400 kHz, 또는 330 내지 370 kHz일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 350 kHz를 인가하였다.
<(b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계>
본 명세서에서 엑소좀을 분리하는 단계는 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 자유유동전기 이동법, PEG를 포함하는 중합체 기반 침전, ELISA 플레이스 상의 트래핑, 항체-코팅 비드, 및 Exoquick 방법으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법일 수 있다.
상기에 세포외 엑소좀의 분리 또는 정제에 대한 몇몇 기법이 기재되었다. 이들 방법은 특히 라이프 테크놀로리즈 코포레이션사(Life Technologies Corporation)로부터의 전체 엑소좀 단리 시약(미국 특허 제 8,901,284호) 및 엑소퀵(ExoQuick)(상표명)(미국 특허 제2013/0337440　A1 호); 및 정해진 기공 크기 막 상의 포획(Grant et al. 2011), 예컨대 전형적으로 연속해서 연결된 상이한 기공 크기의 2개의 필터를 사용하는 엑소미르(ExoMir)(상표명)(미국 특허 제2013/0052647　A1호)를 포함하는, 상이한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하는, 초원심분리 단계(Thery et al. 2006); 친화도 크로마토그래피(Taylor & Gercel-Taylor, 2008); 중합체-매개 침전(Taylor et al. 2011)을 포함하는 분별 원심분리를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명자들은 초원심분리, PEG 방법, 및 ExoQuick 방법을 이용하여 최적의 분리/정제 방법을 검토하였으며, 그 결과 PEG 방법이 비용 및 효율 면에서 가장 적합함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 3 KHz 내지 300 GHz를 인가하는 라디오파 전기자극 (RF) 생성기; 배양챔버; 및 배양챔버의 양 말단에 부착된 전극을 포함하는 엑소좀 배양 장치를 제공한다.
상기 장치는 세포에서 엑소좀의 생산 및 분비를 향상시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 엑소좀 배양장치는 오실로그래프(oscillograph), 온도 센서, pH 센서, DO 센서, CO2 센서, O2 센서, 및 습도 센서로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 “오실로그래프(Oscillograph)”는 전류, 전압, 주파수의 시간적 변화를 관측·기록하는 장치로, 전자기형(電磁氣型)·음극선형(陰極線型) 등이 있으며, 필름 인화·브라운관 등으로 표시한다. 오실로그래프에 기록한 도형을 오실로그램이라 한다. 본 발명의 일실시예에서는 주파수 및 출력(전력)을 기록하기 위하여 오실로그래프를 이용하였다.
본 명세서에서 “라디오파 전기자극 생성기(RF generator; 무선주파수 생성기)”는 라디오파 주파수의 교류 전류를 생성하는 장치이다. 본 발명의 라디오파 전기자극의 발생은 CRET(Capacitive Resistance Electric Transfer) 시스템을 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본발명의 라디오파 전기자극(RF) 생성기는 CRET 시스템일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 라디오파 전기자극은 0.05 내지 3 MHz 일 수 있으며, 100 내지 1000 kHz, 200 내지 800 kHz, 200 내지 600 kHz, 200 내지 500 kHz, 250 내지 500 kHz, 300 내지 400 kHz, 또는 330 내지 370 kHz일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 350 kHz를 인가하였다.
본 발명의 일실시예에서는 0.05 - 3 MHz의 주파수 범위와 10 - 50 W의 출력 범위를 갖는 RF 생성기를 이용하였다.
본 명세서에서 “온도 센서”는 배양 챔버의 온도를 관측/감지하는 장치이다.
본 명세서에서 “배양 챔버”는 세포를 배양하는 곳으로, 라디오파 전기자극을 인가하면서 배양을 진행할 수 있다.
상기 배양챔버에서 배양되는 세포는 신경구(Neurosphere), 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 심장세포, 신장세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 베타세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, 면역세포, 주피세포 등을 포함하는 인체조직 유래 체세포; 소변, 타액, 땀, 피 등 인체 배출되는 용액에서 추출한 세포; 신경 제대혈 등의 골수 유래 줄기세포; 지방 유래 줄기세포; 성체 줄기세포; 배아줄기세포, iPSC 등의 만능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양챔버는 일정한 작업 부피를 갖도록 설계될 수 있다. 상기배양챔버는 그 형태가 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 원통형일 수 있다.
본 명세서에서 “배양챔버의 양 말단에 부착된 전극”은 배양챔버 내에 라디오파 전기자극을 인가하는 목적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 전극은 백금, 금, 구리, 팔라듐 및 티타늄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양챔버의 양 말단에 부착된 전극은 전열의 목적으로 폴리아마이드 (polyamide)로 코팅할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 엑소좀 배양 장치를 이용하여 라디오파 전기자극을 가하여 세포를 배양한 결과, 엑소좀 수율이 현저히 높아질 뿐만 아니라, 생산된 엑소좀의 활성 또한 우수함을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.
그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 슈반 세포에 대한 라디오파 교류 전류 처리
슈반 세포를 CRET (capacitive resistance electric transfer) 시스템에 의해 생성된 RF(Radiofrequency) 전류에 노출시켰다. CRET는 E-motion Plus TM303 시스템 (Plus, Seoul, Korea)을 변형하여 CRET로 사용하였고, 이 시스템은 0.05 - 0.50 MHz의 주파수 범위와 10 - 50 W의 출력범위를 갖는다. 이 RF 생성기는 기본적으로 의학 치료에 일반적으로 사용되는 Indiva Active HCR 902(INDIBA, Barcelona, Spain)장치와 유사하며 RF생성기의 주파수 및 출력은 Tektronix 오실로스코프 TDS 210 (Beaverton, OR, USA)에서 측정되었다.
도 1과 같이, 길이 8 cm 및 직경 2 cm의 유리 실린더로 이루어진 배양 챔버의 양 말단에 부착된 전극은 전열의 목적으로 폴리아마이드 (polyamide)로 코팅되어 있고, 이 전극은 RF생성기에 연결되어 있다.
인간 슈반 세포(hSc, human schwann cells) 5 × 106 개를 10 ml 슈반세포 배양 배지에 넣었다. 세포는 37 ℃의 일정한 온도 하에서 30 초의 펄스레이트(pulse rate)로 15분의 지속적인 RF 흐름을 겪었다. 유리 튜브 내 세포는 튜브의 2 개의 단부에서 2 개의 전극으로 연결되었다. 동일한 수의 RF 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포를 엑소좀 고갈된 슈반 세포 배지에서 별도로 배양하였다. 48 시간 후, 조건 배지를 수집하고, 엑소좀을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 방법으로 농축시켰다.
1-2. 엑소좀 정제 및 특성 규명
엑소좀은 세 가지 다른 정제 방법 (초원심 분리, 이전에 보고된 폴리에틸렌글리콜-6000 및 ExoQuick-TC PLUSTM 키트)을 사용하여 수집된 조건배지로부터 분리 및 정제되었다. 초기 정제 단계는 모든 방법에서 동일하였다.
48 시간 후, 조건 배지를 30 분 동안 4 ℃에서 300 g에서 10 분, 1,000 g에서 10 분, 10,000 g로 순차적으로 원심 분리하여 생균, 죽은 세포 및 잔해를 제거하였다. 원심 분리 후, 상등액을 수집하고 4 ℃에서 90 분 동안 100,000 g에서 고속 초원심 분리(70Ti 로터, Beckman coulter 사용)로 엑소좀을 농축하였다. 펠렛을 수집하고 PBS로 세척하고 동일한 원심 분리 단계를 반복하였다. 마지막으로, 원하는 펠렛을 장기간 사용하기 위하여, 100 ㎕의 얼음 냉각 PBS로 재현탁하고 -80 ℃에서 보관하였다.
폴리에틸렌글리콜(PEG) 방법의 경우, 10 % PEG-6000 용액(최종 농도)을 직접 첨가하고, 상기 원심 분리 단계에서 수집된 상층액에 혼합하였다. 혼합 용액을 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 12 시간 후, 4 ℃에서 1시간 동안 탁상 원심 분리기(Eppendorf, S-4-104 스윙 버킷 로터를 사용하는 모델 5810R; 3,214 g)에서 최대속도로 원심 분리하였다. 그런 다음 상층액을 따라내어 5 분 동안 말리고 가끔 두드려서 잔류 PEG를 완전히 제거하였다. 만들어진 펠렛을 5 ml PBS로 재현탁시켰다. 더 순수한 엑소좀을 얻기 위해, 한 번 반복하였다. 마지막으로, 펠릿을 입자가 없는 PBS (pH 7.4) 500 ㎕에 현탁시켰다.
Exo-Quick-TC PLUSTM 방법(Kit 방법)은 매우 간단하다. 엑소좀은 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라 농축되었다. 조건 배지를 수집하고, 세포 파편 및 죽은 세포를 제거하기 위해 이전과 동일한 초기 원심 분리 단계를 수행하였다. 그런 다음 엑소-침전(exo-precipitation) 용액을 조건 배지에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 배양했다. 그 다음, 용액을 원심 분리하고 엑소좀 다운펠렛화 하였다. 펠렛을 재현탁 완충액으로 유지시키고 추가 정제를 위해 비드에 첨가하였다. 마지막으로, 원심 분리(8,000 g, 5 분) 후에 상등액을 수집하였다.
1-3. 웨스턴 블롯 (Western-Blot)
엑소좀 마커 단백질은 표준 프로토콜(Lopez-Verrilli, Picou, & Court, 2013)에 따라 웨스턴 블롯을 사용하여 검출되었다. 정제된 엑소좀은 1 mM 프로테아제 억제제 PMSF가 보충된 방사선 면역 침전 분석(RIPA; radio immunoprecipitation assay) 완충액을 사용하여 파괴되었다. 용액을 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 엑소좀 샘플을 10 % SDS-PAGE로 분리시키고 PVDF (Polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5 % 비지방 탈지 우유가 함유된 트리스 완충 식염수(TBST)에서 실온에서 1시간 동안 블로킹한 다음 세척하였다. TBST로 3단계 세척한 후, 멤브레인을 4 ℃에서 하룻밤 동안 CD63, CD81 및 TSG101을 포함하는 항체와 함께 배양한 다음, TBST 완충액으로 3단계 세척 하였다. 이어서, 멤브레인을 적절한 항-HRP 접합체와 함께 배양하고, 밴드를 화학 발광 시약으로 시각화하고, ChemiDoc 시스템을 사용하여 검출하였다.
1-4. 동적 광산란 (DLS, Dynamic Light Scattering) 분석
정제된 엑소좀의 크기 분포는 동적 광산란(DynaPro, NanoStar)을 사용하여 측정되었다. 희석된 10 ㎕의 엑소좀 용액을 큐벳에 넣고 각 엑소좀 조제물의 크기 분포 실험을 수행하였다.
1-5. 투과 전자 현미경 ( TEM , Transmission Electron Microscopy)
TEM를 사용하여 엑소좀의 모양을 분석하였다. 샘플 준비는 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 4 % 파라포름 알데히드를 10 ㎕의 엑소좀 용액에 첨가하였다. 5 ㎕의 상기 용액을 Formvar-carbon으로 코팅한 그리드 위에 놓고 건조한 환경에서 20 분 간 배양하였다. 과량의 용액을 세척하기 위해 그리드를 깨끗한 집게를 이용하여 PBS 방울로 옮겼다. 그런 다음 그리드를 글루타르 알데히드 50 ㎕에 옮기고, 물로 여러 번 (7-10회) 세척하였다. 샘플을 대조하기 위해, 50 ㎕의 uranyl-oxalate 용액을 그리드 상에 놓고 5 분 간 배양한 뒤, 4 % 우라닐 아세테이트와 2 % 메틸 셀룰로오스의 혼합물 (1 : 9 비율)에 삽입했다. 마지막으로 그리드를 얼음 상에서 10 분 동안 메틸셀룰로오스 용액으로 항온 배양하고, 완전히 건조되도록 건조한 장소에 보관했다.
1-6. 세포 흡수 분석(Cellular uptake assay)
세포 흡수를 연구하기 위해, 정제된 엑소좀을 제조자 프로토콜에 따라 ExoGlowTM-Membrane EV 라벨링 키트로 표지하였다. 2 ㎕ 적색염료를 12 ㎕ 반응 완충액과 혼합하였다. 염료를 볼텍싱 (vortexing)에 의해 균일하게 혼합하고, 혼합물을 50 ㎍ 엑소좀 용액에 직접 첨가하고 30 분 동안 배양하였다. 유리 염료는 10,000 rpm에서 1 분간 스핀 컬럼을 탈염시킴으로써 제거되었다. 10 ㎕ 의 표지된 엑소좀을 수집하여 NSC34 세포에 직접 첨가하여 내재화 여부를 모니터링했다. 6 시간 후, 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. 내재화된 엑소좀은 형광 현미경을 사용하여 시각화되었다.
1-7. 엑소좀의 정량화
정제된 엑소좀을 시판 Exocet Quantification Assay kit(Exocet 96A-1, System Biosciences)를 사용하여 정량하였다. 엑소좀을 함유하는 총 단백질 20 - 30 ㎍를 키트와 함께 제공된 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 혼합물 용액을 37 ℃에서 5 분 간 가온시켜 엑소좀 단백질을 유리시켰다. 짧은 볼텍싱 후, 상기 혼합물 용액을 1500 × g에서 5분간 원심 분리하였다. 생성된 상등액을 별도의 튜브에 수집하였다. 그런 다음 50 ㎕의 시료를 50 ㎕의 반응 완충액(A + B)와 혼합하고 96 웰 플레이트에서 실온에서 20 분 간 배양하였다. 배양 후 흡광도를 405 nm에서 분광 광도계로 측정하였다. 병행 실험에서, 표준 곡선은 키트와 함께 제공된 표준 용액을 사용하여 준비되었다.
1-8. 활동 결정
5x104 개의 세포를 폴리-L-라이신(PLL) 코팅된 6 웰 플레이트 상에 DMEM 배지를 함유한 1 % FBS에서 배양하였다. 다음날 세포를 hSc-exo와 동일한 양의 hSc 조절 배지가 들어있는 엑소좀으로 처리했다. 엑소좀을 제조할 때에 ~ 9X108을 사용 하였다. 48 시간 후에 신경 돌기 성장을 관찰하였다.
실시예 2. 엑소좀 정제 방법의 평가
엑소좀 정제 방법은 엑소좀의 품질, 크기 분포 및 수율 측면에서 최적화되었다.
세가지 다른 방법에서 각각 초원심 분리(UC), 엑소좀을 정제용 폴리에틸렌 글리콜(PEG-6,000; PEG) 및 시판용 키트(Kit)를 사용했다.
도 2a에 나타난 바와 같이, 엑소좀 정량화(Exosome quantification)는 UC 방법으로 정제된 엑소좀과 비교하여, 시판 키트 및 PEG 방법에서 각각 4 배 및 3 배 큰 수율을 보였다.
이에, RF 주파수는 350 KHz를 인가하고, PEG 방법을 이용하여 정제하여 엑소좀의 수율을 확인하였다.
도 2b에 나타난 바와 같이, RF 처리군이 RF 미처리군과 비교하여, 약 1.7 배 큰 수율을 보였다.
도 3a에 나타난 바와 같이, TEM 이미지를 통하여, 엑소좀 모양을 확인하였다.
도 3b에 나타난 바와 같이, 각 엑소좀 제제의 크기 분포는 동적 광산란(DLS) 측정을 사용하여 결정되었다. Kit 방법에 의해 정제된 엑소좀의 크기가 독보적으로 균질화 되었으며, 다른 두 가지 방법은 보고된 크기 범위(30-200 nm) 내에서 상당히 불균일한 분포를 보였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, Western blot 분석은 엑소좀이 있음을 보여주었고, CD63과 CD81의 발현은 슈반세포 유래 엑소좀이 성공적으로 정제되었음을 나타내었다.
실시예 3. 슈반 세포 엑소좀 활성의 평가
신경 돌기 성장을 위한 세포 인자가 엑소좀에 의해 전달될 수 있는지를 확인하기 위해, 먼저 엑소좀의 NSC34 세포 내재화를 조사했다.
정제된 엑소좀을 시판중인 EV 막 염색 키트, ExoGlow™로 표지하고 37 ℃에서 6 시간 동안 NSC34와 함께 추가로 배양했다.
도 4에 나타난 바와 같이, 현미경 이미지로부터 엑소좀이 세포 내재화되었음을 확인할 수 있었다.
다음으로 각 엑소좀 준비 방법이 엑소좀에 미치는 효과를 조사하였다. 동일한 양의 엑소좀(~9 × 108)과 각각의 조건 배지를 NSC34 세포에 첨가하고 48시간 동안 배양하여 신경 돌기(Neurite) 성장을 유도 하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 여러 가지 엑소좀 분리 방법으로 정제한 엑소좀의 신경 돌기(Neurite) 성장활성을 비교하였을 때, Kit 방법을 이용하여 정제된 엑소좀이 가장 높은 신경돌기 성장 활성을 보인다는 것을 확인하였다.
도 5b에 나타난 바와 같이, UC, PEG 및 키트 방법에 의해 준비된 엑소좀은 대조군과 비교하여 1.81, 1.83 및 1.93 배의 신경 돌기 성장을 보였고, 이는 UC 및 PEG 방법의 엑소좀 제조도 키트와 유사한 활성을 갖는다는 것을 의미하는 것이다.
모든 결과를 종합 해 볼 때 PEG 방법은 UC 및 시판용 키트와 같이 활성 및 수율면에서 효율적이라는 결론을 얻었다.
도 5c에 나타난 바와 같이, RF를 인가하여 만든 exosome의 경우, RF미처리군과 비교하여 정제방법에 관계없이 축삭이 긴 세포를 많이 만드는 것을 확인하였다.
따라서, PEG-방법이 최소한의 비용으로 키트와 유사한 수율을 나타내기 때문에, 이후의 실험을 위한 모든 엑소좀 샘플 준비에 PEG 방법을 사용하였다.
실시예 4. 교류 전류의 엑소좀 분비 유도
실시예 4-1. 슈반세포에서 엑소좀 분비 유도
생물학적 세포에서 miRNA, RNA, 단백질, 지질 및 기타 요소의 발현정도가 물리적 스트레스와 화학적 스트레스에 의해 변화된다는 여러 연구 결과가 있으며, 이러한 요인들은 세포 밖에서 직접적으로 분비되거나 많은 측면에서 중요한 역할을 하는 엑소좀을 통해 분비된다.
인간 슈반 세포 (hSc, Human Schwann cells)는 뉴런의 재생 및 성장에 중요한 역할을 하는 엑소좀을 방출하는 것으로 알려져 있다.
이와 관련하여, 우리는 물리적 스트레스 유도제로 알려진 고주파(radiofrequency, RF)가 hSc로부터 엑소좀의 방출을 향상시킬 수 있는지 확인하였다.
엑소좀의 방출을 유발하기 위해, hSc 세포에 37 ℃에서 15분 동안 RF 자극(빈도 350 ± 3KHz, 전력 42W)을 가한 다음 48시간 동안 hSc 성장 배지에서 배양하고, ExoCet키트를 사용하여 엑소좀을 정량화하였다
병행 실험에서 동일한 수의 RF 미처리 세포를 동일한 성장 배지에서 성장시켰다.
그 결과, Radiofrequency (RF) 처리된 세포가 처리되지 않은(RF 미처리) 세포보다 엑소좀을 함유한 단백질과 RNA를 1.5 배 및 1.35 배 더 많이 분비한다는 것을 발견했다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 엑소좀 정량화 실험에서 null 실험보다 RF 처리 세포에서 ~ 1.75 배 더 많은 엑소좀 방출을 보였다.
도 6b에 나타난 바와 같이, NSC 34 세포의 신경 돌기 성장을 결정한 결과, RF-exo는 w/o RF-exo보다 1.25 배 더 우수한 신경 돌기 성장을 보였다. 이로써 RF를 인가하여 만든 exosome의 경우 축삭이 긴 세포를 더 많이 만들며, 그에 따라 RF 처리군 엑소좀의 활성이 미처리군과 비교하여 우수함을 확인하였다.
실시예 4-2. HEK293 세포에서 엑소좀 분비 유도
엑소좀의 방출을 유발하기 위해, HEK293 세포에 37 ℃에서 15분 동안 RF 자극(빈도 350 ± 3 KHz)을 가한 다음 48 시간 동안 HEK293 세포 성장 배지에서 배양하고, ExoCet 키트를 사용하여 엑소좀을 정량화하였다.
병행 실험에서 동일한 수의 RF 미처리 세포를 동일한 성장 배지에서 성장시켰다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, Radiofrequency(RF) 처리된 세포가 처리되지 않은(RF 미처리) 세포보다 엑소좀을 2.3 배 더 많이 분비한다는 것을 발견했다.
실시예 4-3. L929 세포에서 엑소좀 분비 유도
엑소좀의 방출을 유발하기 위해, 쥐 유래 L929 세포에 37 ℃에서 15분 동안 RF 자극(빈도 350 ± 3KHz)을 가한 다음 48 시간 동안 L929 세포 성장 배지에서 배양하고, ExoCet 키트를 사용하여 엑소좀을 정량화하였다.
병행 실험에서 동일한 수의 RF 미처리 세포를 동일한 성장 배지에서 성장시켰다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Radiofrequency(RF) 처리된 세포가 처리되지 않은(RF 미처리) 세포보다 엑소좀을 1.7 배 더 많이 분비한다는 것을 발견했다.
이러한 결과를 종합하면, CRET 시스템에 의해 생성된 RF 전류가 세포로부터의 엑소좀 분비를 향상시킬 수 있으며, 분비된 엑소좀의 기능도 향상되어 있음을 확인할 수 있었다.
따라서 다양한 질환에 대한 치료 목적으로 사용될 수 있는 세포 유래엑소좀의 대량 생산에 사용될 수 있을 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. (a) 세포에 라디오파 전기자극을 인가하고 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 및 이를 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀의 제조 방법은 세포에서 엑소좀의 생산 및 분비를 향상시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 인간을 포함한 포유동물에서 유래한(분리된) 세포인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 신경구(Neurosphere), 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 심장세포, 신장세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 베타세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, 면역세포, 주피세포 등을 포함하는 인체조직 유래 체세포; 소변, 타액, 땀, 피 등 인체 배출되는 용액에서 추출한 세포; 신경 제대혈 등의 골수 유래 줄기세포; 지방 유래 줄기세포; 성체 줄기세포; 배아줄기세포, iPSC 등의 만능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 신경구(Neurosphere)는 슈반 세포, 신경세포(neuron), 신경교세포(Glia), 성상교세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 라디오파 전기자극은 0.05 내지 3 MHz로 인가하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (b) 단계의 엑소좀의 분리는 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 자유유동전기 이동법, PEG를 포함하는 중합체 기반 침전, ELISA 플레이스 상의 트래핑, 항체-코팅 비드 및 Exoquick 방법으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    분리된 엑소좀은 엑소좀의 활성이 증진된 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조 방법.
  9. 3 KHz 내지 300 GHz를 인가하는 라디오파 전기자극(RF) 생성기; 배양챔버; 및 배양챔버의 양 말단에 부착된 전극을 포함하는, 엑소좀 배양 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 장치는 세포에서 엑소좀의 생산 및 분비를 향상시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 배양 장치.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 라디오파 전기자극 생성기는 CRET(Capacitive Resistance Electric Transfer) 시스템인 것을 특징으로 하는, 엑소좀 배양 장치.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀 배양 장치는 오실로그래프(oscillograph), 온도 센서, pH 센서, DO 센서, CO2 센서, O2 센서, 및 습도 센서로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 배양 장치.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 라디오파 전기자극 생성기는 0.05 내지 3 MHz의 주파수의 라디오파를 발생시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 배양 장치.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022204955A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Shenzhen ChuangSheng XinKe Biotechnology Co., Ltd. Method for preparation of exosomes from ipscs and its derivatives for any clinical use thereof

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112553152A (zh) * 2020-10-27 2021-03-26 重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司 一种快速提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法
CN115607745B (zh) * 2022-11-09 2023-09-15 深圳先进技术研究院 外泌体程控组织修复材料及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110010092A (ko) * 2008-04-21 2011-01-31 나노식스 에이비 원형질막 소포 및 이의 제조 및 이용 방법
WO2016030358A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 Jozef Stefan Institute Method for treatment of tools and tools used for isolation of microvesicles, nanovesicles or exsomes
US20160243171A1 (en) * 2010-08-13 2016-08-25 The University Court Of The University Of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
KR20170106149A (ko) * 2016-03-11 2017-09-20 가톨릭관동대학교기술지주 주식회사 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102499114B1 (ko) * 2017-10-31 2023-02-13 주식회사 유스바이오글로벌 세포 및 배양액 조건에 따른 전기자극 변수 제어장치 및 방법
WO2019136268A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Modulation of extracellular vesicles with electrical stimulation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110010092A (ko) * 2008-04-21 2011-01-31 나노식스 에이비 원형질막 소포 및 이의 제조 및 이용 방법
US20160243171A1 (en) * 2010-08-13 2016-08-25 The University Court Of The University Of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
WO2016030358A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 Jozef Stefan Institute Method for treatment of tools and tools used for isolation of microvesicles, nanovesicles or exsomes
KR20170106149A (ko) * 2016-03-11 2017-09-20 가톨릭관동대학교기술지주 주식회사 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIA CHIRIACÒ; MONICA BIANCO; ANNAMARIA NIGRO; ELISABETTA PRIMICERI; FRANCESCO FERRARA; ALESSANDRO ROMANO; ANGELO QUATTRINI; ROBE: "Lab-on-Chio for Exosomes and Microvesicles Detection and Characterization", SENSORS, vol. 18, no. 10, 20 September 2018 (2018-09-20), pages 3175, XP055758407 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022204955A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Shenzhen ChuangSheng XinKe Biotechnology Co., Ltd. Method for preparation of exosomes from ipscs and its derivatives for any clinical use thereof

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