KR20110010092A

KR20110010092A - 원형질막 소포 및 이의 제조 및 이용 방법

Info

Publication number: KR20110010092A
Application number: KR1020107025680A
Authority: KR
Inventors: 브리짓 바우어; 맥스 데이빗슨; 오우 오르와; 안데르스 칼슨; 로저 칼슨
Original assignee: 나노식스 에이비
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2011-01-31
Also published as: JP2012500963A; WO2009130649A3; WO2009130659A2; EP2350260A2; AU2009239600A1; CN102066549A; US20110143385A1; CA2722026A1; BRPI0910769A2; WO2009130659A3; WO2009130649A2

Abstract

본 발명은 원형질막 소포, 이의 제조 방법, 및 원형질막 소포의 이용 방법을 제공한다.

Description

원형질막 소포 및 이의 제조 및 이용 방법{PLASMA MEMBRANE VESICLES AND METHODS OF MAKING AND USING SAME}

관련 출원

본원은 2008, 4, 21자로 출원된 미국 가출원 제 61/046,479 호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본원에 참조로 명확히 통합된다.

생체막 또는 생물학적 막은 세포를 그 주위 환경(즉, 원형질막)으로부터 분리하고 세포소기관(예를 들어, 골지 복합체, 소포체 및 미토콘드리아) 및 세포핵과 같은 세포 내의 내부 구조를 구성하는 벽이다. 이러한 벽 구조물의 기능은 세포가 물질의 유입 및 유출을 조정 및 조절하고, 상이한 세포소기관 사이에서 세포 내부에서 물질을 패키징 및 수송하고, 특정 시약 또는 시그널링 물질에 대한 특정 수송 경로를 제공하고, 세포 부피 내에 구획의 형성을 통하여 오염물질을 제공하는 방식을 포함한다(Lehninger et al., 1993).

원형질막 단백질은 모든 공지의 약물 표적의 ~70%를 차지하므로 (예를 들어, 이온 채널 및 G 단백질-커플링된 수용체), 원형질막의 효율적인 프로테옴(proteomic) 및 지질체(lipidomic) 분석은 그 기능을 밝히고 약물 개발을 위한 새로운 표적을 발견하기 위하여 대단히 중요하다. 막 프로테옴을 분석하는 방법이 계속하여 개발 중에 있고, 신규한 프로토콜이 꾸준하게 출현되고 있으며, 현재 막의 지질 구성 성분 및 그 기능에 대한 관심이 증가하고 있는 추세이다.

막 프로테옴 및 지질체 분석의 어려움은 주로 원형질막뿐 아니라 세포 내 구획 내 지질 및 막 단백질의 분포에 기인한다. 동정된 단백질 및 지질을 그 본래 위치에 배치하기 위해서는, 막 하부 위치가 구별가능하여야 한다. 이를 달성하기 위하여, 대개 세포 내 세포소기관을 분리하는 것이 필요하며, 이는 전형적으로 세포 용해에 이은 편차 및/또는 밀도구배 원심분리에 의하여 행하여진다. 이러한 방법은 주로 지질:단백질 비율 및 조성에 의하여 결정되는 세포소기관의 고유 밀도에 의하여 분리하는 것에 의존한다. 어느 정도의 세포소기관 강화를 달성할 수 있으나, 상이한 세포소기관의 막들이 유사한 밀도를 가지므로 분획 사이에 조성이 종종 중복된다. 따라서, 이러한 프로토콜을 이용하면, 물리학의 법칙은 상이한 막 단백질 급원들의 완전한 분리에 대하여 반박한다. 다른 문제는 내막계가 상호연결되어 있다는 사실이다. 소포, 및 세관은 물질을 분비 및 세포내 경로를 통하여 실어나르며, 이는 다시 막 단백질 및 지질 분포에 있어서 중복을 초래한다. 따라서, 예를 들어 단백질 상관관계 프로파일링에 의하여 관측된 것과 같이, 많은 막 단백질이 복수의 세포 위치에 배치된다. 프로테옴 연구, 예를 들어 친화성 강화를 위하여 원형질막을 분리하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 왔으나, 이러한 방법들은 다른 세포소기관이 동정된 막 단백질의 ~30-40%를 여전히 차치하여 고유한 원형질막 단백질의 동정을 방해하는 오염의 공통적인 문제를 가진다. 원형질막 지질의 분석에 있어서도 마찬가지이다. 상이한 세포 유형 또는 심지어 동일한 세포 유형 내에 세포소기관 사이의 생체막 조성을 검사해 보면, 상이한 지질 종의 다양성 및 수가 두드러진다(Schmidt and MacKinnon, 2008). 생체막 내 지질 종의 다양성은 막의 기능과 어느 정도 관련되며, 예를 들어, 일부 단백질은 특정 지질의 존재하에서만 기능적으로 된다. 또한, 많은 과정들이 생체막 내 하전된 지질을 통한 단백질 흡착의 정전기적 조절을 수반하며, 그 자체가 생체막 표면 상에서 일어나는 반응을 중재할 수 있다. 생체막을 추가적으로 검사하면, 원형질막의 두 단분자막 사이에 다양한 지질 종 분포의 불균형이 추정될 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 콜린은 원형질막의 외부 단분자막 내에서 주로 발견되는 반면, 다수의 포스파티딜 에탄올아민 및 포스파티딜 세린은 내부 단분자막 내에 위치한다 (Langner and Kubica, 1999). 이는 단분자막 기능의 이중작용을 반영하는 것으로, 외부 단분자막은 주위 환경에 대한 다소 불활성 막을 제공하는 반면, 내부 표면은 예를 들어 포스파티딜 세린 성분으로부터 발생되는 순전하에 의하여 반응이 일어나는 부위를 제공한다.

따라서, 원형질 막 내에 막 단백질 및 지질의 연구 및 특성 규명을 촉진시키기 위한 방법 및 조성물의 발견에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 고순도 원형질막 소포의 제조 방법 및 이의 이용 방법의 발견에 적어도 부분적으로 기초한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 세포를 소포형성제와 접촉시킴으로써 원형질막 소포를 생산하는 단계를 포함하는 원형질막 소포의 제조 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포를 기계적으로 교반하는 단계를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 상기 세포는 부착성 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 현탁액 내에 있다. 관련된 구현예에서, 상기 세포는 포유동물, 예컨대 인간 세포이다.

일 구현예에서, 상기 소포형성제는 설프히드릴 블록킹제를 포함하며, 예를 들어, 포름알데히드, 피루브산 알데히드, 아세트알데히드, 글리옥살, 글루타르알데히드, 아크롤레인, 메타크롤레인, 피리독살, N-에틸 말레이미드(NEM), 말레이미드, 클로로머큐리벤조에이트, 요오도아세테이트, 아비산칼륨, 아셀렌산나트륨, 티메로살(메르티올레이트), 벤조일 퍼옥사이드, 염화카드뮴, 과산화수소, 요오도벤조산, 메랄루라이드 나트륨(머큐히드린), 염화제2수은, 염화제1수은, 클로르머로드린(네오히드린), 페닐히드라진, 텔루르산칼륨, 말론산나트륨, p-아르세노벤조산, 5,5'-디아미노-2.2'-디메틸 아르세노벤젠, N,N'-디메틸렌 설포네이트 디소듐염, 요오도아세트아미드, 옥소페나르신(마파르센), 염화금, p-클로로머큐리벤조산, p-클로로머큐리페닐설폰산, 염화제2구리, 요오딘 메르브로민(머큐로크롬) 포르피린딘, 과망간산칼륨, 메르살릴(살리르간), 질산은, 강력 은 단백질(프로타르골), 및 아세트산 우라닐이다.

특정 구현예에서, 상기 소포형성제는 디티오트레이톨(DTT) 및 포름알데히드를 포함한다.

대안적인 구현예에서, 상기 소포형성제는 세포 독소, 예를 들어, 사이토칼라신 B 또는 멜리틴이다.

다른 구현예에서, 상기 세포는 교반기 또는 초음파처리에 의하여 기계적으로 교반된다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 세포를 상기 소포형성제와 접촉시키기 전에, 세포를 세척하여 배지를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 원형질막 소포를 예를 들어 여과, 밀도구배 원심분리, 또는 투석 중 어느 하나 이상에 의하여 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계들 중 하나 이상을 포함하는 고순도 원형질막 소포의 제조 방법을 제공한다:

상기 원형질막 소포를 알킬화 및 환원제와 접촉시키는 단계;

상기 원형질막 소포를 알칼리 용액과 접촉시키는 단계;

상기 원형질막 소포 상에서 초음파처리를 이용하여 소포 내 오염물질을 배출시키는 단계;

상기 원형질막 소포 상에서 초음파처리를 이용하여 원형질막 소포를 세정하는 단계; 및

상기 원형질막 소포를 완충 용액으로 세척하는 단계.

관련 구현예에서, 상기 알킬화제는 요오도아세트아미드이다. 추가적인 관련 구현예에서, 상기 알칼리 용액은 적어도 pH 11이다. 또 추가적인 구현예에서, 상기 알칼리 용액은 Na₂CO₃ 또는 NaOH이다.

다른 구현예에서, 상기 원형질막 소포의 직경은 20㎛ 또는 10㎛ 이하이다.

일부 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 막횡단 단백질, 예를 들어, 막횡단 알파나선형 단백질, 막횡단 베타배럴 단백질, 지질-고정 막단백질, 및 막주변 단백질을 포함한다.

예시적 구현예에서, 상기 막횡단 단백질은 효소, 수송체, 수용체, 채널, 세포 부착 단백질, G 단백질, GTPase로부터 선택된다.

다른 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 지질 고정 단백질을 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 상기 원형질막 소포 기원의 세포 유형과 관련된 특정 조성의 지질을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 원형질막 소포를 하나 이상의 몇몇 프로테아제, 또는 몇몇 프로테아제와 연속으로 접촉시키는 단계, 및 상기 프로테아제에 의하여 생성된 펩타이드를 분석함으로써 세포의 막 프로테옴을 분석하는 단계를 포함하는 세포의 막 프로테옴의 분석 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 예를 들어, 트립신 또는 키모트립신이다.

부가적인 구현예에서, 상기 방법은 단백질 단편을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 구현예에서, 상기 펩타이드 단편을 질량 분석법에 의하여 분석한다.

다른 측면에서, 본 발명은 관심의 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 단계; 본원에 기재된 방법에 의하여 원형질막 소포를 제조하는 단계; 상기 원형질막 소포를 후보 조절인자와 접촉시키는 단계; 상기 후보 조절인자가 상기 막횡단 단백질을 조절할 수 있는지 판단함으로써, 막횡단 단백질의 조절인자를 확인하는 단계를 포함하는 막횡단 단백질의 조절인자를 확인하는 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 리포터 유전자의 활성을 측정함으로써 상기 후보 조절인자의 막횡단 단백질 조절 능력을 판단한다

다른 측면에서, 본 발명은 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 본원에 기재된 방법에 의하여 원형질막 소포를 제조하는 단계; 상기 원형질막 소포 내에 존재하는 폴리펩타이드를 분석함으로써, 화합물의 막횡단 프로테옴에 대한 영향을 결정하는 단계를 포함하는 막횡단 프로테옴에 대한 화합물의 영향을 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 상기 화합물은 소분자, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산 분자, RNAi, shRNA, 또는 miRNA이다.

관련 구현예에서, 상기 방법은 상기 원형질막 소포를 프로테아제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 프로테아제에 의하여 생산된 펩타이드를 질량분석법에 의하여 분석하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 원형질막 소포를 표면에 부착시키는 단계; 상기 원형질막 소포를 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 단계; 및 생성된 펩타이드를 분석하여 단백질의 정체를 판단하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 원형질막 소포 내 단백질을 분석하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 표면은 미세유체 소자이다. 다른 구현예에서, 상기 펩타이드를 질량분석법에 의하여 분석한다.

다른 측면에서, 본 발명은 세포를 화합물과 접촉시키고; 본원에 기재된 방법에 의하여 원형질막 소포를 생산하고; 및 추가 분석을 위하여 지질 성분을 추출함에 의하여 원형질막의 지질 성분을 분석하는 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 지질 구성 성분의 추출은 지질 표적 구성 성분에 따라 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 추출된 원형질막 지질 내에서 막횡단 단백질을 재구성할 때 상기 지질 조성의 영향을 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에서, 세포를 화합물과 접촉시켜 본원에 기재된 방법에 의하여 원형질막 소포를 생산하고, 상기 지질 성분을 또한 본원에 기재된 방법에 의하여 추출하고, 최종적으로 상기 막단백질을 상기 추출된 지질 내에서 재구성한다. 관련 측면에서, 재구성은 예를 들어 계면활성제를 이용하여 천연막으로부터 막단백질을 추출하고 이를 지질 막 환경 내로 삽입하는 것을 의미한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 원형질막을 가로지르는 수송, 흡수 및 물질의 원형질막과의 막 상호작용 연구 방법 및 적용을 제공한다. 관련 측면에서, 상기 물질은 이에 제한되지 않으나 펩타이드, 단백질, 당, 콜레스테롤 및 다양한 형태의 DNA 및 RNA일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 단분산 원형질막 소포들의 집단을 제공한다. 예시적 구현예에서, 상기 원형질막 소포들의 직경은 5㎛ 내지 25nm, 50㎛ 내지 500㎛, 또는 100㎛ 내지 200㎛이다.

관련 구현예에서, 상기 집단은 소정의 막 단백질, 예를 들어 막횡단 단백질 또는 지질 고정 단백질에 대하여 강화되어 있다. 관련 구현예에서, 상기 집단은 면역조직화학 또는 친화 정제에 의하여 강화된다.

일 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 세포소기관 또는 세포골격 구조를 함유하지 않는다.

본원에 기재된 방법은 원형질막 지질의 재구성 실험에 추후 사용을 위해 특정 세포 유형으로부터의 정제를 가능케 한다. 본 발명의 이점은 원형질막의 세포 특이적 지질 성분을 유지한다는 사실에 기인한다. 특정 세포주의 원형질막으로부터 나오는 막 단백질의 재구성을 천연 막 내에서와 동일한 지질을 이용하여 수행할 수 있다.

도 1 세포 배양액을 컨플루언스하게 성장시킨 후(A), 성장 배지를 흡입에 의하여 제거하고 2회 세척하여(B) 잔류 성장 배지 오염물질을 제거한다. (C)소포형성 용액을 세포층에 첨가하면 (D)원형질막 소포가 세포 표면에 형성되고 배양 중에 용액 내로 분리되어 나온다. 상기 플라스크를 교반하여 PMV 발산을 촉진시킨다. (E)상기 원형질막 소포 용액을 조심스럽게 상기 세포층으로부터 흡입시켜 원뿔형 관 내로 이동시켜 (F)조 원형질막 소포 용액을 수득한다.
도 2 (A-B)수확된 세포 함유 원형질막 소포 용액 아래 2M 수크로오즈 용액을 놓아 고밀도상을 제공한다. (C)상기 용액을 수평 로터(swing-out rotor)를 이용하여 저속으로 원심분리한다. 원심분리 중에 탈착된 세포 및 세포 찌꺼기만을 고밀도 수크로오스상 내에서 펠릿화하는 한편, 원형질막 소포를 저밀도 완충 상 내에 유지한다. (D)원형질막 소포를 함유하는 상부 상을 조심스럽게 흡입하고, 라지 컷오프 투석막 내로 이동시키고 투석을 위하여 HEPES 완충액 내에 놓는다. (F)투석 중에, 소포형성제 및 저 MW 단백질을 제거하여 초순수 원형질막 소포 용액을 생산한다.
도 3 (A-B)상기 정제된 원형질막 소포를 환원 및 알킬화제에 노출시켜 절단 부위를 노출시키고 단백질 응집을 방지한다. (C)상기 원형질막 소포 용액을 높은 pH에서 Na₂CO₃로 세척하여 비공유결합 단백질-단백질 상호작용을 방해하고, 세포질 단백질을 상기 막으로부터 분리시킨다. 초음파처리는 원형질막 소포를 분열시키고 그 세포질 내용물이 배출되도록 한다. (D)상기 원형질막 소포를 초원심분리하고, 상등액을 흡입시켜 (E-F)PMV 내부로부터 배출되는 오염물질을 제거한다. (G)상기 막 펠릿을 헹구고 완충액 내에서 초음파처리하여 초순수 소형 원형질막 소포 용액을 수득한다.
도 4 (A-B)상기 원형질막 소포 용액을 유입 노즐을 통하여 주입함으로써 가공처리된 원형질막 소포를 유동세포 표면 상에 고정화한다. (C-D)프로테아제 주입 후, 막 단백질의 표면 노출 영역을 제거하여 소정 세트의 펩타이드를 생산한다. 이들을 출구 노즐을 통하여 상기 칩으로부터 용출시킨다(D). (E)상기 용출된 펩타이드 표본을 가공하고 LC-MS/MS를 통하여 분석한다.
도 5. 정제된 원형질막 소포 및 마이크로솜 내 동정된 막 단백질의 비교. 원형질막 소포 내에서, 43 막 단백질 중 32 단백질이 원형질막에 고유하게 결합되며, 이는 마이크로솜 내에서 79 중 단지 17과 비교된다. 전체적으로, 마이크로솜 막 단백질의 ~44%가 원형질막-결합되는 반면, PMV 분석은 93% PM-결합 단백질의 결과를 나타낸다.
도 6. 원형질막 소포 내에 발견되는 원형질막 단백질 부류. GTPase가 최대 부분을 구성하고, G-단백질 및 세포 부착 기능 관련 단백질이 그 뒤를 잇는다. 원형질막 소포의 막 단백질 셋업에 대한 지식은 단일 원형질막 소포 내에서 활성 검사의 개발 가능성을 제시한다.
도 7 고유 위치를 가지는 고정된 막 단백질에 대한 세포내 분포의 비교. (A) 원형질막 소포막 내 분포 (B) 마이크로솜 막 내 분포
도 8 글리세로포스포리피드의 구조. 이들 구조의 골격은 두 개의 알킬 사슬 또는 다양한 포화도를 가지는 지방산에 에스테르 결합을 통해 결합된 글리세롤 분자이다. 포스페이트 분자를 통한 세번째 결합은 상기 지질의 머리기를 정의한다. 이 도면은 또한 pH 7에서 지질의 순전하를 기재한다. 포스파티딜 콜린은 쯔비터이온성 지질이며, 이는 상기 지질이 중성 pH 값에서 서로를 무효화하는 음전하 및 양전하 모두를 함유함을 의미한다.
도 9 백본으로서 장사슬 아민 알콜, 장사슬 지방산, 및 예를 들어 포스포디에스테르 결합을 통하여 다른 극성 머리기에 추가로 결합될 수 있는 극성 머리 알콜을 함유하는 스핑고지질의 구조. 이러한 군에서 가장 단순한 화합물은 세라미드이며, 도면은 또한 스핑코지질의 세 개의 상이한 군으로부터의 예를 보인다: 스핑고마이엘린, 당지질 및 강글리오사이드. 도면에 사용되는 당에 대한 기호는 다음과 같다: Glc, D-글루코스; Gal, D-갈락토오스; GalNAc, N-아세틸-D-갈락토스아민; NeuNAc, N-아세틸뉴라민산(시알산).

본 발명은 원형질막 소포 및 원형질막 소포의 제조 방법을 제공한다. 본원에 제공되는 방법은 당업자로 하여금 그들이 선택하는 임의의 세포 유형으로부터 원형질막 소포의 제조를 가능케 한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 원형질막 소포는 WO 2006/068619에 기재된 소자와 함께 사용될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 명확히 통합된다.

원형질막 소포의 제조

본 발명은 막 단백질을 포함하는 원형질막 소포의 제조 및 이용을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 세포소기관 또는 세포 매트릭스 물질을 함유하지 않는다.

일 측면에서, 본 발명의 방법은 고순도 및/또는 단분산 원형질막 소포의 제조를 허용한다.

"단분산"은 유사한 크기의 원형질막 소포 집단을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 원형질막 소포 집단의 일원의 직경은 서로의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이내이다.

원형질막 소포는 블렙(bleb)으로서도 알려져 있다. 블렙은 세포의 세포벽, 외막, 세포질막 및/또는 원형질막 내에 형성되는 작은 봉오리와 같은 돌출이다. 본원에 기재된 선별된 조건 하에 배양되었을 때, 상기 막 소포는 전체 세포로부터 배지 내로 이탈한다. 상기 막 소포는 일반적으로 구형이며, 2층을 가지고, 약 1㎛ 내지 약 100μM의 직경을 가진다.

본 발명의 방법에서는 세포를 소포형성제를 포함하는 제제와 접촉시키는 것이 중요하다. 특정 구현예에서, 상기 소포형성제는 설프히드릴 블록킹제, 예를 들어, 포름알데히드, 피루브산 알데히드, 아세트알데히드, 글리옥살, 글루타르알데히드, 아크롤레인, 메타크롤레인, 피리독살, N-에틸 말레이미드(NEM), 말레이미드, 클로로머큐리벤조에이트, 요오도아세테이트, 아비산칼륨, 아셀렌산나트륨, 티메로살(메르티올레이트), 벤조일 퍼옥사이드, 염화카드뮴, 과산화수소, 요오도벤조산, 메랄루라이드 나트륨(머큐히드린), 염화제2수은, 염화제1수은, 클로르머로드린(네오히드린), 페닐히드라진, 텔루르산칼륨, 말론산나트륨, p-아르세노벤조산, 5,5'-디아미노-2.2'-디메틸 아르세노벤젠, N,N'-디메틸렌 설포네이트 디소듐염, 요오도아세트아미드, 옥소페나르신(마파르센), 염화금, p-클로로머큐리벤조산, p-클로로머큐리페닐설폰산, 염화제2구리, 요오딘 메르브로민(머큐로크롬) 포르피린딘, 과망간산칼륨, 메르살릴(살리르간), 질산은, 강력 은 단백질(프로타르골), 및 아세트산 우라닐을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 소포형성제는 이들 제제의 조합, 예를 들어 함께 작용하는 디티오트레이톨(DTT) 및 포름알데히드이다.

다른 구현예에서, 상기 소포형성제는 세포 독소, 예를 들어 시토칼라신 B 또는 멜리틴이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 소포 형성 양을 증가시키기 위하여 상기 세포를 기계적으로 교반한다. 상기 기계적 교반은 예를 들어 교반기 또는 초음파처리일 수 있다.

일단 원형질막 소포가 형성되면, 원한다면 이를 정제할 수 있다. 원형질막 소포를 정제하는 많은 방법이 있으며, 이에 제한되지 않으나 여과, 밀도구배원심분리 또는 투석을 포함한다. 일부 예에서, 이들 방법 몇몇의 조합이 바람직하다.

초순수 원형질막 소포를 생산하기 위하여, 다음 정제 및 조작 단계들 중 하나 이상이 수행될 수 있다: 막 단백질의 알킬 및 환원, 알칼리 세척에 의하여 비공유결합성 단백질-단백질 상호작용 중단, 초음파처리에 의하여 소포내 오염물질 배출 및 작은 소포 형성, 초원심분리에 의하여 원형질막 소포 분획 세정, 헹굼 및 중탄산암모늄완충액 내 분산.

막 단백질을 예를 들어 디티오트리톨, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리부틸포스핀(TBP)와 접촉시켜 DTT, 또는 요오도에탄올 및 트리에틸포스핀DTT의 조합을 대체시킴으로써 막 단백질의 환원을 달성할 수 있으며, 요오도아세트아미드를 이용하여 알킬화를 수행하여 디설파이드 결합을 파괴할 수 있다. 이에 따라 보다 많은 절단 부위가 분해를 위하여 이용가능하게 되며 단백질 응집이 감소된다.

상기 원형질막 소포를 높은 pH 용액 또는 높은 염 용액으로 세척하여 비공유결합성 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 단계는 또한 세포질 단백질을 막으로부터 분리시킬 것이다.

상기 원형질막 소포를 초음파에 노출시켜 소포내 오염물질을 배출시키고 보다 작은 소포를 형성할 수 있다. 이러한 정제 단계는 연장된 초음파처리를 포함하며, 이는 원형질막 소포의 분열 및 더 작은 소포로서 재봉합을 야기하여 결과적으로 내부 세포질을 용액 내로 배출시킨다.

이러한 부가적인 오염물질 급원을 제거하기 위하여, PMV 막을 초원심분리에 의하여 펠릿화할 수 있으며 상등액을 제거한다.

상기 막 펠릿을 또한 헹구고 완충 용액, 예를 들어 중탄산암모늄 완충액 내에 분산시킬 수 있다.

상기 원형질막 소포를 또한 필터를 통하여 여과하여 균일한 크기의 원형질막 소포 집단을 생산할 수 있다.

상기 원형질막 소포 집단을 예를 들어 친화 정제 또는 면역정제에 의하여 소정의 막 단백질에 대하여 강화할 수 있다.

다양한 세포를 이용하여 원형질막 소포를 제조할 수 있다. 상기 세포 또는 세포주는 표면에 부착하여 또는 성장 배지 내에 자유롭게 성장할 수 있다. 세포는 임의의 유기체, 바람직하게 포유동물, 예를 들어 인간 세포일 수 있다. 일 구현예에서, 원형질막 소포의 제조에 사용되는 세포는 질환 상태, 예를 들어 암과 관련된 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 형질전환 또는 트랜스펙션되어 목적으로 하는 단백질을 생산한다. 예시적 구현예에서, 상기 목적으로 하는 단백질은 하나 또는 몇몇 개의 막 단백질, 예를 들어 막횡단 단백질 또는 지질 고정 단백질이다.

외부 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 도입하여 당업자에게 공지된 통상적인 분자 생물학 기법을 이용하여 막 소포를 생산할 수 있다. 삽입된 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 번역을 위하여 필요한 엘리먼트를 선택된 세포에 따라 선별할 수 있으며, 이는 당업자에 의하여 용이하게 달성될 수 있다. 핵산 서열로 트랜스펙션되거나 형질전환된 세포의 선별을 촉진시키는 리포터 유전자를 또한 미생물 내로 혼입할 수 있다 (트랜스펙션/형질전환 방법 및 전사 및 번역 엘리먼트의 선별, 및 리포터 유전자에 대하여, 예컨대, Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조). 외부 단백질을 인코딩하는 서열은 일반적으로, 예를 들어 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville Md.) 및 British Biotechnology Limited (Cowley Oxford England)를 포함하는 서열을 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 기탁기관을 포함하는 다양한 급원으로부터 얻을 수 있다.

"막횡단 도메인"은 막에 걸치며, "막 고정 도메인"은 막 내에 위치하나 이를 횡단하지 않는다. "세포외" 또는 "디스플레이 도메인"은 세포 외부 또는 원형질막 소포 상에 존재하고, 따라서 세포 또는 원형질막 소포의 외부 환경과 접촉한다.

"진핵생물"은 당업계에 사용되는 바와 같은 용어이다. 진핵생물은 비제한적 예로서, 균류, 단세포 진핵생물, 식물 또는 동물일 수 있다. 동물은 래트, 마우스, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 유인원 또는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.

"진핵생물 막(eukaryotic membrane)"은 진핵생물에서 발견되는 막이다. 진핵생물 막은, 비제한적인 예로서, 세포질 막, 핵막, 핵인 막, 소포체(endoplasmic reticulum: ER)의 막, 골치제 막, 리소좀 막, 퍼옥시좀 막, 카베올라 막, 또는 미토콘드리아, 엽록체 또는 색소체의 내부 또는 외부막일 수 있다.

"막 단백질"은 막 내에서 전체적으로 또는 부분적으로 발견되는 단백질이다. 막 단백질은 적어도 하나의 막 고정 도메인 또는 적어도 하나의 막횡단 도메인을 가질 수 있다.

"발현 벡터"는 단백질을 인코딩하는 외부 핵산 분자가 외부 핵산 분자의 발현을 유도하는 적절한 발현 서열에 작동가능하게 연결되도록 하는 방식으로 삽입될 수 있는 인공 핵산 분자이다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 비-벡터 핵산 서열에 의하여 인코딩되는 유전자 산물이 발현 엘리먼트로부터 생체 내에서 생산됨을 의미한다.

"발현 구조체"는 목적으로 하는 핵산 서열이 발현 벡터 내에 존재하는 발현 서열에 작동가능하게 연결되도록 배치되는 방식으로 삽입된 발현 벡터이다.

본 발명은 원형질막 내에 또는 그 위에 존재하는 단백질의 연구 및 특성 규명을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적 단백질에 대하여 이하 기재한다.

막 단백질

막 단백질은 일반적으로 두 가지 유형의, 막주변 단백질(peripheral membrane proteins) 및 막관통 단백질(integral membrane proteins)로 구성된다.

막관통 단백질은 지질 이중층 막의 두 층(또는 "리플렛")에 걸쳐있을 수 있다. 따라서, 이러한 단백질은 세포외, 막횡단 및 세포내 도메인을 가질 수 있다. 세포외 도메인은 세포의 외부 환경에 노출되는 반면, 세포내 도메인은 세포의 세포질과 마주한다. 막관통 단백질의 막을 가로지르는 부분이 "막횡단 도메인"이다. 막횡단 도메인은 종종 전형적으로 알파 나선 구조를 취할 것으로 예상되는 15 내지 25 소수성 아미노산을 포함하는 하나 이상의 영역에 의하여 세포막을 가로지른다.

막관통 단백질은 바이토픽(bitopic) 또는 폴리토픽(polytopic)으로 분류된다 (Singer, (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-96). 바이토픽 단백질은 막에 걸쳐 있는 반면, 폴리토픽 단백질은 복수의 막에 걸치는 부분을 포함한다.

막주변 단백질은 막 표면에 결합되고 막 영역의 소수성 층 내로 통합되지 않는 막 단백질이다. 막주변 단백질은 막에 걸쳐 있지 않으나, 그 대신, 막 표면, 막을 형성하는 지질 이중층 중 한 층, 또는 막관통 단백질의 세포외 도메인에 결합되어 있다.

본 발명은 이에 제한되지 않으나 이하의 예시적 수용체 및 막 단백질을 포함하는 임의의 막 단백질에 적용될 수 있다. 상기 단백질은 이에 제한되지 않으나 수용체(예를 들어, GPCRs, 스핑고지질 수용체, 신경전달물질 수용체, 감각수용기, 성장인자 수용체, 호르몬 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 면역학적 수용체 및 보체 수용체, FC 수용체), 채널(예를 들어, 칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널), 공동(예를 들어, 핵공 단백질, 수 채널), 이온 및 기타 펌프(예를 들어, 칼슘 펌프, 양성자 펌프), 교환기(예를 들어, 나트륨/칼륨 교환기, 나트륨/수소 교환기, 칼륨/수소 교환기), 전자 수송 단백질(예를 들어, 사이토크롬 옥시다아제), 효소 및 카이나아제(예를 들어, 단백질 카이나아제, ATPase, GTPase, 포스포타아제, 프로타아제), 구조적/연결 단백질(예를 들어, 카베올린, 클라트린), 어댑터 단백질(DP를 들어,TRAD, TRAP, FAN), 케모탁틱/부착성 단백질(예를 들어, ICAMI1, 셀렉틴, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1), 및 PI-특이적 PLC와 같은 포스포리파아제 및 기타 포스포리파아제를 포함한다.

기타 막 단백질이 본 발명의 범위 내이며, 이에 제한되지 않으나, 채널(예를들어, 칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널), 공동(예를 들어, 핵공, 수 채널), 이온 및 기타 펌프(예를 들어, 칼슘 펌프, 양성자 펌프), 교환기(예를 들어, 나트륨/칼륨 교환기, 나트륨/수소 교환기, 칼륨/수소 교환기), 전자 수송 단백질(예를 들어, 사이토크롬 옥시다아제), 효소 및 카이나아제(예를 들어, 단백질 카이나아제, ATPase, GTPase, 포스포타아제, 프로타아제), 구조적/연결 단백질(예를 들어, 카베올린, 클라트린), 어댑터 단백질(DP를 들어,TRAD, TRAP, FAN)을 포함한다.

세포 부착 분자

세포 부착 분자를 본 발명의 방법 및 조성물에 이용할 수 있다. 예시적 세포 부착 분자는 인간 리노바이러스 수용체(ICAM-1), ICAM-2, ICAM-3 및 PECAM-1을 포함하며, 케모탁틱/부착 단백질(예를 들어, 셀렉틴, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1)은 본 발명의 범위 내이다. 또한, Alpin et al., "Signal Transduction and Signal Modulation by Cell Adhesion Receptors: The Role of Integrins, Cadherins, Immunobulin-Cell Adhesion Molecules, and Selectins", Pharmacological Reviews, Vol. 50, No.2를 참조한다.

상기 비제한적 예 이외에도, 본 발명은 미국 특허 제 6,335,018 호(모락셀라의 고분자량 주요 외막 단백질); 미국 특허 제 6,264,954 호(해모필러스 외막 단백질); 미국 특허 제 6,197,543 호(인간 소포 막 단백질-유사 단백질); 미국 특허 제 6,121,427 호(브란하멜라의 주요 외막 단백질 CD); 미국 특허 제 6,083,743 호 및 제 6,013,514 호(해모필러스 외막 단백질); 미국 특허 제 6,004,562 호(모락셀라 카타할리스의 외막 단백질 B1); 미국 특허 제 5,863,764 호(인간 막 단백질을 인코딩하는 DNA); 미국 특허 제 5,861,283 호(대뇌변연계 관련 막 단백질을 인코딩하는 DNA); 미국 특허 제 5,824,321 호(클로닝된 렙토스피라 외막 단백질); 미국 특허 제 5,821,085 호(T. 팔라듐 희 외막 단백질의 뉴클레오타이드 서열); 미국 특허 제 5,821,055 호(클라미디아 주요 외막 단백질); 미국 특허 제 5,808,024 호(모락셀라의 고분자량 주요 외막 단백질을 인코딩하는 핵산); 미국 특허 제 5,770,714 호(클라미디아 주요 외막 단백질); 미국 특허 제 5,763,589 호(인간 막 단백질); 미국 특허 제 5,753,459 호(T.팔라듐 희 외막 단백질의 뉴클레오타이드 서열); 미국 특허 제 5,607,920 호(콘카나발린, 결합 단백질 및 콘도로사이트로부터의 76 kD 콘도로사이트 막 단백질(CMP) 및 이의 수득 방법); 및 미국 특허 제 5,503,992 호(해모필러스 인플루엔자의 15 kD 외막 단백질을 인코딩하는 DNA)에 기재된 막 단백질에 적용될 수 있다.

막횡단 도메인의 다양한 유형 및 예가 알려져 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 다음 유형의 막횡단 단백질에 속한다.

막을 1회 횡단하는 모노트로픽("단일 패스") 도메인의 비제한적 예는 표피생장인자(EGF)에 대한 수용체, 종양 괴사 인자(TNF)에 대한 수용체 등에서 발견되는 것들을 포함한다. 폴리트로픽("멀티패스") 단백질은 2 회 이상 막을 횡단한다. 폴리트로픽 단백질의 비제한적 예는 다음과 같다.

바이오트로픽("2 패스") 막 단백질은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: E. coli의 EnvZ; 퍼옥시좀 막 단백질 Pex11-1p(Anton et al., ARF- 및 코토머(coatomer)-개재 퍼옥시좀 소포형성, Cell Biochem Biophys 2000;32 Spring:27-36); S.cervisiae의 다면발현 약물 ABC 수송체(Rogers et al., The pleitropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae, J Mol Microbiol Biotechnol 2001 3:207-14); 및 인간 및 래트 요산염 수송체 hUAT 및 rUAT (Lipkowitz et al., Functional reconstitution, membrane targeting, genomic structure, and chromosomal localization of a human urate transporte, J Clin Invest 2001 107:1103-15).

트리트로픽("3 패스") 막 단백질은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 아라비돕시스의 에틸렌 수용체 ETR1; 콜리플라워 카드 발현(Cauliflower Card Expression) 단백질 CC1 (Palmer et al., A Brassica oleracea Gene Expressed in a Variety-Specific Manner May Encode a Novel Plant Transmembrane Receptor, Plant Cell Physiol 2001 42:404-413); 및 미토콘드리아 막 단백질 hMRS3/4의 스플리스 변형체 (Li et al., Characterization of a novel humna putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing protines 3 and 4, FEBS Lett 2001 494:79-84).

테트라스패닌 또는 테트라스팬은 네 개의 막횡단 도메인을 가지는 막 단백질의 비제한적 예이다 (Levy et al., J. Biol. Chem, 226:14597-14602, 1991; Tomlinson et al., J. 1 mmol. 23:136-40, 1993; and Barclay et al., (In) The Leucocyte antigen factbooks, Academic press, London, 1993). 이들 단백질은 원형질막을 4회 횡단하므로 막횡단 4 수퍼패밀리(TM4)로서 총괄적으로 알려져 있다. 이 부류에 속하는 것으로 공지된 단백질은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 포유동물 항원 CD9 (MIC3), 혈소판 활성화 및 응집에 수반되는 단백질; B 림프구 상에 발현되는 포유동물 백혈구 항원 CD37; 조혈세포 내 성장 조절에 수반될 수 있는 포유동물 백혈구 항원 CD53 (OX-44); 포유동물 리소좀 막 단백질 CD63 (흑색종 관련 항원 ME491; 항원 AD1); 림프종 세포 성장 조절에서 중요한 역할을 할 포유동물 항원 CD81 (세포 표면 단백질 TAPA-1); CD4 및 CD8과 관련되며 TCR/CD3 경로에 대하여 공동자극 시그널을 전달하는 포유동물 항원 CD82 (단백질 R2; 항원 C33; Kangai 1(KAI1)); 포유동물 항원 CD151 (SFA-1); 혈소판-내피 테트라스팬 항원 3(PETA-3); 포유동물 TM4SF2 (세포 표면 당단백질 A15; TALLA-1; MXS1); 포유동물 TM4SF3 (종양 관련 항원 CO-029); 포유동물 TM4SF6 (Tspan-6; TM4-D); 포유동물 TM4SF7 (신규 항원 2(NAG-2); Tspan-4); 포유동물 Tspan-2; 포유동물 Tspan-3 (Tm4-a); 포유동물 테트라스팬 NET-5; 및 만손주혈흡충 및 일본주혈흡충 23 Kd 표면 항원(SM23/SJ23).

여섯 개의 막횡단 도메인을 가지는 막 단백질의 비제한적 예는 EBV 막관통 단백질 LMP-1, 및 미토콘드리아 단백질 hMRS3/4의 스플리스 변형체를 포함한다 (Li et al., Characterization of a novel human putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing proteins 3 and 4, FEBS Lett Apr. 6, 2001; 494(1-2):79-84). 여섯 개의 막횡단 도메인을 가지는 단백질은 또한 STEAP(전립선의 여섯 개의 막횡단 내피 항원) 단백질(Afar et al., 미국 특허 제 6,329,503 호)을 포함한다. 상기 STEAP 류의 프로토타입 멤버 STEAP-1은 정상적인 인간 조직 내에서 주로 전립선 세포 내에 발현되는 타입 IIIa 막 단백질로 보인다. 구조적으로, STEAP-1은 여섯 개의 막횡단 도메인 및 세포내 N- 및 C-말단의 분자 토폴로지를 특징으로 하는 339 아미노산 단백질로, 이는 세 개의 세포외 및 두 개의 세포내 루프 내로 "세르펜틴" 방식으로 접힘을 나타낸다.

수백 개의 7-패스 막 단백질이 공지되어 있다. 제한없이 베타-아드레노 수용체, 아드레날린 작용성 수용체, EDG 수용체, 아데노신 수용체, 키닌에 대한 B 수용체, 안지오텐신 수용체, 및 오피오드 수용체를 포함하는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCRs)가 본원 명세서의 다른 부분에 보다 상세히 기재되어 있다.

9 개의 막횡단 도메인을 가지는 단백질의 비제한적 예는 리포칼린-1 상호작용 막 수용체이다 (Wojnar et al., Molecular cloning of a novel Lipocalin-1 interactign human cell membrane receptor (LIMR) using phage-display, J Biol Chem 2001 3).

막횡단 및 고정(anchoring) 도메인을 모두 가지는 단백질이 공지되어 있다. 예를 들어, AMPA 수용체 서브유닛은 막횡단 도메인들 및 하나의 막-고정 도메인을 가진다.

지질 구조체

생체막 내 가장 보편적인 지질은 1,2-디알킬포스포글리세라이드 또는 인지질이다(Gennis, 1989). 이는 예를 들어 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 글리세롤(PG)를 포함한다. 이들 인지질의 구조를 도 8에 요약한다.

인지질 구조는 통상적인 글리세롤 분자에 에스테르 결합에 의하여 결합되는 두 개의 알킬 사슬 또는 지방산으로 구성된다. 세번째 히드록실기가 포스페이트 분자에 결합되며, 이는 지질의 다양한 머리기에 연결된다. 상기 알킬 사슬 또는 탄화수소 꼬리는 함께 예컨대 막의 투과성 및 유동성과 같은 근본적 특성에 영향을 미치는 길이(14-24 탄소 원자) 및 포화도 모두에 있어서 다르다. 다른 핸드 상의 머리기는 막의 특성 및 작용성에 영향을 미치는 분자의 전하 정보를 함유한다. 가장 보편적인 인지질은 포스파티딜 콜린으로, 이의 머리기는 3차 아민으로 구성된다. 이러한 유형의 지질은 즈비터이온성이며, 이는 그 구조가 중성 pH 값에서 0의 순전하를 가짐을 의미한다. 이는 포스페이트 상에 위치하는 전하(음전하) 및 3차 아민 상에 위치하는 전하(양전하)의 균형을 맞춤에 의하여 일어난다. 다른 핸드 상의 포스파티딜 세린은 그 머리기 상에 카르복시기(음전하) 및 아민을 모두 함유하므로 중성 pH에서 -1의 순전하를 얻는다.

스핑고지질 또한 생체막 내에서 보편적이며, 한 분자의 장사슬 아미노 알콜 스핑고신 또는 그 유도체 하나, 한 분자의 장사슬 지방산 및 극성 머리 알콜로 이루어지며, 이는 종종 포스포디에스테르 결합을 가진다. 상기 스핑고지질은 또한 세 군, 스핑고마이엘린, 당지질 및 강글리오사이드로 나뉘어질 수 있다(도 9). 스핑고마이엘린은 특성 및 구조에 있어서 포스파티딜콜린과 유사성을 가지며, 동물 세포의 원형질막 내에 존재한다. 상기 당지질 및 강글리오사이드 또한 동물 세포 원형질막 내에서 발견되며, 뇌와 같은 신경 조직 내에 많이 존재하고, 그 극성 머리기에 부착되는 당 유닛을 가진다.

그 콜레스테롤이 동물 조직 내에서 가장 보편적인 스테롤은 극성 머리기 및 그 연장된 형태에서 16-탄소 지방산과 대략 동일한 길이의 비극성 탄화수소 몸체를 가진다. 스테롤은 종종 장 내에 계면활성제 또는 스테로이드 호르몬으로 작용하는 담즙산과 같은 특정 생물학적 기능을 가지는 분자에 대한 전구체이다.

많은 다양한 용매를 사용하여 지질을 용해시킬 수 있으나, 이들은 지질과 단백질 및 다당류와 같은 다른 세포 구조체 사이의 결합을 파괴할 수 있어야만 세포 물질 및 조직으로부터 지질을 추출하기에 적합하다. 이상적으로, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 세포막 또는 지질단백질과의 결합으로부터 모든 지질을 배출시키기 위하여 상당히 극성이어야 한다. 상기 추출 용매는 또한 효소적 가수분해를 어느 정도 방지할 수 있다.

지방산 또는 다른 지방족 모이어티의 소수성 탄화수소 사슬 및 현저히 친수성인 포스페이트 또는 당 잔기와 같은 극성 작용기와 같은 지질의 몇몇 구조적 특징들은 유기 용매 내 지질의 용해도를 조절한다. 극성기를 결여한 지질, 예를 들어 트리아실글리세롤 또는 콜레스테롤 에스테르는 헥산, 톨루엔 또는 시클로헥산과 같은 탄화수소 내에 가용성이며, 예를 들어 디에틸 에테르 또는 클로로포름과 같은 보다 극성 용매 내에 가용성이다. 그러나 이들은 메탄올과 같은 극성 용매이 내에 다소 불용성이다. 인지질 및 글리코스핑고리피드와 같은 극성 지질은, 다른 유형의 지질에 의하여 가용화되지 않는다면, 탄화수소 내에 난용성이나, 이들은 메탄올, 에탄올 또는 클로로포름과 같은 보다 극성 용매 내에 쉽게 용해된다. 상기 용매의 높은 유전 상수 및 극성은 이온-쌍극자 상호작용 및 수소 결합을 극복한다.

가장 복잡한 지질은 수 난용성이며 적어도 미셀 용액을 형성하며, 강글리오사이드, 폴리포스포이노시타이드, 리소포스포리피드, 아실카르니틴 및 코엔자임 A 에스테르와 같은 지질은 특히 가용성이다. 순수 용매는 대개 일반적인 목적의 지질 추출제로서 유용하지 않다. 용매 혼합물이 보다 유용하며, 가장 널리 사용되는 혼합물 중 하나는 클로로포름과 메탄올의 2:1 비(v/v) 혼합물이다. 상기 혼합물은 지질을 조직(동물, 식물 및 박테리아)으로부터 다른 단순한 용매 조합 보다 더욱 철저히 추출할 것이다. 일부 다른 연구에서, 디클로로메탄(DCM)-메탄올(2:1, v/v)이 클로로포름-메탄올 혼합물과 마찬가지로 효율적인 것으로 밝혀졌으며, 디클로로메탄의 더 낮은 독성은 이점일 수 있다.

프로판-2-올 및 헥산의 혼합물(3:2,v/v) 또한 동물 조직으로부터 지질의 추출을 위하여 사용되어 왔으며, 이 혼합물은 더 낮은 독성을 가진다. 메탄올-헥산(1:1, v/v)은 잎 조직으로부터 지질의 추출을 위하여 사용되어 왔다. 헥산-에탄올(5:2, v/v)은 유비퀴논의 추출을 위하여 사용되어 왔으며, 계면활성제 소듐 도데실 설페이트가 첨가된 헵탄-에탄올이 동물 조직 내 비타민 E/지질 비율을 결정하기 위하여 추천되어 왔다. 지질 용해도에 대하여 시험되어 온 다른 혼합물들은 톨루엔-에탄올, 벤젠-에탄올, 벤젠-메탄올, 프로판-2-올-벤젠-물(2:2:1, v/v), 물로 포화된 부탄-1-올, 헥산-2-올, 및 부탄-1-올-디이소프로필 에테르(2:3, v/v)이다. 디에틸 에테르 및 클로로포름 단독 또한 지질을 위한 우수한 용매이나, 예를 들어 조직으로부터 지질을 추출하는데에는 좋지 못하다. 이들을 사용하여 식물 조직을 추출할 때, 부탄-1-올이 그러하듯이 상기 용매들은 또한 불행히도 포스포리파아제 D의 활성을 증진시킨다. 프로판-1-올 및 프로판-2-올은 이러한 반응을 강력히 억제하며, 더 낮은 비등점을 가지는 후자가 예비 추출제로서 식물 조직에 사용이 권고되어 왔다.

아세톤은 단순 지질 및 당지질을 용해시킬 수 있으나, 이는 인지질을 쉽게 용해시키지 못하며, 이는 실제로 종종 다른 용매 내에 용액으로부터 인지질을 침전시키는데에 사용된다. 초임계 유체 또한 지질 추출 목적으로 시험되어 왔으며, 그 결과는 이러한 절차가 단순 지질에 대하여 작용할 것임을 나타낸다.

본 발명의 원형질막 소포의 이용 방법

본 발명의 원형질막 소포는 많은 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 원형질막 소포는 막 외부에서 불용성인 막 단백질을 연구하는데에 이용될 수 있다. 이는 또한 막 단백질의 조절인자를 스크리닝하는데에 이용되거나, 또는 공지의 리간드에 결합하는 막 단백질을 동정하기 위한 역 스크리닝에 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 본 발명의 원형질막 소포는 제 시간에, 예를 들어 리간드와 접촉시 또는 예컨대 암성 질환 상태로의 전환시 상이한 지점에서 유사한 세포의 또는 서로에 대하여 세포의 단백질 발현 패턴을 연구하는데에 이용될 수 있다.

예시적 구현예에서, 상기 원형질막 소포는 세포 표면 단백질의 발현 패턴을 연구하는데에 이용된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 원형질막 소포를 원하는 시간에 목적으로 하는 세포로부터 제조한다.

상기 원형질막 소포를 프로테아제, 예를 들어 트립신 또는 키모트립신과 접촉시키고, 결과 생성되는 단백질 단편을 동정한다. 당업계에 공지된 방법 중 임의의 방법을 이용하여 폴리펩타이드 단편을 동정할 수 있다.

효소적 분해를 용액 내에서, 또한 원형질막 소포를 유동세포 내 고정화한 후에 수행할 수 있다. 용액 내 분해를 위하여, 프로테아제를 가공된 원형질막 소포 용액에 첨가하고, 펩타이드를 크기 여과에 의하여 상기 막으로부터 분리할 수 있다.

폴리펩타이드 단편을 질량분석법에 의하여 분석할 수 있다. 예시적 구현예에서, 상기 단편을 LC MS/MS를 이용하여 분석한다. 액체 크로마토그래피는 표본 내에 함유된 개별적 성분을 분리하여 동정할 수 있도록 한다. 분리된 성분들을 그들의 정체를 판단하기 위한 추후 분석을 위하여 질량분석기 내로 공급할 수 있다. 두 질량분석 단계를 가지는 시스템을 LC-MS/MS 시스템이라 한다. 질량분석기는 표본을 인풋으로서 취하고, 상기 표본을 이온화하여 양이온 또는 음이온을 생산한다. 전자분사 이온화의 이용을 포함하는 다수의 상이한 이온화 방법을 이용할 수 있다. 다음, 상기 이온을 제1 단계 분리에서 질량 대 전하 비율에 의하여 분리하며, 이를 통상적으로 MS1라 한다. 상기 이온을 그 이온의 중량에 기초하여 다른 정도로 전환시키는 자석의 이용을 포함하는 다수의 수단에 의하여 상기 질량 분리를 달성할 수 있다. 다음, 상기 분리된 이온은 충돌 세포 내로 이동하며, 거기서 충돌 기체 또는 상기 이온과 상호작용하는 다른 물질과 접촉하게 된다. 상기 반응한 이온은 통상 MS2로 불리우는 제2 단계의 질량 분리를 겪는다.

상기 분리된 이온을 질량 분석 단계(또는 단계들)의 마지막에서 분석한다. 상기 분석은 상기 이온의 시그널의 강도 대 상기 이온의 질량 대 전하 비율을 질량 스펙트럼이라 불리우는 그래프로 도시한다. 상기 질량 스펙트럼의 분석은 검출기에 도달하는 이온의 질량 및 상대적인 수도(relative abundance) 모두를 제공한다. 상기 수도는 시그널 강도로부터 얻는다. 액체 크로마토그래피와 질량분석법의 조합을 이용하여 대사산물과 같은 화학 물질을 동정할 수 있다. 분자가 충돌 기체와 충돌하면, 공유 결합이 종종 파괴되어 하전된 단편 어레이를 형성한다. 상기 질량 분석법은 단편의 질량을 측정하며, 그 다음 이를 분석하여 본래 분자의 구조 및/또는 조성을 결정할 수 있다. 정확한 질량 측정이 가능한 질량분석기, 예를 들어 하이브리드 사중극자 오르토가놀 TOF 장비 또는 FTICR을 이용하면 이러한 특징이 공칭 질량으로부터 현저히 증진되어, 분석 물질 원소 조성 정보를 도출할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 표본 내에서 특정 물질을 분리할 수 있다.

예시적 구현예에서, 정제된 원형질막 소포로부터 지질 성분을 추출하여 본 발명의 원형질막 소포를 원형질막의 지질 조성의 연구에 이용한다.

다른 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 단편을 면역조직화학에 의하여 분석하여 특정 막 단백질의 부재 존재를 평가할 수 있다. 따라서, 다른 구현예에서, 면역분석을 이용하여 펩타이드 단편을 검출 및 분석할 수 있다. 이러한 방법은 (a) 목적으로 하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고; (b) 표본을 상기 항체와 접촉시키고; (c) 상기 표본 내에서 상기 펩타이드에 결합하는 항체의 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함한다.

펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위하여, 정제된 펩타이드 또는 그 핵산 서열을 이용할 수 있다. 펩타이드에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 이들 마커의 추가적인 특성 연구에 의하여 수득할 수 있다. 각각의 마커로부터의 분해 단편의 분자량을 이용하여 다양한 효소에 의하여 생성된 분해 단편의 분자량에 매칭되는 서열에 대하여 SwissProt 데이터베이스와 같은 데이터베이스를 탐색할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 다른 펩타이드의 핵산 및 아미노산 서열을, 그들의 마커가 상기 데이터베이스 내에 공지된 단백질이라면, 동정할 수 있다.

분석

원형질막 소포를 상기 원형질막 소포 내에 함유된 막 단백질과 상호작용하는 화합물의 동정을 위하여 수동, 반자동화, 자동화 및/또는 로봇식 분석에 이용할 수 있다.

원형질막 소포를 약제 스크리닝 분석에 이용할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 원형질막 소포는 막 단백질의 발현을 위한 환경 및 조절 인자의 동정을 위한 연구를 제공한다.

단백질 발현을 평가하기 위한 다른 기법은 웨스턴 블롯을 수반한다. 목적으로 하는 다양한 발현 단백질에 대한 항체가 생성되었으며, 많은 것들이 상업적으로 이용가능하다. 단백질 또는 이로부터 유도되는 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성하기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-22 to 11-46 참조). 원형질막 소포 및 다른 발현 시스템 내에 발현 벡터로부터 단백질 발현을 나타내는데에 이용될 수 있는 표준 웨스턴 블롯 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Winston et al., Unit 10.7 of Chapter 10 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 10-32 to 10-35 참조).

고속 스크리닝 ( HTS )

HTS(High-Throughput Screening)는 자동화된 분석을 이용하여 원하는 활성에 대한 다수의 화합물을 탐색한다. 전형적으로, HTS 분석은 특정 효소 또는 분자에 작용하는 화합물을 스크리닝함으로써 새로운 약물을 발견하는데에 이용된다. 예를 들어, 화합물질이 효소를 불활성화한다면, 그 화합물은 질환을 야기시키는 세포 내에서 과정을 방지하는데에 효과적인 것으로 입증될 것이다. 초고속 방법은 연구가들로 하여금 로봇식 핸들링 시스템 및 자동화된 결과 분석을 이용하여 각각의 표적에 대한 수천 개의 상이한 화학물질들의 시도를 가능케 한다.

본원에 사용되는 "고속 스크리닝" 또는 "HTS"는 로봇식 스크리닝 분석을 이용하는 다수의 화합물(라이브러리); 일반적으로, 수만 내지 수십만 개의 화합물의 빠른 실험실 내 스크리닝을 의미한다. 초고속 스크리닝(uHTS)은 일반적으로 1일 당 100,000 시험보다 큰 속도로 가속화된 고속 스크리닝을 의미한다.

스크리닝 분석은 분석 성분의 적절한 조작의 확인 및 교정을 위한 조절을 포함한다. 모든 반응물을 포함하나 화학물질 라이브러리의 멤버를 포함하지 않는 블랭크 웰이 대개 포함된다. 다른 예로서, 이에 대한 조절 인자를 탐색하는 효소의 공지의 억제제(또는 활성화제)를 하나의 분석 표본과 함께 배양하고, 결과적인 효소 활성 감소(또는 증가)를 본원의 방법에 따라 결정할 수 있다. 조절인자 또한 효소 활성화제 또는 억제제와 결합되어, 그렇지 않으면 공지의 효소 조절 인자의 존재에 의하여 야기되는 효소 활성 또는 억제를 저해할 조절 인자를 발견할 수 있음을 인지할 것이다. 유사하게, 스핑고지질 표적에 대한 리간드 탐색시, 상기 표적에 대한 공지의 리간드가 대조/교정 분석 웰 내에 존재할 수 있다.

본 발명의 원형질막 소포는 원하는 활성, 예를 들어 리간드의 수용체의 결합을 블록킹하는 화합물의 동정을 위하여 후보 화합물들을 스크리닝하기 위한 고속 스크리닝 분석에 용이하게 사용할 수 있다. 따라서, 동정된 화합물들은 전형적인 "리드(lead) 화합물"로 작용하거나, 또는 그 자체가 치료제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 스크리닝 분석을 이용하여 다양한 분자의 라이브러리러부터 원하는 활성을 가지는 하나 이상의 화합물을 동정하는 것을 포함한다. "스크리닝 분석"은 소정의 활성을 가지는 집단 내의 화합물을 동정, 분리 및/또는 그 구조를 결정하도록 고안된 선별 분석이다. "동정"은 원하는 활성을 가지는 화합물을 분리하고, 그 화학적 구조를 결정하고(제한없이, 핵산 및 폴리펩타이드 각각의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함), 부가적으로 또는 대안적으로 스크리닝된 활성을 가지는 화합물을 정제하는 것을 의미한다. 생화학적 및 생물학적 분석은 단백질-단백질 상호작용, 효소 촉매작용, 소분자-단백질 결합, 작용제 및 길항제로부터 세포 기능에 이르는 광범위한 시스템 내에 활성을 시험하도록 고안된다. 이러한 분석은 자동화된, 반자동화된 및 HTF(초고속 스크리닝) 분석을 포함한다.

HTS 방법에서, 바람직하게 많은 상이한 화합물들을 로봇식, 자동 또는 반자동 방법에 의하여 함께 시험하여 원하는 활성에 대하여 다수의 화합물을 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝한다. 본 발명의 통합 시스템을 이용하여 약 6,000 내지 20,000 및 심지어 약 100,000 내지 1,000,000의 상이한 화합물들을 하루에 분석하고 스크리닝하는 것이 가능하다.

고속 경쟁적 억제 분석은 특정 표적 단백질을 억제하는 제제를 동정하도록 고안된다. 특정 막 단백질을 발현 및/또는 디스플레이하는 원형질막 소포를 모든 유형의 경쟁적 억제 분석에 사용할 수 있다.

본 발명의 원형질막 소포를 "기능적 스크리닝 HTS 분석"에 이용한다. 기능적 스크리닝 분석은 특정 표적 단백질의 기능에 대한 정보를 제공하는 분석으로서 정의된다. 기능적 분석은 특정 표적 단백질에 대한 제제를 스크리닝하여 그 단백질에 대한 길항제 또는 작용제로서 작용하는 제제를 동정한다. 기능적 분석은 표적 단백질이 그 천연 기능을 수행할 수 있도록 하는 환경 내에 있을 것을 요한다. 이와 같은 기능은, 이에 제한되지 않으나, GPCR과 G-단백질 커플링, 인산화 또는 단백질 가수분해와 같은 효소 활성, 단백질-단백질 상호작용 및 분자 및 이온 수송을 포함한다.

기능적 분석은 천연 기능을 할 수 있는 단백질에 대한 제제를 스크리닝한다. 기능적 연구에 사용되는 표적 단백질은 측정가능한 기능을 수행하여야 한다. 측정가능한 단백질 기능의 예는 이에 제한되지 않으나, 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 이용하는 GPCR에의 G-단백질 커플링의 측정(Ruiz-Velasco et al., Functional expression and FRET analysis of green fluorescent proteins fused to G-protein subunits in rat synmpathetic neurons, J. Physiol. 537:679-692, 2001; Janetopoulos et al., Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells, Science 291:2408-2411, 2001); 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 이용한 표적 GPCR에의 기능적 리간드 유도 G-단백질 커플링 분석(Menard, L. Bioluminescence Resonance ENergy Transfer(BRET): A powerful platform to study G-protein coupled receptors(GPCR) activity in intact cells, Assay Development, Nov. 28-30, 2001), 형광기판을 이용하는 프로테아제의 효소 활성 측정(Grant, Designing biochemical assays for proteases using fluorogenic substrates, Assay Dvelopment, Nov. 28-30, 2001); 및 전압 민감성 염료를 통한 이온 채널 기능의 결정(Andrews et al, Correlated measurements of free and total intracellular calcium concentration in central nervous system neurons, Microsc Res Tech. 46:370-379, 1999)을 포함한다.

고속 기능적 스크리닝의 비제한적 일 예는 원형질막 소포를 이용하여 GPCRs의 그들 각각의 G-단백질에의 기능적 커플링을 분석한다. 리간드 결합에 따라, 전압 극성화, 이온 결합, 빛 상호작용 및 다른 자극성 이벤트가 GPCRs을 활성화하여 이들의 그들 각각의 G-단백질에 커플링되도록 야기한다. 원형질막 소포에서, GPCR 및 그 각각의 G-단백질이 동시에 발현될 수 있다. GPCR 활성화에 따라, 상기 커플링 이벤트가 원형질막 소포 내에서 일어난다. 따라서, 원형질막 소포 내에 이러한 커플링을 검출함으로써, GPCRs에 결합하는 제제를 스크리닝하여 길항제 및 작용제를 동정할 수 있다. 상기 길항제는 GPCR의 기능 억제를 검출하는 억제 분석을 이용하여 동정된다. 따라서, 상기 제제는 GPCR의 활성화를 억제하는 방식으로 GPCR과 상호작용한다. 상기 작용제는 천연 활성화제의 부재 하에 GPCR을 활성화하는 제제를 스크리닝함으로써 동정된다.

기능적 분석에 이용되는 원형질막 소포의 다른 비제한적인 예는 이온 채널에 대한 작용제/길항제의 스크리닝을 수반한다. 일 예는 다시스트론 에피솜 플라스미드 상에 인코딩되며 또한 발광 가용성 단백질 에쿼린을 인코딩하는 칼슘 채널 SCaMPER이다. 이러한 분석에서, 상기 원형질막 소포는 그 세포질 내에 에쿼린 단백질 및 원형질막 소포 상에 발현되는 SCaMPER 단백질을 함유할 것이다. 따라서, SCaMPER의 그 리간드, SPC 또는 그 유사체에 의한 활성화에 따라, 칼슘이 원형질막 소포 내로 유동할 것이며 발광할 에쿼린이 이에 결합할 것이다. 따라서, 상기 칼슘 채널의 기능적 활성화에 대한 검출 신호가 얻어진다.

원형질막 소포는 또한 표적 단백질의 발현 및 스크리닝 분석에 사용하기 위한 막 단백질의 제조에 이용될 수 있다. 이러한 단백질은 이에 제한되지 않으나, 수용체(예를 들어 GPCRs 수용체, 신경전달물질 수용체, 감각수용기, 생장인자 수용체, 호르몬 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 면역학적 수용체 및 보체 수용체, FC 수용체), 채널(예를 들어, 칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널), 공동(예를 들어, 핵공 단백질, 수 채널), 이온 및 기타 펌프(예를 들어, 칼슘 펌프, 양성자 펌프), 교환기(예를 들어, 나트륨/칼륨 교환기, 나트륨/수소 교환기, 칼륨/수소 교환기), 전자 수송 단백질(예를 들어, 사이토크롬 옥시다아제), 효소 및 카이나아제(예를 들어, 단백질 카이나아제, ATPase, GTPase, 포스포타아제, 프로타아제), 구조적/링커 단백질(예를 들어, 카베올린, 클라트린), 어댑터 단백질(예를 들어,TRAD, TRAP, FAN), 케모탁틱/부착 단백질(예를 들어, ICAMI1, 셀렉틴, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1), 및 키메릭/융합 단백질(예를 들어, 정상적으로 가용성 단백질이 다른 단백질의 막횡단 영역에 부착되어 있는 단백질)을 포함한다. 이와 같은 분석에서, 막 제조를 이용하여 길항제 또는 작용제인 제제를 스크리닝한다.

화학적 라이브러리

조합 화학의 발전에 따라 수백 내지 수천 개의 상이한 화합물의 신속하고 경제적인 합성이 가능케 되었다. 이들 화합물들은 전형적으로 효율적인 스크리닝을 위하여 고안된 소 유기분자의 중간 크기 라이브러리 내에 배열된다. 조합 방법을 이용하여 신규한 억제제 동정에 적합한 편향되지 않은 라이브러리를 생성할 수 있다. 또한, 이미 결정된 생물학적 활성을 가지는 단일 모화합물로부터 유래되는 더 작고 덜 다양한 라이브러리를 생성할 수 있다. 어떠한 경우에도, 중요한 효소의 억제제와 같은 조합 화학에 의하여 생산되는 치료적으로 적절한 생물학적 분자를 특별히 표적하기 위한 효율적인 스크리닝 시스템의 결여는 이들 자원의 최적 이용을 방해한다.

조합 화학적 라이브러리는 시약과 같은 다수의 화학적 "빌딩 블록"을 조합함에 의한, 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의하여 생성된 다양한 화학적 화합물의 컬렉션이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학적 라이브러리는 화학적 빌딩 블록(아미노산) 세트를 다수의 조합으로 및 소정의 화합물 길이(즉, 폴리펩타이드 화합물 내 아미노산의 수)에 대하여 잠재적으로 모든 가능한 방식으로 조합함으로써 형성된다. 수백만 개의 화학적 화합물들을 이와 같은 화학적 빌딩 블록의 조합적 혼합을 통하여 합성할 수 있다.

"라이브러리"는 2 내지 50,000,000 개의 다양한 멤버 화합물들을 포함한다. 바람직하게, 라이브러리는 적어도 48 개의 다양한 화합물, 바람직하게 96 이상의 다양한 화합물, 보다 바람직하게 384 이상의 다양한 화합물, 더 바람직하게 10,000 이상의 다양한 화합물, 바람직하게 100,000 개의 다양한 멤버 및 가장 바람직하게 1,000,000 개의 다양한 멤버 화합물들을 포함한다. "다양한"은 라이브러리 내 50% 이상의 화합물이 그 라이브러리의 다른 멤버와 동일하지 않은 화학적 구조를 가짐을 의미한다. 바람직하게, 라이브러리 내 화합물이 75% 이상, 더 바람직하게 90% 이상 및 가장 바람직하게 약 99% 이상이 그 컬렉션의 다른 멤버와 동일하지 않은 화학적 구조를 가진다.

조합 화학적 라이브러리의 제조는 당업자에게 주지되어 있다. 검토를 위하여, 다음을 참조한다: Thompson et al., Synthesis and application of small molecule libraries, Chem Rev 96:555-600, 1996; Kenan et al., Exploring molecular diversity with combinatorial shape livraries, Trends Biochem Sci 19:57-64, 1994; Janda, Tagged versus untagged libraries: methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries, Proc Natl Acad Sci USA. 91:10779-85, 1994; Lebl et al., One-bead-one-structure combinatorial libraries, Biopolymers 37:177-98, 1995; Eichler et al., Peptide, peptidomimetic, and organic synthetic combinatorial libraries, Med Res Rev. 15:481-96, 1995; Chabala, Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads, Curr Opin Biotechnol. 6:632-9, 1995; Dolle, Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry, Mol Divers. 2:223-36, 1997; Fauchere et al., Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesize soluble libraries, Can J Physiol Pharmacol. 75:683-9, 1997; Eichler et al., Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries, Mol Med Today 1: 174-80, 1995; 및 Kay et al., Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries, Comb Chem Throughput Screen 4:535-43, 2001.

이와 같은 조합 화학적 라이브러리는, 이에 제한되지 않으나, 펩타이드 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제 5,010,175 호, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991) 및 Houghton, et al., Nature, 354:84-88 1991을 참조)를 포함한다. 화학적 다양성 라이브러리를 제조하기 위한 다른 화학적 방법을 또한 이용할 수 있다. 이러한 화학은, 이에 제한되지 않으나, 펩토이드(PCT 공보 제 WO 91/19735 호); 인코딩된 펩타이드(PCT 공보 WO 93/20242); 랜덤 바이오-올리고머(PCT 공보 WO 92/00091); 벤조디아제핀(미국 특허 제 5,288,514 호); 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩타이드와 같은 다이버소머(diversomers)(Hobbs, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 1993); 비닐자리 폴리펩타이드(Hagihara, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 1992); 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 가지는 비펩타이드성 펩티도미메틱(Hirschmann, et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 1992); 소 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성(Chen, et al., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 1994); 올리고카바메이트(Cho et al., Science, 261:1303 1993); 및/또는 펩피딜 포스포네이트(Campbell, et al., J. Org. Chem. 59-658 1994); 핵산 라이브러리(예를 들어, Ausubel, Berger and Sambrook, all supra 참조); 헵타이드 핵산 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제 5,539,083호(1995) 및 PCT/US96/10287 참조); 항체 라이브러리(예를 들어 Vaughn, et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) 및 PCT/US96/10287 참조); 탄수화물 라이브러리(예를 들어 Liang et al., Science, 284:1520-1522 (1996) 및 미국 특허 제 5,593,853 호 참조); 소 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C&E News, January 18, 33 페이지 (1993) 참조); 이소프레노이드(미국 특허 제 5,569,588 호); 티아졸리디논 및 메타티아자논 (미국 특허 제 5,549,974 호); 피롤리돈(미국 특허 제 5,525,735 호 및 제 5,519,134 호); 모르폴리노 화합물(미국 특허 제 5,506,337 호); 벤조디아제핀(미국 특허 제 5,288,514 호) 등을 포함한다.

역 스크리닝

일 측면에서, 본 발명은 소정의 화합물과 상호작용하는 막 단백질 동정을 위하여 각각의 원형질막 소포가 몇몇 개의, 바람직하게 하나의 막 단백질을 인코딩하는 발현 엘리먼트를 포함하는 원형질막 소포 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 비제한적인 예로서, 막 단백질, 융합 단백질 또는 세포질 단백질을 인코딩하는 서열을 "샷건" 클로닝에 의해서 또는 디렉티드 클로닝에 의해서, 예를 들어 cDNA 클론에 대한 스크리닝 또는 선별에 의하여, 또는 단백질 패밀리의 매우 보존된 영역을 인코딩하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 단백질을 인코딩하는 DNA 단편의 PCR 증폭에 의하여 발현 벡터 내로 클로닝한다. 이와 같은 기술의 비제한적인 예에 대해서는, 예를 들어, Krautwurst, D. et al. 1998. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell 95:917-926을 참조한다. 비제한적인 예로서, 수용체를 발현하는 원형질막 소포는 약물일 수 있는 소정의 리간드에 결합한다. 수용체 결합, 효소 활성 및 채널링 이벤트에 대한 다양한 분석이 당업계에 공지되어 있으며, 검출가능한 화합물을 포함할 수 있다; 결합 분석의 경우, 경쟁적 분석을 또한 이용할 수 있다(Masimirembwa, C.M. et al. 2001. In vitro high throughput screening of compounds for favorable metabolic proteins in drug discovery. Comb. Chem. High Throughput Screen. 4:245-264; Mattheakis, L.C., 및 A. Saychenko. 2001. Assay technologies for screening ion channel targets. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4:124-134; Numann, R., 및 P.A. Negulescu. 2001. High-throughput screening strategies for cardiac ion channels. Trends Cardiovasc. Med. 11:54-59; Le Poul, E., et al. 2002. Adaptation of aeuquorin functional assay to high throughput screening. J. Biomol. Screen. 7:57-65; 및 Graham, D.L.et al. 2001. Application of beta-galactosidase enzyme complementation technology as a high throughput screening format for antagonists of the epidermal growth factor receptor. J. Biomol. Screen. 6:401-411).

원형질막 소포가 분석에 의하여 동정되고 분리되면, 막 단백질이 동정된다. 리간드, 길항제 및 작용제를 리드 화합물 및/또는 상기 막 단백질이 중요한 역할을 하는 질환을 치료하기 위한 약물로서 이용할 수 있다. 특히, 소정의 리간드가 약물인 경우, 그 약물이 치료 효과를 갖는 질환을 신규 리간드, 길항제 및 작용제, 또는 이로부터 개발되는 약물 및 전구 약물을 이용하여 치료할 것으로 예상된다.

막 단백질의 구조 결정

단백질의 3차원(3D) 구조를 약물 발견에 이용할 수 있다. 그러나, 막 단백질은 3D 구조 결정에 문제를 제시한다. Muller, Towards 3D structure of G protein-coupled receptors: a miltidisciplinary approach. (Review), Curr Med Chem 2000pp.861-88; Levy et al., Two-dimensional crystallization on lipid layer. A successful approach for membrane proteins, J Struct Biol 1999 127, 44-52. 구상 단백질의 수백 개의 상이한 폴드의 3차원적 구조가 결정되었지만, 20 개 이하의 상이한 막관통 단백질 구조가 결정되었다. 이에 대해서는 많은 이유가 있다. 막으로부터 막 단백질의 추출은 그 천연 구조를 쉽게 파괴시킬 수 있으며, 막 단백질은 결정화하기 매우 어렵다.

일부 막 단백질은 막 내에서 2차원적 결정을 쉽게 형성하며, x-선 결정학 대신 전자회절분광법을 이용하여 구조 결정에 이용할 수 있다.

핵 자기 공명(NMR)은 막 단백질 구조 결정을 위한 대안적 방법이나, 대부분의 막 단백질은 현재 기술로 고해상도 NMR을 위해서는 지나치게 크다. 더욱이, 막 단백질은 NMR을 위한 특정 조건을 요구한다; 예를 들어, 단백질 양성자의 시그널의 막 지질 양성자의 노이즈와의 혼동을 피하기 위하여 중수소화 지질이 사용되어야 한다.

본 발명의 원형질막 소포를 이용하여 막으로부터 제거되면 불용성인 막 단백질의 구조를 결정할 수 있다.

상이한 단백질 발현 프로파일링 분석

본 발명은 또한 단백질 발현 프로파일링 분석에 의하여 상이하게 발현되는 단백질을 동정하는 방법을 제공한다. 단백질 발현 프로파일은 세포 또는 세포주로부터 생산된 원형질막 소포 집단 표본으로부터 단백질의 분해 및 검출을 허용하는 방법에 의하여 생성될 수 있다. 증가된 해상도는 더 많은 수의 개별적 단백질의 분석을 가능케 하여 그 프로파일의 성능 및 유용성을 증가시키므로, 고해상능을 가지는 방법이 일반적으로 바람직하다. 다량 단백질의 존재는 특히 미량 단백질에 대하여 다른 단백질의 더욱 미묘한 변화를 가리므로, 단백질 분리 및 검출 이전에 면역제거와 같이, 표본을 전처리하여 표본으로부터 다량 단백질을 제거할 수 있다. 또한, 표본에 하나 이상의 절차를 가하여 표본의 복잡성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 이용하여 표본을 분획할 수 있다; 각각의 분획은 감소된 복잡성을 가질 것이며, 그 분획 내에 단백질 분석을 촉진시킬 것이다.

몇몇 단백질을 동시에 분해하고 검출하는 세 가지 유용한 방법은 어레이 기반 방법; 질량분석법 기반 방법; 및 2차원 겔 전기영동 기반 방법을 포함한다.

단백질 어레이는 일반적으로 각각 고체 지지체 상에 상이한 위치에 고정화되는 항체 또는 항체 가변 영역과 같은 상당한 수의 상이한 단백질 포획제를 수반한다. 이와 같은 어레이는 예를 들어 Sigma-Aldrich로부터 Panorama 분석 라인의 일부로서 얻을 수 있다. 상기 어레이를 단백질 표본에 노출시키면, 상기 포획제가 특정 단백질 표적을 선택적으로 포획한다. 포획단 단백질을 표지 검출에 의하여 검출한다. 예를 들어, 단백질을 어레이에 노출시키기 전에 표지할 수 있다; 어레이 상의 특정 위치에서 표지의 검출은 상응하는 단백질의 검출을 의미한다. 어레이가 포화되지 않으면, 검출되는 표지의 양은 표본 내 단백질 농도 또는 양과 관련이 있을 것이다. 또한, 포획된 단백질을 샌드위치 면역분석 포맷으로, 그 자체가 표지되거나 그렇지않으면 검출될 수 있는 제2 포획제에 연이어 노출시킬 수 있다.

질량분석법 기반 방법은, 예를 들어, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI), 액체크로마토그래피/질량분석법/질량분석법(LC-MS/MS) 및 표면 증진된 레이저 탈착/이온화(SELDI) 기법을 포함한다. 예를 들어, 전자분사 이온화 및 MALDI를 이용하여 단백질 프로파일을 생성할 수 있다. SELDI는 예를 들어 미국 특허 제 6,225,047 호에 기재된 바와 같이, 질량분석기 칩 상에 보유 표면을 포함한다. 단백질 표본 내 서브세트의 단백질이 상기 표면에 보유되어, 혼합물의 복잡성을 감소시킨다. 연이은 비행시간(time-of flight) 질량분석법에 의하여 보유된 단백질의 "지문"을 생성한다.

2차원 겔 전기영동을 수반하는 방법에서, 표본 내 단백질은 일반적으로 SDS-PAGE 중 등전 집중에 의하여 제1 규모로, 및 분자량에 의하여 제2 규모로 분리한다. 2차원 해상도에 의하여, 수백 또는 수천 개의 단백질이 동시에 분해 및 분석될 수 있다. 상기 단백질을 은 염색과 같이 염색 적용에 의하여, 또는 Cy2, Cy3 또는 Cy5 염색과 같이 단백질 상에 표지의 존재에 의하여 검출한다. 단백질을 동정하기 위하여, 겔 스팟을 잘라내고 겔-내 트립신 분해를 수행할 수 있다. 상기 트립신 분해를 MALDI와 같은 질량분석법에 의하여 분석할 수 있다. 결과 생성되는 펩타이드의 질량 스펙트럼, 즉 펩타이드 질량 지문 또는 PMF를 시퀀스 데이터베이스에 대하여 탐색한다. 상기 PMF를 탐색 프로그램에 의하여 실리코 내 생성된 모든 이론적 트립신 펩타이드의 질량과 비교한다. Prospector, Sequest 및 MasCot (Matrix Science, Ltd., London, UK)와 같은 프로그램을 데이터베이스 탐색에 이용할 수 있다. 예를 들어, MasCot은 어떠한 매치가 유의하거나 그러하지 않음을 나타내는 통계학적 기반 Mowse 스코어를 생산한다. MS/MS를 이용하여 데이터베이스 매치를 얻을 가능성을 증가시킬 수 있다. 펩타이드의 CID-MS/MS (탄뎀 MS의 충돌 유도 해리)를 이용하여 아미노산 서열에 대한 정보를 함유하는 단편 이온의 스펙트럼을 제공할 수 있다. 이러한 정보를 펩타이드 질량 지문에 첨가하여 Mascot가 매치의 통계학적 유의성을 증가시킬 수 있도록 한다. 또한, 어떠한 경우에는, 단일 펩타이드의 원 MS/MS 스펙트럼만을 제출함으로써 단백질을 동정하는 것이 가능하다.

추출된 지질 내 막 단백질의 재구성

생물학적 막의 현장 연구는 막 내 지질 및 단백질의 복잡성으로 인하여 어렵다. 따라서, 많은 경우에 있어서, 천연 막으로부터 막 단백질을 정제하고 인공 막 내로 상기 막 단백질을 재삽입하는 것이 필수적이다. 이러한 과정을 재구성이라 한다. 재구성은 막 단백질이 무손상 기능을 가지도록 하기 위하여 요구되며, 이는 막 단백질이 정확히 폴딩되고 지질 2중 층 내로 삽입될 경우에 일어난다. 막 단백질을 재구성하는 다양한 방법이 있으며, 이러한 과정에 대한 일반적인 프로토콜은 없는 것으로 보이나, 상기 방법은 대개 기계적 수단(막 단백질을 지질과 함께 초음파처리 또는 전단), 동결-해동, 유기 용매 및 계면활성제(detergent) 중 하나 또는 몇몇 개를 포함한다. 계면활성제가 가장 보편적이며, 재구성 목적으로 널리 사용되고, 이 과정을 통하여 막 단백질의 활성을 보존하는 올바른 조건을 발견하는데에 가장 많은 노력이 들어간다. 막 단백질의 배향 및 삽입, 재구성된 프로테오리포솜의 형태학 및 크기 및 그들의 침투성 또한 중요한 인자이다.

재구성은 정상적으로 순수 단백질을 과잉 (인-)지질 및 적절한 계면활성제(들)과 함께 공동 미셀화함을 통하여 진행되어 혼합된 지질-단백질-계면활성제 및 지질-계면활성제 미셀 용액을 형성한다. 다음 상기 계면활성제는 상기 미셀 용액으로부터 제거되어, 막 단백질이 혼입된 폐쇄된 지질 2중 층의 형성을 초래한다. 많은 방법 및 프로토콜이 문헌에 존재하며, 이들은 주로 계면활성제의 제거 기법에 있어서 다르다.

몇몇 논문에서는, 막 단백질이 그 주변 지질 환경에 의하여 매우 영향을 받는 것이 주목되었다. 어떠한 경우에 있어서는, 특정 지질이 몇몇 막 단백질 기능에 필수적인 것으로 입증되었다. 또한, 2중 층 특성이 막 단백질에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 단백질의 소수성 길이와 지질 2중 층의 미스 매치는 막 단백질의 기능에 큰 영향을 미칠 수 있다. 탄성, 및 곡률 에너지 및 측면 압력을 포함하는 2중 층이 또한 막 단백질에 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 방법은 원형질막 지질의 재구성 실험에 추후 사용을 위해 특정 세포 유형으로부터의 정제를 가능케 한다. 본 발명의 이점은 원형질막의 세포 특이적 지질 성분을 유지한다는 사실에 기인한다. 특정 세포주의 원형질막으로부터 나오는 막 단백질의 재구성을 천연 막 내에서와 동일한 지질을 이용하여 수행할 수 있다.

실시예

본 발명은 이하 기재되는 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며; 본 발명은 본원에 제공되는 모든 적용 및 당업자의 기술 범위 내의 모든 동등한 변형물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

실시예 1: 고순도 원형질막 소포( PMVs )의 제조

고순도 원형밀작 소포의 제조는 다음 4 단계로 이루어진다:

1. PMV-형성제를 세포 배양액에 첨가하여 PMVs 형성

2. PMVs를 세포 배양액으로부터 배출

3. 밀도구배 원심분리에 의하여 PMVs의 정제

4. 투석에 의하여 PMVs의 정제

단계 1-2는 약 10 마이크로미터 이하의 직경의 PMVs 크기를 가지는 조 다분산 PMV 분획을 생성한다. 이와 같은 PMVs는 몇몇 구조적 및 기능적 분석에서 매우 큰 유용성을 가질 수 있다. 이와 같은 분석의 예는 이온 채널 기능, G-단백질 기능, 부착 단백질 기능 등을 포함한다.

단계 3 및 4를 부가하면 약 10 마이크로미터 이하의 직경의 PMVs 크기를 가지는 초순수 다분산 PMV 분획이 생성되며, 상기 PMVs는 단백질 발현 스크리닝을 위한 프로테옴 분석 및 표적 동정을 포함하는 몇몇 구조적 및 기능적 분석에 이용될 수 있다.

PMV - 형성제를 부착 세포 배양액에 첨가함에 의한 PMVs 의 형성. PMVs를 고수율로 생산하기 위해서는, 충분한 양의 세포를 배양하여야 한다. 이러한 방법은 규모조정가능하며, 단일 세포로부터 단일 PMVs조차도 수집할 수 있는 마이크로프렙으로부터 PMVs를 수억 개의 세포로부터 수집할 수 있는 대규모고 배치 제조까지 잘 작동한다. 부착성 세포 이외에도, 현탁 세포 또한 이용가능하며, 이는 부착성 세포에 대하여 본원에 기재된 바와 동일한 절차를 따른다.

부착성 세포를 ~80% 컨플루언시로 성장시켜 ~15 X 10⁶ 세포를 수득한다 (도 1A 참조). 다음, 혈청 단백질은 프로테옴 분석에 있어서 오염물질 급원을 제기할 수 있으므로, 상기 세포층을 10 mM HEPES 및 140 mM NaCl을 함유하는 완충 용액을 이용하여 완전히 세척하여 배지를 완전히 제거한다(도 1B).

다음, 2 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 25 mM 포름알데히드(FA)를 함유하는 소포형성 용액을 배양 플라스크에 직접 첨가함으로써 소포형성을 유도한다 (도 1C). FA 및 DTT를 이용하여, ~15분 후 PMVs가 형성되기 시작한다.

배양 ~30 분 후, 상기 플라스크를 서서히 흔들어 기계적으로 교반한다(도 1D). 이에 따라 소포가 세포층으로부터 분리되어 나와 부동성 PMV 현탁액이 형성된다. 상기 플라스크를 흔들어 교반을 수동적으로 수행하거나 또는 기계적 실험실 교반기 또는 대안적으로 초음파처리를 이용하여 수행할 수 있다.

소포형성을 37℃에서 수행하고, 30분 내지 수 시간에 걸쳐 지속시켜, 수율을 최대화한다. 형성되는 소포를 피펫을 이용하여 세포 배양 접시로부터 에펜도르프 튜브로 이동시킨다(도 1F).

단일 NG108-15 세포는 2 시간의 시간 창 내에 세 개의 10㎛-직경 PMVs를 생산할 수 있다. 이는 단일 세포의 PM으로부터 배출되는 ~300㎛² 막 면적에 상응한다. 따라서, ~1 X 10⁶ 부착성 세포를 보유하는 배양 플라스크는 10㎛ 평균 직경의 3백만 PMVs를 생산할 것이며, 이는 314 mm² 막 면적에 상응한다.

또한, 하나의 세포-부착 PMV의 성장 시간을 실온에서 현미경 관찰하여 막 배출 속도를 측정하였다. 3 PMVs 생산을 가정하면, 30 분 내에 직경 5㎛ 확대(5㎛ -> 10㎛)는 세포당 ~8㎛²/분의 막 배출 속도에 상응한다. 비교로, 내포작용(endocytosis) 속도는 세포당 ~5㎛²/분의 범위 내이다. 첫번째 PMV 생산물(~12시간) 제거 후 12-24 시간의 부가적인 배양 라운드는 소포형성 용액을 사용하여 여전히 다량의 PMVs를 생산하므로, 세포는 더 긴 배양 기간에 걸쳐 훨씬 더 많은 PMVs를 배출할 수 있을 것으로 추측할 수 있다. 그러나, 첫번째 배양 라운드 후에 60 시간 후 수확되는 세번째 PMVs 생산물은 현저히 더 작은 직경을 가지며, 이는 유용한 막 저장량의 고갈을 나타낸다.

상기 단계 종결 후, 조 다분산 PMV 분획이 약 10 마이크로미터 이하의 직경의 PMVs 크기로 얻어진다 (도 1F). 이러한 PMVs는 몇몇 구조적 및 기능적 분석에서 매우 유용할 것이다. 특히, 세포 크기 대상이 이용되는 분석은 고속 분석 및 하이컨텐트 분석을 포함한다.

초순수 PMV 분획을 필요로 하는 적용을 위하여, 조 PMV-함유 용액은 예를 들어 프로테옴 분석을 오염시킬 수 있는 다양한 물질을 함유하므로 이는 정제되어야 한다. 먼저, PMVs를 탈착 세포 및 세포 찌꺼기와 같은 다른 막 입자로부터 분리하여야 한다. PMVs는 세포질로 충진되어 있고 세포와 유사한 크기를 가지므로, 큰 분획은 세포성 물질과 함께 원심분리 동안 펠릿화하여 효율적인 분리를 방해할 것이다. 이를 방지하기 위하여, 세포에 대한 PMVs 밀도 차이를 이용한다. 이를 위하여, PMV 용액(도 2A)을 원심분리 튜브 내로 이동하고 그 밑에 고밀도 수크로오스 상을 놓는다(도 2B). 이는 2M 수크로오스를 상기 PMV 용액 아래 조심스럽게 첨가함으로써 이루어진다. 다음, 원심분리를 500 x g로 수평로터 내에서 15분 동안 수행한다. PMVs는 상기 완충/수크로오스 상 경계에 축적되나 이를 가로지르지 않는 반면, 세포는 상기 튜브 바닥에서 펠릿화하여 세포 및 PMVs의 거의 완전한 분리를 보증한다(도 2C).

세포를 또한 여과법, 예를 들어, 수 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 피터를 이용하여 PMV 용액으로부터 제거할 수 있다.

추가적인 오염 물질은 소포형성 과정 중에 세포로부터 및 붕괴된 PMVs로부터 배출될 수 있는 가용성 단백질이다. 또한, 소포형성제 FA는 그 단백질 가교 활성으로 인하여 다운스트림 프로테아제 분해 효율성을 저해할 수 있다. 이는 위와 같은 이유로 기능적 및 구조적 분석을 복잡하게 한다. 따라서, 상기 표본을 흡입시키고(도 2D), 투석 타이빙(tybing)으로 이동시키고(도 2E), 하이 컷오프 투석 튜브(1 MDa)를 이용하여 투석시킨다. 투석을 10 mM HEPES 및 140 mM NaCl을 함유하는 완충액에 대하여 8-12 시간 동안 수행한다. 투석 종결 후, 상기 소포를 에펜도르프 튜브로 이동시킨다(도 2F).

상기한 방법은 약 10 마이크로미터 이하의 PMVs 직경 크기를 가지는 상당히 다분산성인 PMV 분획을 생산하며, 상기 PMVs는 몇몇 구조적 및 기능적 분석, 특히 단백질 발현 스크리닝을 위한 프로테옴 분석, 표적 동정 및 후술하는 바와 같은 많은 분석에 이용될 수 있다.

초순수 PMV 분획을 적용에 따라 다양한 방식으로 추가적으로 가공할 수 있다. 따라서, 당 잔기, 막 단백질 및 닥 자체 등의 변형과 같이 PMVs의 화학적 조성을 각각의 경우에 대하여 조정할 수 있다. 콜로이드 크기는 중요한 파라미터일 수 있으며, 막 단백질의 특정 화학적 변형을 가지는 단분산 분획이 종종 바람직하다. 이하에서는, 프로테옴 분석을 수행하기 위한 초순수 PMV 분획의 온-칩 및 용액-내 가공 단계를 기재한다. 이러한 가공은 5 단계로 이루어지며, 이 중 몇몇 단계는 특정 적용에 따라 선택적이다.

1. 막 단백질의 알킬화 및 환원

2. 알칼리 세척하여 비-공유결합성 단백질-단백질 상호작용 방해

3. 초음파처리하여 소포내 오염물질 배출 및 작은 소포 형성

4. 초음파처리하여 PMV 분획 세정

5. 헹굼 및 중탄산암모늄 완충액 내 분산

상기 단계들을 이하 아라비아 숫자로 언급한다.

1. 막 단백질의 알킬화 및 환원. 분해에 유용한 더 많은 절단 부위를 형성하고 단백질 응집을 방지할 목적으로, 다분산 PMVs의 투석된 표본 내 표면-노출 막 단백질을(도 3A) 10 mM DTT로 환원시키고 50 mM 요오도아세트아미드로 알킬화하여 다이설파이드 결합을 분해한다 (도 3B).

2. 알칼리 세척하여 비-공유결합성 단백질-단백질 상호작용 방해. 두번째로, 높은 pH 세척 단계(pH 11, Na₂CO₃)는 비공유결합성 단백질-단백질 상호작용을 방해하여 세포질 단백질을 막으로부터 해리시킨다 (도 3C).

3. 단계 2를 초음파처리와 결합하여 소포내 오염물질을 배출시키고 작은 소포를 형성한다. 이 단계는 또한 PMVs 분열 및 더 작은 소포로서 재밀봉을 야기하여 결과적으로 PMV 용액 내로 세포질을 배출시키는 연장된 초음파처리를 포함한다.

4. 초음파처리하여 PMV 분획 세정. 부가적인 오염물질 급원을 제거하기 위하여, 상기 PMV 막을 100,000 x g 에서 초원심분리하여 펠릿화하고 상등액을 제거한다 (도 3D).

5. 헹굼 및 중탄산암모늄 완충액 내 분산 (도 3E-F). 최종적으로, 상기 막 펠릿을 헹구고 20 mM 중탄산암모늄 완충액 내 초음파처리에 의하여 분산시키면 분해 준비가 된다(도 3H).

상기 PVM 분획을 상기한 바와 같은 단계 1~5에 따라 가공 후, 작은 크기의 PMVs의 초순수 단분산 분획을 얻었다. 이러한 단분산 PMVs의 초순수 분획을 구조적 및 기능적 분석을 포함하는 많은 적용에 이용할 수 있다.

이하에서는, LC-MS/MS에 의하여 막 프로테옴 분석을 수행할 목적으로, 이러한 분획이 효소에 의한 단백 분해를 위하여 어떻게 이용되는지 기재한다. 두 개의 상이한 분해 프로토콜을 이용한다. 한가지는 용액 내에서 수행되고, 다른 하나는 후술하는 바와 같이 유동 세포 내에서 고정화된 PMVs를 이용하여 수행된다.

1. PMVs 내 막 단백질의 용액-내 분해

2. 고정화된 PMVs 상에 막 단백질의 분해

분해를 용액-내에서 및 유동 세포 내 PMV-고정화 후에 수행할 수 있다. 용액-내 분해를 위하여, 트립신을 가공된 PMV 용액에 첨가하고, 펩타이드를 로우 컷오프 여과에 의하여 막으로부터 분리한다.

유동세포의 작동 원리는 단순한 완충액/시약 교환 및 표본 핸들링을 허용하는 PMVs의 고체상 고정화에 근거한다(도 4A-D). 상기 PMV 용액을 막뿐아니라 단백질 또한 표면에 부착되는 유동 세포 내로 주입한다. 트립신 용액의 주입에 의하여 고정화된 PMVs 표면 상에 노출되는 단백질 도메인의 분해가 개시된다 (도 4A-D). 일부 가용성 단백질 오염물질이 고정화되고 이들 중 많은 것들이 반복되는 세척 사이클 동안 막 단백질 분획의 희생없이 씻겨지므로, 상기 유동세포는 또한 세정된 펩타이드 분획을 제공하는 정제 단계를 제공한다. 최종적으로, 상기 펩타이드를 용출시키고 LC-MS/MS에 의하여 분석한다.

실시예 2: NG -108 세포로부터 원형질막 소포의 분리 및 정제 및 연이은 LC-MS/MS 프로테옴 분석

원형질막 소포의 분리 및 정제 . NG108-15 세포를 DMEM (4,5 g/L 글루코오스, 2mM L-글루타민)과 10% FCS를 이용하여 컨플루언스하게 성장시켰다. 소포형성을 이전에 기재된 바와 같이²⁰ ^, ²⁹ 일부 변경하여 수행하였다. 간략히, 컨플루언트 세포층을 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7.4로 2회 세척하였다. 세포를 2-4 mL 소포형성 완충액(10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM DTT, 및 25 mM 포름알데히드, pH 7.4)를 이용하여 배양하였으며, 배양 시간은 37℃에서 가볍게 흔들면서(60-80 사이클/분) 8-16 시간 사이에서 선택되었다. 상등액을 상기 플라스크로부터 수집하고 15 mL 원뿔형 튜브 내에 풀링하였다. 표면으로부터 탈착된 세포를 제거하기 위하여, 상기 용액 아래에 2mL 2 M 수크로오스를 놓고 수평 로터를 이용하여 4℃에서 500 x g로 15 분간 원심분리하였다. 상등액을 수집하였더니, 다수의 큰 블렙이 수크로오스 상 가까이 용액 내에 발견됨이 주목되었다. 다음, PMVs를 투석하였으며, Spectrapor Biotech 1000 kDa MWCO CE 막(Spectrum Labs, Breda, NL)이 잔류 소포형성 완충 성분 및 저분자량 단백질을 분석 전에 제거하기 위한 가장 효율적인 투석 물질인 것으로 입증되었다. RC(재생 셀룰로오스)막을 이용하는 투석 후 PMVs의 회수는 저조하였으나, CE(셀룰로오스 에스테르)막을 이용한 PMV 수율은 안정적이었다. PMVs가 RC막에 부착하여 수율을 현저히 감소시키는 것으로 추측된다. 투석을 대개 2L의 10 mM Hepes 및 140 mM NaCl, pH 7.4에 대하여 4℃에서 8-12 시간 동안 수행하였다.

PMVs 의 다운스트림 가공 및 단백분해

정제된 PMV 용액을 최적의 다운스트림 분석을 위하여 가공하였다. DTT(10 mM 최종 농도, 56℃, 1 시간)를 이용하여 환원을 수행하였다. 연이은 알킬화를 요오도아세트아미드(50 mM 최종 농도, RT, 1시간)를 이용하여 수행하였다. 상기 PMV 용액에, Na₂CO₃를 최종 농도 100 mM(pH 11)로 첨가한 후, ~30 분 동안 얼음 상에서 욕-초음파처리하였다. 다음, 막을 원심분리(100,000 x g, 60 분)에 의하여 수집하였다. 상등액을 제거하고 조심스럽게 헹군 다음, 펠릿을 재현탁시키고 20 mM 중탄산암모늄, pH 8 내에 초음파처리하여 분산시켰다. 다음, 단백질 함량 분석을 위하여 다음 두 가지 방법 중 하나를 이용하였다: 1) 상기 PMV 현탁액을 트립신을 이용하여(0.005 mg/mL, 37℃, 16 시간) 용액-내 분해시킨 다음, 여과하였다(Anotop, 20 nm 필터). 여과된 펩타이드 용액을 LC-MS/MS에 의하여 후술하는 바와 같이 분석하였다; 2) 상기 PMV 현탁액을 가공하고 LPI^TM FlowCell (Nanoxis AB Goteborg, Sweden) 내로 주입하였으며, 여기서 소포를 고정화하였다. 상기 유동세포를 300 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8로 헹군 다음 20 mM 중탄산암모늄, pH 8로 헹구어 고정화된 막 소포들을 세척하였다. 상기 표본을 37℃에서 2 시간 동안 트립신과 함께 배양함으로써 (20 mM 중탄산암모늄 내 0.005 mg/mL, pH 8) 상기 고정화된 소포 내 막 단백질을 분해하였다. 결과 형성되는 펩타이드 용액을 20 mM 중탄산암모늄, pH 8로 용출시키고, LC-MS/MS에 의하여 분석하였다.

LC - MS / MS 및 생물정보학

펩타이드를 Goteborg University, Proteomics Core Facility에서 LC-MS/MS에 의하여 분석하였다. 분석 전에, 표본을 진공 원심분리하여 건조시키고, 물 내 20 μL 0.1% 포름산 내에서 재구성하였다. 상기 표본을 13,000 x g에서 15 분 동안 원심분리하고, 17μL를 최종적으로 LC-MS/MS 시스템의 오토샘플러로 이동하였다. 액체 크로마토그래피를 위하여, Agilent 1100 바이너리 펌프를 이용하였으며, 트립신 펩타이드를 3 ㎛ ReproSil-Pur C18-AQ 입자(Dr. Maisch, GmbH, Ammerbuch, Germany)로 내부 충진된 200 ·0.05 mm i.d. 융합 실리카 컬럼 상에서 분리하였다. 표본(2 μL)을 주입하고 펩타이드를 3 ㎛ C18-결합 입자로 충진된 예비컬럼 (45·0.1 mm i.d.) 상에서 먼저 포획하였다. 0.2% 포름산 내 10-50% 아세토니트릴로 이루어지는 40 분 구배를 펩타이드 분리에 이용하였으며, 대략 100 mL/분으로 분할하여 컬럼을 통한 흐름을 감소시켰다. 내부 변형된 나노스프레이 급원을 구비하는 7-T LTQ-FT 질량분석기 (Hybrid Linear Trap Quadrupole-Fourier Transform) (Thermo Electron) 내에서 질량 분석을 수행하였다. 상기 장비를 데이터 의존 방식으로 MS와 MS/MS 획득 사이에 자동적으로 스위칭하도록 작동시켰다. MS 스펙트럼을 FT-ICR에서 얻었으며, MS/MS 스펙트럼을 LTQ-트랩에서 얻었다. 각각의 FT-ICR 스캔에 대하여, 여섯 개의 가장 강렬한 이중 또는 삼중 양성자화된 이온을 충돌 유도 해리(CID)에 의하여 순차적으로 선형 트랩 내에 단편화하였다.이미 단편화된 표적 이온은 6 초 동안 MS/MS 분석에서 제외하였다. 모든 탠덤 질량 스펙트럼을 SwissProt 데이터베이스의 설치류 서브세트에 대하여 MASCOT (Matrix Science)에 의하여 탐색하였다. 사용된 탐색 파라미터는 다음과 같았다: 전구체 이온 질량에 대한 5 ppm 질량 tolerance 및 생성물 이온 질량에 대한 0.5 Da; 트립신을 이용한 분해; 최대 하나의 미싱 트립신 절단; 메티오닌의 산화 및 시스테인의 카르바미도메틸화를 포함하는 가변적 변형. 0.05 미만의 Mascot 예측값을 가지는 펩타이드만을 고려하였다. 단백질 동정 기준은 적어도 2 개의 고유한 동정된 펩타이드 검출을 포함하나, 펩타이드가 재현가능하게 검출된다면 단일 펩타이드 동정이 허용되었다. 단백질 동정 사이에 공유되는 펩타이드는 포함되지 않았다. 세포내 위치를 UniProt 데이터베이스로부터 얻은 정보에 근거하여 ChromatinDB (http://www.chromdb.org/), 세포내 위치 예측 프로그램 Cello (http://cello.life.nctu.edu.tw/) 및 ProteomeAnalyst (http://pa.cs.ualberta.ca:8080/pa/), 및 LC-MS/MS에 의한 단백질의 프로테옴 및 세포내 분석 데이터를 제공하는 문헌으로부터 수집된 정보의 보조로 배치하였다. 막횡단 도메인을 통하여 이중층에 고정되는 단백질 또는 지질 변형을 Uniprot annotation에 근거하여 동정하였다.

마이크로좀 막 제조

NG108-15 세포를 PBS로 세척하고, 1mM NaHCO₃ 내에서 잠시 팽창시키고, 20 스트로크로 타이트-피팅 Dounce 균질화기 내에서 기계적으로 분해하였다. 세포핵 및 세포 찌꺼기를 원심분리에 의하여 제거하였다(400 x g, 5분). 상기 마이크로솜 막 분획을 함유하는 상등액을 Na₂CO₃로 최종 농도 100mM (pH 11)로 보충하였다. 막을 원심분리(100,000 x g, 60분)에 의하여 펠릿화하였다. 상등액 제거 후, 막 펠릿을 재현탁하고 팁 초음파분쇄기(VibraCell Model 1501, Sonices & Materials Inc., USA)를 이용하여 300 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8 내에 분산시켰다. 막 소포 표본을 마이크로솜 막 제조의 분석에 이용된 것과 동일한 절차를 따라 LPI^TM FlowCell 내로 주입하였다.

PMVs 내 동정된 막 단백질

PMV 막의 세포내 기원을 결정하기 위하여, 그 안에 발견되는 막 단백질의 세포내 위치를 조사하였다. 다섯 개의 독립적인 PMV 표본을 분석한 결과, 총 274 단백질을 동정하였다. 막 회합 및 세포내 위치를 설명하기 위하여 사용한 급원에 따라, 43 PMV 단백질은 적어도 하나의 α-나선 도메인 또는 지질 앵커에 의하여 막에 고정되며(표 1), 44 단백질은 다른 상호작용에 의하여 막과 회합된다. 고정된 막 단백질 중 40 개가 PM에 위치하는 것으로 발견되었으며(90%), 이 중 32 단백질(74%)이 PM에 고유하였다. 나머지 191 단백질에 대해서는, 막 회합을 동정할 수 없었으며, 이들은 내부 PMVs로부터 유래되는 가용성 단백질인 것으로 추정한다.

비교를 위하여, NG108-15 세포주의 마이크로좀 제조를 수행하였다. 이는 세포용해 및 세포핵과 가용성 단백질 제거에 의하여 세포막을 분리하기 위한 표준 방법이다. 두 개의 마이크로좀 제제를 분석한 결과, 총 308 단백질을 동정하였다. 79 단백질은 적어도 하나의 α-나선 도메인 또는 지질 앵커에 의하여 막에 고정되며, 57 단백질은 다른 상호작용에 의하여 막과 회합된다. 고정된 막 단백질 중 35 개는 PM에 위치하는 것으로 밝혀졌으며(44%), 이 중 단지 17 단백질만이(20%) PM에 고유하다(도 5). 마이크로좀 제제와 비교하여, PMV 막 분획의 PM 단백질 함량이 훨씬 높다(90%).

PMVs 내 동정된 막 단백질 중에, GTPase 및 G-단백질이 주로 발견된다. 아미노산 수송체, 이온 수송체 및 세포 부착 및 성장에 책임있는 단백질 또한 나타낸다(도 6). 추정되는 원형질막-세포골격 가교 단백질 또한 동정되었음을 주목할 만하며, 이는 소포형성 과정이 이들 단백질의 세포골격으로부터 해리를 야기할 수 있음을 나타낸다. 동정된 막 단백질의 상대적인 세포내 분포에 대한 세부사항에 대해서는 도 7을 참조하며, 이는 또한 마이크로좀 및 PMV 막 분획을 비교한다. 본 PMV 분석에서, 191 가용성 단백질을 또한 동정할 수 있었으며, 이들 중 많은 것이 PMV 내부로부터 유래되는 리보좀 세포질 단백질이다. 아마도, 이들은 PMV 표본의 투석 후 가공 단계 중에 배출된다. 첫번째 초음파처리 단계는 마이크로미터 크기의 PMVs가 분열되고 재밀봉되어 내부 세포질을 배출시킴을 야기한다. 리보솜이 PMV 용액 내에 풍부한 것으로 보이며, 이들은 큰 크기로 인하여 투석에 의하여 제거될 수 없으며 가공된 PMV 막과 함께 펠릿화할 것이다. 또한, 막 펠릿이 분해 직전에 부가적인 초음파처리 단계를 거치므로, 부가적인 세포질 단백질의 배출이 일어날 수 있으며, 이는 수득되는 결과물 내에 가용성 단백질 수를 증가시킬 것이다. 리보솜 단백질의 제거를 위한 원심분리 단계의 조정 또는 마지막 초음파처리 단계에 대한 대안의 발견과 같은 추가적인 최적화가 이러한 오염물질 급원을 최소로 감소시킬 수 있을 것이다.

실시예 3: 지질 성분의 추출

CHO-K1 세포를 T175 플라스크 내에서 95% 컨플루언시로 배양하였다. 배지를 플라스크로부터 제거하고, 세포를 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, pH 7.4로 수 회 세척하였다. 원형질막 소포형성을 유도하기 위하여, 25 mM 포름알데히드, 2 mM DTT, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, pH 7.4의 용액 6 mL를 각각의 플라스크에 첨가하였다. 소포형성을 37℃에서 2 시간 동안 세포 플라스크를 가볍게 흔들며 행하였다. 소포형성 후, 원형질막 소포를 함유하는 용액을 플라스크로부터 수집하고 풀링하였다. 상기 용액을 40 ㎛ 기공 필터를 통과시켜 세포 응집체를 제거하고, 5 ㎛ 필터를 통과시켜 단일 세포를 제거하였다. 다음, 상기 용액을 -20℃에서 동결시켰다. 상이한 세포 배치로부터의 블렙 용액을 추출을 위하여 더 큰 배치 내로 풀링하였다. 전체 블렙 용액 부피를 측정하고 이를 이용하여 추출을 위한 유기 용매 부피를 계산하였다. 첫번째 단계는 NH₄Ac (아세트산 암모늄)을 최종 농도 10 mM로 첨가하는 것이었다. 변경된 Bligh-Dyer 추출 프로토콜을 이용하였으며, 용매의 비율을 2:1:0,8 (MeOH:DCM:NH₄Ac (10 mM))로 설정하였다. 다음, 메탄올(MeOH) 및 디클로로메탄(DCM)을 상기 블렙 용액에 첨가하였다. 상 분리가 보이지 않았으며, 상기 용액을 13 mm 프로브 팁을 구비한 Sonics & Materials Inc의 Vibra Cell(모델 501)을 이용하여 팁 초음파처리하였다. 초음파처리를 7 초 펄스 및 표본 가열을 감소시키기 위한 그 사이의 7 초 레스트로 설정된 30% 진폭으로 2 분 동안 수행하였다. 40 ml DCM 및 10 ml NH₄AC (120 mM)을 첨가하여 상 분리를 유도하고, 상기 DCM 상을 수집하였다. 다시, 10 ml의 NH₄Ac (120 mM)을 첨가하고 DCM 상을 수집하였다. 50 ml의 DCM을 MeOH/NH₄Ac 상에 첨가하고 상기한 바와 같이 팁 초음파처리하였다. 팁 초음파처리 후, 10 ml의 NH₄Ac(120 mM) 및 50 ml DCM을 용액에 첨가하였다. 흔들어 상 분리시킨 후, DCM 상을 수집하였다. 50 ml DCM, 50 ml MeOH 및 10 ml NH₄Ac(120 mM)를 잔류 MeOH/NH₄Ac 상에 첨가하였다. 흔든 후, 상기 DCM 상을 수집하였다. 최종적으로, 10 ml NH4Ac (120 mM)를 잔류 MeOH/NH₄Ac 상에 첨가하고, DCM을 수집하였다. 풀링된 DCM 상을 -20℃에서 밤새 저장한 후, DCM 상의 회전증발 전에 MeOH/NH₄Ac 상이 DCM 상으로부터 분리될 수 있었다. 상기 DCM 상을 회전증발시키고, 건조된 잔사를 측량하였다. 대략 8천만 세포로부터 생산된 블렙이 추출후 1 mg의 건조 지질을 제공하는 것으로 추정되었다. 나아가, 건조된 지질 잔사를 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 오염물질에 대하여 검사하였다. 대략 1천만으로부터 나오는 블렙으로부터의 지질 잔사를 2x SDS-PAGE 표본 완충액(4% SDS) 내에 먼저 재구성하였다. 상기 표본을 2 mm 팁을 구비한 Sonics & Materials Inc의 Vibra Cell(모델 501)을 이용하여 팁 초음파처리하였다(30 초 초음파처리 시간, 2 초 펄스 및 그 사이 2 초 레스트 시간, 5% 진폭 설정). 다음, 상기 표본을 수욕(≤ 100℃) 내에서 가열한 후, 5 분간 소용돌이치게 하였다. 다음, 상기 표본을 표준 10% 아크릴아미드 겔 상에서 1 시간 동안 가동시키기 전에 재현탁된 지질을 MQ로 희석하였다. 결과는 지질 추출물이 단백질 오염물질을 함유하지 않음을 나타낸다.

논의

본 발명의 방법은 세포가 그 표면으로부터 마이크로미터 크기 소포 형태로 PM을 발산하는 능력을 이용한다. 그 주요 이점은 PM 함량에 있어서 막 제제의 고순도 및 용이한 핸들링 절차이다. PMVs는 소세포기관 또는 세포골격 구조를 함유하지 않으나, 세포질 성분으로 충진되어 있다. PMVs가 PM으로부터만 유래한다는 사실로 인하여, 이는 특히 프로테옴 과학에 있어서 광범위한 적용을 위한 우수한 플랫폼을 제공한다. 미리 세포 배양액에 단백질의 트랜스펙션, 재조합 또는 과잉발현, 형광물질 표지, 유전자 사일런싱 등과 같은 분자생물학 기법을 적용함으로써 PMVs의 막 및 내부 단백질 조성을 조절할 수 있다. 이는 PM의 비교 프로테옴 연구를 위하여 유리할 것이며, 그 역학적 행동에 대한 통찰을 제공할 것이다. 예를 들어, PM 단백질의 시공적 행동 및 내막계를 이용한 막의 역학적 교환은 접근가능한 중요한 이슈이다. 본 발명에 제시된 PM 프로테옴을 분석하는 방법은, 예를 들어 상대적으로 높은 ER/Golgi 단백질 분획이 후의 PMV 형성에서 발견될 것이므로, 상이한 PMV 형성을 분석하고 비교함으로써 연장된 배양 시간(>24 시간) 후에 PMV 형성을 위하여 내부 막 저장량이 이용되는지에 대한 대답을 도울 것이다. HEK293 및 CHO-K1과 같은 다른 포유동물 세포주 또한 소포형성 용액에 노출되면 PMVs를 다량으로 생산할 수 있을 것이므로(데이터 도시하지 않음), 상기 정제 프로토콜을 광범위한 세포주²¹ ^,22에 적용할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 방법은 상이한 세포주의 PM 프로테옴을 분석 및 비교하고, 목적으로 하는 특정 세포주의 다양한 단백질 발현 프로파일을 비교하기 위한 유망한 기법으로 된다.

본 발명에 제시된 기법은 막 단백질 함량에 있어서 매우 고순도의 PMs를 얻는 방법이며, 분자생물학 기법과 결합되어 원형질막 프로테옴의 역학적 특성을 연구하기 위한 강력한 수단을 제공하므로, 포유동물 PMs의 프로테옴 분석을 위한 강력한 도구로 생각된다. 또한, 막 및 세포질 성분이 각각의 단일 PMV 내에 통합적이므로, 이들은 다용도의 단순한 세포 모델을 구성하여 더욱 복잡한 세포 과정의 연구를 가능케 한다. 예를 들어, PMV 내부의 프로테옴 분석은 예를 들어 세포질 단백질과 커플링되는 막 단백질 활성의 조사를 위하여 매우 유용할 것이다.

참조 문헌 통합

본원 명세서를 통하여 인용되는 모든 문헌, 특허, 계류중인 특허 출원 및 특허 공보의 내용은 본원에 참조로 명확히 통합된다.

균등물

당업자는 통상적인 실험만을 이용하여 본원 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현에에 대한 많은 균등물들을 인지하거나 식별해낼 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물은 이하의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

SP Acc#	유전자	설명	#Peps	Mem	위치
O35566	Cd151	CD151 항원	1	TM,LA	PM
O35874	Slca4	중성 아미노산 수송체 A	3	TM	PM
O88507	Cntfr	섬모 신경친화성 인자 수용체 알파 전구체	1	LA	PM
P06837	Gap43	뉴로모듈린	8	LA	PM
P09055	ltgb1	인테그린 베타-1 전구체	3	TM	PM
P09242	Alpl	알칼리 포스포타아제, 조직-비특이적 동질효소 전구체	3	LA	PM
P10852	Slc3a2	4F2 세포-표면 항원 중쇄	21	TM	PM
P11505	Atp2b1	원형질막 칼슘-수송 ATPase 1	8	TM	PM
P11627	L1cam	신경 세포 부착 분자 L1 전구체	2	TM	PM
P13596	Ncam1	신경 세포 부착 분자 1, 140 kDa 이소폼 전구체	7	TM	PM,CSk
P14094	Atp1b1	나트륨/칼륨-수송 ATPase 서브유닛 베타-1	2	TM	PM
P18572	Bsg	바시진 전구체	5	TM	PM
P21279	Gnaq	구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(q) 서브유닛 알파	4	LA	PM
P21995	Emb	엠비진 전구체	4	TM	PM
P26645	Marcks	미리스토일화 알라닌-풍부 C-카이나아제 기질	4	LA	PM,CSk,CSol
P27601	Gna3	구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 알파-13 서브유닛	2	LA	PM
P28565	Nap1l1	뉴클레오솜 어셈블리 단백질 1-유사 1	4	LA	N,CSol
P28667	Marck니1	MARCKS-관련 단백질	2	LA	PM
P32037	Slc2a3	용제 캐리어 패밀리 2, 촉진된 글루코스 수송체 멤버 3	3	TM	PM
P35279	Rab6a	Ras-관련 단백질 Rab-6A	1	LA	ER,G,ES
P35762	Cd81	CD81 항원	1	TM	PM
P38402	GNA2	구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(i), 알파-2 서브유닛	3	LA	PM
P40240	Cd9	CD9 항원	2	TM,LA	PM
P51150	Rab7a	Ras-관련 단백질 Rab-7a	3	LA	ER,G,ES
P51912	Slca5	중성 아미노산 수송체 B(0)	7	TM	PM
P53986	Slc6a1	모노카르복실레이트 수송체 1	6	TM	PM
P60766	Cdc42	세포 분열 조절 단백질 42 상동 전구체	4	LA	PM,N
P61027	Rab10	Ras-관련 단백질 Rab-10	1	LA	PM,ER,G
P62492	Rab11a	Ras-관련 단백질 Rab-11A	3	LA	PM,ES
P62821	Rab1A	Ras-관련 단백질 Rap-1A	8	LA	PM,ER,G
P62835	Rap1a	Ras-관련 단백질 Rap-1A 전구체	1	LA	PM
P84078	Arf1	ADP-리보실화 인자 1	2	LA	PM,ER,G
P97370	Atp1b3	나트륨/칼륨-수송 ATPase 서브유닛 베타-3	1	TM	PM
Q06806	Tie1	티로신-단백질 카이나아제 수용체 Tie-1 전구체	1	TM	PM
Q61735	Cd47	백혈구 표면 항원 CD47 전구체	1	TM	PM
Q80527	Gng5	구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(I)/G(S)/G(O) 서브유닛 감마-5 전구체	1	LA	PM
Q8R4A8	GNAS	구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(S) 서브유닛 알파	7	LA	PM
Q8VDN2	Atp1a1	나트륨/칼륨-수송 ATPase 서브유닛 알파-1 전구체	24	TM	PM
Q91XV3	Basp1	뇌 산성 가용성 단백질 1	8	LA	PM
Q99JI6	Rap1b	Ras-관련 단백질 Rap-1b 전구체	1	LA	PM
Q9QUI0	Rhoa	수송 단백질 RhoA 전구체	4	LA	PM,CSk
Q9R1Q7	Plp2	프로테오리피드 단백질 2	1	TM,LA	PM
Q9Z127	Slc7a5	대 중성 아미노산 수송체 소-서브유닛 1	7	TM	PM

Claims

세포를 소포형성제와 접촉시킴으로써 원형질막 소포를 생산하는 단계를 포함하는 원형질막 소포의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포를 기계적으로 교반하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 부착성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 현탁액 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소포형성제는 설프히드릴 블록킹제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 설프히드릴 블록킹제는 포름알데히드, 피루브산 알데히드, 아세트알데히드, 글리옥살, 글루타르알데히드, 아크롤레인, 메타크롤레인, 피리독살, N-에틸 말레이미드(NEM), 말레이미드, 클로로머큐리벤조에이트, 요오도아세테이트, 아비산칼륨, 아셀렌산나트륨, 티메로살(메르티올레이트), 벤조일 퍼옥사이드, 염화카드뮴, 과산화수소, 요오도벤조산, 메랄루라이드 나트륨(머큐히드린), 염화제2수은, 염화제1수은, 클로르머로드린(네오히드린), 페닐히드라진, 텔루르산칼륨, 말론산나트륨, p-아르세노벤조산, 5,5'-디아미노-2.2'-디메틸 아르세노벤젠, N,N'-디메틸렌 설포네이트 디소듐염, 요오도아세트아미드, 옥소페나르신(마파르센), 염화금, p-클로로머큐리벤조산, p-클로로머큐리페닐설폰산, 염화제2구리, 요오딘 메르브로민(머큐로크롬) 포르피린딘, 과망간산칼륨, 메르살릴(살리르간), 질산은, 강력 은 단백질(프로타르골), 및 아세트산 우라닐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소포형성제는 디티오트레이톨(DTT) 및 포름알데히드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소포형성제는 세포 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 세포 독소는 사이토칼라신 B 또는 멜리틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 교반기에 의하여 기계적으로 교반되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 초음파 처리에 의하여 기계적으로 교반되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 세포를 상기 소포형성제와 접촉시키기 전에, 세포를 세척하여 배지를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 원형질막 소포를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 원형질막 소포를 여과, 밀도구배 원심분리, 또는 투석 중 어느 하나 이상에 의하여 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계들 중 하나 이상을 포함하는 고순도 원형질막 소포의 제조 방법:
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원형질막 소포를 알킬화 및 환원제와 접촉시키는 단계;
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원형질막 소포를 알칼리 용액과 접촉시키는 단계;
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원형질막 소포 상에서 초음파처리를 이용하여 소포 내 오염물질을 배출시키는 단계;
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원형질막 소포 상에서 초음파처리를 이용하여 원형질막 소포를 세정하는 단계; 및
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원형질막 소포를 완충 용액으로 세척하는 단계.
제17항에 있어서, 상기 알킬화제는 요오도아세트아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 알칼리 용액은 적어도 pH 11인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 알칼리 용액은 Na₂CO₃ 또는 NaOH인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 원형질막 소포의 직경은 20㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 원형질막 소포의 직경은 10㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형질막 소포는 막횡단 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 막횡단 단백질은 막횡단 알파나선형 단백질, 막횡단 베타배럴 단백질, 지질-고정 막단백질, 및 막주변 막단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 막횡단 단백질은 효소, 수송체, 수용체, 채널, 세포 부착 단백질, G 단백질, GTPase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형질막 소포는 지질 고정 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 원형질막 소포를 하나 이상의 몇몇 프로테아제; 또는 몇몇 프로테아제와 연속하여 접촉시키는 단계, 및
상기 프로테아제에 의하여 생성된 펩타이드를 분석함으로써
세포의 막 프로테옴을 분석하는 단계
를 포함하는 세포의 막 프로테옴의 분석 방법.
제26항에 있어서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 트립신 또는 키모트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 단백질 단편을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 펩타이드 단편을 질량 분석법에 의하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
목적으로 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 단계;
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 원형질막 소포를 제조하는 단계;
상기 원형질막 소포를 후보 조절인자와 접촉시키는 단계;
상기 후보 조절인자가 상기 막횡단 단백질을 조절할 수 있는지 판단함으로써
막횡단 단백질의 조절인자를 확인하는 단계
를 포함하는 막횡단 단백질의 조절인자를 확인하는 방법.
제31항에 있어서, 리포터 유전자의 활성을 측정함으로써 상기 후보 조절인자의 막횡단 단백질 조절 능력을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
세포를 화합물과 접촉시키는 단계;
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 원형질막 소포를 제조하는 단계;
상기 원형질막 소포 내에 존재하는 폴리펩타이드를 분석함으로써
화합물의 막횡단 프로테옴에 대한 영향을 결정하는 단계
를 포함하는 막횡단 프로테옴에 대한 화합물의 영향을 결정하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 화합물은 소분자, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산 분자, RNAi, shRNA, 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 원형질막 소포를 프로테아제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 프로테아제에 의하여 생산된 펩타이드를 질량분석법에 의하여 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 원형질막 소포 내에 단백질을 분석하는 방법으로서,
상기 원형질막 소포를 표면에 부착시키는 단계;
상기 원형질막 소포를 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 단계; 및
생성된 펩타이드를 분석하여 단백질의 정체를 결정하는 단계
를 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 표면은 미세유체 소자인 것을 특징으로 하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 펩타이드를 질량분석법에 의하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
하나 이상의 세포의 소포형성을 유도하는 단계;
상기 막 소포를 분리하는 단계;
유기 용매를 이용하여 상기 막 소포를 추출하는 단계; 및
상기 유기 용매로부터 지질을 분리함으로써
상기 세포막으로부터 지질을 추출하는 단계
를 포함하는 세포막으로부터 지질을 추출하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 지질을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 분석은 존재하는 지질을 동정하는 단계 및/또는 하나 이상의 존재하는 지질의 양을 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 세포를 화합물과 접촉시켜 세포막 내 지질 함량 또는 지질 양에 대한 영향을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
단분산 원형질막 소포들의 집단.
제44항에 있어서, 상기 원형질막 소포들의 직경은 5㎛ 내지 25nm인 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제44항에 있어서, 상기 원형질막 소포들의 직경은 50㎛ 내지 500㎛인 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제44항에 있어서, 상기 원형질막 소포들의 직경은 100㎛ 내지 200㎛인 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 소정의 막 단백질에 대하여 강화된 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제48항에 있어서, 상기 막 단백질은 막횡단 단백질인 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제48항에 있어서, 상기 막 단백질은 지질 고정 단백질인 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제50항에 있어서, 상기 집단은 면역조직화학에 의하여 강화되는 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형질막 소포는 세포소기관 또는 세포골격 구조를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 집단.
제40항에 있어서, 상기 추출된 지질을 재구성을 목적으로 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.