CN118010902A - 一种荜茇样品特征图谱的构建方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荜茇样品特征图谱的构建方法及检测方法。本发明通过采用超高效液相色谱法，并对色谱条件进行合理控制，找出同时适用于荜茇药材、饮片、水提物及其标准汤剂和配方颗粒等的超高效液相色谱条件，从而构建荜茇样品的特征图谱。本发明的特征图谱包含10个特征峰，使荜茇的质量控制从原来的单个成分的含量测定或少数几个共有峰的测定，上升到对荜茇样品内在品质的整体把控，为荜茇及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药分析和中药质量控制领域，具体涉及一种荜茇样品特征图谱的构建方法及检测方法。
背景技术
荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗。其味辛，性温。归脾、胃、肾、膀胱经。具有温中散寒、行气止痛之功效。用于胃寒呕逆，脘腹冷痛，寒疝腹痛，寒湿瘀滞，小便浑浊。现代药理研究发现，荜茇还兼有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化，调节体内代谢以及免疫调节等作用。
荜茇在临床上的使用多以汤剂为主，汤剂的有效成分含量直接影响中药的临床有效性，而依靠现代设备生产的中药配方颗粒，正是以标准汤剂为基准进行生产的。为保证从药材到标准汤剂到配方颗粒，这个过程中化学成分的一致性，亟需一种检测方法，该检测方法不仅能够检测荜茇药材，还适用于荜茇标准汤剂及其中药配方颗粒等的检测，对荜茇现代制剂的质量检测与控制至关重要。2020年版《中国药典》将胡椒碱的含量作为荜茇的质量评价指标，但由于中药有效成分多样性及复杂性，单一成分的含量测定不足以说明药材的内在质量，亦缺乏专属性。而UPLC特征图谱能够提供更为全面、丰富的信息。市场上同为胡椒科属的假蒟因与荜茇外形相似，常有混用现象。文献报道(崔国静,刘芳.荜茇与其伪品假蒟[J].首都食品与医药,2015,0(9)；许亚玲,田静,舒娟.荜茇与其伪品假蒟子的鉴别[J].贵阳中医学院学报,2005,27(4).等)主要采用原植物和药材饮片的性状、理化、显微、薄层鉴别和胡椒碱含量，性状鉴别依赖于有经验的中药鉴定人员，外观相似容易出错，且对于经水提取后失去药材性状的标准汤剂、配方颗粒而言，性状、理化、薄层均难以鉴别荜茇的真伪。而通过胡椒碱的含量作为鉴别点，只通过一种特征成分鉴别易造成错检，不全面。目前还没有通过UPLC指纹图谱/特征图谱鉴别荜茇及其伪品的报道。因此，有必要建立一种全面、准确、快速、专属性强的检测方法，该检测方法不仅能够检测荜茇药材、饮片、水提物，并且还适用于荜茇标准汤剂及其配方颗粒等的检测，对荜茇现代制剂的质量检测以及真伪鉴别至关重要。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明的目的在于提供一种荜茇样品的特征图谱的构建方法，通过该方法构建的特征图谱能整体控制荜茇药材、饮片、水提物以及标准汤剂和/或配方颗粒等的质量。
进一步地，本发明的目的还在于提供一种荜茇样品的检测方法，该方法简单高效、结果客观、精密可靠、专属性强、灵敏度高，稳定性和耐受性好，并且能够区分荜茇的真伪，以及更进一步地，可以鉴别荜茇与假蒟。
用于解决问题的方案
通过发明人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：
[1]一种荜茇样品特征图谱的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：
(a)对照品溶液制备：包括分别取荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品制备对照品溶液的步骤；
(b)供试品溶液制备：用提取溶剂对荜茇样品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述荜茇样品为荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；
(c)特征图谱的建立：采用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析建立特征图谱；
所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.6～1.8μm的色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，以冰醋酸或0.1～0.5wt％的冰醋酸水溶液为流动相B；
梯度洗脱程序：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至62％；5min～7min，所述流动相A的体积百分比由62％上升至70％；7min～10min，所述流动相A的体积百分比由70％上升至85％；10min～15min，所述流动相A的体积百分比由85％上升至90％；15min～23min，所述流动相A的体积百分比保持90％。
[2]根据[1]所述的构建方法，其中，所述特征图谱包含10个峰，其中峰1为荜茇宁，峰2为胡椒碱，峰5为假荜茇酰胺B。
[3]根据[1]或[2]所述的构建方法，其中，以峰5为参照峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10与峰5的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，所述峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9和峰10对应的规定值分别为0.52、0.92、1.24、1.69、1.92、1.98和2.04。
[4]根据[1]～[3]任一技术方案所述的构建方法，其中，供试品溶液制备包括：
用甲醇或包含甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液对荜茇药材进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液；
或者，用甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液对荜茇标准汤剂进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液；
或者，用甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液对荜茇配方颗粒进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液；
[5]根据[4]所述的构建方法，其中，所述超声提取的时长为15min～60min，功率为250W～300W，频率为35kHz～45kHz。
[6]根据[1]～[5]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述对照品溶液制备包括加甲醇或者包含甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液制成每1ml含荜茇宁对照品5μg～20μg、胡椒碱对照品10μg～50μg、假荜茇酰胺对照品B2μg～25μg的对照品溶液。
[7]根据[1]～[6]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述对照品溶液制备还包括取适量荜茇对照药材，加入甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液，超声处理30分钟，摇匀，滤过，即得。
[8]根据[1]～[7]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述色谱柱的柱长为100mm，内径为2.1mm；所述色谱条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，检测波长为250nm～280nm。
[9]本发明还提供一种荜茇样品的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测荜茇样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；所述荜茇样品为荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与权利要求1～8任一项所述的构建方法构建的特征图谱进行比较以检测荜茇样品的质量和/或真伪；
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.6～1.8μm的色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，以冰醋酸或0.1～0.5wt％的冰醋酸水溶液为流动相B；
梯度洗脱程序：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至62％；5min～7min，所述流动相A的体积百分比由62％上升至70％；7min～10min，所述流动相A的体积百分比由70％上升至85％；10min～15min，所述流动相A的体积百分比由85％上升至90％；15min～23min，所述流动相A的体积百分比保持90％。
[10]本发明还提供一种[9]所述的检测方法在鉴别荜茇与假蒟中的应用。
发明的效果
本发明选择同时适用于荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物及其标准汤剂和/或中药配方颗粒的超高效液相色谱条件，以药材、标准汤剂或/和中药配方颗粒为供试品进行检测，从而构建特征图谱，该特征图谱包含10个特征峰，不仅能够反映荜茇药材的质量，而且还能反映荜茇饮片、水提物、标准汤剂和中药配方颗粒等的质量，尤其是能同时适用于荜茇药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的质量检测，为荜茇及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法，也为荜茇及其现代制剂的质量综合评价提供了科学的实验依据。
采用该特征图谱对荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物以及标准汤剂和中药配方颗粒进行检测，简单、快速、高效，结果客观，精密可靠，专属性强，灵敏度高，稳定性和耐受性好，尤其适用于荜茇药材、标准汤剂和/或配方颗粒，还能够将正品荜茇与伪品假蒟区分开来。本发明的特征图谱包含10个特征峰，使荜茇的质量控制从原来的单个成分的含量测定或少数几个共有峰的测定，上升到对整个荜茇的内在品质的把控以及专属性鉴别。
本发明首次将超高效液相色谱法应用于荜茇药材及其现代制剂的质量检测，弥补了荜茇药材及现代制剂质量检测的空白，从内在质量上实现了荜茇从药材到中药配方颗粒上的质量把控及专属性鉴别，既能解决因原材料外观的缺失而造成饮片、水提物以及标准汤剂、中药配方颗粒鉴别困难的问题，也能从源头至终端产品上削减混伪品给中药市场带来的不良影响，从而确保荜茇药材、饮片、水提物以及标准汤剂、配方颗粒的质量，有利于保障临床用药的安全有效。
本发明方法简单，重现性好，准确可靠，便于操作，相比于HPLC来说，节约时间，通过优化色谱条件使得检测时间缩短为23min，溶剂消耗量少，对环境污染小。本发明的图谱各特征峰分离度较好，通过对照品及质谱信息确认了全部特征峰的化学信息，专属性较强，分析效率高，稳定性高，重复性好，适用范围广,而且适用于荜茇药材标准汤剂及配方颗粒等产品的检测，尤其适合规模化生产的检测与监控。
需要说明的是，上述的记载并不是公开了本发明的全部实施方式和本发明的全部优点。
附图说明
图1是本发明对流动相的考察结果的特征图谱。
图2是本发明洗脱时间梯度1的考察结果。
图3是本发明洗脱时间梯度2的考察结果。
图4是本发明洗脱时间梯度3的考察结果。
图5是本发明实施例1中对照品的特征图谱。
图6是本发明实施例1中荜茇15批药材叠加特征图谱。
图7是本发明实施例1中荜茇15批标准汤剂叠加特征图谱。
图8是本发明实施例1中荜茇3批配方颗粒叠加特征图谱。
图9是本发明实施例1中荜茇药材对照特征图谱。
图10是本发明实施例1中荜茇标准汤剂对照特征图谱。
图11是本发明实施例1中荜茇配方颗粒对照特征图谱。
图12是本发明实施例1中荜茇特征图谱不同柱温考察。
图13是本发明实施例1中荜茇特征图谱不同流速考察。
图14是本发明实施例1中荜茇特征图谱不同色谱柱考察。
图15是本发明实施例6中荜茇和假蒟标准汤剂特征图谱对比图。
图16是本发明实施例6中荜茇和假蒟药材特征图谱对比图
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。另外，本说明书中记载的文献全部作为参考文献在本说明书中进行援引。
除非另有定义，本说明书中所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
在描述本说明书的上下文中(尤其在所附权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该(所述，the)”和类似的语言将被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指示或与上下文明显矛盾。
本说明书中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“一些具体/优选的技术方案”、“另一些具体/优选的技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
除非另有说明，本文中所使用的术语“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，通常由国家药品检定机构审查认可，其标准应不低于制品的质量标准。
除非另有说明，本文中所使用的术语“供试品”是指用作检测或鉴定的实验样品。
除非另有说明，本文中所使用的术语“精密称定或精密称取”是指称取重量应准确至所取重量的千分之一，术语“称定”是指称取重量应准确至所取重量的百分之一，术语“精密加入”是指量取体积应准确至所取体积的千分之一，术语“精密吸取”是指通过微量进样器来准确量取样品的操作方式。
除非另有说明，本文中所使用的术语“续滤液”是指过滤时弃去初滤液后继续收集的滤液。与初滤液相比，续滤液更加接近样品的真实浓度，因为过滤介质(如滤膜、滤纸等)有可能会吸附溶质，因而造成初滤液中样品浓度偏低；另外，续滤液更加干净，因为被过滤介质吸附的溶质可以形成滤饼，降低了过滤孔径，因而能够截留更微小的微粒。
除非另有说明，本文中所使用的术语“超高效液相色谱”(或称“UPLC”)是指在高效液相色谱(HPLC)的基础上开发一种全新技术，具有填料颗粒小、检测速度快、分析通量大、灵敏度高等特点。
除非另有说明，本文中所使用的术语“保留时间”是指被分离组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时为止所经历的时间，即从进样开始到出现被分离组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间；术语“相对保留时间”是指被分离组分的校正保留时间与标样的校正保留时间之比。
除非另有说明，本文中所使用的术语“参照峰”(或称“对照峰”)是指在计算相对保留时间时标样所对应的色谱峰。
除非另有说明，本文中涉及溶液浓度百分比“％”是指体积百分比。比如0.1％磷酸水溶液是指将1mL的磷酸加纯水至1000mL，由于量筒不建议作为混合溶液的容器，故0.1％磷酸水溶液也约等于将1000mL纯水与1mL的磷酸混合均匀。
<荜茇样品的特征图谱的构建方法>
本发明的荜茇样品的特征图谱的构建方法，主要包括如下步骤：
(a)对照品溶液制备：分别取荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品制备对照品溶液；进一步地，以水、醇或醇-水溶液溶解对照品。在本发明的一些具体实施方式中，上述对照品溶液的制备方法如下：取对照品适量，精密称定，加入前述溶剂，混匀至溶清，即得。进一步地，提取溶剂为醇或醇-水溶液，如甲醇、甲醇-水溶液，更进一步地，甲醇-水溶液中的甲醇体积分数不低于20％，优选提取溶剂的浓度以甲醇的体积分数计为70％～90％。更具体地，荜茇宁对照品浓度为5μg～20μg/mL、胡椒碱对照品浓度为10μg～50μg/mL、假荜茇酰胺B对照品浓度为2μg～25μg/mL。
(b)供试品溶液制备：用提取溶剂对荜茇样品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述荜茇样品可以为荜茇药材、荜茇标准汤剂、水提物、饮片、和/或荜茇配方颗粒，在本发明一些具体的实施方案中，所述荜茇样品可以为荜茇药材、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；其中，“药材”或“生药”是指未经加工或未制成成品的中药原料；“标准汤剂”是指以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂；“配方颗粒”是由单味中药饮片按传统标准炮制后经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。在本发明的一些具体实施方式中，提取溶剂选自甲醇或者包含甲醇体积百分比为20％～90％的甲醇水溶液，为了获得更好的峰型(或峰形)、综合考虑总提取效率，提取试剂优选为甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液或甲醇；更优选甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液或甲醇。关于提取方式，对于荜茇药材，优选先对药材粉末进行过筛，优选地可以采用四号筛，为了获得更丰富的色谱峰信息，提取可采用超声、加热回流的方式进行，优选采用操作更简便的超声处理提取方式，在本发明的一些优选实施方式中，采用甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液或甲醇对过筛后的荜茇药材粉末进行提取，更优选的为采用甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液或甲醇对过筛后的荜茇药材粉末进行提取；采用的提取方式为超声处理，功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz；更进一步地，综合考虑各个色谱峰的提取效率，超声提取的时长为15min～60min。对于荜茇标准汤剂，是对药材先进行前处理、煎煮、低温浓缩、冷冻干燥等工序得到冻干粉，优选对冻干粉进行研细处理，之后优选采用甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液或甲醇进行提取，提取采用超声、加热回流或振摇的方式均可以进行，为了使提取操作简便，优选采用超声处理的方式，超声的功率、频率对本发明影响不大，更进一步地，超声提取的时长为15min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz。在本发明的一些具体实施方式中，提取溶剂相对于荜茇样品的添加量为300～600mL/g，进一步为350～550mL/g，更进一步地，对于荜茇粉末而言，提取溶剂相对于荜茇粉末的添加量为400～500mL/g；对于荜茇标准汤剂或荜茇配方颗粒，提取溶剂的相对添加量为450～520mL/g。供试品浓度太小很可能不利于色谱峰的检出，浓度太大则色谱柱超载容易导致色谱峰峰形不佳。在本发明的一些具体实施方式中，供试品溶液的制备方法如下：取荜茇药材适量，粉碎，过筛(四号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50～90％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声处理15min～60min，放冷，再称定重量，用体积分数为60％～80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或者，取荜茇标准汤剂或荜茇配方颗粒适量，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50～90％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声处理15min～60min，放冷，再称定重量，用体积分数为60％～80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；其中，荜茇药材、荜茇标准汤剂或荜茇配方颗粒与体积分数为50～90％的甲醇水溶液的质量体积比为1g:(200～600mL)。
(c)特征图谱的建立：采用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析建立特征图谱；
本发明通过深入的研究确定同时适用于荜茇药材、饮片、水提物及其标准汤剂和/或配方颗粒的超高效液相色谱条件，其包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径(填料粒径)为1.5～2μm的色谱柱；进一步地，为了获得更优的柱效，粒径为1.6～1.8μm；更进一步地，色谱柱柱长为100～150mm，内径为2.1mm。在本发明的一些具体实施方式中，所述色谱柱选自Eclipse Plus C18RRHD(Agilent，2.1mm×100mm,1.8μm)、CORTECS T3(Waters,2.1×100mm,1.6μm)、BEH C18(Waters,2.1×100mm,1.7μm)中的任意一种；更进一步地，色谱柱优选使用Eclipse PlusC18 RRHD(Agilent,2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱，使用该色谱柱进行分离，特征峰的分离度更好，图谱整体比较美观。
流动相：以乙腈为流动相A，以冰醋酸或0.05～0.7wt％的冰醋酸水溶液为流动相B；在本发明的一些优选实施方式中，以冰醋酸或0.1～0.5wt％的冰醋酸水溶液为流动相B，有助于获得良好的峰型。
本发明的梯度洗脱程序如下：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至62％；5min～7min，所述流动相A的体积百分比由62％上升至70％；7min～10min，所述流动相A的体积百分比由70％上升至85％；10min～15min，所述流动相A的体积百分比由85％上升至90％；15min～23min，所述流动相A的体积百分比保持90％。采用该条件可以实现无论是针对荜茇药材、标准汤剂或者配方颗粒的样品，各色谱峰均可以充分分离且峰型良好，并且分析周期短、分离效率和分离度更高。
本发明采用的检测器可以为紫外检测器，进一步地，本发明的色谱条件还包括：检测波长为250nm～280nm。在本发明的一些优选实施方式中，检测波长为240nm～260nm，在该范围的检测波长下色谱峰信息较为丰富，各色谱峰的分离效果均较好，且基线较为平稳。更进一步地，本发明的色谱条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min；和/或，柱温为25℃～35℃。本发明的构建方法在该柱温或流速范围内，较小的柱温变动或流速变动均能满足系统适用性要求。在本发明的一些优选实施方式中，流速为0.28mL/min～0.32mL/min；和/或，柱温为28℃～33℃。
进一步地，本发明通过至少15个批次来自不同产地的荜茇药材的供试品溶液以及对照品溶液的检测，并进行分析比较，选择共有峰建立特征图谱，参照对照品色谱峰的定位来进行共有峰的指认。最后将得到的药材、标准汤剂以及配方颗粒的色谱图各导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱和对照特征图谱。采用本发明前述的构建方法所得到的荜茇样品特征图谱至少包含10个峰，进一步地，峰1为荜茇宁对照品的峰，峰2为胡椒碱对照品的峰，峰5为假荜茇酰胺B对照品的峰，由于峰5的分离度较好、保留时间适中，所以以峰5为参比峰，计算其他各峰的保留时间，峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9和峰10的相对保留时间分别为0.52(±10％)，0.92(±10％)，1.24(±10％)，1.69(±10％)，1.92(±10％)，1.98(±10％)，2.04(±10％)，峰1、峰2的出峰时间采用对照品随行定位的方式。10个共有峰在各药材、标准汤剂、配方颗粒中均能稳定出现，且吻合度较好。
本发明通过优化供试品制备、色谱分析条件，缩短了分析时间，提升了分析效率，建立了同时适用于荜茇药材及其标准汤剂和配方颗粒的超高效液相色谱条件，真实地反映了荜茇药材、标准汤剂和配方颗粒原有化学成分情况。
<荜茇样品的检测方法>
另一方面，本发明特征图谱可以用于荜茇样品(如荜茇药材、水提物、饮片以及标准汤剂、和/或配方颗粒)质量控制的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测荜茇样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；所述荜茇样品可以为荜茇药材、饮片、水提物以及荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒，在本发明一些具体的实施方案中，所述荜茇样品可以为荜茇药材、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与本发明的构建方法构建的特征图谱进行比较以检测荜茇样品的质量和/或真伪；进一步地，若二者的UPLC特征图谱一致，则为合格品；若二者的UPLC特征图谱不一致，则为不合格品。在本发明的一些具体实施方式中，采用本发明前述的供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测。
在本发明一些具体的实施方案中，采用荜茇药材、标准汤剂和/或配方颗粒特征图谱对待测样品进行检测。本发明的构建及检测方法为荜茇从原料到成品的内在质量控制提供新的分析手段，方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，保持了荜茇药材、饮片、水提物以及标准汤剂与配方颗粒质量的一致性，为评价工艺稳定性提供了重要的多指标参数依据。
实施例
以下将通过具体的实施例对本发明做出进一步的说明：
实验仪器、试剂及药品
Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司)；Agilent 12920超高效液相色谱仪(Agilent公司)；METTLER TOLEDO XP6百万分之一天平(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-250B超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；AS165W型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)；GKC114控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)。
15批荜茇药材由江阴天江药业有限公司收集并鉴定。15批荜茇标准汤剂由江阴天江药业有限公司根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“研究表征标准汤剂用汤剂的制备”项的指导原则由原药材制备而成。3批荜茇配方颗粒样品均为公司生产制备。假蒟，由江阴天江药业有限公司鉴定，并制备为假蒟标准汤剂。荜茇对照药材，批号为121023-201103，购于中国食品药品检定研究院。
胡椒碱(批号：110775-201706)购于中国食品药品检定研究院。荜茇宁(批号：B23090)购于上海源叶生物技术有限公司。假荜茇酰胺B(批号：10445)购于上海诗丹德生物技术有限公司。
甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；冰醋酸(色谱纯，aladdin公司)；水为超纯水。
实施例一：荜茇药材、标准汤剂以及配方颗粒特征图谱的构建
1.对照品溶液制备
取荜茇对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
另取荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品，加甲醇制成每1ml含荜茇宁5μg、胡椒碱25μg、假荜茇酰胺B 5μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液制备
(1)荜茇药材供试品溶液：取荜茇药材适量，粉碎，过四号筛，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)荜茇标准汤剂供试品溶液：取荜茇药材经前处理、煎煮、低温浓缩、冷冻干燥制成的荜茇标准汤剂的冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)荜茇配方颗粒供试品溶液：取荜茇药材经前处理、提取、浓缩、喷雾干燥、制粒、包装所得的中药配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件
(1)流动相的考察
色谱柱采用Eclipse Plus C18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，流动相A为甲醇，流动相B(分别采用0.1％磷酸、0.1％甲酸、0.5％冰醋酸、水)，按表1中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml，柱温为30℃，检测波长为320nm。
表1：流动相考察梯度洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～4 | 11→14 | 89→86 |
| 4～6 | 14 | 86 |
| 6～9 | 14→17 | 86→83 |
| 9～13 | 17 | 83 |
| 13～16 | 17→27 | 83→73 |
| 16～19 | 27 | 73 |
| 19～21 | 27→45 | 73→55 |
| 21～25 | 45 | 55 |
通过设置不同的流动相B来对各个特征峰的分离效果进行考察，考察结果见图1，由分离结果可知，采用0.5％的冰醋酸对特征峰的分离效果较好。
(2)洗脱时间梯度的考察
(2-1)
色谱柱采用Eclipse Plus C18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.5％的冰醋酸溶液，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为320nm。
表2：洗脱时间梯度1的考察
| 时间(分钟) | 甲醇(％) | 流动相B(％) |
| 0～3 | 11→14 | 89→86 |
| 3～5 | 14 | 86 |
| 5～20 | 14→17 | 86→83 |
| 20～24 | 17 | 83 |
| 24～30 | 17→27 | 83→73 |
| 30～38 | 27 | 73 |
按照表2的时间设置进行洗脱，结果见图2，发现0～15min没有出现响应值较高的色谱峰。
(2-2)
色谱柱采用Eclipse Plus C18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％的冰醋酸溶液，按表3中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml，柱温为30℃，检测波长为320nm。
表3：洗脱时间梯度2的考察
按照表3的时间设置进行洗脱，结果见图3，发现虽然在该时间设置条件下各个特征峰的分离效果较好，但是分析时间较长。
(2-3)
色谱柱采用Eclipse Plus C18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％的冰醋酸溶液，按表4中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml，柱温为30℃，检测波长为320nm。
表4：洗脱时间梯度3的考察
| 时间(分钟) | 甲醇(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 45→62 | 55→38 |
| 5～7 | 62→70 | 38→30 |
| 7～10 | 70→85 | 30→15 |
| 10～15 | 85→90 | 15→10 |
| 15～19 | 90 | 10 |
按照表4的时间设置进行洗脱，结果见图4，发现在该色谱条件下，色谱峰信息丰富，且各个特征峰分离较好，分析时间适中。
根据以上流动相以及洗脱时间梯度的考察，本发明的色谱条件为：采用EclipsePlus C18 RRHD(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸溶液为流动相B，按表5规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为0.30mL/min；检测波长为254nm。
表5：流动相梯度洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 45→62 | 55→38 |
| 5～7 | 62→70 | 38→30 |
| 7～10 | 70→85 | 30→15 |
| 10～15 | 85→90 | 15→10 |
| 15～23 | 90 | 10 |
4.特征图谱的建立
4.1分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得荜茇药材、标准汤剂、中药配方颗粒特征图谱。
4.2色谱峰的指认
采用荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品进行定位，结果表明：峰1为荜茇宁；峰2为胡椒碱；峰5为假荜茇酰胺B。见图5。
参照峰和共有峰的选择
测定15批不同产地荜茇药材所得色谱图，确定了10个共有峰，见图6。图6为荜茇的15批药材叠加特征图谱。
测定15批自生产荜茇标准汤剂所得色谱图，确定了10个共有峰，见图7。图7为荜茇15批标准汤剂叠加特征图谱。
测定3批中试生产的荜茇配方颗粒所得色谱图，确定了10个共有峰，见图8。图8为荜茇3批中药配方颗粒叠加特征图谱。
对照特征图谱的建立和相似的评价
将15批荜茇药材、15批荜茇标准汤剂、3批荜茇配方颗粒色谱图各导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱(见图6、图7、图8)和对照特征图谱(见图9、图10、图11)。
5.方法学考察
5.1精密度试验
取荜茇药材(YC122008003)、标准汤剂(DG122008003)、中药配方颗粒(20010049)样品各1份，按照“2.供试品溶液制备”所述方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液1μL，连续进样6次，按照“3.色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中荜茇宁、胡椒碱以及假荜茇酰胺B的3个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与假荜茇酰胺B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间、相对峰面积。
精密度试验结果显示，荜茇药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.04％，相对峰面积RSD值均小于1.55％；荜茇标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.13％，相对峰面积RSD值均小于1.43％；荜茇中药配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.25％，相对峰面积RSD值均小于2.39％；表明仪器精密度良好。
5.2重复性试验
取荜茇药材(YC122008003)、标准汤剂(DG122008003)、中药配方颗粒(20010049)样品各6份，按照“2.供试品溶液制备”所述方法制备，分别精密吸取供试品溶液1μL，按照“3.色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中荜茇宁、胡椒碱以及假荜茇酰胺B的3个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与假荜茇酰胺B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间、相对峰面积。
重复性试验结果显示，荜茇药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.09％，相对峰面积RSD值均小于1.67％；荜茇标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.11％，相对峰面积RSD值均小于1.84％；荜茇配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.16％，相对峰面RSD值均小于1.92％；表明该方法重复性良好。
5.3稳定性试验
取荜茇药材(YC122008003)、标准汤剂(DG122008003)、中药配方颗粒(20010049)样品各1份，按照“2.供试品溶液制备”所述方法制备，，分别于0h、2h、4h、8h、12h、18h、24h，按照“3.色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中荜茇宁、胡椒碱以及假荜茇酰胺B的3个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与假荜茇酰胺B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间、相对峰面积。
稳定性试验结果显示，荜茇药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.09％，相对峰面积RSD值均小于1.65％；荜茇标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.12％，相对峰面积RSD值均小于2.71％；荜茇配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.08％，相对峰面RSD值均小于2.97％；表明该方法稳定性良好。
5.4耐用性试验
柱温考察：比较了25℃、30℃、35℃的色谱图，结果显示25℃～35℃范围内的柱温变动能满足系统适用性要求，优选柱温30℃。见图12。
流速考察：比较了0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min的色谱图，结果显示流速在0.25～0.35ml/min范围内，流速变动能满足系统适用性要求，优选流速0.30mL/min，见图13。
色谱柱考察：比较了3种不同型号色谱柱，分别为Eclipse Plus c18(Agilent,2.1×100mm,1.8μm)、CORTECS T3(Waters,2.1×100mm,1.6μm)、BEH C18(Waters,2.1×100mm,1.7μm)，三根色谱柱色谱峰峰形均佳，分离度均较好，见图14。
实施例二：荜茇药材的检测方法
1.待测样品溶液的制备
取荜茇药材适量，粉碎，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.检测
精密吸取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例一中“3.色谱条件”项。
通过比较待测样品与图9荜茇药材对照特征图谱，可知，该待测样品的检测图谱与荜茇药材对照特征图谱的相似度为0.96，能检出10个特征峰，并且与对照药材参照物色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰1、峰2、峰5应分别与荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品参照物峰的保留时间相对应。与假荜茇酰胺B参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10的相对保留时间分别为0.52、0.92、1.23、1.70、1.95、2.02、2.09，均符合规定值的±10％范围。规定值为：0.52(峰3)、0.92(峰4)、1.24(峰6)、1.69(峰7)、1.92(峰8)、1.98(峰9)、2.04(峰10)。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格药材。
实施例三：荜茇标准汤剂的检测方法
1.待测样品溶液的制备
取荜茇药材经前处理、煎煮、低温浓缩、冷冻干燥制成的荜茇标准汤剂的冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.检测
精密吸取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例一中“3.色谱条件”项。
通过比较待测样品与图10荜茇标准汤剂对照特征图谱，可知，该待测样品的检测图谱与荜茇标准汤剂对照特征图谱的相似度为0.92，能检出10个特征峰，并且与对照药材参照物色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰1、峰2、峰5应分别与荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品参照物峰的保留时间相对应。与假荜茇酰胺B参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10的相对保留时间分别为0.52、0.92、1.23、1.70、1.93、2.00、2.05，均符合规定值的±10％范围。规定值为：0.52(峰3)、0.92(峰4)、1.24(峰6)、1.69(峰7)、1.92(峰8)、1.98(峰9)、2.04(峰10)。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格标准汤剂。
实施例四：荜茇配方颗粒的检测方法
1.待测样品溶液的制备
取荜茇药材经前处理、提取、浓缩、喷雾干燥、制粒、包装所得的中药配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.检测
精密吸取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例一中“3.色谱条件”项。
通过比较待测样品与图11荜茇配方颗粒对照特征图谱，可知，该待测样品的检测图谱与荜茇配方颗粒对照特征图谱的相似度为0.96，能检出10个特征峰，并且与对照药材参照物色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰1、峰2、峰5应分别与荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品参照物峰的保留时间相对应。与假荜茇酰胺B参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10的相对保留时间分别为0.52、0.92、1.23、1.70、1.93、2.00、2.05，均符合规定值的±10％范围。规定值为：0.52(峰3)、0.92(峰4)、1.24(峰6)、1.69(峰7)、1.92(峰8)、1.98(峰9)、2.04(峰10)。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格荜茇配方颗粒。
实施例五：荜茇药材、标准汤剂、中药配方颗粒的一致性评价
本实施例将构建的荜茇药材、标准汤剂和配方颗粒特征图谱方法，应用于荜茇配方颗粒生产过程中各个环节的样品检测和质量评价。取1批中试生产过程中的药材、标准汤剂、配方颗粒进行试验。
1.供试品溶液的制备
药材：取荜茇药材适量，粉碎，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
标准汤剂：取荜茇药材经前处理、煎煮、低温浓缩、冷冻干燥制成的荜茇标准汤剂的冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
中药配方颗粒：取荜茇药材经前处理、提取、浓缩、喷雾干燥、制粒、包装所得的中药配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.检测
精密吸取待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例一中“3.色谱条件”项。
将1批中试生产的荜茇药材、对应的标准汤剂及中药配方颗粒色谱图各导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱，以1批中试药材作为参照图谱，进行相似度比较，比较结果如下表6。
表6：同一批原料的中试药材、标准汤剂、配方颗粒相似度一致性分析
| 编号1 | 相似度 |
| 药材1 | 1.00 |
| 标准汤剂1 | 0.93 |
| 中药配方颗粒1 | 0.92 |
根据表6可知，荜茇药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的图谱相似度极高，这说明以药材为供试品构建的特征图谱不仅能反映药材的质量，同样也反映标准汤剂和中药配方颗粒的质量，因此可以用于药材、标准汤剂和/或中药配方颗粒的检测，可以用于配方颗粒生产各个环节的质量评价，从而保证在生产过程中，每个色谱峰所对应的化学成分都能够很好的从原料传递到最后的成品中。
实施例六：荜茇药材、标准汤剂的混伪品鉴别
荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗。市场上同为胡椒科属的假蒟因与荜茇外形相似，常有混用现象。
取假蒟标准汤剂、假蒟药材，按照“2.供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液1μL，按照“3.色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，结果见图15、图16。
试验结果显示，与正品荜茇的色谱图比较，假蒟色谱峰较少，缺少特征峰1、峰3、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10。荜茇与假蒟内在的化学成分差异显著。峰1、峰3、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10均可作为荜茇混淆品的鉴别分析点，且荜茇标准汤剂、中药配方颗粒与其对应药材的相似度极高，三者色谱图的一致性较强，因此，上述药材、标准汤剂特征图谱的鉴别点也可作为配方颗粒的鉴别点。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种荜茇样品特征图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(a)对照品溶液制备：包括分别取荜茇宁对照品、胡椒碱对照品、假荜茇酰胺B对照品制备对照品溶液的步骤；
(b)供试品溶液制备：用提取溶剂对荜茇样品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述荜茇样品为荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；
(c)特征图谱的建立：采用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析建立特征图谱；
所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.6～1.8μm的色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，以冰醋酸或0.1～0.5wt％的冰醋酸水溶液为流动相B；
梯度洗脱程序：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至62％；5min～7min，所述流动相A的体积百分比由62％上升至70％；7min～10min，所述流动相A的体积百分比由70％上升至85％；10min～15min，所述流动相A的体积百分比由85％上升至90％；15min～23min，所述流动相A的体积百分比保持90％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述特征图谱包含10个峰，其中峰1为荜茇宁，峰2为胡椒碱，峰5为假荜茇酰胺B。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，以峰5为参照峰，计算峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10与峰5的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，所述峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9和峰10对应的规定值分别为0.52、0.92、1.24、1.69、1.92、1.98和2.04。
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，供试品溶液制备包括：
用甲醇或包含甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液对荜茇药材进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液；
或者，用甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液对荜茇标准汤剂进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液；
或者，用甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液对荜茇配方颗粒进行超声提取，收集提取液，制备供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述超声提取的时长为15min～60min，功率为250W～300W，频率为35kHz～45kHz。
6.根据权利要求1～5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液制备包括加甲醇或者包含甲醇体积百分比为70％～90％的甲醇水溶液制成每1ml含荜茇宁对照品5μg～20μg、胡椒碱对照品10μg～50μg、假荜茇酰胺对照品B2μg～25μg的对照品溶液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液制备还包括取适量荜茇对照药材，加入甲醇或包含甲醇体积百分比为50％～90％的甲醇水溶液，超声处理30分钟，摇匀，滤过，即得。
8.根据权利要求1～7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为100mm，内径为2.1mm；所述色谱条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，检测波长为250nm～280nm。
9.一种荜茇样品的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测荜茇样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；所述荜茇样品为荜茇药材、荜茇饮片、荜茇水提物、荜茇标准汤剂和/或荜茇配方颗粒；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与权利要求1～8任一项所述的构建方法构建的特征图谱进行比较以检测荜茇样品的质量和/或真伪；
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.6～1.8μm的色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，以冰醋酸或0.1～0.5wt％的冰醋酸水溶液为流动相B；
梯度洗脱程序：
0min～5min，所述流动相A的体积百分比由45％上升至62％；5min～7min，所述流动相A的体积百分比由62％上升至70％；7min～10min，所述流动相A的体积百分比由70％上升至85％；10min～15min，所述流动相A的体积百分比由85％上升至90％；15min～23min，所述流动相A的体积百分比保持90％。
10.权利要求9所述的检测方法在鉴别荜茇与假蒟中的应用。
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