CN101166981A - 一种用于诊断 2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的方法和试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断 2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种方法和试剂盒，用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性。

Description

一种用于诊断 2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性的方法。
发明背景
捕获并修饰内膜的蛋白聚糖层中的LDL(低密度脂蛋白)颗粒看来似乎是动脉粥样硬化形成中的关键初始步骤。LDL与其他大分子和细胞(包括导致动脉粥样硬化形成的那些大分子和细胞)的大部分相互作用受到暴露在所述颗粒表面的不可交换性apoB100的区段的控制(Chan L，J Biol Chem 1992；267：25621-25624；Camejo G，et al，Pathologicalsignificance 1998；139；205-222)。当可交换性载脂蛋白与蛋白吸附在LDL表面上时，它们看来能够调节一部分上述的相互作用。有效定义的密度为1.019～1.063的脂蛋白类是一群大小、脂质和载脂蛋白组成各异的颗粒(Alaupovioc P，Methods Enzymol 1996；263：32-60)。小而密LDL(sdLDL)子类的水平升高与冠心病的进展关系密切，已经被提议作为胰岛素抵抗与2型糖尿病的动脉粥样硬化性血脂障碍的标志(Krauss RM，World Rev Nutr Diet 1997；80：22-43；Taskinen MR，Diabetologia，2003；46：733-749)。此外，sdLDL的致病率在临床前股动脉和颈动脉粥样硬化受试对象中较高(Hulthe J.et al，Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular Biology 2000；20：2140-2147)。已经提出了一些假说来解释sdLDL所致的动脉粥样硬化。这些颗粒在体外增大了对动脉蛋白聚糖(PG)的亲和力，并且一旦与其联合则所述颗粒比更大的、更轻的LDL变得更容易被酶法和氧化过程所修饰(Camejo G，et al，Pathologicalsignificance 1998；139；205-222；Hurt-Camejo E，et al，Journal of LipidResearch 1990；31；1387-1398)。
从轻的LDL(大)到更密的LDL(小)，颗粒的脂质组成和表面性质均存在逐渐的变化。颗粒表面的磷脂与游离胆固醇的减少与apoB-100的区段的暴露情况的改变有关，所述区段可改变其与apoB/E受体的亲和力。这样的变化也可以部分解释sdLDL对蛋白聚糖具有更大的亲和力的原因是参与蛋白聚糖结合的序列3359-3369(B位)和3145-3157(A位)也参与受体结合(Chan L，J Biol Chem 1992；267：25621-25624)。由此得出下述假说：即sdLDL对PG具有更高的亲和力是因为表面的这些阳性序列变得更为紧密且暴露得更多(Camejo G，et al，Pathologicalsigntificance 1998；139；205-222；Hurt-Camejo E，et al，Journal of LipidResearch 1990；31：1387-1398)。
LDL中的高载脂蛋白CIII(apoCIII)含量日益受到关注是因为具有该表型的受试对象比LDL中apoCIII含量较低的受试对象具有更高遭受心血管事件的风险，而所述心血管事件与LDL-胆固醇值无关(Lee S-J，etal，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003；23(5)：853-858；Lee S-J，et a1.，AmJ Cardiol 2003；92(2)：121-124)。ApoCIII通过抑制极低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯的水解而引起高甘油三酯血症，但其增大LDL的致动脉粥样硬化的原因仍然不明。近来，有证据显示当与LDL结合时ApoCIII增大了脂蛋白对于动脉蛋白聚糖的亲和力(Olin-Lewis K，et al，LLipid Research 2002；43(11)：1969-1977)。
WO2004/085996披露了利用来自受试对象的血浆的高密度HDL与LDL的大小和水平来确定所述受试对象出现心血管相关疾病、代谢相关疾病或年龄相关疾病的可能性的方法。
发明内容
本发明的目的是能够容易地确定或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的可能性。
上述目的得以解决在于提供了一种用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床症状的敏感性的方法，所述方法包括检测所述受试对象的血样中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
根据本发明的另一方面，提供一种用于确定与sdLDL颗粒结合的蛋白的种类和数量的方法作为选择用于临床试验的患者的生物标志的用途。
根据本发明的又一方面，提供一种用于确定受试对象中与sdLDL颗粒结合的蛋白的种类和数量的方法作为用于评价所述受试对象的药物介入的结果的生物标志的用途。
根据本发明的再一方面，提供一种诊断用试剂盒，所述诊断用试剂盒用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性，所述试剂盒包括能够检测与sdLDL颗粒结合的蛋白并对其进行定量的蛋白质芯片。
根据本发明的另一方面，提供一种用于预测动脉内膜中层厚度的方法，所述方法包括检测所述受试对象的血样中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
本发明的方法可用于鉴定大约80％患有2型糖尿病的患者，而无需更多的信息。与来自2型糖尿病患者的小而密LDL结合的蛋白的前述具体情况除了提供由尺寸评价所提供的信息之外，还提供关于与所述疾病有关的致动脉粥样硬化的LDL的生物化学特征的其他信息。
附图说明
图1.在预形成梯度的缓冲液(在D2O与H2O的混合物中、含有140mM NaCl)中分离的血清LDL ApoB100分布图。曲线A来自健康受试对象。曲线B来自患有2型糖尿病并具有LDL B表型的患者。
图2.在Q10蛋白质芯片阵列上分析得到的23名对照者中的10名对照者和22名糖尿病患者(研究2)中的10名患者的sdLDL的SELDI-TOF-MS蛋白质分布图。
图3.在CM10蛋白质芯片阵列上分析得到的23名对照者中的10名对照者和22名糖尿病患者(研究2)中的10名患者的sdLDL的SELDI-TOF-MS蛋白质图。
图4a和图4b.在对照者(受试对象1～23)和患者(受试对象24～45)中，轻的LDL颗粒(Fr4)与(Fr5)sdLDL颗粒中的apoCIII/apoB(图a)和apoCI/apoB(图b)各值的比较。
图5.分别为来自23名对照者中的1名对照者和来自糖尿病(研究2)的22名患者中的1名患者的氘分级分离后的sdLDL以及PG-LDL复合物的SELDI-TOF-MS蛋白质分布图的比较，所述结果在Q10蛋白质芯片阵列上进行分析得到。与对照者相比，患者的sdLDL中分子量分别为8920、9420和9720 Da的三个条带明显增强(p＜0.001)，并且，与对照者的相比，患者的PG-LDL复合物中的这三个条带也明显增强(p＜0.001)。
图6.2型糖尿病患者的sdLDL中的apoCIII的总含量与通过与主动脉多能蛋白聚糖体外结合而不溶的LDL胆固醇的量的相关性。
具体实施方式
本发明提供一种用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性的方法，所述方法包括检测所述受试对象的血样中小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
优选地，对从所述血样分离得到的血清执行所述方法。任选地，在对结合蛋白进行检测和定量前首先从血清中分离出包含sdLDL颗粒的级分。
将小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白的量与从健康对照受试对象定量得到的量进行比较。这可以在对测试受试对象进行的同时对对照受试对象进行，也可以采用历史对照数据。
在一个实施方案中，提供了一种用于在受试对象中诊断2型糖尿病或预测患2型糖尿病、诊断代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、糖尿病的临床表现或动脉粥样硬化的临床表现(即心肌梗死和中风)的方法，
所述方法包括下列步骤：
a)采集所述受试对象的血样并收集所述样品的血清，
b)分离含有小而密低密度脂蛋白(sdLDL颗粒)的级分，
c)检测由步骤b)获得的在所述分离出的sdLDL颗粒上的结合蛋白并对其水平定量，
d)识别所述蛋白，并
e)与来自健康对照受试对象的水平进行比较。
所述血样可以在上述测定前即采，也可以是很久以前自所关注的受试对象采集并在上述测定前以适当方式存储的血样。
使用本领域的技术人员所知的分离sdLDL颗粒与血液的其他组分的任何技术，可以分离包含小而密低密度脂蛋白(sdLDL颗粒)的级分。所述分离例如可以如下进行：使用诸如在D2O中制备的那些缓冲液等适宜的缓冲液进行密度梯度超速离心，或者用动脉蛋白聚糖溶液使sdLDL颗粒从血清中沉淀出。所述分离还可
可使用1D凝胶电泳可以进行检测。检测和定量可以通过免疫测定进行。优选地，利用表面增强激光解吸离子化(SELDL)分析对sdLDL颗粒上的结合蛋白进行检测和定量。
此处使用的术语“结合”可以解释为包含以任何一种非共价方式与sdLDL颗粒结合的蛋白质，所述非共价方式例如有氢键结合、疏水作用、范德华力、离子相互作用。所述蛋白质以不同的亲和力保留在脂蛋白颗粒的表面上并与游离蛋白或与其他类别的脂蛋白结合的那些蛋白相平衡。
与sdLDL颗粒结合的结合蛋白可以是选自由载脂蛋白CIII(apoCIII)、载脂蛋白CI(apoCI)、载脂蛋白(apoAI)或载脂蛋白(apoE)组成的组的一种或多种，其中，apoCIII以三个同种型的形式存在，apoCI以两个同种型的形式存在(Pullinger et al.，1997)。
对于上述方法中评价的与sdLDL颗粒结合的一些结合蛋白，与sdLDL颗粒结合的一种或多种结合蛋白相对于对照受试对象中的结合蛋白的升高的量是所述受试对象是否患有和/或存在出现下述疾病的风险的指标：2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、糖尿病的临床表现或动脉粥样硬化的临床表现(即心肌梗死和中风)。例如，与健康受试对象的相比，apoCIII的水平升高。
对于上述方法中评价的与sdLDL颗粒结合的一些结合蛋白，与sdLDL颗粒结合的一种或多种结合蛋白相对于对照受试对象中的结合蛋白的降低的量是所述受试对象是否患有和/或存在出现下述疾病的风险的指示：2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、糖尿病的临床表现或动脉粥样硬化的临床表现(即心肌梗死和中风)。例如，与健康受试对象的相比，apoCI、apoAI和apoE的水平降低。
在一个实施方案中，测定与sdLDL颗粒结合的apoCIII和apoCI的组合，结果显示与sdLDL颗粒结合的一种或多种结合蛋白相对于对照受试对象中的结合蛋白的的升高的量是所述受试对象是否患有和/或存在出现下述疾病的风险的指标：2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、糖尿病的临床表现或动脉粥样硬化的临床表现(即心肌梗死和中风)。
在另一个实施方案中，测定与sdLDL颗粒结合的apoCIII和/或apoAI和/或apoE和/或apoCI的组合，结果显示，与健康对照受试对象相比，在具有和/或存在出现下述疾病的风险的受试对象中，与sdLDL颗粒结合的apoCI和/或apoAI和/或apoE的量降低，而与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量升高，所述疾病包括2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、糖尿病的临床表现或动脉粥样硬化的临床表现(即心肌梗死和中风)。
通过使用本发明的方法，对与sdLDL颗粒结合的apoCIII、apoCI、apoAI、apoE或者这些蛋白质的组合的检测和定量可用作选择临床实验患者的一种/多种生物标志。
生物标志被定义为正常生物过程、发病过程的可测量和可评价指标，或者被定义为对于例如通过施用治疗剂而进行的治疗介入的药理反应。因此，评估得到的与sdLDL颗粒结合的每一种所述结合蛋白或所述蛋白的组合的水平将在血脂障碍和/或糖尿病和/或动脉粥样硬化患者中用作生物标志，并由此提供选择I至III期研究的适宜受试对象的优异工具。评估得到的与sdLDL颗粒结合的上述蛋白的水平还可用于选择评价所述受试对象的药物介入结果的患者。
因此，用于确定受试对象中与sdLDL颗粒结合的蛋白的种类和数量的方法可以用作选择临床试验患者的生物标志，或者用作评价所述受试对象的药物介入结果的生物标志。可以使用apoCI与apoCIII的组合。在一个实施方案中，与健康对照受试对象相比，与sdLDL颗粒结合的apoCI的量减少，而与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量增多。此外，可以使用apoCI和/或apoAI和/或apoE和/或apoCIII的组合。在一个实施方案中，与健康对照受试对象相比，与sdLDL颗粒结合的apoCI、apoAI和apoE的量减少，与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量增多。
本发明还涉及一种诊断试剂盒，所述诊断用试剂盒用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性，所述试剂盒包括能够检测与sdLDL颗粒结合的蛋白并对其进行定量的蛋白质芯片。所提供的芯片具有偶联的动脉蛋白聚糖。所述芯片也可用于sdLDL结合蛋白的直接检测。所述试剂盒将提供进行本发明的方法的简单快捷的方式，从而由血样获取有关所述受试对象的状态的信息。
本发明还涉及预测受试对象的动脉内膜中层厚度的方法(参见实施例8)，所述方法包括检测所述受试对象的血样中小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
利用超速离心法分离得到的密度为1.019g/ml～1.063g/ml的血浆或血清脂蛋白被有效定义为低密度脂蛋白(LDL)(de Lalla，O.，and J.Gofman，1954，459-478，in D.Glick ed.，Methods in Biochemical Analysis，vol 1.Wiley，Interscience，New York)。1.019g/ml～1.063g/ml内的LDL可以在密度递增的重叠亚类内再次分级。利用电泳、光散射、电子显微镜或核磁共振可评价出递增的密度与递减的尺寸之间紧密相关(Krauss，R.M.，2004，Diabetes Care 27：1496-1504)。通常，密度为1.019g/ml～1.030g/ml的LDL颗粒被视为大而轻，而密度为1.030g/ml～1.063g/ml的LDL颗粒则被指定为小而密。在本发明的研究中，蛋白质组学法可用于在健康对照组与具有B表型的两类患者之间比较与小而密LDL颗粒和大LDL颗粒结合的可交换性载脂蛋白。一组患者具有外周动脉粥样硬化的亚临床迹象和代谢综合征的许多特征。所研究的第二组具有2型糖尿病。蛋白质组学评估被应用至LDL亚类，所述LDL亚类通过在具有生理盐分浓度的D2O密度梯度中进行超速离心而分离得到。使用的蛋白质组学方法涉及使用表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱(SELDITOF MS)确定与LDL亚类结合的结合蛋白，随后利用质谱(MS)和免疫印迹识别发生改变的蛋白。所得结果鉴定到与LDL密度亚类结合的载脂蛋白apoCIII、apoCI、apoAI和apoE。
该项研究的目的是探究具有亚临床动脉粥样硬化和LDL表型B的患者以及具有2型糖尿病和表型B的患者中的轻LDL亚类及密LDL亚类是否具有特定模式的结合载脂蛋白，所述模式不同于配对健康对照者的模式。第一项研究中的患者除了具有LDL B表型外，还具有比对照者明显更粗的腰围、更高的空腹胰岛素、更高空腹血糖、更高的甘油三酯和更低的HDL胆固醇(表1)。因此，他们共有代谢综合征的一些要素。所述代谢综合征可以根据Gmndy，et al.，2004、Arterioscler Thromb VascBiol，24：13e-18或Isomaa，B.，et al.，2001，Diabetes Care 24：683-689定义。
该项研究中的所有患者均表现出低度或中度颈动脉粥样硬化，并且其中的3名患者还存在股动脉粥样硬化斑块。配对对照者中没有人表现出B表型(表1)。第二项研究中的2型糖尿病患者除了具有B表型外，还具有比配对对照者更粗的腰围、更低的HDL胆固醇、更高的甘油三酯以及高得多的颈动脉及股动脉粥样斑块的发病率(表2)。
为分析与两个LDL亚类结合的可交换性载脂蛋白，使用了将载脂蛋白维持在生理盐浓度和pH的超速离心法。该方法将与循环中的LDL颗粒结合的可交换性蛋白及载脂蛋白的分布发生变化的可能性降至最低，正如以高盐浓度进行超速离心所发生的那样(MacConathy WM，Koren K，Wieland H et al，Journal of Chromatography 1985；342：47-66)。另外，可以进行包括利用SELDI分析来确定两个LDL亚类的结合蛋白的蛋白质组学方法，以及随后利用MS和免疫印迹识别已改变的蛋白质峰。该方法可以可接受的变异系数(14～24％)定量评价并识别几种载脂蛋白。结果显示，与健康对照者的对应级分相比，具有亚临床外周动脉粥样硬化、B表型的患者以及具有2型糖尿病和B表型的患者中密度为1.040～1.060±0.005g/ml的sdLDL亚类富含apoCIII(三个同种型)缺乏apoCI(两个同种型)、apoAI和apoE。此外，具有高apoCIII和低apoCI的sdLDL颗粒形式可识别80％被研究的患者，而无需任何关于人体测量的或临床化学参数的其他辅助信息。
总血浆apoCIII和与含有apoB100的颗粒结合的apoCIII是冠心病危险因素的强有力的预测因子，尤其是患代谢综合征的女性和男性中(Onat A，et al，Atherosclerosis 2003/52003；168(1)：81-89)。此外，在具有2型糖尿病和冠状疾病的患者中，具有最高apoCIII含量的LDL的四分位数相对于具有最低apoCIII含量的四分位数将新冠状事件的相对风险提高了6倍以上(Lee S-J，et al，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003；23(5)：853-858)。我们的结果说明在具有代谢综合征标志和患有2型糖尿病的患者中，致动脉粥样硬化sdLDL特别富含apoCIII，缺乏apoCI、apoAI和apoE。
小而密LDL亚类是大且富含甘油三酯的VLDL的主要代谢产物，并且近来的证据表明其apoCIII含量与其产率有关(Marcoux C，et al，Metabolism 2001；50(1)：112-119)。另外，对内脏肥大的受试对象的动力学研究显示，富含甘油三酯的VLDL中的apoCIII的高含量与其联合生产过剩及分解代谢下降有关(Chan DC，et al，Metabolism 2002；51(8)：1041-1046)。这些结果表明这样一个机制：通过该机制，在所研究的代谢综合征和2型糖尿病患者中可生成富含apoCIII的密LDL。在本研究中观察到这些患者的密LDL亚类中apoCI、apoAI和apoE的含量下降，但无法对此作出解释。一种可能是这反映出胰岛素抵抗患者的血浆中这些载脂蛋白的可用性降低，且小而密LDL(富含apoCIII的颗粒)表面对载脂蛋白的保留能力下降，正如已经在大VLDL中对于apoE显示的那样(Breyer ED，et al，J Lipid Research 1999：40(10)：1875-1882)。然而，沿着相同的推理线索可以推测，在健康对照者的密LDL中，高含量的载脂蛋白即apoAI、apoE和apoCI取代了颗粒LDL表面的apoCIII。
尽管为何sdLDL比轻颗粒更易致动脉粥样硬化的原因仍然不明，但其对于动脉蛋白聚糖的高亲和力可增大其在内膜中的保持力(动脉粥样硬化中重要的第一步)(Camejo G，et al，Pathological significance 1998；139；205-222)。我们的结果表明具有B表型的胰岛素抵抗及2型糖尿病患者具有很高的富含apoCIII的sdLDL的循环水平，从而可增强其与动脉内膜的蛋白聚糖的相互作用，由此有助于其进行原位氧化和酶修饰。此外，我们的结果显示这类颗粒缺乏apoAI，而这些颗粒已被认为可保护动脉壁中的LDL免受致动脉粥样硬化修饰(Rohrer L，et al，Current Opinion on Lipidology 2004；15(3)：269-278)。基于这些考虑，可以推测胰岛素抵抗的血脂障碍中共有的这类LDL可能是粥样斑块出现的原因之一。该作用可部分解释LDL中apoCIII增多与胰岛素抵抗及2型糖尿病中的心血管疾病风险增大之间存在明显联系。
实验部分
将通过下列非限制性实施例使本发明得到更详细的体现。在各实施例中，利用双尾Student’st检验对对照组与患者之间的差异进行评价，p＜0.05视为差异显著。
实施例1
受试对象的选择
在第一项研究中，将10名受试对象和10名年龄和性别相匹配的健康对照者进行比较，这10名受试对象具有sdLDL(B表型模式)，颈动脉中存在亚临床动脉粥样硬化，但未同时进行药物治疗，这10名对照者不具有代谢综合征的危险因子(NCEP定义，外加作为胰岛素抵抗标志的高胰岛素血症)，总胆固醇＜6.5mmol/l，没有临床心血管疾病，没有亚临床动脉粥样硬化(在颈动脉或股动脉中未出现粥样硬化斑)，并且没有进行药物治疗，在临床上是健康的(表1)。
在第二项研究中，将21名2型糖尿病患者与23名年龄和性别相匹配的健康对照者进行比较，这21名2型糖尿病患者随机选自动脉粥样硬化和胰岛素抵抗研究(Atherosclerosis and Insulin Resistance study，AIR)中的74名患者，这23名健康对照者不具有代谢综合征的危险因子，所述危险因子由NCEP指南所定义，外加作为胰岛素抵抗标志的高胰岛素血症(表2)。所有受试对象均招募自进行为期3年的追踪检测的AIR研究。早先已经对该研究进行了非常细致的描述(Hulthe J.et al，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology 2000；20：2140-2147；Sigurdardottir V，et al.，Diabetes Care 2004：27(4)：880-884)。如前人所述(Hulthe J.et al，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology 2000；20：2140-2147)，所有参加者的LDL表型均通过凝胶梯度电泳确定。Sahlgrenska大学医院的伦理委员会批准了这些研究。
表1
对照组   表型B   P值
腰围(cm)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)Tg(mmol/L)空腹血糖血浆胰岛素HsCRP     873.811.440.854.729.00.78     973.550.962.355.274.51.88   0.029＞0.30＜0.001＜0.0010.0290.0070.043
颈动脉粥样硬化斑
无小中等/大     1000     064
股动脉粥样硬化斑
无小中等/大     1000     712
研究1中的受试对象的特征，10名健康对照组和10名具有表型B及外周动脉粥样硬化的患者。
表2
    对照组     表型B     P值
腰围(cm)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)Tg(mmol/L)空腹血糖血浆胰岛素HsCRP 3.571.550.874.6465.10.78 3.401.102.089.295.61.88     ＜0.001＞0.30＜0.001＜0.001＜0.0010.0040.043
颈动脉粥样硬化斑
无小中等/大     1503     568
股动脉粥样硬化斑
无小中等/大     1813     1109
研究2中的受试对象的特征，23名健康对照组和21名患有2型糖尿病、具有表型B及外周动脉粥样硬化的患者。
实施例2
LDL级分
如前人所述(Hallberg C，et al.，Journal of Lipid Research 1994；35：1-9)，利用在预形成梯度的缓冲液中进行超速离心自血清样品(1.0-1.35ml)分离LDL密度亚类，所述预形成梯度的缓冲液含有140mM NaCl、10mM Na2EDTA、Hepes 10mM，pH为7.2，并在不同量的氧化氘(D2O)中制备得到。通过梯度的上移收集各级分。以牛血清白蛋白作为标准品，根据制造商的说明书，使用DC蛋白质含量测定(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测定LDL级分的总蛋白含量。通过使用抗人apoB抗体(Dakopatts，Denmark)的比浊法测定LDL级分中的apoB。利用比色法(Roche Diagnostics，RmBH，Manheim，Germany)测定总胆固醇。通过重量分析法(Hallberg C，et al.，Journal of Lipid Research 1994；35：1-9)确定所用溶液的密度和离心后的梯度溶液的密度。利用基本上由Krauss和Burke(Krauss RM，et al.，Journal of Lipid Research 1982；23：97-104)描述的梯度凝胶电泳评价LDL亚类的直径。
图1中显示了具有B表型的受试对象和健康对照者血清的D2O缓冲液中的密度梯度分级分离分布图。收集0.5ml级分获得ApoB分布图，然而对于蛋白质组学分析来说，使用1.0ml级分以使后续分析维持在易处理的数量内。如图1中所示，通过该操作，级分4含有密度为1.030～1.040±0.005g/ml的LDL---研究1中来自全部对照受试对象的最丰富的LDL亚类。该级分在大小范围上大概对应于Krauss的LDL2b-LDL3a范围的大小范围(Krauss RM，Diabetes Care 2004；27(6)：1496-1504)。级分5含有密度为1.040～1.060±0.005g/ml的LDL，它大概对应于Krauss的级分LDL3b至4b的大小范围(Krauss RM，Diabetes Care 2004；27(6)：1496-1504)(图1)。在研究1中，10名具有B表型的研究受试对象中有8名中的该级分为丰富的类。在第二项研究中，23名对照者中有20名表现出最大量的级分4，21名2型糖尿病患者中有19名表现出最大量的级分5。这些结果表明，D2O密度梯度与使用凝胶电泳方法确定的LDL表型有联系，且显示出在两种类型的患者中sdLDL都极为丰富(Hulthe J.et al，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology 2000；20：2140-2147)。
实施例3
LDL结合蛋白的SELDI分析
在两项研究中，分别使用50mM醋酸铵(pH6.0)和50mM Tris-HCL(pH9.0)在两类蛋白质芯片(阳离子型(CM10)蛋白质芯片和阴离子型(Q10)蛋白质芯片)表面上对来自全部受试对象的LDL级分4(密度为1.020～1.040g/ml)和LDL级分5(密度为1.040～1.060g/ml)进行分析。使用经改进以利用蛋白质芯片阵列生物处理器(CiphergenBiosystems)的Biomerk实验室工作站(Beckman-Coulter)对全部样品进行处理。将20μl各LDL级分与80μl结合缓冲液混合，并将混合物添加至芯片表面然后孵育30分钟。接着分别用100μl结合缓冲液将斑点洗涤3次，每次5min，以减少非特异性结合，最后用100μl去离子水洗涤两次。使用包含芥子酸(SPA)(Aldrich Chem Co，Milw，WI)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(Bruker Daltonics，Germany)的两种不同类型的基质。将SPA(1∶2 v/v稀释)或CHCA(1∶5v/v稀释)的饱和溶液与含有0.5％TFA的50％乙腈对各干燥样品斑点施用两次以形成晶体。
随后在用于SELDI分析的蛋白质芯片读取系统(PBS II，CiphergenBiosystems)中读取各阵列。使用在SPA/CHCA基质中稀释的全部蛋白(all-in-protein)/肽标准品对读取器进行外部校准，然后将读取器直接应用于亲水(normal phase)的蛋白质芯片(NP-20蛋白质芯片阵列)的斑点。在对一个实验中所收集的所有谱的全部离子流进行标准化之后，比较蛋白质分布图。显著阈值设定为p＜0.05。
通过SELDI在Q10(阴离子型)和CM10(阳离子型)蛋白质芯片阵列上对与LDL亚类结合的结合蛋白进行分析，该分析平行进行两次，变异系数介于14～24％之间。图2给出对研究2中的患者和对照者的sdLDL分析得到的分子量介于4000-10000Da的代表性分布图，所述分析使用SELDI在Q10蛋白质芯片阵列上进行。已观察到与对照者比较，患者的质量为8920、9420和9720Da的sdLDL的条带具有明显更高的强度。所有这三个条带均用1-D凝胶与电洗脱进行纯化，随后进行SELDI分析，再通过MS/MS分析由其相应的肽离子(peptide ion)识别为人类apoCIII。这三种多晶型物质(polymorph)在分子量上的差异表明它们代表不同的sialidation状态(Pullinger et al.，1997)。图3描述了研究2中患者和对照者的分子量介于3000至8000Da的分布图，所述数据是使用SELDI在CM10蛋白质芯片阵列分析得到的。对照者的sdLDL中6420与6620Da这两个条带明显比患者的显著。这两个条带也用1-D凝胶分析与电洗脱进行提纯，随后进行SELDI，再通过免疫印迹识别为apoCI。ApoCI的两个条带可能代表不同的糖化状态。而且，10000～50000Da质量范围内的SELDI分析可识别和评价两个LDL亚类中的apoAI和apoE。与患者的相比，对照者的sdLDL中apoAI和apoE最显著(数据未显示)。
表3显示了在两项研究中，在用apoB100的含量进行校正后sdLDL(级分5)中被识别的载脂蛋白的相对含量。在研究1中，与配对对照者的等密度级分相比，患者的sdLDL的apoCIII的三个同种型的含量明显更高。另一方面，患者在其sdLDL类中的apoCI、apoAI和apoE的含量明显比对照者的低。在同样对2型糖尿病患者和配对对照者的LDL亚类进行分析的研究2中，患者的sdLDL也明显含有比配对对照者的等密度级分显著更多的apoCIII的三种同种型以及更低含量的apoCI、apoAI和apoE。
此外，在对照者中，sdLDL中的apoCIII和apoCI的含量明显高于轻颗粒中的含量(图4)。在患者中，sdLDL中也具有比轻LDL中更高含量的apoCIII，但没有apoCI(图4)。
表3两项研究中具有LDL表型B的患者及配对对照者的sdLDL(Fr5)中的可交换性载脂蛋白
    研究1   研究2
载脂蛋白     对照者(n＝10)     患者(n＝10)   对照者(n＝23)     患者(n＝22)
  CIII-1(8920)     4.29±2.76      6.89±4.71***   3.48±1.54     6.40±2.43***
  CIII-2(9420)     7.30±5.16      11.84±6.14***   6.23±2.78     11.00±4.19***
  CIII-3(9720)     3.83±2.84      5.38±2.09***   3.36±1.22     5.28±1.87***
  CI-1(6430)     7.57±1.46      6.64±2.76*   7.24±3.09     4.30±2.79**
  CI-2(6630)     6.20±1.59      4.57±1.65*   11.33±5.66     6.95±4.64**
  AI(28130)     0.40±0.44      0.29±0.26*   1.22±1.29     0.57±0.58**
  E(33570)     0.85±0.59      0.42±0.35*   1.49±0.64     1.13±0.53*
数值为平均值±标准偏差(强度任意单位)，由两项研究的患者和对照者中的小而密LDL的apoB100的含量校正。括号里的数值是分子量(Da)。密LDL类级分(fr5)和来自对照者的相同级分之间的载脂蛋白含量的差值的统计显著水平(p)由t检验评价。显著水平：*p＜0.05，**p＜0.0 1，***p＜0.001
实施例4
差异表达的蛋白质峰的提纯
收集来自具有B表型的受试对象的LDL级分5的等分试样并通过真空离心浓缩，溶解在200μl NuPAGE样品缓冲液(0.14M Tris、0.10M tris-HCL、0.4mM EDTA，pH8.5，含有10％甘油、2％LDL和3％DTT)中，沸腾3分钟，然后使用4～12％Bis-Tris凝胶(1well)通过NuPAGE体系(Novex(预制凝胶)，San Diego，CA，USA)进行分离。NuPAGE(2-(N-吗啉)乙磺酸)MES缓冲体系(1M MES、1M tris、69mMSDS、20mM EDTA)用作电泳用缓冲液。按照制造商的说明书将小型全凝胶洗脱仪(Bio-Rad)用于电洗脱。使用洗脱用缓冲液(25mM组氨酸、30mM 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)，pH6.5)，并在100mA洗脱30分钟。收集约0.5mL的十四个级分，并浓缩250μl等分试样/级分，利用NuPAGE体系进行分析，随后进行SYPRO Ruby染色，随后利用MS对蛋白条带进行识别。凝胶洗脱级分的残留部分与冰冷的乙醇以1∶4(v/v)的比率混合，在-20℃沉淀2小时，在4℃以10000xg离心10分钟，溶解在10μl 25mM的NH4HCO3中，然后在NP20蛋白质芯片阵列上进行分析，目的是利用SELDI分析实施提纯方法。
实施例5
LDL结合蛋白(apoCIII、apoAI、apoE)的MS分析
对于后续的MS分析，如前人所述(Bjrhall K，Proteomics 2004；5(1)：307-317)，将在1-凝胶中检测到的条带用胰蛋白酶消化，并利用MS进行分析。简单地说，使用测序级经过修饰的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)消化凝胶块，并用甲酸和乙腈萃取肽。为增大MS模式中的肽离子的信号并能够进行MS/MS分析，按照制造商的说明书，使用POROS20-树脂(Perseptive Biosystems，Framingham，MA，USA)进行脱盐和浓缩。用2μl 70％的ACN、0.1％TFA将肽直接洗脱至MALDI100位靶板。使斑点干燥，然后施用1.25μl基质溶液CHCA(AgilentTechnologies，Waldbronn，Germany，用50％乙腈、0.1％三氟乙酸和终浓度为0.2mg/ml的柠檬酸二铵1∶1稀释)。然后以反射模式在AppliedBiosystem4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF-TOF质谱仪(AB，Framingham，MA，USA)上进行分析。使用GPS ExplorerTM软件(AppliedBiosystems，Framingham，MA，USA)分析MS和MS/MS数据，该软件利用Mascot肽质量指纹分析和MS/MS离子搜寻软件(Matrix sciences，London，UK)。置信水平为95％时可认为鉴定结果为阳性。用1-D凝胶和电洗脱进行提纯后，质量为8920、9420和9720Da的峰识别为apoCIII，随后用MS/MS分析识别其相应的肽离子。提纯操作后进行SELDI分析。利用所述的用于apoCIII的系列步骤将28130和33570Da处的峰被分别识别为apoAI和apoE。
实施例6
apoCI的免疫印迹分析
在对电洗脱级分(含有分别由SEIDI分析得到的6420和6620Da条带)进行1-D凝胶分析后，使用半干印迹技术将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)上。用1∶2000稀释的抗apoCl抗体(Biosciences)(0.02μg/mL)孵育所述膜。对于免疫印迹方法，使用Western Breeze试剂盒(Invitrogen)。条带显示出apoCl具有免疫反应性。
实施例7
LDL与动脉蛋白聚糖的结合
按照前人所述的方法(Lindén T，et al，Eur J Clin Invest 1989；19：38-44)(对之略有改动)，使用从猪主动脉内膜中层中分离出的提纯多能聚糖使血清LDL与蛋白聚糖结合。简言之，将50μl血清加入1.0ml缓冲液A中，所述缓冲液A包含10μg/ml己糖醛酸(hexuronate)多能聚糖、20mM NaCl、10mM CaCl2、2mM MgCl2和5mM HEPES缓冲液，pH为7.0。还将血清加至装有不含多能聚糖的缓冲液A的空白试管中。将各试管在4℃孵育1小时，并在4℃以12000xg离心10分钟，然后用1.0ml缓冲液A洗涤沉淀并弃去上清液。将最终的沉淀溶解在100μl缓冲液B中，所述缓冲液B包含140mM NaCl、5mM Na2-EDTA和10mM Tris碱，pH为10.5。所述溶液的等分试样用于胆固醇测定，并用于与通过蛋白聚糖从血清中沉淀出的LDL结合的可交换性载脂蛋白的SELDI分析。
如前人所述(Lindén T，et al，Eur J Clin Invest 1989；19：38-44)进行的动脉多能聚糖与血清的孵育导致沉淀出大部分LDL。当以apoB100差值进行校正时，如所预期的那样，来自研究2的患者血清的与蛋白聚糖结合的LDL胆固醇(PG-LDL)的量比来自对照者血清的量高出约32％(115±15μg与PG结合的胆固醇/mg apoB(患者)对80.0±9(对照者)，p＜0.05)。此外，对PG-LDL复合物的SELDI分析表明，患者的不溶性LDL包含的apoCIII、apoCIII-2和apoCIII-3比对照者的复合物的分别多出57、65和58％，例如0.70±0.38任意单位的apoCIII-3(患者)对0.30±0.10(对照者)，p＜0.001(图5)。在患者与对照者之间apoCI和apoE的水平(p＜0.05)分别显著改变。在apoAI水平上未发现在统计学上存在显著差异。根据这些研究结果发现，研究2中的患者的sdLDL的总apoCIII含量与血清的利用PG复合的LDL胆固醇的量之间显著相关(图6)。在对照组的sdLDL中的apoCIII含量与利用动脉多能聚糖而不溶的LDL胆固醇之间不存在显著相关。
实施例8
由apoB水平校正、与sdLDL结合的蛋白质和心血管危险因子及动脉粥样硬化之间的关系
在证实了sdLDL中的可交换性载脂蛋白间存在差异的假说后，本发明的目的是解释是否蛋白质的该组成与心血管危险因子、炎症和亚临床动脉粥样硬化相关。通过使用SPSS for Windows 10.0(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)分析全部统计数据。结果表示为数字、(％)、平均值和SD。
ApoC-III除了始终与血清中的炎症标志和基质金属蛋白酶-9正相关之外，还与传统的危险因子正相关。ApoA-I和apoE以及apoC-I显示出与上述标志的反相关(表4)。
ApoCIII与颈总动脉中的内膜中层厚度正相关(r＝0.35，p＝0.02)。apoCI、apoE和apoAI分别与股动脉(r＝-0.34，p＝0.03)、颈动脉球部(r＝-0.43，p＝0.01)和颈总动脉(r＝-0.38，p＝0.01)中的平均IMT反相关。ApoCIII/apoCI的比率与颈动脉球部和股动脉中的IMT显著相关(分别为r＝0.31，p＝0.049；r＝0.38，p＝0.02)。另外，该比率也倾向于与颈总动脉(r＝0.29，p＝0.06)中的IMT相关。
表4由fr5中的apoB校正、与小而密LDL(fr5)结合的蛋白、与心血管危险因子之间的关系，以Spearman的相关系数表达。
    ApoC-III     ApoA-I     Apo-E    ApoC-I
 ApoC-III(血浆)     0.52     -0.31     -0.31
 ApoA-I(血浆)     0.33     0.56
 SBP     0.58     -0.37     -0.31
 WHR     0.57     -0.38     -0.42
 fB-葡萄糖     0.38
 胰岛素原     0.57     -0.40     -0.44
 甘油三酯     0.71     -0.69     -0.39     -0.32
 HDL     -0.47     0.63     0.58     0.31
 LDL     -0.46
 OxLDL     0.43     -0.46     -0.48
 纤维蛋白原     -0.40
 CRP     0.52     -0.30     -0.39
 IL-18     0.45
 MMP-9     0.32     -0.49     -0.33     -0.38
实施例9
利用sdLDL中的apoAI、apoCI、apoCIII或apoE以及血浆中的apo-A1和apoC-III的中值确定患糖尿病的比值比
结合小而密LDL的蛋白浓度由级分5中的apoB校正。在单变量分析中，血浆中的apo A-I和apoC-III，以及级分5中的apoCIII、apoA-I和apoC-I均与成为糖尿病患者的的危险显著相关(表5)。ApoE未显示出在统计学上与糖尿病显著相关。由于apoC-III的血浆水平与apoC-III的LDL结合水平均与患糖尿病的危险相关，因此在多元对数回归分析中包括所述这两个变量。该分析的结果显示仅有sdLDL中的apoC-III是独立的糖尿病预测因子(表6)。当在同一多元对数回归模型中包含所有与sdLDL结合的蛋白质(在单变量分析中，这些蛋白质均与患糖尿病的危险相关)时，apoC-III与apoC-I(情况相反)被证明是独立的糖尿病预测因子(表7)。
无需任何关于患者及对照者的临床特征的更多信息，中值以上和以下的与sdLDL结合的apoC-III可分别将76％的患者和74％的对照组准确地分类为患有糖尿病或未患糖尿病。对于低apoC-I及高apoC-I还可获得类似的数字(数据未示出)。
表5高水平及低水平(分别在中值以上和以下)的受试对象患糖尿病的单变量比值比。小而密LDL结合蛋白(fr5)的数值由fr5中的apoB校正。
    比值比     P值
ApoCIII血浆ApoCIIIfr5ApoAl血浆ApoAlfr5ApoEfr5ApoClfr5     3.89.00.160.270.400.11     0.0380.0020.0090.0380.1350.002
表6血浆及小而密LDL中高及低(分别在中值以上和以下)apoCIII值的受试对象患糖尿病的多变量比值比。小而密LDL结合apoCIII(fr5)的数值由fr5中的apoB校正。
    比值比     P值
  ApoCIII血浆ApoCIIIfr5     2.27.3     0.2700.006
表7在具有小而密LDL结合蛋白高及低(分别在中值以上和以下)值的受试对象患糖尿病的多变量比值比。小而密LDL结合蛋白(fr5)的数值由fr5中的apoB调整。
    比值比     P值
 ApoCIIIfr5ApoAlfr5ApoClfr5ApoEfr5     10.40.7720.090.603     0.009＞0.3000.008＞0.300

Claims (23)

1.一种用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性的方法，所述方法包括检测所述受试对象的血样中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试对象的所述疾病状态根据与sdLDL结合的蛋白质的数量和类型来确定。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法针对由所述血样分离出的血清进行。
4.如权利要求3所述的方法，其中，包含sdLDL颗粒的级分自所述血清分离得到。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，将所述sdLDL颗粒上的结合蛋白的量与对来自健康的对照受试对象定量得到的量相比较。
6.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述sdLDL颗粒上的结合蛋白的量的检测和定量利用表面增强激光解吸离子化(SELDL)分析进行。
7.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述sdLDL颗粒通过运行密度梯度超速离心自血液或血清分离。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述密度梯度超速离心利用在D2O中制备的缓冲液进行。
9.如权利要求3～6中任一项所述的方法，其中，所述sdLDL颗粒通过用动脉蛋白聚糖溶液使所述sdLDL颗粒从所述血清中沉淀出来进行分离。
10.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述结合蛋白选自由载脂蛋白CIII、载脂蛋白CI、载脂蛋白A1和载脂蛋白E组成的组。
11.如权利要求5～10中任一项所述的方法，其中，与sdLDL颗粒结合的一种或多种结合蛋白相对于对照受试对象中的结合蛋白的升高的量是所述受试对象是否患有2型糖尿病的指标。
12.如权利要求5～10中任一项所述的方法，其中，与sdLDL颗粒结合的一种或多种结合蛋白相对于对照受试对象中的结合蛋白的降低的量是所述受试对象是否患有2型糖尿病的指标。
13.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，与健康的对照受试对象相比，与sdLDL颗粒结合的载脂蛋白CI和/或载脂蛋白A1和/或载脂蛋白E的量降低，与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量升高。
14.一种用于确定与sdLDL颗粒结合的蛋白的类型和数量的方法作为选择用于临床试验的患者的生物标志的用途。
15.一种用于确定受试对象中与sdLDL颗粒结合的蛋白的类型和数量的方法作为用于评价所述受试对象的药物介入的结果的生物标志的用途。
16.如权利要求14或15所述的用途，其中，使用载脂蛋白CI与载脂蛋白CIII的组合。
17.如权利要求14或15所述的用途，其中，使用载脂蛋白CI、载脂蛋白A1、载脂蛋白E与载脂蛋白CIII的组合。
18.如权利要求14～15任一项所述的用途，其中，与健康的对照受试对象相比，与sdLDL颗粒结合的apoCI的量降低，与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量增多。
19.如权利要求18所述的用途，其中，与健康的对照受试对象相比，与sdLDL颗粒结合的载脂蛋白CI和/或载脂蛋白A1和/或载脂蛋白E的量降低，与sdLDL颗粒结合的apoCIII的量增多。
20.一种诊断用试剂盒，所述诊断用试剂盒用于诊断或预测受试对象出现2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的敏感性，所述试剂盒包括能够检测与sdLDL颗粒结合的蛋白并对其进行定量的蛋白质芯片。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，所述芯片具有偶联的动脉蛋白聚糖。
22.如权利要求20～21所述的试剂盒，其中，所述芯片用于sdLDL结合蛋白的直接检测。
23.一种用于预测动脉内膜中层厚度的方法，所述方法包括检测所述受试对象的血样中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)颗粒上的结合蛋白并确定其量。
CNA2006800144529A 2005-04-11 2006-04-10 一种用于诊断 2型糖尿病、代谢综合征、亚临床动脉粥样硬化、心肌梗死、中风或糖尿病的临床表现的方法和试剂盒 Pending CN101166981A (zh)

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