CN118010455A - 一种切片样本循环染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于显微镜观察的切片样本循环染色方法。通过将样本固定在被薄膜黏结的厚薄两块基板之间并留有间隙，可以无需拆除基板而对样本进行染色；通过将样本附着在薄基板一侧，可以进行直接将之用作盖玻片而无需拆除、加上单独的盖玻片，实现兼顾满足显微镜观测的光学结构和循环染色的机械结构；厚基板既起到支撑保护薄基板的作用，又构成缓存试剂的功能，提高实验效率。

Description

一种切片样本循环染色方法

技术领域

本发明涉及一种切片样本循环染色方法，主要应用于显微镜观察样本的制备。

背景技术

在病理学上，由于生物切片样本近乎透明，通常需要染色以使不同成分呈现不同色彩以便观察。

特别的，具有特异性的染料能够对同一类成分的不同亚型产生不同染色效果。例如免疫组织化学中，使用针对特定抗体绑定的染料进行浸染，可以对特定蛋白质染色，以量化判断其在组织中存在与否以及浓度。

但是，高特异性的新型染料常需通过复杂、高度专用的合成方法制备，单价高昂，现有的自动染色方法将玻片浸没在染液中再冲洗的方法意味着大量染液消耗，成本极高。

与之相对的，人工加样进行特定区域浸染的方法能一定幅度降低染料消耗，但应对要对同一片玻片定时加入、冲洗、再加入、再冲洗多种染料的工作流程要耗费大量人工。

每一次染色-观测实验中，可以同时浸染的染料数目受到染料间相互干扰的限制而存在上限，因此经常需要将染料分为若干组，每轮染一组、观测该组、多轮循环。但是，观测时需要加盖并用固化剂固定专用盖玻片以保护光学观测仪器镜头，在再次浸染时又需要去除薄且脆的盖玻片以暴露样本，有一定概率损坏样本。

发明内容

对此,本发明提供一种切片样本循环染色方法。通过将样本固定在被薄膜黏结的厚薄两块基板之间并留有间隙，可以无需拆除基板而对样本进行染色；通过将样本附着在薄基板一侧，可以进行直接将之用作盖玻片而无需拆除、加上单独的盖玻片，实现兼顾满足显微镜观测的光学结构和循环染色的机械结构；厚基板既起到支撑保护薄基板的作用，又构成缓存试剂的功能，提高实验效率。

为了达成上述目的，本发明提供一种切片样本循环染色方法，步骤如下。

步骤之一，准备一块平整的长方形的厚基板，长宽尺寸与标准显微镜载玻片一致，在靠近所述厚基板长的方向的一端预先挖开一宽孔、孔宽度与基板宽度接近，将靠近所述开孔的一段称为开孔端，另一端称为排液端。

步骤之二，在所述厚基板的一个平面上、沿两个长边的边缘黏附有薄膜窄条，可选厚度为20至500微米。

步骤之三，准备一块平整的长方形的薄基板，厚度与标准显微镜盖玻片一致约100至350微米，且长宽不大于所述厚基板。

步骤之四，使用一般的切片样本的制备方法，制作切片样本并固定在所述薄基板一个表面。

步骤之五，将所述薄基板与所述厚基板正对齐、紧密贴合并固定，其中对齐方式为：薄基板固定有切片样本的面朝向厚基板，厚基板上黏附的所述薄膜窄条朝向薄基板，薄基板上固定的切片样本靠近所述排液端，厚、薄基板处于排液端的短边对齐。

步骤之六，将相互固定的两块所述基板作为一个整体，放置在倾斜的实验平台上，其中放置方法为：薄基板在下方即紧贴实验平台、厚基板在上方且所述开孔端处于较高处、所述排液端处于较低处。

步骤之七，从所述厚基板的所述开孔处按染色液对应的化学方法学注入染色液或其试剂。

步骤之八，将所述两块基板整体从实验平台上取下，放置在显微镜上观察，其中放置方法为：所述薄基板位于靠近显微镜的物镜一侧。

步骤之九，将所述两块基板整体从显微镜上取下，使用褪色剂、染色液或其他试剂重复步骤六至步骤八进行新的一轮染色并完成观察，直到实验完成。

在其中一个实施例中，所述厚、薄基板面向所述切片样本的至少一个表面进行亲水性处理。

在其中一个实施例中，所述薄膜窄条双面具有粘性，用以固定所述厚基板和所述薄基板。

在其中一个实施例中，所述厚、薄基板贴合后的固定方式为：将快速干结的固定剂涂抹在所述厚、薄基板的两个长边侧。

在其中一个实施例中，所述厚基板开孔靠近基板中心的一侧为月牙型，月牙的圆心靠近所述排液端、也即月牙的隆起朝向开孔端。

在其中一个实施例中，所述薄膜窄条在所述开孔端连为一体，即整体两条平行的窄条加上与其垂直方向上的条组合成U型附着在所述厚基板的同一个面上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他实施例的附图。

图1是厚基板和薄基板组合前的结构示意图。

图2是染色方法进行染色中厚薄基板、实验平台和染色剂注射器的组合示意图。

具体实施方式

现在详细参考附图并描述实施例。为了全面理解本发明，在以下详细描述中提到了众多具体细节。但是本领域技术人员应该理解，本发明可以无需这些具体细节而实现。在其他实例中，不详细描述公知的方法、过程、组件和电路，以免不必要地使实施例模糊。

图1是厚基板和薄基板组合前的结构示意图。在样本制备过程中，样本102被附着在薄基板101表面。这一附着是显微镜切片样本的一般制作方法，流程大致为：先将大块样本切出3微米左右厚度、非常脆弱的一片切片102并将之漂浮在水面，后以用表面光滑的薄基板101轻轻将其捞起并烘干固定。

厚基板111上靠近其一端有开孔112，且厚基板111的两个长边边缘表面黏附有薄膜窄条113。此处，薄膜窄条113附着在厚基板111表面而不是薄基板101表面，是为了满足前述切片样本制备方法中捞取样本的物体表面平整光滑则水可以更均匀且自由流动而不形成局部湍流卷走样本。样本固定在薄基板101而非厚基板111表面是因为：染色后用显微镜观察时，样本到显微镜物镜的工作距离不超过500微米空气(或光学上等效的300微米玻璃)但又必须和物镜间有屏障以免潮湿的样本接触、污染物镜，因而只有固定在非常薄的薄基板101表面并透过此薄基板观察才能兼顾。实践中，薄基板101可以直接使用标准的显微镜盖玻片。

图2是实验中主要组件组合工作时的结构示意图。薄基板101、薄膜113和厚基板111从下至上叠放、固定在一起(可以利用薄膜的双面粘性，也可以在侧面涂抹固化胶)，并在切片样本附近形成薄而宽广的空腔121。此时可以直观看出，如果厚基板111的长宽如果与标准载玻片相近，就可以兼容标准尺寸的显微镜载物台；如果厚基板101的长宽不小于薄基板111，就可以为了保护薄而脆的薄基板111，实现对齐、固定后人手或工具都只需要抓握、移动厚而结实的厚基板101就可以移动切片样本；厚基板111、薄膜113和薄基板101的左端也即排液端如果平齐，能够保证空腔121能如预期的辅助染色实验。此空腔121的工作原理在专利2021110653023(对比专利1)中详述，在此不再赘述。

作为一个整体的厚薄基板一同被放置在适度倾斜的试验台201上、且排液端处于较低位置。进行实验时，染液或其他试剂由外置的加液器202从开孔112滴入并逐渐流动、扩散至空腔121中，与样本接触实现染色。这个染色的原理也在对比专利1有详述。由于空腔121极薄，从开孔112滴入的液体不会立即全部流入空腔121，因而开孔112也兼顾了缓存液体的功能。此时，开孔112靠近样本的一边设计成月牙形，便有利于引导液体向靠近薄膜的两边流动，以抵消薄膜与液体接触面的疏水性导致的流动阻力大、不易扩散，使得液体充分、均匀121充满空腔以浸润整个样本。

与对比专利1相对比，本方法的主要部件结构相似，看似只是将厚薄基板的上下位置交换，并在厚基板上开孔以注入液体而非利用开放的端口，但是基于不同的设计方法，且实际效果有本质的差异。

第一个差异在于开孔112对缓存染液的影响。首先，考虑到为了满足光学特性，薄基板一般应使用标准盖玻片，因而不能加工外形，所以结构受限；其次，由于前述解释的显微镜工作距离限制，该盖玻片厚度固定、不能加厚，并且其他结构也不能超过其上表面高度以免与显微镜物镜冲突，因而薄基板101上不能构建如开孔112的很深的孔结构，进而不能实现前述缓存液体的功能；最后，为了节省价格昂贵的染液，薄膜113应当尽可能薄，将导致空腔121横截面很扁、液体流速很慢。综合而言，如果使用对比专利1的结构，就不能形成如空腔121的结构以在空腔121外缓存液体，进而加液器202必须长时间悬停在结构上方、缓缓滴加液体，占用了其工作时间，拖慢平行实验节奏，并且有加入液体过多溢出的风险。

第二个效果差异在于开孔112的月牙形对染液的液体动力学的影响。在加入染液时，由于空腔121内的空气或已有液体成分不同，在狭窄的空腔121中的接触面上并不会有效的扩散，而是更像不相容的油与水一样推挤、取代而实现更替。这一更替过程可以等效为染液流动中遇到了阻力，因而会改变流动的方向；在与薄膜113接触的位置附近，由于薄膜的阻挡，这一阻力尤为明显。采用对比专利1的结构时，由于前述原因，其上方盖板的边缘是平的，因而液体进入空腔121的动力相同；但在空腔121内部，越往边缘处遭遇的液体阻力越大，因而其流动速率越低；在极端情况下，甚至染液将不流入贴近薄膜的区域，造成该范围液体无法交换、样本无法染色。因此，本方法开孔113采用月牙形使得更多液体在两侧堆积，可以此处增大液体进入空腔121的动力，以抵消较大的阻力，实现液体更均匀的流动和分布。

第三个效果差异在于厚基板111位于整个组合结构的上方，因此自上而下抓取组合结构时更不容易触碰到薄基板101造成其损坏。

综上所述，本发明用新的方法，以薄基板在下、厚基板在上、且厚基板上开特定形状通孔的设计改进了液体动力学模型，实现更好的使用效果。

本发明的不局限于上述实施方式，本发明的上述各个实施方式的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种切片样本循环染色方法，其特征在于，步骤包括：

步骤之一，准备一块平整的长方形的厚基板，长宽尺寸与标准显微镜载玻片一致，在靠近所述厚基板长的方向的一端预先挖开一宽孔、孔宽度与基板宽度接近，将靠近所述开孔的一段称为开孔端，另一端称为排液端；

步骤之二，在所述厚基板的一个平面上、沿两个长边的边缘黏附有薄膜窄条，可选厚度为20至500微米；

步骤之三，准备一块平整的长方形的薄基板，厚度与标准显微镜盖玻片一致，可选100至350微米，且长宽不大于所述厚基板；

步骤之四，使用一般的切片样本的制备方法，制作切片样本并固定在所述薄基板一个表面；

步骤之五，将所述薄基板与所述厚基板正对齐、紧密贴合并固定，其中对齐方式为：薄基板固定有切片样本的面朝向厚基板，厚基板上黏附的所述薄膜窄条朝向薄基板，薄基板上固定的切片样本靠近所述排液端，厚、薄基板处于排液端的短边对齐；

步骤之六，将相互固定的两块所述基板作为一个整体，放置在倾斜的实验平台上，其中放置方法为：薄基板在下方即紧贴实验平台、厚基板在上方且所述开孔端处于较高处、所述排液端处于较低处；

步骤之七，从所述厚基板的所述开孔处按染色液对应的化学方法学注入染色液或其试剂；

步骤之八，将所述两块基板整体从实验平台上取下，放置在显微镜上观察，其中放置方法为：所述薄基板位于靠近显微镜的物镜一侧；

步骤之九，将所述两块基板整体从显微镜上取下，使用褪色剂、染色液或其他试剂重复步骤六至步骤八进行新的一轮染色并完成观察，直到实验完成。

2.根据权利要求1所述染色方法，其特征在于，所述厚、薄基板面向所述切片样本的至少一个表面进行亲水性处理。

3.根据权利要求1所述染色方法，其特征在于，所述薄膜窄条双面具有粘性，用以固定所述厚基板和所述薄基板。

4.根据权利要求1所述染色方法，其特征在于，所述厚、薄基板贴合后的固定方式为：将快速干结的固定剂涂抹在所述厚、薄基板的两个长边侧。

5.根据权利要求1所述染色方法，其特征在于，所述厚基板开孔靠近基板中心的一侧为月牙型，月牙的圆心靠近所述排液端、也即月牙的隆起朝向开孔端。

6.根据权利要求1所述染色方法，其特征在于，所述薄膜窄条在所述开孔端连为一体，即整体两条平行的窄条加上与其垂直方向上的条组合成U型附着在所述厚基板的同一个面上。