CN118011012A - LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用 - Google Patents

LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118011012A
CN118011012A CN202410182372.4A CN202410182372A CN118011012A CN 118011012 A CN118011012 A CN 118011012A CN 202410182372 A CN202410182372 A CN 202410182372A CN 118011012 A CN118011012 A CN 118011012A
Authority
CN
China
Prior art keywords
apob
complex
coronary
atherosclerosis
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410182372.4A
Other languages
English (en)
Inventor
赖仞
房亚群
张治业
吕秋敏
李东升
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Institute of Zoology of CAS filed Critical Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority to CN202410182372.4A priority Critical patent/CN118011012A/zh
Publication of CN118011012A publication Critical patent/CN118011012A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4721—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及生物标志物技术领域，特别是涉及LL‑37‑ApoB‑100生物标志物及其应用。本发明发现了一种与冠状动脉粥样硬化/冠心病预测和诊断相关的血液和/或粥样斑内的生物标志物LL‑37‑ApoB‑100复合物，利用该标志物制备抗体，可以通过酶联免疫吸附的方法预测和诊断冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病，能够有效识别冠状动脉粥样硬化以及稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死等不同的冠心病亚型，相比于传统的冠状动脉粥样硬化或冠心病标志物具有灵敏度更高、特异性更高、检测更加快捷简单、成本更小并且创伤更低等显著优势。

Description

LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，特别是涉及LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病是心脏的冠状动脉血管发生粥样硬化改变而引起冠状动脉管腔狭窄或阻塞，在各种诱因作用下造成心肌缺血缺氧甚至坏死而导致一系列临床症状的疾病，简称冠心病(CAD)。
目前，冠状动脉造影术是冠心病诊断的金标准。然而，冠状动脉造影术是一种有创的冠脉介入性检查方法，不适用于患有凝血功能障碍、出血性疾病或对造影剂过敏的人群。多种风险因素或生物标志物，如C反应蛋白(CRP)、脂蛋白(a)、纤维蛋白原和同型半胱氨酸，都被用来预测动脉粥样硬化性血管疾病的风险【Hackam DG andAnand SS.Emerging riskfactors for atherosclerotic vasculardisease:acriticalreviewoftheevidence.Jama.2003；290:932-40.】。然而，降低C反应蛋白等风险因素的干预研究不完全降低疾病风险【RidkerPM.From C-Reactive Protein to Interleukin-6to Interleukin-1:Moving Upstream To Identify NovelTargets forAtheroprotection.Circulationresearch.2016；118:145-56.】。
迄今为止，冠状动脉粥样硬化的血液生物标志物仍然缺乏。常规风险因素(Hcy、hsCRP、TG、TC、ApoB-100、LDL-C和HDL-C)诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的灵敏度、特异性较低。因此，识别和开发新的生物标志物迫在眉睫。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用。本发明提供的LL-37-ApoB-100复合物作为冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病冠心病的标志物，能够有效识别冠状动脉粥样硬化以及稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死等不同的冠心病亚型，相比于传统的冠状动脉粥样硬化或冠心病标志物具有灵敏度更高、特异性更高、检测更加快捷简单、成本更小并且创伤更低等显著优势。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂在制备冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒中的应用，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。
优选的，所述与冠状动脉粥样硬化相关疾病包括冠心病。
优选的，所述检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体。
本发明提供了一种冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒，包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。
优选的，所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体包括多克隆抗体。
优选的，所述多克隆抗体包括兔源多抗。
优选的，所述LL-37-ApoB-100复合物的制备方法包括：将抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100混合，静置，得到所述LL-37-ApoB-100复合物。
优选的，所述抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100的质量比为250～300：100～150；所述静置的时间为25～40分钟。
优选的，所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体标记有生物素。
优选的，所述诊断试剂盒还包括酶联免疫吸附试剂。
有益效果：
本发明提供了检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂在制备冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒中的应用，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。本发明发现了一种与冠状动脉粥样硬化/冠心病预测和诊断相关的血液和/或粥样斑内的生物标志物LL-37-ApoB-100复合物，利用该标志物制备抗体，可以通过酶联免疫吸附的方法预测和诊断冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病，能够有效识别冠状动脉粥样硬化以及稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死等不同的冠心病亚型，相比于传统的冠状动脉粥样硬化或冠心病标志物具有灵敏度更高、特异性更高、检测更加快捷简单、成本更小并且创伤更低等显著优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为LL-37与ApoB-100形成稳定复合物的结果图；
图2为Cramp-ApoB-100复合物兔多克隆抗体的纯化及效价检测的结果图；
图3为LL-37-ApoB-100复合物兔多克隆抗体的纯化及效价检测的结果图；
图4为构建Apoe-/-小鼠冠状动脉粥样硬化动物模型的结果图；
图5为冠状动脉粥样硬化病人的粥样斑的荧光检测结果图；
图6为正常饲喂和高脂饲喂小鼠的胸主动脉斑块部荧光检测和血浆检测结果图；
图7为经二、四、六周高脂饲料诱导的Apoe-/-小鼠血浆中Cramp-ApoB-100复合物含量与冠状动脉粥样硬化斑块面积呈正相关性的结果图；
图8为经二、四、六周高脂饲料诱导的Apoe-/-小鼠血浆中Cramp、血脂水平与冠状动脉粥样硬化斑块面积相关性分析的结果图；
图9为对照组、冠状动脉粥样硬化组和不同冠心病分型病人中LL-37-ApoB-100复合物血浆水平的含量结果图；
图10为LL-37-ApoB-100复合物、LL-37与常规风险因素诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的ROC曲线结果图。
具体实施方式
本发明提供了检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂在制备冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒中的应用，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。本发明所述LL-37与ApoB-100通过静电相互作用、疏水相互作用结合。在本发明中，所述与冠状动脉粥样硬化相关疾病优选包括冠心病，更优选包括稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死；所述检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂优选包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体。
本发明发现LL-37-ApoB-100复合物作为冠状动脉粥样硬化/冠心病的标志物，能够有效识别冠状动脉粥样硬化以及稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死等不同的冠心病压型，相比于传统的冠状动脉粥样硬化/冠心病标志物具有灵敏度更高、特异性更高、检测更加快捷简单、成本更小并且创伤更低等显著优势。LL-37-ApoB-100复合物既可作为冠状动脉粥样硬化/冠心病的标志物，又可作为预测早期冠状动脉粥样硬化发病以及冠心病发展程度的预测因子。
本发明提供了一种冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒，包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。在本发明中，所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体优选包括多克隆抗体；所述多克隆抗体优选包括兔源多抗；所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体优选标记有生物素；制备所述多克隆抗体的抗原优选为LL-37-ApoB-100复合物；所述LL-37-ApoB-100复合物的制备方法优选包括：将抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100混合，静置，得到所述LL-37-ApoB-100复合物；所述抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100的质量比优选为250～300：100～150，进一步优选为260～290：110～120，更优选为286：114；所述静置的时间优选为25～40分钟，更优选为30分钟；所述诊断试剂盒优选还包括酶联免疫吸附试剂；所述酶联免疫吸附试剂优选包括包被液、封闭液、洗涤液、链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物、显色底物和终止液。
本发明优选还提供了上述技术方案所述诊断试剂盒的使用方法，优选包括：待测样本用包被液稀释后包被在96孔板内，样品孔封闭处理后通过使用生物素标记的抗LL-37-ApoB-100复合物抗体吸附在样本中的LL-37-ApoB-100复合物上，最终通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物来建立显色反应。通过和标准曲线对比推算出所测样本中LL-37-ApoB-100复合物的浓度。在本发明中，所述待测样本优选包括血浆样本。本发明根据LL-37-ApoB-100复合物浓度的高低可以诊断冠心病发病的严重程度，实现冠心病预测和诊断的目的。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
Cramp(SEQ ID NO.3)、LL-37(SEQ ID NO.1)及其打乱序列的对照肽GL-37(SEQ IDNO.2)由吉尔生化(上海)有限公司合成，多肽合成仪为433A型号(ABI，美国)。合成多肽经过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证，序列正确，纯度大于98％。合成的多肽样品以干粉的形式密封保存于-20℃。合成的多肽序列如下：
LL-37：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，SEQ ID NO.1；
GL-37：GLKLRFESKIKGEFLKTPEVRFRDIKLKDFNRISVQR，SEQ ID NO.2；
Cramp：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE，SEQ ID NO.3。
实施例2
表面等离子共振
采用表面等离子共振的方法分析LL-37与ApoB-100的相互作用，实验使用BIAcoreS200(GE)仪器和CM 5芯片(GE)，具体使用步骤如下：
(1)活化CM5芯片：0.1M N-(3-二甲氨基丙)-N'-乙基-碳二亚胺盐酸(EDC)和0.1MN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照1：1的体积比混合，以5μl/min的流速流经CM 5芯片表面，活化其表面的羧甲基基团。
(2)共价耦合：10μg/ml的LL-37或GL-37水溶液流经芯片表面，流速为5μl/min。达到预计的相应值后，停止偶联。
(3)封闭多余活性位点：将40μl浓度为1M的乙醇胺以5μl/min的流速流经芯片表面，封闭多余的活性位点。
(4)平衡体系：HEPS-EP缓冲液以5μl/min的流速流经芯片表面，直到显示的响应值恢复至基线水平。
(5)蛋白的结合实验：用HEPS-EP缓冲液配置浓度由低到高(12.5、25、50、100μg/ml)的ApoB-100(RayBiotech，MD-26-0010P)溶液，依次设置20μl样品，流过芯片表面，流速5μl/min。检测下一个浓度梯度时，用低浓度的NaOH溶液，清洗已经结合的蛋白，再用HEPS-EP缓冲平衡系统，再进样。
(6)处理数据，用作图软件作图，计算结合解离常数。结果见图1。
利用表面等离子共振(SPR)技术，LL-37包被到CM5芯片上，作为固定相；ApoB-100作为流动相，流经芯片表面。如果被检测的两种蛋白质之间存在相互作用，流动相流经芯片表面时，芯片的金属表面折射率发生变化，传感曲线将呈现一个向上的曲线。折射率变化越明显，曲线变化幅度越大，则表面固定相和流动相直接测相互作用强度越大。如果被检测的两种蛋白质之间没有相互作用，传感器曲线将与基线一致，没有明显变化。
当ApoB-100作为流动相流经LL-37-CM 5芯片表面时，结果如图1中的A所示，ApoB-100可以呈浓度梯度依赖性的与LL-37结合。当ApoB-100作为流动相流经乱序对照肽GL-37-CM 5芯片表面时，结果如图1中的B所示，ApoB-100与乱序对照肽GL-37之间没有明显的相互作用。
实施例3
兔多克隆抗体的制备和纯化
制备LL-37-ApoB-100复合物和Cramp-ApoB-100复合物的兔多克隆抗体，方法如下：
将286μg的LL-37与114μg的ApoB-100加入到1ml水中，室温孵育30分钟，得到LL-37-ApoB-100复合物；将286μg的Cramp与114μg的ApoB-100加入到1ml水中，室温孵育30分钟，得到Cramp-ApoB-100复合物；将286μg的Cramp与114μg的LDL加入到1ml水中，室温孵育30分钟，得到Cramp-LDL复合物。
用1ml弗氏完全佐剂分别溶解400μg的LL-37-ApoB-100复合物和Cramp-ApoB-100复合物，经涡旋震荡，充分混匀。然后通过背部多点注射的方法，将2ml混合佐剂注射到新西兰大白兔的皮下。在首次免疫14天后，用同样的方式进行二次免疫，抗原质量减半。在首次免疫后28天和42天时，改用弗氏不完全佐剂溶解抗原，抗原质量较首次免疫减半。在最后一次加强免疫结束后的第七天，耳缘静脉取血，检测抗体效价。对抗体效价在1：1000以上的兔子进行麻醉处理(2％戊巴比妥，静脉注射1ml/kg体重)，使用颈静脉插管的方法获取兔子血液，4℃静置过夜，3500r/min离心30min，得到含有兔多克隆抗体的抗血清。使用间接ELISA方法进行抗体效价检测，兔抗血清的抗体效价大于1：1000后，用兔特异性纯化试剂盒(CellBiolabs，AKR-160)进行抗体纯化。对纯化后的抗体进行长臂生物素标记，保存在-80℃，备用。
Cramp-ApoB-100复合物兔多克隆抗体的纯化及效价检测的结果见图2，其中，图2中的A为纯化后的抗体经12％SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，明显看到IgG的重链和轻链两条带；图2中的B为Cramp-ApoB-100复合物抗体效价检测，比较了该抗体识别Cramp、LDL(Yeasen，20613ES05)、ApoB-100、Cramp-ApoB-100、Cramp-LDL的特异性，在450nm的吸光度值分别为0.11±0.02、0.13±0.02、0.15±0.05、1.14±0.13、0.95±0.05(平均值±SD值)。***p<0.001。Cramp-ApoB-100复合物兔多克隆抗体对Cramp、LDL、ApoB-100在450nm的吸光度值显著低于对复合物的吸光度值，这说明了该抗体能够特异性识别Cramp-ApoB-100和Cramp-37-LDL复合物
LL-37-ApoB-100复合物兔多克隆抗体的纯化及效价检测的结果见图3，图3中的A为纯化后的抗体经12％SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，明显看到IgG的重链和轻链两条带。这说明使用抗体纯化试剂盒纯化IgG的效果较好。图3中的B为LL-37-ApoB-100复合物抗体效价检测，比较了该抗体识别LL-37、LDL、ApoB-100、LL-37-ApoB-100、LL-37-LDL的特异性，在450nm的吸光度值分别为0.11±0.01、0.10±0.004、0.23±0.03、1.22±0.11、1.08±0.09(平均值±SD值)。***p<0.001。LL-37-ApoB-100复合物兔多克隆抗体对LL-37、LDL、ApoB-100在450nm的吸光度值显著低于对复合物的吸光度值，这说明了该抗体能够特异性识别LL-37-ApoB-100和LL-37-LDL复合物。
实施例4
小鼠冠状动脉粥样硬化疾病模型
选用6周龄，雄性Apoe-/-小鼠，经随机分组，每组6只，喂食高脂饲料(含有21％脂肪和0.15％胆固醇)，诱导小鼠冠状动脉粥样硬化的形成。分别在喂食高脂饲料的0、2、4、6周，用2％(w/w)的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，用量为40mg/kg体重。将麻醉后的小鼠固定在解剖台上，打开胸腔，暴露心脏，进行心脏灌流。首先用生理盐水将小鼠全身的血液灌出，再用4％的多聚甲醛灌流，固定小鼠全身。对固定好的小鼠，小心剥离其心脏和胸主动脉，剔除多余的脂肪组织，将剥离好的心脏和胸主动脉保存在固定液里，4℃放置，备用。
实施例5
组织冰冻切片和油红-O染色
取出经4％多聚甲醛固定的小鼠胸主动脉组织样本，用40％的蔗糖溶液(PBS配制)脱水，4℃静置过夜。次日将脱水处理后的样本用OCT包埋剂包埋，再用冰冻切片机(Leica，CM 3050S)制作成8μm的组织冰冻切片，对小鼠胸主动脉冰冻切片进行油红-O染色，具体步骤如下：
(1)配置油红-O染色液：油红-O母液与水以3：2的比例混匀，用0.22μm的滤器进行过滤，避光保存，备用。
(2)用60％的异丙醇浸润切片，1min后，弃掉异丙醇，待其自然晾干。这一步有利于油红-O着色。
(3)加入适量的油红-O染色液，避光染色15min。
(4)染色结束后，弃掉染色液，用60％的异丙醇漂洗5s。
(5)立即用清水冲洗，自然晾干。
(6)染色结束后用显微镜(Nikon Eclipse 80i,Japan)拍照记录图像，并用软件(Image)进行图像定量分析。
通过喂食Apoe-/-小鼠高脂饲料，诱导冠状动脉粥样硬化模型。分别在喂食高脂饲料二、四、六周后，取小鼠的胸主动脉根部，经多聚甲醛固定，做冰冻切片。通过油红-O染色的方法来标记胸主动脉根部的粥样斑，用染色后斑块的面积来衡量冠状动脉粥样硬化发病的严重程度。结果见图4，其中A为小鼠胸主动脉根油红-O染色结果示意图(n＝6)，B为A中斑块面积统计结果。***p<0.001。
由图4可知，经油红-O染色，喂食二、四、六周高脂饲料的Apoe-/-小鼠的胸主动脉根有不同程度的动脉粥样斑，油红-O染色阳性区域占整个胸主动脉根管腔切面的面积分别为0.85％、4.86％、9.95％。Apoe-/-小鼠喂食高脂饲料的时间越长，冠状动脉粥样硬化的发病严重。
实施例6
观察性病例对照研究
招募2022年6月至2023年12月在昆明医科大学第一附属医院进行冠状动脉造影的冠心病患者635例和健康对照组227例。记录受试者的性别、年龄、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hsCRP)等临床资料。健康对照组(NCA)与冠心病组(CAD)的临床特征如表1所示，数值表示为平均值±SD值或中位数(四分位数间距)。
表1健康对照组(NCA)与冠心病组(CAD)的基本临床资料
入选标准：冠状动脉造影中主冠状动脉有狭窄且均≤50％的患者被诊断为冠状动脉粥样硬化(即NOCA组)。冠状动脉造影中至少有一条主冠状动脉出现≥50％狭窄的患者被诊断为冠心病(即CAD组)；根据症状体征及相关检查结果，CAD患者被进一步分为稳定性心绞痛(SAP)、不稳定性心绞痛(UAP)和急性心肌梗死(AMI)。对照组为冠状动脉造影检查结果呈阴性的受试者(即NCA组)。
排除标准：如果受试者患有心肌炎、脂肪肝、脑梗塞、外周冠状动脉粥样硬化、颈冠状动脉粥样硬化、脑冠状动脉粥样硬化、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病，则将其排除在外。
实施例7
组织冰冻切片和免疫荧光染色
取出经4％多聚甲醛固定的人冠状动脉粥样硬化斑及正常动脉内壁样本或小鼠胸主动脉组织样本，用40％的蔗糖溶液(PBS配制)脱水，4℃静置过夜。次日将脱水处理后的样本用OCT包埋剂包埋，再用冰冻切片机(Leica，CM 3050S)制作成8μm的组织冰冻切片。
对冰冻切片的组织样本进行免疫荧光，具体步骤如下：
(1)用免疫组化笔在组织周围画圈，加入适量的PBS清洗组织，轻轻用滤纸吸干。
(2)破膜处理：向圈住的组织上，加入适量的0.3％(w/w)TritonX-100，室温孵育30min。
(3)清洗：用适量PBS清洗3次，每次5min。
(4)封闭：加入适量的2％BSA-PBS溶液，室温孵育1h。
(5)孵育一抗：加入稀释好的实施例3制备的抗LL-37-ApoB-100或Cramp-ApoB-100复合物兔多克隆抗体，4℃孵育过夜。抗体用上述封闭液稀释(1：3000)。若需要同时孵育两种抗体，则两种抗体1：1混匀后，加入到组织上。
(6)清洗：同步骤(3)。
(7)孵育荧光二抗：加入1：200稀释的抗兔荧光二抗(Thermo Fisher Scientific，A11008)，37℃避光孵育1h。根据需要标记的荧光颜色，选用不同荧光标记的抗兔二抗。
(8)清洗：同步骤(3)。
(9)封片：滴加少量含有DAPI的封片剂于组织上，轻轻用盖玻片盖住。
(10)将完成封片的组织切片放掉激光共聚焦显微镜下观察。
对冠状动脉粥样硬化病人的粥样斑和正常人的动脉样本进行冰冻切片，用免疫荧光的方法检测了LL-37和ApoB-100在粥样斑和正常动脉壁中的定位情况。绿光荧光标记LL-37，红光荧光标记ApoB-100，DAPI(蓝色荧光，特异性识别双链DNA)标记组织中细胞核的位置。结果见图5，标尺为30μm。
由图5可知，冠状动脉粥样硬化病人的粥样斑中存在大量的LL-37和ApoB-100，且斑块中的大部分LL-37和ApoB-100存在明显的共定位。而正常人的动脉样本中几乎无LL-37和ApoB-100。
图6为小鼠冠状动脉粥样硬化斑块和血浆中存在大量Cramp-ApoB-100复合物的结果图。图6中的A为免疫荧光检测发现喂食高脂饲料的Apoe-/-小鼠的胸主动脉斑块中存在大量的Cramp-ApoB-100复合物，而喂食正常饲料的Apoe-/-小鼠的胸主动脉中没用明显的该复合物。绿光荧光标记Cramp-ApoB-100复合物，蓝色荧光标记组织中细胞核的位置。标尺为100μm。图6中的B为喂食二、四、六周高脂饲料的Apoe-/-小鼠血浆中Cramp-ApoB-100复合物含量，浓度分别为0.85±0.34、4.86±1.43、9.95±2.57(平均值±SD值，n＝20)。**p<0.01，***p<0.001。
由图6可知，Apoe-/-小鼠诱发冠状动脉粥样硬化后，胸主动脉粥样硬化斑块中出现大量的Cramp-ApoB-100复合物。随着高脂饲料诱导时间的增加(小鼠胸主动脉粥样硬化斑块面积逐渐增加)，Apoe-/-小鼠血浆中Cramp-ApoB-100复合物的含量也逐渐升高。
实施例8
LL-37-ApoB-100复合物和Cramp-ApoB-100复合物的浓度测定
冠状动脉粥样硬化性心脏病病人及对照组血浆LL-37-ApoB-100复合物浓度的测定、冠状动脉粥样硬化模型小鼠血浆Cramp-ApoB-100复合物浓度的测定，以及兔多克隆抗体效价的测定，均采用间接ELISA方法测定，具体步骤如下：
(1)包被抗原：用包被液稀释不同浓度的LL-37、Cramp、ApoB-100以及它们的复合物为标准品，用包被液稀释血浆，分别加入酶标板条内，每孔加入100μl。37℃孵育1h，然后4℃包被过夜。包被液为pH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，配置方法为：1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠溶解至1L去离子水。
(2)洗涤：包被结束后，倒掉板孔内的包被液，用洗涤液洗次，每孔250μl，每次3至5分钟，洗3至5次。最后一次洗涤结束，后尽量拍干。洗涤液为含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液。PBS的配方为：0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾、8.7g氯化钠和2.16g十二水合磷酸二氢钠溶解至1L去离子水。
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭1h。封闭液为用洗涤液配置的1％BSA溶液。
(4)加入一抗：封闭结束后，加入实施例3制备的抗LL-37-ApoB-100或Cramp-ApoB-100复合物兔多克隆抗体，每孔100μl，37℃孵育1h。抗体用封闭液稀释。
抗体效价检测时，封闭结束后，加入兔抗血清：用封闭液将兔抗血清倍比稀释(1:200、1:400、…、1:102400)，每孔100μl，37℃孵育1h。同时设置空白对照和阴性对照(兔IgG)。
(5)洗涤：一抗孵育结束后，洗涤，步骤同上述步骤(2)。
(6)加入酶标偶联物抗体：洗涤结束后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(抗体效价检测时，加入HPR标记的抗兔IgG抗体)，每孔100μl，37℃避光孵育1h。
(7)洗涤：孵育结束后，洗涤，步骤同上述(2)。
(8)显色：每孔加入100μl TMB，37℃避光孵育10～30分钟。
(9)终止：每孔加入100μl终止液，终止显色。终止液为2mol/l的硫酸，配方为：21.7ml浓硫酸缓慢加入到78.3ml水中，慢慢搅拌混匀。
(10)读数：用酶标仪读取450nm和630nm处的吸光度值。
(11)根据标准曲线计算浓度。
图7和图8为经二、四、六周高脂饲料诱导的Apoe-/-小鼠血浆中Cramp-ApoB-100复合物含量与冠状动脉粥样硬化斑块面积呈正相关性的结果图，其中图7中的A～C为血浆Cramp-ApoB-100复合物或ApoB-100水平与冠状动脉粥样硬化斑块面积的相关性。图8中的A为血浆Cramp水平与冠状动脉粥样硬化斑块面积的相关性，图8中的B～F为血浆血脂水平与冠状动脉粥样硬化斑块面积的相关性。n＝每组20只小鼠。TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇。
由图7和图8可知，经二、四、六周高脂饲料诱导的Apoe-/-小鼠胸主冠状动脉粥样硬化斑块面积逐渐增加。通过比较不同时间主动脉根斑块面积与血浆中Cramp、ApoB-100、Cramp-ApoB-100复合物、ApoA、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的相关性，发现随着主动脉根斑块面积的增加，小鼠血浆中Cramp、ApoB-100、Cramp-ApoB-100复合物、TG、TC、LDL-C的含量有逐渐升高的趋势(相关系数r值为正数且数值越来越大)，ApoA、HDL-C的含量逐渐降低的趋势(相关系数r值为负数且数值越来越小)。但是Cramp-ApoB-100复合物的相关系数r值均高于其他组，且具有显著性差异(p＜0.001)，即主动脉根斑块面积增加与Cramp-ApoB-100复合物含量增加的相关性更强，该复合物含量的增加更能预测粥样硬化斑块面积的增加程度。
图9为对照组、冠状动脉粥样硬化组和不同冠心病分型病人中LL-37-ApoB-100复合物血浆水平的含量结果图。在NC、NOCA、SA、UA、AMI组，LL-37-ApoB-100复合物血浆浓度的中位数(IQR)为31.74(20.13-38.66)ng/ml、38.73(30.95-46.27)ng/ml、45.75(36.09-63.34)ng/ml、49.00(38.22-65.15)ng/ml和52.61(41.68-69.80)ng/ml。NC，对照组(冠状动脉无狭窄，n＝227)；NOCA，冠状动脉粥样硬化组(动脉血管狭窄率小于50％，n＝92)；SA，稳定型心绞痛(n＝129)；UA，不稳定型心绞痛(n＝174)；AMI，急性心肌梗死(n＝240)。
在这项观察性病例对照中，根据患者症状体征及相关检查结果，患者冠状动脉粥样硬化的严重程度为冠状动脉粥样硬化＞稳定性心绞痛＞不稳定性心绞痛＞急性心肌梗死。在这4组病人LL-37-ApoB-100复合物的血浆浓度中位数(IQR)均高于对照组，即LL-37-ApoB-100复合物的血浆浓度随着冠状动脉粥样硬化的严重程度的增加而升高。
图10为LL-37-ApoB-100复合物、LL-37与常规风险因素诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的ROC曲线结果图(n＝862)。***p＜0.001。同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。
ROC曲线下面积AUC如下表2所示。
表2 ROC曲线下面积AUC结果
组别 AUC(95％CI) p-value
LL-37-ApoB-100 0.82(0.81-0.85) 8.63E-48
LL-37 0.67(0.63-0.70) 1.64E-13
Hcy 0.62(0.59-0.65) 8.39E-08
hsCRP 0.61(0.58-0.64) 8.82E-07
TG 0.56(0.52-0.59) 9.73E-03
TC 0.56(0.53-0.61) 4.00E-03
ApoB-100 0.54(0.51-0.57) 7.68E-02
LDL-C 0.52(0.49-0.56) 0.33
HDL-C 0.52(0.49-0.55) 0.4
ROC曲线以及曲线下面积AUC数值的大小可以反映LL-37-ApoB-100复合物、LL-37与常规风险因素(Hcy、hsCRP、TG、TC、ApoB-100、LDL-C和HDL-C)诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的灵敏度、特异性。LL-37-ApoB-100复合物的ROC曲线下面积AUC均高于其他因素，即可说明该复合物相比于传统的冠状动脉粥样硬化/冠心病标志物具有灵敏度更高、特异性更高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂在制备冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒中的应用，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与冠状动脉粥样硬化相关疾病包括冠心病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测LL-37-ApoB-100复合物的试剂包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体。
4.一种冠状动脉粥样硬化或与冠状动脉粥样硬化相关疾病的诊断试剂盒，其特征在于，包括抗LL-37-ApoB-100复合物抗体，所述LL-37-ApoB-100复合物由抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100组成。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体包括多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体包括兔源多抗。
7.根据权利要求4或5所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述LL-37-ApoB-100复合物的制备方法包括：将抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100混合，静置，得到所述LL-37-ApoB-100复合物。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抗菌肽LL-37和载脂蛋白B-100的质量比为250～300：100～150；所述静置的时间为25～40分钟。
9.根据权利要求4或5所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述抗LL-37-ApoB-100复合物抗体标记有生物素。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括酶联免疫吸附试剂。
CN202410182372.4A 2024-02-19 2024-02-19 LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用 Pending CN118011012A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410182372.4A CN118011012A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410182372.4A CN118011012A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118011012A true CN118011012A (zh) 2024-05-10

Family

ID=90958111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410182372.4A Pending CN118011012A (zh) 2024-02-19 2024-02-19 LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118011012A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004069621A (ja) * 2002-08-08 2004-03-04 Ikagaku:Kk 急性冠症候群の発症を予知するための診断用キット
WO2004091515A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA CONJUGATES
US20060177435A1 (en) * 2004-10-05 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Methods for assessing atherogenesis by determining oxidized phospholipid to apolipoprotein B ratios
WO2008104194A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Bioinvent International Ab Oxidized ldl and antibodies thereto for the treatment of atheroscleroti c plaques
WO2011160845A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Medirista Biotechnologies Ab Oxidized phospholipids and lipoproteins, and antibodies thereto, as biomarkers of inflammatory conditions and methods of treatment
CN104480199A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中国科学院昆明动物研究所 LL-37-mtDNA复合物标志物及其应用
CN105188687A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 奈米瑞斯公司 Metadichol*液体和凝胶纳米颗粒制剂

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004069621A (ja) * 2002-08-08 2004-03-04 Ikagaku:Kk 急性冠症候群の発症を予知するための診断用キット
WO2004091515A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA CONJUGATES
US20060177435A1 (en) * 2004-10-05 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Methods for assessing atherogenesis by determining oxidized phospholipid to apolipoprotein B ratios
WO2008104194A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Bioinvent International Ab Oxidized ldl and antibodies thereto for the treatment of atheroscleroti c plaques
WO2011160845A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Medirista Biotechnologies Ab Oxidized phospholipids and lipoproteins, and antibodies thereto, as biomarkers of inflammatory conditions and methods of treatment
CN105188687A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 奈米瑞斯公司 Metadichol*液体和凝胶纳米颗粒制剂
CN104480199A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中国科学院昆明动物研究所 LL-37-mtDNA复合物标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101678703B1 (ko) 갈렉틴-３ 면역검정
US8399207B2 (en) Monoclonal antibodies against osteopontin
CN101166981A (zh) 一种用于诊断 2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的方法和试剂盒
JP6933834B1 (ja) 新型コロナウイルス感染者の重症化リスクの検査方法、その検査キット、コンパニオン診断薬及びその重症化リスクマーカー
Schwarz et al. A novel monoclonal antibody immunoassay for the detection of human serum hepcidin
KR101589285B1 (ko) 심혈관 질환 마커 파랄레민 및 이를 이용한 심혈관 질환 진단 방법
CN117969822A (zh) Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用
CN117777287B (zh) 靶向降钙素原的抗体f4b4及其应用
CN108982868A (zh) 核体蛋白sp110及含有该蛋白的试剂盒在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用
CN118011012A (zh) LL-37-ApoB-100生物标志物及其应用
US20200271647A1 (en) Biomarkers for predicting prognosis of kidney disease
CN114994306B (zh) 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒
CN113956355B (zh) 抗人脑利钠肽(bnp)兔单克隆抗体及其应用
CN108663522A (zh) 膀胱癌检测试剂盒
CN111487411B (zh) Ceacam1多肽的新应用
CN110687285A (zh) 诊断试剂盒及mak16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用
JP5857385B2 (ja) Ａｐｅ１／ｒｅｆ−１を含有する膀胱癌診断用組成物、及びこれを利用した膀胱癌診断キット
JP5553603B2 (ja) 新規肝癌マーカー
CN117024586B (zh) 一种抗体组合物及应用于检测血液中ykl-40浓度的方法
EP2918600A1 (en) Novel peptide and use thereof
AU2021105747A4 (en) Application of diagnostic kit and MAK16 in preparation of reagent for early diagnosis of systemic lupus erythematosus
RU2281512C2 (ru) СПОСОБ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА БЕТТА ig-h3
WO2024065892A1 (zh) 检测嗜酸性粒细胞的试剂、嗜酸性粒细胞及其胞质内容物和羟基二十二碳六烯酸的应用
SK50962008A3 (sk) Peptidy na použitie v diagnostike prítomnosti rupturovaných aterosklerotických lézií u jedinca
US20130115633A1 (en) Methods &amp; Devices for Diagnosing Cardiac Disorders

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination