WO2019111427A1 - 切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途 - Google Patents

切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2019111427A1
WO2019111427A1 PCT/JP2018/011192 JP2018011192W WO2019111427A1 WO 2019111427 A1 WO2019111427 A1 WO 2019111427A1 JP 2018011192 W JP2018011192 W JP 2018011192W WO 2019111427 A1 WO2019111427 A1 WO 2019111427A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
section
sections
base layer
layer
cover
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/011192
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
順也 福岡
亮 吉川
Original Assignee
株式会社Ｎ Ｌａｂ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社Ｎ Ｌａｂ filed Critical 株式会社Ｎ Ｌａｂ
Priority to JP2019557983A priority Critical patent/JPWO2019111427A1/ja
Publication of WO2019111427A1 publication Critical patent/WO2019111427A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Definitions

  • the present invention relates to a device for sealing a section for sealing and preparing thin serially sliced sections from a tissue sample. Further, the present invention provides a method for producing the above-mentioned section sealing device, and a section including a lesion (such as a tumor cell) in the arrangement of a large number of sections in a sample prepared using the section sealing device. It relates to the method of identification.
  • tissue sample is embedded in paraffin or the like to form a tissue sample, and a slice cut into several ⁇ m is attached to a glass slide using a microtome (thin slicer), Chemical staining, sealing with a mounting medium with a thin cover glass, observation with a microscope (spectroscopy), and storage have been taken.
  • a microtome thin slicer
  • Chemical staining, sealing with a mounting medium with a thin cover glass, observation with a microscope (spectroscopy), and storage have been taken.
  • HE staining hematoxylin / eosin staining
  • NGS next-generation gene sequencing
  • the additionally sliced section contains a cell to be tested (such as a tumor cell) greatly affects the test result. For example, if there are tumor cells in the first HE-stained specimen, and the additional sliced sections did not contain the same tumor cells, although they were additionally stained to confirm the diagnosis of this tumor, the additional tests themselves are It is possible to be wasted or to make a false diagnosis as false negative. In fact, it is difficult to directly confirm whether tumor cells are contained in unstained (unstained) sections or not, so the z-axis is not applied to the unstained sections (one or more) of interest. Sections that are vertically related by orientation are subjected to HE staining and microscopically judged indirectly.
  • an object of the present invention is to provide a device for sectioning of the sample, a method of manufacturing a section-encapsulated sample using the section-mounting device, and a method of identifying a section including a diseased portion.
  • the main components of the present invention are as follows. [1] It has a film-like base layer made of an organic polymer material, one of the main surfaces of the base layer is adhesive, and is an arrangement surface for arranging a section, It has a film-like cover layer made of an organic polymer material, and one main surface of the cover layer covers the section disposed on the disposition surface of the base layer and is for sticking to the disposition surface. , Cover surface, At least one of the arrangement surface of the base layer and the cover surface of the cover layer has a width including a plurality of sections adjacent to each other, The other of the arrangement surface of the base layer and the cover surface of the cover layer seals the plurality of adjacently arranged pieces individually and releases the seal individually with respect to the one side.
  • One of the main surfaces of the base layer is adhesive and is an arrangement surface for arranging a plurality of sections at intervals
  • the cover layer has a plurality of frame portions individually surrounding the periphery of each of the plurality of sections disposed on the arrangement surface, and a cover section respectively covering each section surrounded by each frame section.
  • Each frame part is mutually connected
  • Each lid covers and seals each section surrounded by each frame section, and is detachable or movable with respect to each frame section away from each section.
  • the frame portion and the lid portion of the cover layer are different portions included in the same sheet of film, and the portion surrounded by each frame portion is each lid portion, A part or all of the outer periphery of each lid is cut from each frame, whereby each lid is detachable or movable with respect to each frame;
  • the frame portion and the lid portion are partially connected to each other, and the connected portion is separable, and each lid portion is divided into each frame portion by dividing the connected portion.
  • the section-encapsulating device is in the form of a strip having a predetermined length and a predetermined width, and the base layer and the cover layer are also in the form of a strip having the predetermined length and the predetermined width,
  • the base layer has a predetermined band width and length so that the plurality of segments are arranged in a row at a predetermined interval in a longitudinal direction of the arrangement surface of the base layer.
  • the cover surface of the cover layer has a width that includes a plurality of sections adjacent to each other
  • the arrangement surface of the base layer has a detachable structure with respect to the cover surface of the cover layer so as to individually seal and individually release the plurality of adjacently arranged pieces.
  • the arrangement surface of the base layer has a width for arranging one section
  • the cover surface of one cover layer has a width in which the arrangement surfaces of the plurality of base layers stick to each other adjacent to each other
  • the arrangement surface of the base layer and the cover surface of the cover layer allow the plurality of sections to be individually sealed between the base layer and the cover layer in a state in which the plurality of sections are arranged adjacent to one another To be released,
  • the device for section insertion as described in said [7].
  • a laminate comprising the base layer on the lower layer side and the adhesive layer on the upper layer side, wherein the surface of the adhesive layer is an arrangement surface, ]
  • the method further comprises a staining step, which comprises During the section placement process or after the section placement process and before the sealing process or after the sealing process In this process, for each set of a predetermined number of sections along the order of slices, the first section in each set is subjected to staining to test whether or not the section contains a lesion. , The method for producing a section-encapsulated sample according to the above [12] or [13]. [15] In the section disposing step, a plurality of sections containing devices are used, and a plurality of sections are arranged in the order of slices across the plurality of sections containing devices; In the staining step, the first section of the plurality of sections in each section encapsulating device is stained.
  • [16] Using one or more of the section-encapsulated specimens manufactured by the method of manufacturing a section-encapsulated specimen according to the above [14] or [15], It is determined in the order of slices whether or not the stained section contains a lesion. All sections located between the first section showing that the section contains a lesion area by the staining, and the last section showing that the section contains a lesion section in the section , Identify the section containing the affected area, How to identify the section that contains the affected area.
  • the device for encapsulating a section of the present invention has a combination of a base layer made of an organic polymer material provided with an adhesive surface and a cover layer made of an organic polymer material covering the adhesive surface.
  • the feature of the section enclosing device is that it has the following configurations (i) and (ii). (I) At least one of the arrangement surface of the base layer and the cover surface of the cover layer is wide enough to include a plurality of sections adjacent to each other.
  • the other of the arrangement surface of the base layer and the cover surface of the cover layer individually seal and individually release the plurality of adjacently arranged pieces;
  • the base layer and the cover layer which have a structure detachable from one side, have a structure capable of individually sealing a plurality of sections and individually releasing the seal.
  • a plurality of sections can be arranged adjacent to each other, and a plurality of sections formed by slicing a tissue sample can also be arranged in the order of slicing.
  • the plurality of sections can be individually sealed and individually unsealed. This also allows any sections to be subjected to detailed analysis after sampling.
  • the “structure capable of individually sealing a plurality of sections and individually releasing the seal” in the configuration of the above (ii) is, as described in detail later, at least one of a base layer and a cover layer.
  • One is a structure in which a plurality of sections arranged in an adjacent state are sandwiched in cooperation with the other so as to individually cover the sections.
  • the device for encapsulating a section having the configuration of the above (i) and (ii) there are typically two aspects.
  • at least the base layer is a single wide sheet (which may be in the form of a strip)
  • it is at least one wide sheet in the cover layer (which may be in the form of a strip). is there.
  • the inner portion of the opening is cut out so that the opening is located at a predetermined interval, and the peripheral portion (remaining portion) surrounding the opening is used as a frame portion.
  • the cutout portion removed from the opening is used as a lid.
  • Serial sections are prepared from tissues containing tumor cells embedded in paraffin, aligned on the adhesive side of the base layer, covered by a cover layer and covering and sealing all individual sections with a lid The samples are arranged in the order of slices. When staining the sections, the lid may be peeled off every several sheets, the sections may be subjected to HE staining in the opening of each frame, and sealed with the encapsulant (FIG. 12).
  • the continuous sections are individually placed on the adhesive surface of the base layer, covered by a cover layer, and the individual sections are sealed so that the continuous sections are arranged in the order of slices.
  • a sample is obtained.
  • the base layer on which the section before being covered by the cover layer is placed or the base layer on which the section peeled off from the cover layer is placed is directly dipped in the HE staining solution and sealed with the mounting agent in the cover layer. can do.
  • unstained sections assumed to contain tumor cells can be further examined separately by performing separate staining other than HE staining separately for each frame part, direct removal of tissue, or punching etc.
  • the nucleic acid can be easily collected by partially cutting it out and used for genetic testing such as NGS.
  • a section sliced continuously from a tissue sample is sandwiched between an organic polymer base layer and a cover layer made of organic polymer material instead of conventional glass, and continuous in the order of slicing Sealing facilitates management and long term storage of the entire section.
  • HE staining by subjecting a specific section of the serial sections at a predetermined interval to HE staining, it is possible to indirectly predict information on the entire tissue contained in the serial section, and for unstained sections. Because it is easily accessible, it is possible to quickly carry out the required test on the target section.
  • FIG. 1 is a view showing an example of a first embodiment of the device for encapsulating a section of the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a view showing the upper surface (the upper surface of the cover layer) of the section sealing device
  • FIG. 1 (b) is a sectional view taken along the line X1-X1 in FIG. 1 (a).
  • FIG. 2 is a view showing another example of the first aspect of the device for encapsulating a section of the present invention.
  • FIGS. 2 (a) and 2 (b) are cross-sectional views of the section-encapsulating device cut as in FIG. 1 (b).
  • FIGS. 2 (c) to 2 (e) are top views of another embodiment of the section sealing device.
  • FIG. 1 is a view showing an example of a first embodiment of the device for encapsulating a section of the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a view showing the upper surface (the upper surface of the cover layer) of the section sealing device
  • FIG. 3 shows a state in which five continuous sections are sequentially arranged on the arrangement surface (adhesive surface) of the base layer, and a cover for covering them, using the first aspect of the device for section encapsulation of the present invention
  • FIGS. 4 to 13 the first aspect of the device for encapsulating a section of the present invention is used.
  • FIG. 4 is a view showing a continuous piece placed on the placement surface and covered with a cover layer. Each lid is removable.
  • the cover layer is drawn so as to flexibly bend and follow the section which protrudes by the thickness of the slice from the arrangement surface of the base layer.
  • FIG. 5 is a photographic view showing a state in which five continuous sections are arranged in order on the arrangement surface of the base layer and they are covered with a cover layer. Each lid is removable.
  • FIG. 6 is a photograph showing a state in which the lid of the first section-enclosed sample is peeled out of the five section-enclosed samples, and the hematoxylin solution is dropped on the well-like part surrounded by the frame section.
  • FIG. 7 is a view showing a stained section sealed with a mounting agent by a lid.
  • FIG. 7 (a) is a top view showing a state in which the front lid is removed, and Fig. 7 (b) covers the section with the lid, and the device for sealing a section as in Fig. 1 (b). It is a figure which shows the cross section at the time of cut
  • FIG. 8 is a photographic view showing a state in which the HE-stained section is sealed with a mounting medium by a lid.
  • FIG. 9 is a photograph showing a microscopic image (magnification of objective lens 4 times) of a section of lung tissue that has been HE-stained and sealed with a mounting agent in a section-encapsulating device with a lid.
  • FIG. 10 is a photograph showing a microscopic image (magnification of objective lens 20 ⁇ ) of a section of lung tissue that has been HE-stained and sealed with a mounting agent in a section-encapsulating device with a lid.
  • FIG. 11 is a view showing an example of a method of manufacturing a device for section encapsulation according to the present invention, and is a side view of the section-encapsulating device in the form of a band viewed from the side (in the width direction).
  • FIG. 11A shows a process in which sliced slices are sequentially arranged in the order of slices on the arrangement plane.
  • Fig. 11 (b) is a view showing a step of covering the section disposed on the arrangement surface of the base layer by the process of Fig.
  • FIG. 12 is a view showing a device for encapsulating a section in which serial sections of a tissue containing a tumor cell are arranged. Each number waved to the left of each section mounting device indicates the serial number assigned to the section. Only the top section of each section mounting device is subjected to HE staining.
  • FIG. 13 shows a microscopic image of a section of gastric tissue containing signet ring cell carcinoma that has been HE-stained and sealed with a mounting medium on a glass slide (upper left, lower left) or a section mounting device (upper right, lower right).
  • FIG. 14 is a view showing an example of the second aspect of the device for encapsulating a section of the present invention, and a view showing a state in which a plurality of sections are individually sealed using the second aspect. The individual seals can be released individually by the structure of the base layer.
  • FIG. 14 (a) is a view showing the lower surface (cover surface of the cover layer) of the section sealing device
  • FIG. 14 (b) is a sectional view taken along line X2-X2 in FIG. 14 (a).
  • FIG. 14 (c) shows another example of the second aspect, and shows the same cross section as FIG. 14 (b).
  • FIG. 15 is a view showing the process of immersing the section in distilled water together with the base layer.
  • FIG. 16 is a photograph showing a section of stomach tissue that has been HE-stained and sealed with a mounting medium on a glass slide (left) or a sectioning device (right).
  • FIG. 17 is a photographic view showing a section of skin tissue that has been HE-stained and sealed with a mounting medium on a glass slide (left) or a sectioning device (right).
  • FIG. 18 is a photographic view showing a microscopic image (high-magnification image (200 ⁇ )) of a section of gastric signet ring cell carcinoma of the stomach that has been HE-stained and sealed together with a mounting agent in a section-encapsulating device.
  • FIG. 19 is a photograph showing a microscopic image (medium magnification (100 ⁇ )) of a Bowen's disease section of skin that has been HE-stained and sealed together with a mounting agent in a section-encapsulating device.
  • FIG. 18 is a photographic view showing a section of skin tissue that has been HE-stained and sealed with a mounting medium on a glass slide (left) or a sectioning device (right).
  • FIG. 18 is a photographic view showing a microscopic image (high-
  • FIG. 20 is a photographic image showing the state before bonding of the cover layer and the base layer.
  • FIG. 21 is a photographic image showing the state after adhesion of the cover layer and the base layer.
  • FIG. 22 shows that only two consecutive devices for sealing the esophagus adenocarcinoma in the esophagus (two for the first and second devices for sealing a section) and the thirteenth consecutive section are sealed. It is a photograph figure showing one piece of devices for section enclosure (device for 3rd section enclosure). The first section of each section mounting device is HE-stained.
  • Figure 23 shows a digital image of the first section of the second section encapsulation device. The annotations indicate the tumor (adenocarcinoma) area of the esophagus.
  • FIG. 21 is a photographic image showing the state after adhesion of the cover layer and the base layer.
  • FIG. 22 shows that only two consecutive devices for sealing the esophagus adenocarcinoma in the es
  • FIG. 24 is a photograph showing an immunostaining image of the second to fourth sections of the first section sealing device.
  • FIG. 25 is a photographic view showing a microscopic image (high-magnification image (100 ⁇ )) of a second section immunostained with p53 antibody.
  • FIG. 26 is a photographic view showing a microscopic image (high-magnification image (100 ⁇ )) of a third section immunostained with a CEA antibody.
  • FIG. 27 is a photographic view showing a microscopic image (high-magnification image (100 ⁇ )) of the fourth section immunostained with the AE1 / AE3 antibody.
  • FIG. 28 is a photographic view showing an unstained section-derived tumor (adenocarcinoma) area in a test tube.
  • FIG. 29 is a graph showing the purity of RNA extracted from the unstained section-derived tumor (adenocarcinoma) region.
  • the section-encapsulating device has, as shown in FIG. 1, a film-like base layer 10 made of an organic polymer material and a film-like cover layer 20 made of an organic polymer material.
  • One main surface of the base layer 10 is adhesive and is a placement surface 10a for placing a section.
  • One main surface of the cover layer 20 is a cover surface 20a for covering the section disposed on the disposition surface 10a of the base layer 10 and for adhering to the disposition surface 10a.
  • the feature of the section sealing device is that (i) a plurality of sections in which at least one of the placement surface 10a and the cover surface 20a (the placement surface 10a in the example of FIG. 1) And (ii) the other of the arrangement surface 10a and the cover surface 20a (the cover surface 20a in the example of FIG. 1) individually separates the plurality of adjacently arranged pieces. It is characterized in that it has a detachable structure with respect to the one (the placement surface 10a in the example of FIG. 1) so as to seal and release the seal individually.
  • the first aspect and the second aspect can be mentioned as the aspect of the device for encapsulating a section having the configuration of the above (i) and (ii).
  • the base layer is a single wide sheet (which may be strip-shaped), and the cover layer has a structure for individually covering a plurality of sections.
  • the second aspect is an aspect in which the roles of the base layer and the cover layer are reversed with respect to the first aspect, the cover layer is a single wide sheet (may be strip-like), and the base layer is It has a structure in which a plurality of sections are individually covered.
  • one main surface of the base layer 10 is a surface having tackiness, and is disposed with a width for arranging a plurality of sections at intervals. It is the surface 10a.
  • the cover layer 20 is a film-like layer for attaching to the arrangement surface 10 a of the base layer 10.
  • the cover surface 20a of the cover layer 20 has a structure that is removable from one of the plurality of sections so as to individually seal and individually release the plurality of sections.
  • the cover layer 20 is configured to have a plurality of frame portions 21 and a plurality of lid portions 22 corresponding thereto. The plurality of frame portions 21 are connected to one another.
  • the plurality of frame portions individually surround each of the plurality of sections disposed on the placement surface 10a, as shown in FIGS. 3 and 4, together with the placement surface 10a, for each section.
  • each frame portion encloses each section, as shown in FIG. 4B, the section is disposed on the bottom surface (arrangement surface) in each well constituted by each frame portion and the disposition surface.
  • the lid 22 is a film-like member for individually covering each section surrounded by each frame.
  • Each lid covers each section surrounded by each frame section and the arrangement surface around it, and sandwiches and seals each section together with the arrangement surface. Further, each lid is detachable or movable with respect to each frame.
  • each lid can be separated from each section, or can be separately covered after the frame section is first attached to the surface on which the base layer is disposed.
  • the device for encapsulating a section having the above configuration the above-described effects can be obtained, and the object of the present invention is achieved.
  • the configuration of each part of the section sealing device will be described.
  • encapsulation refers to “a mode in which a section placed on one main surface of a base layer and stained is sealed by a cover layer together with a mounting agent”, and “main one of the base layer "Aspect in which only unstained sections arranged on the surface are sealed by the cover layer".
  • the stained section which is disposed on one of the main surfaces of the base layer and surrounded by the frame portion of the cover layer attached to the base layer, is Only the unstained sections, which are sealed by the cover of the cover layer, and "a surface disposed on one of the main surfaces of the base layer and surrounded by the frame of the cover layer affixed to the base layer" Is included in both of the embodiments in which the cover is sealed by the lid.
  • the base layer, the cover layer, the frame portion of the cover layer, and the lid portion of the cover layer in the first aspect will be described in detail.
  • the base layer may be a rigid substrate, but the portion other than the placement site is a slice device in that the operation of attaching the attachment surface to the placement surface is preferably performed while cutting the slice thinly with a slicing device such as a microtome.
  • a slicing device such as a microtome.
  • it is a flexible substrate that can be bent so as not to hinder the operation of the cutting blade.
  • a film made of an organic polymer material can be mentioned.
  • the base layer has adhesiveness so that at least one of the two main surfaces can be used as a disposition surface.
  • the whole layer is a film made of a self-adhesive material such as polyurethane gel, or, as shown in FIG. 1 (b), a lower support layer 11, It is preferable that it is a laminated body (a film-like material having a laminated structure) having an adhesive material layer 12 on the upper layer side, and the surface of the adhesive material layer 12 is an arrangement surface 10a.
  • the thickness (layer thickness) of the entire base layer 10 is not particularly limited, and may vary depending on the material, but is about 15 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • examples of the material of the support layer 11 include organic polymer materials such as polyethylene, polyethylene terephthalate, and polytetrafluoroethylene.
  • the thickness of the support layer 11 is not particularly limited, and may vary depending on the material, but is about 10 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • the material of the pressure-sensitive adhesive layer 12 (that is, the pressure-sensitive adhesive) is not particularly limited, but is made of an organic polymer material such as an acrylic pressure-sensitive adhesive (for example, Lintec Co., Ltd., product number 3755AD25), a urethane-based pressure-sensitive adhesive Adhesives are mentioned as preferred.
  • the thickness of the pressure-sensitive adhesive layer 11 is not particularly limited, and may vary depending on the material, but may be about 5 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • Adhesives are a type of adhesive also called pressure sensitive adhesives.
  • the adhesiveness of the pressure-sensitive adhesive layer is preferably such that the lid can be peeled off after the lid is attached to the surface (arrangement surface) of the pressure-sensitive adhesive layer.
  • the base layer is a laminate having flexibility
  • a commercially available pressure-sensitive adhesive tape or pressure-sensitive adhesive sheet can be used as the base layer, and in particular, a pressure-sensitive adhesive tape or pressure-sensitive adhesive sheet for holding a section can be preferably used.
  • the tackiness of the pressure-sensitive adhesive layer in the present invention can refer to the tackiness of the pressure-sensitive adhesive tape for holding a section or a pressure-sensitive adhesive sheet.
  • the cover layer 20 may be independent pieces with a cover surface of a width for placing one section.
  • the cover layer of such pieces is used as many as the number of sections placed on the placement surface of the base layer, sealing each section individually. Also, after sealing, the seal is released for each section by peeling off the individual cover layers individually.
  • the cover layer 20 has a frame portion 21 and a lid portion 22.
  • the frame portion 21 is a member surrounding a section (for example, the portion indicated by reference numeral 30 in FIG. 4B) disposed on the disposition surface 10a of the base layer 10, and thus the central portion surrounded by the frame portion When the lid is removed, the opening (through hole) 21a is formed.
  • the frame portion and the lid portion may be separate members from each other, but in a preferred embodiment, as shown in FIG.
  • the part enclosed by the frame part is each lid part.
  • the lid has an outer shape that fits snugly into the opening 21a enclosed by the frame.
  • the lid is a portion cut from the opening 21 a surrounded by the frame.
  • the outer shape of the lid 23 is smaller than the shape of the opening surrounded by the frame, and an appropriate gap is formed between the outer peripheral surface of the lid 23 and the inner surface of the opening. There is. Further, in the embodiment illustrated in FIG.
  • the outer peripheral edge portion of the lid portion 24 protrudes outward from the opening surrounded by the frame portion, and rides on the upper surface of the frame portion.
  • the frame portion and the lid portion are film-like members formed separately.
  • the operation of covering the section by the lid removed from the frame is easy in that the operation of fitting the lid into the opening of the frame is not necessary. is there.
  • the material of the frame portion is not particularly limited, but examples of flexible materials include organic polymer materials such as polyethylene, polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene and the like.
  • the thickness of the frame portion is not particularly limited, the thickness of about 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m is preferable in consideration of the thickness of the section and the thickness of the lid described later, and the thickness of about 100 ⁇ m to 300 ⁇ m is more preferable. is there.
  • the lid portion is preferably a film made of a flexible organic polymer material so as to be in close contact with the arrangement surface and the slice and preferably covered.
  • the material of the lid is not particularly limited, but examples of flexible materials include organic polymer materials such as polyethylene, polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene, and the like.
  • the thickness of the lid is not particularly limited, but is preferably about 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m, and more preferably about 100 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • the frame portion and the lid portion are different portions included in the same single film.
  • the material and thickness of the frame portion and the lid portion are the same as each other.
  • a part or all of the outer periphery of each lid may be cut from each frame so that each lid is detachable or movable with respect to each frame.
  • that each lid is "removable or movable" with respect to each frame means that it is completely separated from each frame, as exemplified below.
  • it includes a detachable state, or a state in which an opening and closing operation like a door is possible with a part connected to each frame part. In the embodiment shown in FIG.
  • the outer shape of each lid and the shape of the opening of each frame are the same rectangle, and each lid and each frame are not cut at the apex of the rectangle and are connected with each other ing.
  • the outer shape of each lid and the shape of the opening of each frame are the same rectangle, and each lid and each frame have a center of two opposing sides of the rectangle. , They are not cut off and connected to each other.
  • These parts connected to each other are about 0.1 mm to 0.3 mm, and can be easily divided by pulling the lid with a hand or the like, and the lid can be removed from the frame.
  • FIGS. 2 (c) and 2 (d) the position, length, etc.
  • the portion where the lid portion and the frame portion are connected to each other may be determined appropriately, so that only the connected portion is more easily divided. Any other configuration may be added, such as Further, in the embodiment shown in FIG. 2 (e), the outer shape of each lid and the shape of the opening of each frame are the same rectangle, and each lid and each frame are cut along one side of the rectangle. It is connected with each other. According to this aspect, as shown by a broken line in FIG. 2E, the connected side can be used as a hinge and the lid can perform an open / close operation like a door.
  • the shape and size of the opening (through hole) of the frame portion in the first aspect can be appropriately determined according to the outer shape of the section so as to accommodate the section.
  • the basic shape of the openings is not particularly limited and may be circular or square (square, rectangular) or the like, but in view of no dead space between the openings, it may be a square, particularly illustrated in FIG. Thus, a rectangle extending in the direction of arrangement (in the direction of the next opening) is a preferred basic shape. Modifications of details to the basic shape may be made as appropriate, such as rounding of corners (apex portions) of a square or chamfering.
  • the length of one side is not particularly limited, but in view of the size of a section of a general sample, about 30 mm to about 50 mm is versatile, and in particular, 40 mm to About 45 mm is useful.
  • the dimension L2) or the like) can be appropriately determined in accordance with the size of the opening and the strength of the frame portion.
  • the distance between the centers of the openings is preferably about 40 mm to 60 mm
  • the dimension L1 of the frame portion existing between the openings is preferably about 1 mm to 10 mm
  • the distance L2 from the opening to the edge of the frame is, for example, about 1 mm to 5 mm as a preferred dimension.
  • the lid portion may be turned to the back if the shapes are line symmetrical or point symmetric. Even if it is rotated about a point-symmetrical rotation center, the lid can fit into the opening of the frame, which is preferable. However, such an advantage can be obtained when the line symmetry or point symmetry shape is exactly the line symmetry or point symmetry shape.
  • the lid may be turned over or point symmetric even if it looks axisymmetric or point symmetric If it rotates about the rotation center, it may not fit exactly in the opening, and it may take time to search for the fitting position. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the outer peripheral shape of the lid portion and the outer peripheral shape of the opening portion into which the lid portion is fitted are basic shapes which are not line symmetrical and not point symmetrical. As a result, only one attitude in which the lid fits in the opening is clarified, and it is not necessary to search for the attitude in which the lid fits in the opening.
  • the basic shape which is not such line symmetry and not point symmetry is not particularly limited.
  • the shape has a chamfered shape only at three places, or a shape where protrusions are provided at irregular positions on the outer edge of the lid (in this case, the protrusions fit into the positions corresponding to the protrusions at the opening) Notches of the same shape are provided) and the like.
  • the cover surface 200a of the cover layer 200 has a width that encompasses a plurality of sections 30 arranged next to each other.
  • the arrangement surface (adhesive surface) of the base layer 100 covers the cover surface of the cover layer 200 so as to individually seal and release the plurality of sections individually. It has a detachable structure with respect to 200a.
  • the cover layer in the second aspect may be a simple single wide sheet, and in a preferred aspect is a band-like sheet having a predetermined length and a predetermined width as described later.
  • the base layer in the second embodiment has a frame and a central portion as in the cover layer of FIG. 1 (a), as in the cover layer of FIGS. 2 (a) to 2 (e), A mode in which the central part is completely separated from the frame part, a not completely separated but separable aspect, or a door-like opening / closing operation with a part connected to the frame part It may be an aspect.
  • the separately removable structure of the base layer can refer to the structure of the cover layer described above.
  • the base layer 100 has a support layer 110 and an adhesive material layer 120, and a laminate (a film having a laminated structure) in which the surface of the adhesive material layer 120 is an arrangement surface 100a.
  • the base layer 100 is a small piece having a placement surface 100a of a size for placing one section 30.
  • the base layer 100 is used as many as the number of segments.
  • the cover surface 200 a of the cover layer 200 has an area where the plurality of base layers 100 can be attached adjacent to each other. As a result, as shown in FIG.
  • the base layer and the base layer are arranged in a state in which the plurality of sections are arranged adjacent to each other by the arrangement surface 100a of the plurality of base layers and the cover surface 200a of one cover layer.
  • the seal is released for each section.
  • FIG. 14 (b) shows an embodiment where the base layer 100 is a simple piece.
  • the base layer 100 has a frame portion 102 and a central portion 101 surrounded by the frame portions.
  • the frame portion 102 has a support layer 112 and an adhesive layer 122
  • the central portion 101 has a support layer 111 and an adhesive layer 121.
  • the frame portion 102 and the central portion 101 may be divided by cutting after being formed as a single sheet.
  • the relationship between the frame portion 102 and the central portion 101 is such that the central portion is completely separated from the frame portion, as in the cover layers of FIGS. 2 (a) to 2 (e). It may be an aspect which is not separated but is separable, or an aspect which can be opened and closed like a door in a state where a part is connected to the frame part.
  • the thickness, material, dimensions, cover layer thickness, material, dimensions of the base layer in the second aspect can refer to parts of the first aspect.
  • the base layer and the cover layer are transparent so that the sealed section can be observed from the outside, speculum with almost the same resolution as a glass slide is possible, and tissue Chemical diagnosis is also possible, which is preferable.
  • the base layer and the cover layer preferably have the same outer shape.
  • the outer peripheral shape of the device for encapsulating a section may be any shape, and the sections may be arranged in a matrix, but in view of ease of carrying and practicability of observation under a microscope, the section has a predetermined length and A belt shape having a predetermined width is a preferable shape.
  • the outer peripheral shapes of the base layer and the cover layer are also in the shape of a band having the predetermined length and the predetermined width.
  • the base layer has a predetermined band width and length such that a plurality of sections are arranged in a row at predetermined intervals in a longitudinal direction of the arrangement surface of the base layer.
  • the base layer and the cover layer preferably have the same outer circumferential shape.
  • the band width and the band length can be appropriately determined according to the outer shape of the section.
  • the band width is generally about 20 mm to 50 mm, and particularly about 30 mm to 40 mm.
  • the length of the band may be long enough to be wound on a roll, but it is easy to carry, convenient for observation under a microscope, and of an opening size sufficient to attach the section. From the viewpoint of balancing, a strip-like length capable of arranging about 3 to 6 pieces, preferably about 4 to 5 pieces, is useful. In the example of FIGS. 1 to 5, it is a strip shape in which five pieces of segments can be arranged.
  • the section sealed in the section-encapsulating device of the present invention is not particularly limited, but the utility of the present invention is particularly remarkable if it is a continuous section obtained by sequentially slicing from a tissue sample.
  • the tissue sample 30A may be one in which paraffin 32A surrounds the periphery of the tissue 31A.
  • a lesion portion 33A is included in a tissue 31A illustrated in FIG. 12 (a).
  • the tissue used for the tissue sample is not particularly limited, but is not limited to mammals (eg, human, monkey, mouse, rat, dog, cow, horse, pig, sheep, goat, cat, rabbit, hamster, Guinea pig, preferably human, tissue (eg, brain, each part of brain (eg, olfactory bulb, amygdala, cerebrum bulb, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, bulbar, cerebellum), spinal cord, pituitary, Stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal, skin, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, prostate, testis, ovary, Placenta, uterus, bone, joints, adipose tissue, skeletal muscle, etc.).
  • mammals eg, human, monkey, mouse, rat,
  • the tissue may be a normal tissue or a tissue containing a lesion, but it is suitable for the material of a section in which the tissue containing the lesion is sealed in the device for encapsulating a section of the present invention.
  • Lesions include neoplastic lesions, inflammatory lesions, infectious lesions, degenerative lesions and the like.
  • the tissue sample is trimmed to an outer peripheral shape and size that fits in the opening of the frame portion of the device for encapsulating a section of the present invention or in the base layer, and fixed, embedded, dewatered and degreased, and substituted with an intermediate, and embedded in paraffin. It is obtained by Specifically, after carefully removing excess fat and blood clots of the extracted organ in physiological saline and thoroughly wiping the moisture with filter paper, the fixation process is to form a rectangular parallelepiped having a side of 5 to 20 mm. It can be carried out by trimming with a razor and immersing in a fixative. Examples of the fixative include formalin solution and Bouin solution, but formalin solution is preferable.
  • the formalin solution use is made of a 4% aqueous formaldehyde solution in which a 35 to 40% aqueous formaldehyde solution is diluted with distilled water or a buffer solution. Fixation is usually performed at room temperature for 24 hours to 48 hours.
  • Bouin solution is prepared at the time of use by mixing 15: 5: 1 (v / v) of picric acid saturated aqueous solution, 35 to 40% formaldehyde aqueous solution, and glacial acetic acid respectively.
  • the Bouin solution has the disadvantage of causing hemolysis, but is excellent in that contraction of tissue is small and fixation time is short (2 to 6 hours). Since 70 to 80% of the tissue is water, the tissue after fixation does not penetrate paraffin into the tissue as it is.
  • the dewatering / degreasing treatment can be carried out by first completely removing (dehydrating) water in the tissue with an alcohol series (methanol or ethanol). At this time, fat is also removed (defatting) to prevent melting point depression of paraffin.
  • alcohol series methanol or ethanol
  • fat is also removed (defatting) to prevent melting point depression of paraffin.
  • dehydration is performed in 70% ethanol overnight, 30 minutes x 5 times in 99.5% ethanol, and 30 minutes in 100% ethanol. Since ethanol is not compatible with paraffin, once the ethanol which has permeated into the tissue is subjected to a replacement treatment with an intermediate such as xylene or chloroform, the paraffin dissolved in the tissue is permeated.
  • Chloroform is twice as toxic as xylene, but it has a high penetration rate into tissues and is excellent in that it is nonflammable.
  • the substitution treatment can be carried out by performing substitution twice for 30 minutes. After replacement treatment with an intermediate, the tissue is infiltrated four times for 30 minutes in melted hard paraffin (60 ° C.) in a paraffin melter set at 60 ° C. Thereafter, the paraffin is poured into a frame for paraffin embedding, and the tissue is dipped and hardened. A tissue sample can be obtained as described above.
  • the thickness of the section is not particularly limited, but is generally 3 ⁇ m to 20 ⁇ m, generally 3 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the outer peripheral shape and size of the section may be indeterminate, and the outer peripheral shape and size fit in the opening of the frame portion or in the base layer described above are preferable, and the outer shape and size in a conventionally known specimen can be referred to.
  • the method for producing the section-encapsulated sample uses one or more sections-encapsulating device of the present invention described above.
  • a single device for sealing a section may be used if a single device for sealing a section can dispose a sufficiently large number of sections
  • the device for sealing a section is a strip, and one section
  • the number of sections that can be placed on the encapsulating device is on the order of three to six. In that case, the required number of strip-shaped pieces for encapsulating a device may be used.
  • FIG. 12 (b) is a view in the case of using the first aspect of the device for encapsulating a section of the present invention, but can also be regarded as a view in the case of using the second aspect.
  • a predetermined portion such as the leading end of each strip-shaped enclosed sample portion can be used to control the plurality of strip-shaped enclosed sample portions. It is preferable to describe the contents and the order of the above, and a barcode, an IC chip, an IC tag or the like in which the contents and the order of the sections are described may be given.
  • the method of manufacturing the section-encapsulated sample includes a section disposing step and a sealing step.
  • a section obtained by slicing a tissue sample is placed on the placement surface of the base layer of the section-encapsulating device.
  • the cover layer of the section sealing device covers and seals the sections disposed on the placement surface of the base layer, and a plurality of sections are mutually enclosed and section encapsulated in the order of slices. Get a sample.
  • FIG. 11 shows an example of a section disposing step
  • FIG. 11 (b) shows an example of a sealing step.
  • the tissue sample 30A is sliced by the cutting blade 50 of the slicing apparatus (the main body is not shown) on the disposing surface 10a of the base layer 10 of the section encapsulating device.
  • the plurality of segments 30 are spaced apart from one another in the order of slices. The distance between the centers of the segments at this time is equal to the distance between the centers of the openings of the frame portion of the cover layer described above.
  • positioning surface of a base layer previously, and covering a slice with a cover layer later becomes possible, and the efficiency of processing improves.
  • the arrangement surface of the base layer (the base layer is transparent because the section is arranged on the arrangement surface of the base layer to be equal to the center-to-center distance between the openings of the frame unit in the absence of the frame portion
  • a mark 10P for segment arrangement as shown in the photograph of FIG. 3 be applied by printing or the like to the back surface of the base layer.
  • the segments can be positioned at the center annotation of each frame section.
  • the mark 10P for segment arrangement is a dot, the aspect which draws the line of the shape same as the shape of the opening of a frame part, the aspect which draws a line which shows only four corners of the opening, a frame
  • Various marks may be employed to assist the alignment of the slicing apparatus with the base layer, such as an aspect in which the part corresponding to the part is colored.
  • the frame portion 21 of the cover layer 20 of the section encapsulation device surrounds each of the sections 30 disposed on the placement surface 10a of the base layer 10
  • Each section is individually surrounded by the cover 22 of the cover layer 20, and the sections are sandwiched and sealed between the cover 22 and the placement surface 10a as shown in FIG. 4C.
  • the method for producing a section-encapsulated sample has a staining step of staining for examining whether or not a lesion part is included in the section.
  • the step of staining the sections is not applied to all the sections, but to the sections arranged in the order of slices, it is applied to specific sections spaced by a predetermined number of sections.
  • the staining step may be performed in the case of the first aspect of the device for segment encapsulation, (i) placing a segment during the segment placement step described above, or (ii) after the segment placement step It may be carried out before the sealing step, or (iii) may be carried out with the lid opened for the particular sealed section after the sealing step.
  • the preferred timing of the operation is the timing of the above (iii) from the point of staining only a predetermined section to prevent adhesion of staining solution to other sections.
  • the above-mentioned staining step may be performed while (i) placing a section during the above-described section placing step, or (ii) after the section placing step And may be performed before the sealing step, and (iii) after the sealing step, the sealed specific section may be performed again from the cover layer together with the base layer.
  • the preferred timing of the practice is the timing of (ii) or (iii) from the viewpoint of staining only a predetermined section to prevent adhesion of staining solution to other sections.
  • the staining method for examining whether or not the section contains a lesion area can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the target lesion area to be detected, but as the staining method to be selected first, hematoxylin and hematoxylin are selected. Eosin staining (HE staining) may be mentioned. HE staining can easily stain a wide range of stained objects such as cell nuclei, cytoplasm, stroma, cartilage tissue, erythrocytes, etc., and the tissue structure can be grasped by microscopic observation.
  • HE staining is performed by deparaffinizing the sections, staining the sections sequentially with a hematoxylin staining solution and eosin staining solution, dehydrating and clearing, and sealing with a mounting agent and a lid or a cover layer be able to.
  • deparaffinization can be carried out by dripping deparaffinization solution onto a section, spreading it over the entire surface of the section, and then sucking the deparaffinization solution two to three times.
  • An alkane type organic solvent is used as a deparaffinization liquid.
  • alkane organic solvent examples include heptane and octane.
  • Clear Plus (Pharma Co., Ltd.) can also be used as a commercially available deparaffinizing solution.
  • xylene can also be used as a deparaffinizing solution.
  • the staining process with the hematoxylin staining solution and the eosin staining solution is performed by washing the section with running water, dropping the hematoxylin staining solution onto the section to react, washing the section again with running water, and treating the eosin staining solution to the section It can implement by dripping and making it react. As illustrated in FIG.
  • the sections placed on the placement surface 10 a surrounded by the frame portion 21 of the section encapsulating device are stained with the hematoxylin solution 40.
  • Dehydration treatment can be carried out specifically by dropping an alcohol series (methanol or ethanol) onto the section and sucking it.
  • Penetration treatment can be implemented by the same operation as the above-mentioned deparaffinization treatment.
  • the sealing process can be carried out specifically by dropping a mounting agent onto the section and sealing the section with a lid.
  • an acrylic resin dissolved in an alkane organic solvent is used.
  • the alkane organic solvent include heptane and octane.
  • acrylic resin polymethyl methacrylate, polymethyl acrylate, etc. are mentioned.
  • each treatment in the case of the second aspect of the device for encapsulating a section includes deparaffinization, staining with hematoxylin staining solution and eosin staining solution, dehydration processing, and clearing treatment, in which the base layer and the section are integrated. It can be carried out.
  • the inside of an arbitrary container is filled with a deparaffin solution, hematoxylin staining solution, eosin staining solution, water, alcohol or the like to an extent that the base layer and the section can be immersed in a united state,
  • a deparaffin solution hematoxylin staining solution, eosin staining solution, water, alcohol or the like
  • Each of the above treatments can be carried out by immersing (FIG. 15).
  • the sealing process can be carried out by covering the united base layer and section after staining with a covering layer with a covering layer and sealing the section.
  • the section disposing step a plurality of devices for encapsulating a section are used and a plurality of sections are sectioned
  • staining is performed on the top section of each of a plurality of sections in each section encapsulating device (each strip-shaped enclosed sample portion) Is preferred. This makes it possible at a glance to see what sections each strip-like section of the enclosed sample contains.
  • the identification method uses one or more of the section-encapsulated specimens manufactured by the method of manufacturing a section-encapsulated specimen described above (however, the manufacturing method essentially includes a staining step).
  • the tissue 31A in the original tissue sample 30A before slicing contains a lesion 33A.
  • this lesion portion 33A is assumed to be included in the sixth to the 22nd sections by being sliced.
  • one section of a predetermined number of sections is stained, and in a preferred embodiment, it is determined along the order of slices. Of the number of sections, the leading section is stained.
  • attention is paid to the stained sections, and it is determined in accordance with the order of slices whether or not a lesion area is included.
  • To determine in accordance with the order of slices means to associate the order of slices with the determination, and the order of determination is not limited.
  • the first section S1, the seventh section S7, the thirteenth section S13, the nineteenth section S19, and the twenty-fifth section S25 are determined. Then, the first section (in the example of FIG.
  • each of the sixth and twentieth to twenty-second sections (S6, S20 to S22) including the lesion area is excluded from the subject, but includes the lesion area by staining of a small number of sections. The presence range of the section can be identified quickly, and the section containing the unstained lesion area can be subjected to further examination.
  • the section-enclosed sample is constituted by a plurality of strip-shaped (five in the example of the illustrated example) section-enclosed sample portions.
  • a section containing a section containing a section indicating that the section contains a lesion by staining in the example of FIG. 12 (b), the second, third and fourth sections from the left
  • the section sealed in the section-encapsulated sample is a section sliced from a tumor tissue
  • the staining is HE staining
  • a lesion identified in the section stained by HE staining The part may be a tumor part.
  • criteria for determining whether or not a tumor part is included in the section can be determined based on, for example, the disorder of cell polarity, swelling or deformation of cell nuclei, chromatin staining, etc. .
  • Example 1 Preparation of a Device for Containing a Section Containing Five Wells and Sealing of a Section
  • the inventors prepared a device for containing a fragment for containing five wells (FIG. 2).
  • a material in which polyethylene terephthalate is used as a material of the support layer and the cover layer, and an acrylic adhesive is used as an adhesive of the adhesive layer was used.
  • the thickness of the support layer was 20 ⁇ m
  • the thickness of the pressure-sensitive adhesive layer was 5 ⁇ m (25 ⁇ m for the base layer)
  • the thickness of the cover layer was about 100 ⁇ m.
  • the size of the base layer and the cover layer was set to 30 mm in width and 240 mm in length so as to fit in an A4 clear file or the like.
  • the size of the opening of the cover layer was set to 24 mm in width and 42 mm in length, and the lid was cut out so that the intervals between the openings became uniform. In addition, it was tried to actually attach a section to the section sealing device (FIG. 3).
  • sticker enclosure which the unstained section was sealed is shown below. 1.
  • Formalin fixed paraffin embedded tissue blocks of normal lungs were set in a microtome.
  • the microtome may be either a rotary type or a slide type. 2.
  • the edge of the microtome so that slices of 3-5 ⁇ m thickness can be sliced from the tissue sample, the base layer is attached to the tissue sample surface, and the slice is adhered to the base layer by slicing the tissue sample as it is.
  • Example 2 HE staining of the section sealed in the section sealing device It was tried whether the section sealed in the device for sealing HE staining section could be HE stained in the well. The reaction was carried out by dropping 0.1 to 0.3 mL (mL is a milliliter) of the solution on the wells without directly immersing the device for encapsulating a section in a staining solution etc. except for washing with running water. Also, in order to minimize the reaction between the adhesive of the cover layer and the adhesive layer and the staining solution, it is not xylene which is generally used in HE staining when deparaffinizing and clearing the section, An alkane organic solvent, Clear Plus (Pharma Co., Ltd.), was used. The specific procedure is shown below. 1.
  • the lid of the first section of the sectioning device prepared according to Example 1 was peeled off. 2.
  • 0.1 to 0.3 mL of Clear Plus is added dropwise to the wells with the section mounting device inclined at 30 to 45 degrees, and after flowing over the surface of the section, use a paper etc to remove Clear Plus. Sucked.
  • the sections were deparaffinized by repeating this operation 2-3 times. 3. Above 2.
  • the procedure of was carried out with 100% ethanol instead of Clear Plus. 4.
  • the sections were flushed with running water for 30 seconds to 1 minute. 5.
  • 0.1-0.3 mL of hematoxylin solution was dropped to the wells and reacted with the sections for 1 to 3 minutes (FIG. 6). 6.
  • the sections were flushed with running water for 30 seconds to 1 minute. 7.
  • 0.1-0.3 mL of eosin solution was dropped to the wells and reacted with the sections for 30 seconds to 1 minute.
  • 8. 0.1 to 0.3 mL of 100% ethanol was added dropwise to the wells while the device for segment mounting was inclined at 10 to 30 degrees, and it was drained while dewatering. 9. Above 2.
  • the section was processed through the procedure of. 10.
  • the section was sealed with a lid with a mounting agent (PARA mount D (Pharma Co., Ltd.)) in which an acrylic resin was dissolved in an alkane-based organic solvent (FIGS. 7 and 8).
  • the HE-stained sections in the section-encapsulating device obtained as described above were clearly observed even with a speculum with an objective lens of 4 to 20 ⁇ magnification (FIGS. 9, 10).
  • a glass slide was used in the staining and discrimination of tissues and cells. The same diagnosis as a glass slide could be obtained at almost the same level as ( Figure 11).
  • Example 3 Examination of Diagnosability by HE Staining of a Section Sealed in a Device for Section Encapsulation Using Tissue Specimens of 30 Cases
  • the inventors have made a histodiagnosis by HE staining of a section sealed in a device for section encapsulation. It was examined using past specimens of a relatively large number of cases. A total of 30 cases of formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens, including 5 cases each of the stomach, esophagus, large intestine, lung, skin and cervix, were used for the examination.
  • various resection methods included biopsy, excision biopsy, and surgical excision, and various diagnoses including benign, atypical, and malignant.
  • the observer described the diagnosis by examining the glass slide of the above 30 cases and described the diagnosis, and after describing the two-week interval, examined the specimens of the same 30 cases prepared by the device for section inclusion and described the diagnosis . According to this method, the agreement rate of the diagnosis by the glass slide and the diagnosis by the device for section sealing was determined.
  • the second mode shown in FIGS. 14 (a) and 14 (b) was used as a device for sealing a section.
  • a material in which polyethylene terephthalate is used as a material of the support layer and the cover layer, and an acrylic adhesive is used as an adhesive of the adhesive layer was used.
  • the thickness of the support layer was 20 ⁇ m
  • the thickness of the pressure-sensitive adhesive layer was 5 ⁇ m (25 ⁇ m for the base layer)
  • the thickness of the cover layer was about 200 ⁇ m.
  • the size of the base layer and the cover layer was set to be approximately the same size as a normal glass slide or cover glass, and one case's sections were placed on one section mounting device. Specifically, the size of one base layer was set to 30 mm in width and 50 mm in length, and the surplus portion was appropriately cut off according to the size of the tissue block. In addition, the size of the cover layer was set to 30 mm in width and 75 mm in length.
  • the sections were immersed in distilled water for 2 to 3 minutes and rinsed away. 6. The sections were immersed in eosin solution for 1 minute. 7. The sections were rinsed by immersion in distilled water for 30 seconds. 8. Above 1. The procedure of was replaced with Fast Solve and dehydrated with 100% ethanol. 9. Above 1. I did the operation and cleared. 10. The sections were sealed by sandwiching the section with the mounting agent between the base layer and the cover layer (Fig. 16, Fig. 17). The HE-stained sections in the section-encapsulating device obtained as described above were clearly observed even with a speculum with an objective lens of 4 to 40 ⁇ magnification (FIGS. 18 and 19). The number of diagnostic matches of one observer was 26 matches and 4 mismatches.
  • the connective tissue having many components such as fibers has low chargeability as compared with the epithelial tissue having many cellular components, so it has low adhesiveness and stability on the glass slide, and is easily exfoliated in the staining process. A similar phenomenon to this may have occurred this time with the device for encapsulating a section. Secondly, it was thought that it was not due to mechanical stress on the blocks during slicing. However, most of the tissue blocks used this time were about 8 years after preparation, and there was a possibility that vulnerability was increased due to drying and deterioration of the sample. From this, it was thought that it could be improved by using a relatively recently produced tissue block. If this did not improve, it could be improved by improving the microtome.
  • tissue diagnosis can be performed similarly to a glass slide in a device for section encapsulation.
  • Example 4 Immunostaining of Sections Sealed in a Section-Encapsulating Device
  • the inventors examined whether immunostaining of sections sealed in a section-encapsulating device was possible.
  • the section enclosing device the second mode shown in FIGS. 14 (a) and 14 (b) was used as in the third example.
  • a material in which polyethylene terephthalate is used as a material of the support layer and the cover layer, and an acrylic adhesive is used as an adhesive of the adhesive layer was used.
  • the thickness of the support layer was 20 ⁇ m
  • the thickness of the pressure-sensitive adhesive layer was 5 ⁇ m (25 ⁇ m for the base layer)
  • the thickness of the cover layer was about 200 ⁇ m.
  • the size of the base layer was set to be 30 mm in width and 50 mm in length, which were approximately the same size as a normal cover glass, and one slice was placed on one base layer.
  • the cover layer was set to a width of 30 mm and a length of 300 mm so that six continuous sections could be mounted (FIGS. 20 and 21).
  • the sections were immersed in distilled water for 2 to 3 minutes and rinsed away. 4.
  • the sections were immersed in an antigen activation solution (Epitope retrieval solution, Leica Biosystems, Inc.) for 40 minutes at 98 ° C. 5.
  • the sections were immersed and washed in a buffer solution (Bond Wash Solution, Leica Biosystems, Inc.) for 2 to 3 minutes. 6.
  • 100 ⁇ L of a hydrogen peroxide solution was dropped on a clean glass flat plate (this time using a glass slide), and the section side was placed so as to be immersed in the solution by capillary action and reacted for 30 minutes. 7.
  • the sections were rinsed by immersion in buffer solution for 2 to 3 minutes. 8. Above 6.
  • the sections were reacted with primary antibody for 30 minutes in the same manner as in.
  • an antibody against p53 Leica Biosystems, Inc.
  • an antibody against pancytokeratin AE1 / AE3, Nichirei Biosciences, Inc.
  • an antibody against CEA Dako, Inc.
  • the sections were rinsed by immersion in buffer solution for 2 to 3 minutes. 10. Above 6.
  • the sections were reacted with a sensitizing solution (Mouse LINKER, Dako Inc.) for 15 minutes in the same manner as in. 11.
  • the sections were rinsed by immersion in buffer solution for 2 to 3 minutes. 12. Above 6.
  • the sections were reacted with a secondary antibody (Bond Polymer Refine Detection, Leica Biosystems, Inc.) for 30 minutes in the same manner as in (1). 13. The sections were rinsed by immersion in buffer solution for 2 to 3 minutes. 14. The sections were labeled by dropping a diaminobenzidine solution (DAB + Liquid, Dako Co., Ltd.). The reaction time was confirmed under a microscope and ended when the reaction progressed appropriately. 15. The sections were immersed in distilled water for 2 to 3 minutes and rinsed away. 16. The sections were immersed in hematoxylin solution for 2 minutes. 17. The sections were rinsed by immersion in distilled water for 30 seconds. 18. Above 1. The procedure of was replaced with Fast Solve and dehydrated with 100% ethanol. 19. Above 1. I did the operation and cleared. 20. The sections were sealed by sandwiching the section with the mounting agent between the base layer and the cover layer. The immunostained sections in the section mounting device obtained as described above were confirmed to be appropriately stained (FIGS. 24 to 27).
  • Example 5 Extraction of Nucleic Acids from Sections Sealed in a Device for Section Encapsulation
  • the inventors examined whether it is possible to extract nucleic acids necessary for genetic testing from the sections sealed in a device for section encapsulation.
  • six unstained sections were peeled off from the device for section encapsulation prepared in Example 4 together with the base layer, and subjected to nucleic acid extraction.
  • the extraction was performed according to the protocol using RNeasy FFPE kit, a reagent for research by Qiagen, Inc. The specific procedure is shown below. 1.
  • the sections were immersed quickly in xylene three to five times with the base layer and deparaffinized (operations in the following steps were also carried out with the base layer and sections integrated). 2. Above 1. The operation of was carried out with 100% ethanol. 3. The sections were allowed to dry. 4. From the observation of the HE staining of the first section of each section mounting device, the area identified as tumor in the dried section was cut out and inserted into the test tube (FIG. 28). 5. The buffer solution was dropped into a tube and centrifuged at 10000 times / minute for 1 minute. 6. The protease K solution was dropped into a tube and reacted at 56 ° C. for 15 minutes and at 80 ° C. for 15 minutes. The reaction was quenched by ice-cooling for 7.3 minutes.
  • the RNA concentration was 18.2 ng / ⁇ l, and the amount of RNA corresponding to the thickness and number of sections used for extraction was obtained.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本発明の切片封入用デバイスは、有機高分子材料からなるフィルム状のベース層と、有機高分子材料からなるフィルム状のカバー層を有する。ベース層の一方の主面は、粘着性を有し、切片を配置するための配置面である。カバー層の一方の主面は、ベース層の配置面に配置された切片を覆いかつ配置面に貼り付くためのカバー面である。前記配置面およびカバー面のうち、少なくとも一方が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、他方が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方に対して着脱可能な構造を有する。

Description

切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途
　本発明は、組織試料から薄く順次スライスされた切片を密封し標本とするための切片封入用デバイスに関する。また、本発明は、前記切片封入用デバイスの製造方法、および、該切片封入用デバイスを用いて作成された標本中の多数の切片の配列中から病変部分（腫瘍細胞など）を含んだ切片を特定する方法に関する。
　組織形態学や病理学の分野では長い間、組織標本をパラフィンなどに包埋して組織試料とし、ミクロトーム（薄切装置）を用いてこれを数μｍにスライスした切片をガラススライドに貼り付け、化学的に染色、薄いカバーガラスで封入剤と共に密封、顕微鏡で観察（検鏡）、保存するという手法が取られてきた。
　病理診断業務においては、通常、最も基本的な組織の染色方法であるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を施し、まず形態学的な観察で診断の絞り込みを行い、必要に応じて特殊染色、免疫染色、蛍光 in situ ハイブリダイゼーションや次世代遺伝子シークエンス（ＮＧＳ）などの遺伝子解析といった追加検査を逐次オーダーし、確定診断を下すというフローを取る。これには、余分な検査を行わないという医療経済的な理由だけでなく、将来の検査や研究に必要な組織を可能な限り保存するために、徒に切片をブロックから切り取らないようにするという目的もある。
　このとき、追加薄切された切片に、検査対象となる細胞（腫瘍細胞など）が含まれているか否かは検査結果に大きな影響を与える。例えば、初めのＨＥ染色標本に腫瘍細胞があり、この腫瘍の診断を確定するために追加染色をしたものの追加薄切された切片に同じ腫瘍細胞が含まれていなかった場合、その追加検査自体が無駄になる、もしくは偽陰性として誤った診断を下してしまう可能性がある。実際には、染色を施していない（未染）切片に腫瘍細胞が含まれているか否かの直接的な確認は難しいので、対象の未染切片（１枚、もしくは複数）に対してz軸方向で上下関係にある切片にＨＥ染色を施し、検鏡して間接的に判断する。
　しかし、追加の薄切切片のスライスの際には、ミクロトームと組織試料の調節のため試料の余剰な削り取りがやむを得ず、追加薄切の度に試料が損耗される。特に生検のような１ｍｍ以下のサイズにもなるような小組織の場合には、追加薄切の際に腫瘍細胞が思いがけず全て削り取られてしまう可能性が高い。現状この問題に対しては、初めの薄切の際に予め余分に切片を薄切し、染色や検査を施さずに取り置きし（未染スライド）、追加オーダーの際に染色するという手法が現在では用いられている。ただし、未染スライドの組織は空気の酸化ストレスや紫外線ストレスに曝されやすく、時間が経つほど免疫染色や遺伝子解析での精度が逓減するため、すぐに使用されなければ廃棄されることが多い。例えば、ミクロトームによって組織試料から切片を連続的に切り出し、１枚の長い粘着テープに順次切片を貼り付け、テープを巻き取ることによって切片を保存する装置が開示されている（特許文献１）。しかし、該装置はテープに接着した切片を密封しておらず、空気に曝露されたままという問題が解決されていない。
　このような組織の保存や利用方法に関する問題は、現代の最先端の研究や医療のネックとなる可能性がある。近年、実臨床においては、初期の抗癌治療に対して抵抗性となった患者に対し、数年以上過去の組織を再度解析してオーダーメイド治療を検討する症例が増えている。臨床研究においては、生存解析や治療効果判定などの予後解析は重要な指標の一つであるが、そのためには研究対象の数年から十数年の予後データが必要となる。そのため数年以上過去の病理標本を参照し、新たな手法や技術を用いて組織を再度解析することは多い。現在の手法では、過去の組織の保存や利用方法に上記のような課題があり、解析の際にエラーや誤ったデータの取得につながる可能性が高い。
特表２００１－５０２４３０号公報
　本発明が解決しようとする課題は、組織ブロックなどの組織試料の切片を効率的に利用し、試料に含まれる腫瘍細胞などの病変部分などのタンパク質や遺伝子を保存し、必要な際に容易に用いることができるように、前記試料の切片の保存を可能にすることである。従って、本発明は、前記試料の切片封入用デバイス、前記切片封入用デバイスを用いた切片封入標本の製造方法および病変部分を含んだ切片を特定する方法を提供することを目的とする。
　本発明の主たる構成は、次のとおりである。
［１］有機高分子材料からなるフィルム状のベース層を有し、該ベース層の一方の主面は、粘着性を有し、かつ、切片を配置するための配置面であり、
　有機高分子材料からなるフィルム状のカバー層を有し、該カバー層の一方の主面は、前記ベース層の配置面に配置された前記切片を覆い、かつ、前記配置面に貼り付くための、カバー面であり、
　前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの少なくとも一方が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、
　前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの他方が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方に対して着脱可能な構造を有する、
切片封入用デバイス。
［２］前記ベース層の一方の主面は、粘着性を有し、かつ、複数の切片を間隔をおいて配置するための配置面であり、
　前記カバー層は、前記配置面上に配置された複数の切片のそれぞれの周囲を個別に取り囲む複数のフレーム部と、各フレーム部によって囲まれた各切片をそれぞれに覆う蓋部とを有し、
　各フレーム部同士は互いにつながっており、
　各蓋部は、各フレーム部によって囲まれた各切片を覆って密封し、各切片から離れるように、各フレーム部に対して着脱可能または可動である、
前記［１］に記載の切片封入用デバイス。
［３］前記カバー層のフレーム部と蓋部が、同じ１枚のフィルム中に含まれた互いに異なる部分であり、各フレーム部に囲まれた部分が各蓋部であり、
　各蓋部の外周のうちの一部または全部が各フレーム部から切断され、それにより、各蓋部は、各フレーム部に対して着脱可能または可動である、
前記［２］に記載の切片封入用デバイス。
［４］フレーム部と蓋部とが、部分的に互いにつながっており、該つながっている部分は分断可能であり、該つながっている部分を分断することにより、各蓋部は、各フレーム部に対して着脱可能である、前記［３］に記載の切片封入用デバイス。
［５］各蓋部の外周形状が、線対称の形状および点対称の形状ではない、前記［３］または［４］に記載の切片封入用デバイス。
［６］当該切片封入用デバイスが所定長さと所定幅とを持った帯状であり、前記ベース層および前記カバー層も、それぞれ前記の所定長さと所定幅とを持った帯状であり、
　前記ベース層は、自体の配置面の長手方向に前記複数の切片が所定の間隔をおいて所定数だけ一列に配置されるように、予め決定された帯幅と長さとを有する、
前記［２］～［５］のいずれかに記載の切片封入用デバイス。
［７］前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの、少なくとも前記カバー層のカバー面が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、
　前記ベース層の配置面が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記カバー層のカバー面に対して着脱可能な構造を有する、
前記［１］に記載の切片封入用デバイス。
［８］前記ベース層の配置面が、１つの切片を配置する広さを持っており、かつ、
　１つのカバー層のカバー面が、複数のベース層の各配置面が互いに隣り合って貼り付く広さを持っており、
　前記ベース層の配置面と前記カバー層のカバー面とによって、複数の切片が、互いに隣り合って並んだ状態で、ベース層とカバー層との間に個別に密封され、かつ個別に該密封を解除される、
前記［７］に記載の切片封入用デバイス。
［９］前記ベース層が、下層側の支持体層と、上層側の粘着材層とを有してなる積層体であって、粘着材層の表面が配置面となっている、前記［１］～［８］のいずれかに記載の切片封入用デバイス。
［１０］ベース層とカバー層のうちの少なくとも一方が、密封された切片を外部から観察し得るように透明である、前記［１］～［８］のいずれかに記載の切片封入用デバイス。
［１１］前記複数の切片が、もとの組織試料から順次スライスされることによって得られる連続切片である、前記［１］～［１０］のいずれかに記載の切片封入用デバイス。
［１２］前記［１］～［１１］のいずれかに記載の切片封入用デバイスを１以上用い、該切片封入用デバイスのベース層の配置面に、組織試料をスライスしてなる切片を配置する、切片配置工程と、
　前記切片封入用デバイスのカバー層によって、前記ベース層の配置面に配置された切片を覆って密封し、前記組織試料をスライスしてなる複数の切片が、互いに間隔をおいてスライスの順番に配置された切片封入標本を得る、密封工程とを有する、
切片封入標本の製造方法。
［１３］前記［２］～［６］のいずれかに記載の切片封入用デバイスを１以上用い、該切片封入用デバイスのベース層の配置面に、組織試料をスライスしてなる複数の切片を、互いに間隔をおいてスライスの順番に配置する、切片配置工程と、
　前記切片封入用デバイスのカバー層のフレーム部によって、前記ベース層の配置面に配置された各切片のそれぞれの周囲を個別に取り囲み、かつ、該カバー層の蓋部によって、各切片をそれぞれに覆い密封する、密封工程とを有する、
前記［１２］に記載の切片封入標本の製造方法。
［１４］さらに染色工程を有し、該染色工程は、
　切片配置工程中に、または、切片配置工程の後であって密封工程の前に、または、密封工程の後で、
　スライスの順番に沿った所定の数の切片の組ごとに、各組中の最初の切片に対して、切片中に病変部分が含まれているか否かを検査するための染色を行う工程である、
前記［１２］または［１３］に記載の切片封入標本の製造方法。
［１５］前記切片配置工程において、前記切片封入用デバイスを複数用い、複数の切片を複数の切片封入用デバイスにわたってスライスの順番に配置し、
　前記染色工程において、各切片封入用デバイス中の複数の切片のうちの先頭の切片に対して前記染色を行う、
前記［１４］に記載の切片封入標本の製造方法。
［１６］前記［１４］または［１５］に記載の切片封入標本の製造方法によって製造された１以上の切片封入標本を用い、
　前記染色された切片に病変部分が含まれているか否かをスライスの順番に沿って判定し、
　該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最初の切片と、該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片との間に位置する全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する、
病変部分を含んだ切片を特定する方法。
［１７］前記［１５］に記載の切片封入標本の製造方法によって製造された複数の切片封入標本を用い、
　前記染色された切片に病変部分が含まれているか否かをスライスの順番に沿って判定し、
　該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す切片を含んだ切片封入標本のうち、該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片を含んだ切片封入標本以外の切片封入標本に含まれた全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する、
前記［１６］に記載の病変部分を含んだ切片を特定する方法。
　本発明の切片封入用デバイスは、粘着面を備えた有機高分子材料製のベース層と、該粘着面を覆う有機高分子材料製のカバー層との組み合わせを有する。当該切片封入用デバイスの特徴は、次の（ｉ）および（ｉｉ）の構成を有する点にある。
　（ｉ）前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの少なくとも一方が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っている。
　（ｉｉ）前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの他方が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方に対して着脱可能な構造を有するベース層とカバー層とによって、複数の切片を個別に密封し得、かつ、個別に該密封を解除し得る構造を有する。
　前記（ｉ）の構成によって、複数の切片を隣り合った状態で並べることができ、組織試料をスライスしてなる複数の切片を、スライスの順番に配置することも可能になる。そして前記（ｉｉ）の構成によって、複数の切片は、個別に密封され得、かつ、個別に該密封を解除され得る。これにより、任意の切片を標本化の後に、詳細な分析に供することも可能になる。
　前記（ｉｉ）の構成における「複数の切片を個別に密封し得、かつ、個別に該密封を解除し得る構造」とは、詳細な態様は後述するが、ベース層とカバー層のうちの少なくとも一方が、隣り合った状態で配置された複数の切片に対して、個別に蓋をするように他方と協働して挟み込む構造である。
　前記（ｉ）および（ｉｉ）の構成を有する当該切片封入用デバイスの態様として、典型的には２つの態様が挙げられる。第１の態様では、少なくともベース層が広い１枚のシート（帯状でもよい）であり、これとは逆に、第２の態様では、少なくともカバー層が広い１枚のシート（帯状でもよい）である。
　第１の態様の構成例では、カバー層の作製の際に、開口部が所定の間隔で位置するように該開口部の内側部分を切り抜き、開口部を取り巻く周囲部分（残部）をフレーム部として用い、また、開口部から除去された切抜き部分を蓋部として用いている。パラフィンに包埋された腫瘍細胞を含む組織から連続切片を作製し、ベース層の粘着面上に並べ、それらをカバー層によって覆い、全ての各切片を蓋部で覆い密封することよって、連続切片がスライスの順番に並んだ標本が得られる。切片の染色に際しては、切片数枚ごとに蓋部を剥離し、各フレーム部の開口部内で切片にＨＥ染色を施し、封入剤と共に蓋部で密封することができる（図１２）。第２の態様の構成例では、上記の連続切片を、個別にベース層の粘着面上に載置し、カバー層によって覆い、各切片を密封することよって、連続切片がスライスの順番に並んだ標本が得られる。切片の染色に際しては、カバー層によって覆う前の切片が載置されたベース層またはカバー層から剥離した切片が載置されたベース層を直接ＨＥ染色液に浸漬し、封入剤と共にカバー層に密封することができる。これら染色された複数の切片を検鏡することで、染色した切片間に並べられた未染色の切片に腫瘍細胞が含まれているか否か、また未染色の切片内のどこに腫瘍細胞が存在しているかを確認することができる。また、腫瘍細胞が含まれていると想定される未染色の切片は、フレーム部ごとに個別にＨＥ染色以外の別の染色を施すことによってさらに別の臨床検査や、直接組織を削り取るもしくはパンチなどで部分的に切り抜くことで容易に核酸を採取してＮＧＳなどの遺伝子検査などに用いたりすることができる。ベース層およびカバー層の両方に透明度の高いものを用いれば、ガラススライドとほぼ同様の分解能での検鏡が可能であり、組織学的診断も可能である。
　切片封入標本を作製する際に、組織試料から連続的にスライスした切片を、従来のガラスではなく、有機高分子材料製のベース層とカバー層との間に層状に挟み込み、スライスの順番に連続的に密封することによって、切片全体の管理および長期保存が容易になる。
　また、連続切片のうち所定の間隔を置いた特定の切片をＨＥ染色に供することによって、連続切片に含まれる組織全体の情報を間接的に予測することが可能となり、かつ未染色の切片に対して容易にアクセスできるため、目的の切片に対して必要な試験を迅速に行うことが可能となる。
図１は、本発明の切片封入用デバイスの第１の態様の一例を示す図である。図１（ａ）は、当該切片封入用デバイスの上面（カバー層の上面）を示す図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＸ１－Ｘ１断面矢視図である。 図２は、本発明の切片封入用デバイスの第１の態様の他の例を示す図である。図２（ａ）、（ｂ）は、図１（ｂ）と同様に、当該切片封入用デバイスを切断した場合の断面を示す図である。図２（ｃ）～（ｅ）は、当該切片封入用デバイスの他の態様例における上面を示す図である。 図３は、本発明の切片封入用デバイスの第１の態様を用い、ベース層の配置面（粘着面）上に５枚の連続切片を順番に配置した状態、および、それらを覆うためのカバー層の一例を示す写真図である。以下、図４～図１３では、本発明の切片封入用デバイスの第１の態様を用いている。 図４は、連続切片を配置面上に配置し、カバー層で覆った状態を示す図である。各蓋部は着脱可能である。図４（ｃ）では、説明のために、ベース層の配置面からスライスの厚さ分だけ突き出した切片に対して、カバー層が柔軟に屈曲して追従しているように描いているが、逆にベース層が柔軟に屈曲して追従してもよく、カバー層とベース層が共に柔軟に屈曲して切片を挟み込んでいてもよい。 図５は、ベース層の配置面上に５枚の連続切片を順番に配置し、それらをカバー層で覆った状態を示す写真図である。各蓋部は着脱可能である。 図６は、５つの切片封入標本のうち、１つ目の切片封入標本の蓋部を剥離し、フレーム部によって囲まれたウェル状の部分にヘマトキシリン溶液を滴下した状態を示す写真図である。 図７は、染色された切片を封入剤と共に蓋部で密封した状態を示す図である。図７（ａ）は、先頭の蓋部を取り外した状態を示す上面図であり、図７（ｂ）は、蓋部で切片を覆い、図１（ｂ）と同様に、切片封入用デバイスを切断した場合の断面を示す図である。 図８は、ＨＥ染色された切片を封入剤と共に蓋部で密封した状態を示す写真図である。 図９は、ＨＥ染色され、切片封入用デバイスに封入剤と共に蓋部で密封された肺組織の切片の顕微鏡像（対物レンズ４倍拡大）を示す写真図である。 図１０は、ＨＥ染色され、切片封入用デバイスに封入剤と共に蓋部で密封された肺組織の切片の顕微鏡像（対物レンズ２０倍拡大）を示す写真図である。 図１１は、本発明の切片封入用デバイスの製造方法の一例を示す図であり、帯状を呈する当該切片封入用デバイスを側方（帯幅方向）から見た側面図である。図１１（ａ）は、スライスされた切片が配置面上にスライスの順番に順次配置される工程を示している。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）の工程によってベース層の配置面上に配置された切片を、カバー層で覆う工程を示す図である。 図１２は、腫瘍細胞を含む組織の連続切片が並べられた切片封入用デバイスを示す図である。各切片封入用デバイスの左に振られた各番号は切片に付与される連続番号を示す。各切片封入用デバイスの先頭の切片のみがＨＥ染色に供されている。 図１３は、ＨＥ染色され、ガラススライド（左上、左下）または切片封入用デバイス（右上、右下）に封入剤と共に蓋部で密封された印環細胞癌を含む胃組織の切片の顕微鏡像を示す写真図である。 図１４は、本発明の切片封入用デバイスの第２の態様の一例を示す図であり、かつ、該第２の態様を用い、複数の切片を個別に密封した状態を示す図である。該個別の密封は、ベース層の構造によって、個別に解除され得るようになっている。図１４（ａ）は、当該切片封入用デバイスの下面（カバー層のカバー面）を示す図であり、図１４（ｂ）は、図１４（ａ）のＸ２－Ｘ２断面矢視図である。図１４（ｃ）は、第２の態様の他の例を示しており、図１４（ｂ）と同様の断面を示している。図１４（ｂ）、（ｃ）では、説明のために、カバー層のカバー面からスライスの厚さ分だけ突き出した切片に対して、ベース層が柔軟に屈曲して追従しているように描いているが、逆にカバー層が柔軟に屈曲して追従してもよく、ベース層とカバー層が共に柔軟に屈曲して切片を挟み込んでいてもよい。 図１５は、ベース層とともに切片を蒸留水に浸漬する工程を示す図である。 図１６は、ＨＥ染色され、ガラススライド（左）または切片封入用デバイス（右）に封入剤と共に密封された胃組織の切片を示す写真図である。 図１７は、ＨＥ染色され、ガラススライド（左）または切片封入用デバイス（右）に封入剤と共に密封された皮膚組織の切片を示す写真図である。 図１８は、ＨＥ染色され、切片封入用デバイスに封入剤と共に密封された胃の印環細胞癌の切片の顕微鏡像（強拡大像（２００倍））を示す写真図である。 図１９は、ＨＥ染色され、切片封入用デバイスに封入剤と共に密封された皮膚のボーエン病の切片の顕微鏡像（中拡大像（１００倍））を示す写真図である。 図２０は、カバー層とベース層の接着前の状態を示す写真像である。 図２１は、カバー層とベース層の接着後の状態を示す写真像である。 図２２は、食道の腺癌の６つの連続切片が密封された切片封入用デバイス２枚（第一切片封入用デバイスおよび第二切片封入用デバイス）と１３枚目の連続切片のみが密封された切片封入用デバイス１枚（第三切片封入用デバイス）を示す写真図である。各切片封入用デバイスの第一切片はＨＥ染色されている。 図２３は、第二切片封入用デバイスの第一切片のデジタル画像を示す図である。アノテーションは食道の腫瘍（腺癌）領域を示す。 図２４は、第一切片封入用デバイスの第二から第四切片の免疫染色像を示す写真図である。 図２５は、ｐ５３抗体で免疫染色された第二切片の顕微鏡像（強拡大像（１００倍））を示す写真図である。 図２６は、ＣＥＡ抗体で免疫染色された第三切片の顕微鏡像（強拡大像（１００倍））を示す写真図である。 図２７は、AE1/AE3抗体で免疫染色された第四切片の顕微鏡像（強拡大像（１００倍））を示す写真図である。 図２８は、試験チューブ内の未染色切片由来腫瘍（腺癌）領域を示す写真図である。 図２９は、未染色切片由来腫瘍（腺癌）領域から抽出されたRNA純度を示すグラフである。
　先ず、本発明の切片封入用デバイスの態様を実施例を示す図を参照しながら詳細に説明する。当該切片封入用デバイスは、図１に示すように、有機高分子材料からなるフィルム状のベース層１０と、有機高分子材料からなるフィルム状のカバー層２０とを有する。ベース層１０の一方の主面は、粘着性を有し、かつ、切片を配置するための配置面１０ａである。カバー層２０の一方の主面は、ベース層１０の配置面１０ａに配置された切片を覆い、かつ、配置面１０ａに貼り付くための、カバー面２０ａである。当該切片封入用デバイスの特徴は、上記したように、（ｉ）配置面１０ａおよびカバー面２０ａのうちの少なくとも一方（図１の例では配置面１０ａ）が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、（ｉｉ）配置面１０ａおよびカバー面２０ａのうちの他方（図１の例ではカバー面２０ａ）が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方（図１の例では配置面１０ａ）に対して着脱可能な構造を有しているという点にある。
　上記したように、前記（ｉ）、（ｉｉ）の構成を有する当該切片封入用デバイスの態様として、第１の態様と第２の態様が挙げられる。第１の態様は、少なくともベース層が広い１枚のシート（帯状でもよい）であり、カバー層が、複数の切片に対して個別に蓋をする構造を有する。第２の態様は、第１の態様に対して、ベース層とカバー層の役割が逆になった態様であり、カバー層が広い１枚のシート（帯状でもよい）であり、ベース層が、複数の切片に対して個別に蓋をする構造を有する。以下に、これら第１の態様、第２の態様を詳細に説明する。
〔第１の態様〕
　第１の態様では、図１に示すように、ベース層１０の一方の主面は、粘着性を有する面であって、かつ、複数の切片を間隔をおいて配置する広さを持った配置面１０ａである。カバー層２０は、ベース層１０の配置面１０ａに貼り付けるためのフィルム状の層である。第１の態様では、カバー層２０のカバー面２０ａが、前記の複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方に対して着脱可能な構造を有する。
　図１に示す例では、カバー層２０は、複数のフレーム部２１とそれに対応する複数の蓋部２２とを有して構成される。複数のフレーム部２１同士は互いにつながっている。複数のフレーム部は、図３、図４に示すように、配置面１０ａ上に配置された複数の切片のそれぞれの周囲を個別に取り囲み、配置面１０ａと一緒になって、各切片のための個別のウェルを構成する。各フレーム部が各切片を取り囲むと、図４（ｂ）に示すように、各フレーム部と配置面とによって構成された各ウェル内の底面（配置面）上に各切片が配置された状態となる。蓋部２２は、各フレーム部によって囲まれた各切片をそれぞれに覆うためのフィルム状の部材である。各蓋部は、各フレーム部によって囲まれた各切片およびその周囲の配置面を覆い、配置面と共に各切片を挟み込んで密封する。また、各蓋部は、各フレーム部に対して着脱可能または可動である。これにより、各蓋部は、各切片から離れることが可能であるか、または、先にベース層の配置面にフレーム部を貼り付けた後、別途、各切片を覆うことも可能である。
　以上の構成を有する当該切片封入用デバイスを用いることにより、上記した効果を得ることができ、本発明の目的が達成される。以下、当該切片封入用デバイスの各部の構成を説明する。なお、本明細書中において、「封入」とは、「ベース層の一方の主面に配置され、染色された切片を封入剤と共にカバー層によって密封する態様」と、「ベース層の一方の主面に配置された未染色の切片のみをカバー層によって密封する態様」の両者を含むものである。例えば、第一の態様では、「ベース層の一方の主面に配置され、かつ該ベース層に貼り付けられたカバー層のフレーム部によって周囲を取り囲まれた、染色された切片を封入剤と共に該カバー層の蓋部によって密封する態様」と、「ベース層の一方の主面に配置され、かつ該ベース層に貼り付けられたカバー層のフレーム部によって周囲を取り囲まれた、未染色の切片のみを該蓋部によって密封する態様」の両者を含むものである。
　以下、第１の態様における、ベース層、カバー層、カバー層のフレーム部、カバー層の蓋部を、詳細に説明する。
（ベース層）
　ベース層は、剛性を有する基板であってもよいが、ミクロトームなどのスライス装置によって切片を薄く切断しながら配置面に貼り付けていく操作を好ましく行う点からは、配置部位以外の部分がスライス装置の切断刃の動作の障害にならないよう、湾曲可能な可撓性を有する基板であることが好ましい。このようなベース層としては、有機高分子材料からなるフィルムが挙げられる。また、ベース層は、両主面のうち少なくとも一方の主面が配置面として利用可能であるよう粘着性を有する。このようなベース層としては、層全体がポリウレタンゲルのように自己粘着性を有する材料からなるフィルムであるか、または、図１（ｂ）に示すように、下層側の支持体層１１と、上層側の粘着材層１２とを有し、該粘着材層１２の表面が配置面１０ａとなっている積層体（積層構造を持ったフィルム状物）であることが好ましい。
　ベース層１０全体の厚さ（層厚）は、特に限定はされず、材料によっても異なるが、１５μｍ～２００μｍ程度が例示される。
　ベース層１０が、可撓性を有する積層体である場合、支持体層１１の材料としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレンなどの有機高分子材料が挙げられる。支持体層１１の厚さは、特に限定はされず、材料によっても異なるが、１０μｍ～１５０μｍ程度が例示される。
　粘着剤層１２の材料（即ち、粘着剤）としては、特に限定はされないが、アクリル系粘着剤（例えば、リンテック株式会社製、製品番号3755AD25）、ウレタン系粘着剤などの有機高分子材料からなる粘着剤が好ましいものとして挙げられる。粘着剤層１１の厚さは、特に限定はされず、材料によっても異なるが、５μｍ～５０μｍ程度が例示される。粘着剤は、感圧性接着剤とも呼ばれる接着剤の一種である。粘着剤層の粘着性は、蓋部を該粘着剤層の表面（配置面）に貼り付けた後、該蓋部を剥がすことが可能な程度の粘着性であることが好ましい。
　ベース層が可撓性を有する積層体である場合、市販の粘着テープや粘着シートをベース層として用いることができ、とりわけ、切片保持用の粘着テープや粘着シートが好ましいく利用可能である。本発明における粘着剤層の粘着性は、前記切片保持用の粘着テープや粘着シートの粘着性を参照することができる。
（カバー層）
　カバー層２０は、１つの切片を配置する広さのカバー面を持った互いに独立した小片であってもよい。そのような小片のカバー層は、ベース層の配置面上に配置された複数の切片の数だけ用いられ、各切片を個別に密封する。また、密封後は、個々のカバー層を個別に剥がすことによって、密封は各切片毎に解除される。
　好ましい態様では、図１に示すように、カバー層２０は、フレーム部２１と蓋部２２とを有する。フレーム部２１は、ベース層１０の配置面１０ａ上に配置された切片（例えば、図４（ｂ）において符号３０で示す部分）を取り囲む部材であり、よって、フレーム部に取り囲まれた中央部分は、蓋部を取り除くと開口部（貫通孔）２１ａとなる。
　フレーム部と蓋部は、互いに別個の部材であってもよいが、好ましい態様では、図１（ｂ）に示すように、同じ１枚のフィルム中に含まれた互いに異なる部分であって、各フレーム部に囲まれた部分が各蓋部である。図１に示す態様では、蓋部は、フレーム部が取り囲んだ開口部２１ａにぴったりはまり込む外形を有する。換言すると、図１に示す態様では、蓋部は、フレーム部が取り囲んだ開口部２１ａから切り取られた部分である。
　図２（ａ）に例示する態様では、蓋部２３の外形は、フレーム部が取り囲んだ開口部の形状よりも小さく、蓋部２３の外周面と開口部の内面との間には適度な隙間がある。また、図２（ｂ）に例示する態様では、蓋部２４の外周縁部は、フレーム部が取り囲んだ開口部から外側にはみ出しており、フレーム部の上面に乗り上げている。図２（ｂ）の態様では、フレーム部と蓋部とは別個に形成されたフィルム状の部材である。図２（ａ）、（ｂ）の態様では、蓋部をフレーム部の開口にぴったり嵌め込む操作が不要であると言う点で、枠部から取り外した蓋部によって、切片を覆う作業が容易である。
（カバー層のフレーム部）
　フレーム部は、切片を取り囲む部材であるから、可撓性は必須ではないが、湾曲させることによって蓋部の取り外しを容易にするという点からは、ベース層と同様の可撓性を有することが好ましい。フレーム部の材料は、特に限定はされないが、可撓性を有する材料としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレンなどの有機高分子材料が挙げられる。フレーム部の厚さは、特に限定はされないが、後述の切片の厚さや蓋部の厚さを考慮して、１００μｍ～１０００μｍ程度が好ましい厚さであり、１００μｍ～３００μｍ程度がより好ましい厚さである。
（カバー層の蓋部）
　蓋部は、配置面と切片に密着し好ましく覆うことができるよう、可撓性を有する有機高分子材料からなるフィルムであることが好ましい。蓋部の材料は、特に限定はされないが、可撓性を有する材料としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレンなどの有機高分子材料が挙げられる。蓋部の厚さは、特に限定はされないが、１００μｍ～１０００μｍ程度が好ましい厚さであり、１００μｍ～３００μｍ程度がより好ましい厚さである。
　上記したように、第１の態様におけるカバー層の好ましい態様では、フレーム部と蓋部とは、同じ１枚のフィルム中に含まれた互いに異なる部分である。この場合、フレーム部と蓋部の材料および厚さは、互いに同じである。また、各蓋部の外周のうちの一部または全部が各フレーム部から切断されていてよく、それにより、各蓋部は各フレーム部に対して着脱可能または可動である。
　本発明において、各蓋部が各フレーム部に対して「着脱可能または可動」であるとは、以下に例示するように、各フレーム部に対して完全に分離している状態、完全に分離していないが分離可能な状態、または、各フレーム部に対して一部がつながった状態でドアのような開閉動作が可能な状態を含む。
　図２（ｃ）の態様例では、各蓋部の外形と各フレーム部の開口部の形状は、同じ長方形であり、各蓋部と各フレーム部は、長方形の頂点において、切断されず互いにつながっている。
　また、図２（ｄ）の態様例では、各蓋部の外形と各フレーム部の開口部の形状は、同じ長方形であり、各蓋部と各フレーム部は、長方形の対向する２辺の中央において、切断されず互いにつながっている。これらの互いにつながった部分は、０．１ｍｍ～０．３ｍｍ程度であり、手などによって蓋部を引っ張ることで容易に分断することができ、蓋部をフレーム部から取り外すことができる。
　図２（ｃ）、（ｄ）の態様例において、蓋部とフレーム部とが互いにつながった部分の位置や、長さなどは、適宜決定してよく、つながった部分だけがより分断されやすいように薄くするなど、任意の構成をさらに加えてよい。
　また、図２（ｅ）の態様例では、各蓋部の外形と各フレーム部の開口部の形状は、同じ長方形であり、各蓋部と各フレーム部は、長方形の１辺全体が切断されず互いにつながっている。この態様により、図２（ｅ）に破線で示すように、つながった１辺をヒンジ部として、蓋部はドアのような開閉動作を行うことができる。
　第１の態様におけるフレーム部の開口部（貫通孔部）の形状およびそのサイズは、切片を収容し得るよう、該切片の外形に応じて適宜決定することができる。開口部の基本形状は、特に限定されず、円形や方形（正方形、長方形）などであってもよいが、開口部同士の間にデッドスペースが生じない点からは、方形、とりわけ図１に例示するように、配列方向（隣の開口の方向）に長く延びた長方形が好ましい基本形状である。方形の角部（頂点部分）に丸みを付けたり面取り形状とするといった、基本形状に対する細部の改変は適宜加えてよい。
　開口部の基本形状が方形である場合、その１辺の長さは、特に限定はされないが、一般的な試料の切片のサイズを鑑みると、３０ｍｍ～５０ｍｍ程度が汎用的であり、とりわけ４０ｍｍ～４５ｍｍ程度が有用である。
　フレーム部の開口部の配置パターン、ピッチ（中心間距離）、開口部同士の間の距離（図１（ａ）における寸法Ｌ１）、開口部からフレーム部の縁部までの距離（図１（ａ）における寸法Ｌ２）などは、開口部のサイズやフレーム部の強度に応じて適宜決定することができる。上記したフレーム部の材料や厚さの場合、開口部同士の中心間距離は、４０ｍｍ～６０ｍｍ程度が好ましく、開口部同士の間に存在するフレーム部の寸法Ｌ１は、１ｍｍ～１０ｍｍ程度が好ましい寸法として例示され、開口部からフレーム部の縁部までの距離Ｌ２は、１ｍｍ～５ｍｍ程度が好ましい寸法として例示される。
（蓋部の外周形状）
　図１に示すように、蓋部の外周形状とフレーム部の開口部の形状が互いに同じである場合、これらの形状が線対称や点対称の形状であると、蓋部を裏向けても、点対称の回転中心について回転させても、蓋部はフレーム部の開口部にはまり込むことができるので、好ましい。
　しかしながら、そのような利点が得られるのは、線対称や点対称の形状が正確に線対称や点対称の形状である場合である。製造誤差などによって、同じ蓋部の中でも辺同士の長さや頂部の角度が互いに微量だけ異なっている場合、見た目には線対称や点対称であっても、蓋部を裏向けたり、点対称の回転中心について回転させると、開口部にぴったりと嵌り込まなくなり、嵌り込む姿勢を探すのに手間がかかる場合がある。
　そこで、本発明の好ましい態様では、蓋部の外周形状、および、該蓋部が嵌り込む開口部の外周形状を、線対称ではなくかつ点対称ではない基本形状とする。これにより、蓋部が開口部に嵌り込むただ１通りの姿勢が明確になり、蓋部が開口部に嵌り込む姿勢を探す手間が無くなる。このような線対称ではなくかつ点対称ではない基本形状は、特に限定はされないが、例えば、図３に示す蓋部２２のように、方形の４つの頂点のうち所定の箇所（図３の例では３か所）だけ面取り形状とする形状や、蓋部の外周縁の不規則な位置に突起部を設ける形状（この場合、開口部には、突起部に対応する位置に突起部が嵌り込む同じ形状の切り欠きが設けられる）などが挙げられる。
〔第２の態様〕
　第２の態様では、図１４に一例を示すように、少なくともカバー層２００のカバー面２００ａが、互いに隣り合って並んだ複数の切片３０を包含する広さを持っている。一方、ベース層１００の配置面（粘着面）は、第１の態様におけるカバー層と同様に、複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、カバー層２００のカバー面２００ａに対して着脱可能な構造を有する。第２の態様におけるカバー層は、単純な１枚の広いシートであってよく、好ましい態様では、後述のとおり、所定長さと所定幅とを持った帯状のシートである。一方、第２の態様におけるベース層は、図１（ａ）のカバー層のようにフレームと中央部分とを有してなる態様、図２（ａ）～（ｅ）のカバー層のように、中央部分がフレーム部に対して完全に分離している態様、完全に分離していないが分離可能な態様、または、フレーム部に対して一部がつながった状態でドアのような開閉動作が可能な態様であってもよい。ベース層の個別に着脱可能な構造は、上記したカバー層の構造を参照することができる。
　図１４の例では、ベース層１００は、支持体層１１０と、粘着材層１２０とを有し、該粘着材層１２０の表面が配置面１００ａとなっている積層体（積層構造を持ったフィルム状物）である。図１４（ａ）の例では、ベース層１００は、１つの切片３０を配置する広さの配置面１００ａを持った小片である。ベース層１００は、切片の数だけ用いられる。カバー層２００のカバー面２００ａは、複数のベース層１００を互いに隣り合って貼り付けることができる広さを持っている。これにより、図１４（ｂ）に示すように、複数のベース層の配置面１００ａと１つのカバー層のカバー面２００ａとによって、複数の切片が、互いに隣り合って並んだ状態で、ベース層とカバー層との間に個別に密封され、任意のベース層を個別に剥離することで、各切片ごとに密封が解除される。
　図１４（ｂ）は、ベース層１００が単純な小片である場合の態様を示している。これに対して、図１４（ｃ）は、ベース層１００がフレーム部１０２と、各フレーム部によって囲まれた中央部１０１とを有する。フレーム部１０２は、支持体層１１２と、粘着材層１２２とを有し、また、中央部１０１は、支持体層１１１と、粘着材層１２１とを有する。これら、フレーム部１０２と中央部１０１は、１枚のシートとして形成された後、切断加工によって区分されてよい。上記したように、フレーム部１０２と中央部１０１の関係は、図２（ａ）～（ｅ）のカバー層のように、中央部分がフレーム部に対して完全に分離している態様、完全に分離していないが分離可能な態様、または、フレーム部に対して一部がつながった状態でドアのような開閉動作が可能な態様であってもよい。
　第２の態様における、ベース層の厚さ、材料、寸法、カバー層の厚さ、材料、寸法は、第１の態様の各部を参照することができる。
〔第１、第２の共通の構成〕
　ベース層とカバー層のうち、少なくとも一方、好ましくは両方が、密封された切片を外部から観察し得るように透明であれば、ガラススライドとほぼ同様の分解能での検鏡が可能であり、組織学的診断も可能となるので好ましい。ベース層とカバー層は、互いに同じ外形を有することが好ましい。
　当該切片封入用デバイスの外周形状は、任意の形状であってよく、切片は行列状に配置されてもよいが、持ち運びの容易さや顕微鏡下での観察の実用性の点からは、所定長さと所定幅とを持った帯状が好ましい形状である。
　当該切片封入用デバイスが帯状である場合、ベース層およびカバー層の外周形状も、それぞれ前記の所定長さと所定幅とを持った帯状となる。この場合、ベース層は、自体の配置面の長手方向に複数の切片が所定の間隔をおいて所定数だけ一列に配置されるように、予め決定された帯幅と長さとを有する。ベース層とカバー層は、互いに同じ外周形状を有することが好ましい。
　当該切片封入用デバイスが帯状である場合、帯幅と帯の長さは、切片の外形に応じて適宜決定することができる。帯幅は、２０ｍｍ～５０ｍｍ程度が汎用的であり、とりわけ３０ｍｍ～４０ｍｍ程度が有用である。帯の長さは、ロールに巻き付けることができるような長尺であってもよいが、持ち運びの容易さや顕微鏡下での観察における利便性と、切片を貼り付けるのに十分な開口部のサイズのバランスを取るという点からは、切片が３個～６個程度、好ましくは４個～５個程度配置し得る短冊状となる長さが有用である。図１～図５の例では、切片が５個配置され得る短冊状である。
〔切片〕
　本発明の切片封入用デバイスに密封される切片は、特に限定はされないが、組織試料から順次スライスされることによって得られる連続切片であれば、本発明の有用性が特に顕著になる。
　図１２（ａ）に例示するように、組織試料３０Ａは、パラフィン３２Ａが、組織３１Ａの周囲を取り巻いたものであってもよい。図１２（ａ）に例示する組織３１Ａ中には、病変部分３３Ａが含まれている。
　組織試料に使用される組織としては、特に制限されるわけではないが、哺乳動物（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等、好ましくはヒト）の組織（例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など）であってよい。前記組織は、正常組織であっても、病変部分を含む組織であってもよいが、病変部分を含む組織が本発明の切片封入用デバイスに密封される切片の材料に適している。病変部分としては腫瘍性病変、炎症性病変、感染性病変、変性病変などが挙げられる。
　組織試料は、本発明の切片封入用デバイスのフレーム部の開口部内やベース層内に収まる外周形状やサイズにトリミングし、固定処理、脱水・脱脂処理、中間剤による置換処理を経てパラフィンに包埋することによって得られる。
　固定処理は、具体的には、摘出した臓器の余分な脂肪や血餅などを生理食塩水中で丁寧に取り除き、ろ紙にて水分を充分に拭った後、一辺が５～２０ｍｍの直方体となるように、カミソリにてトリミングを施し、固定液に浸漬することによって実施することができる。固定液としては、ホルマリン液、Bouin（ブアン）液が挙げられるが、ホルマリン液が好ましい。ホルマリン液としては、３５～４０％ホルムアルデヒド水溶液を蒸留水または緩衝液で希釈した４％ホルムアルデヒド水溶液を使用する。固定処理は通常、常温で２４時間～４８時間行う。また、Bouin液は、ピクリン酸飽和水溶液、３５～４０％ホルムアルデヒド水溶液、氷酢酸を各々１５：５：１（ｖ／ｖ）混合して用時調製する。Bouin液は、溶血を生じさせるという短所がある一方、組織の収縮が小さく、固定時間が短時間（２～６時間）であるという点で優れる。
　組織の７０～８０％は水分であるため、固定処理後の組織は、そのままではパラフィンは組織内に浸透しない。そこで組織の脱水・脱脂処理を行う。脱水・脱脂処理の操作としては、まず、組織内の水をアルコール系列（メタノールまたはエタノール）で完全に除く（脱水）ことによって実施することができる。この際に、脂肪も取り除かれ（脱脂）、パラフィンの融点降下を防止する。エタノールを使用する場合、固定後、７０％エタノール中で１晩、９９．５％エタノール中で３０分ｘ５回、１００％エタノール中で３０分の順で脱水する。
　エタノールはパラフィンに馴染まないため、組織内に浸透したエタノールを一旦キシレンまたはクロロホルム等の中間剤による置換処理を経て、組織に溶けたパラフィンを浸透させる。クロロホルムはキシレンの２倍毒性が高いが、組織への浸透速度が速く、引火性がないなどの点では優れている．具体的には、置換処理は、キシレンを使用する場合、３０分置換を２回行うことによって実施することができる。
　中間剤による置換処理後、６０℃に設定したパラフィン溶融器中で溶融した硬パラフィン（６０℃）に組織を３０分、４回浸透させる。その後、パラフィン包埋用の枠にパラフィンを流し込み、組織を浸漬して、硬化させる。
　以上のようにして、組織試料を得ることができる。
　切片の厚さは、特に限定はされないが、３μｍ～２０μｍ程度が汎用的であり、とりわけ３μｍ～５μｍ程度が有用である。切片の外周形状やサイズは不定であってよく、上記したフレーム部の開口部内やベース層内に収まる外周形状やサイズが好ましく、従来公知の標本などにおける外形やサイズを参照することができる。
〔本発明の切片封入用デバイスを用いた切片封入標本の製造方法〕
　次に、本発明による切片封入標本の製造方法を説明する。
　当該切片封入標本の製造方法は、上記で説明した本発明の切片封入用デバイスを１以上用いる。１つの切片封入用デバイスが十分に多数の切片を配置し得るものであれば、用いる切片封入用デバイスは１つでよいが、好ましい態様では、該切片封入用デバイスは帯状であり、１つの切片封入用デバイスに配置し得る切片の数は、３～６程度である。その場合には、帯状の切片封入用デバイスを、必要数だけ用いればよい。これにより、図１２（ｂ）に示すような、複数の短冊状の切片封入標本部分が集合した切片封入標本が得られる。図１２（ｂ）は、本発明の切片封入用デバイスの第１態様を用いた場合の図であるが、第２態様を用いた場合の図であると見なすこともできる。
　複数の短冊状の切片封入標本部分を形成する場合、それら複数の短冊状の切片封入標本部分を管理し得るよう、各短冊状の切片封入標本部分の先頭端部など所定の部位には、切片の内容や順番を記載しておくことが好ましく、切片の内容や順番が記載されたバーコードやＩＣチップ、ＩＣタグなどが付与されていてもよい。
（切片配置工程と密封工程）
　本発明による切片封入標本の製造方法では、本発明の切片封入用デバイスが１以上用いられる。当該切片封入標本の製造方法は、切片配置工程と、密封工程とを有する。切片配置工程では、当該切片封入用デバイスのベース層の配置面に、組織試料をスライスしてなる切片を配置する。また、密封工程では、当該切片封入用デバイスのカバー層によって、ベース層の配置面に配置された切片を覆って密封し、複数の切片が互いに間隔をおいてスライスの順番に配置された切片封入標本を得る。
　図１１に示す例では、切片封入用デバイスの第１の態様を用いており、図１１（ａ）は切片配置工程の一例を示し、図１１（ｂ）は、密封工程の一例を示している。切片配置工程では、図１１（ａ）に例示するように、切片封入用デバイスのベース層１０の配置面１０ａに、組織試料３０Ａをスライス装置（本体は図示せず）の切断刃５０によってスライスしてなる複数の切片３０を、互いに間隔をおいてスライスの順番に配置する。このときの切片同士の中心間距離は、上記したカバー層のフレーム部の開口部同士の中心間距離に等しくしておく。これにより、先にベース層の配置面上に切片を配置しておき、後からカバー層で切片を囲み覆うという手順の工程が可能になり、加工の効率が向上する。尚、フレーム部が無い状態において、ベース層の配置面上に切片を、フレーム部の開口部同士の中心間距離に等しくなるように配置する点から、ベース層の配置面（ベース層が透明の場合には、ベース層の裏面でもよい）には、図３の写真図に示すような切片配置のための目印１０Ｐを印刷等によって付与しておくことが好ましい。これにより、スライス装置に対するベース層の位置合わせが容易になり、次の密封工程において、カバー層をベース層に積層したとき、各フレーム部の中央付記に切片を位置させることができる。図３の例では、切片配置のための目印１０Ｐはドットであるが、フレーム部の開口部の形状と同じ形状の線を描く態様や、該開口部の四隅だけを示す線を描く態様、フレーム部に対応する部分に着色する態様など、スライス装置とベース層との位置合わせを補助するための種々の目印を採用することができる。
　次に密封工程では、図１１（ｂ）に例示するように、切片封入用デバイスのカバー層２０のフレーム部２１によって、ベース層１０の配置面１０ａに配置された各切片３０のそれぞれの周囲を個別に取り囲み、かつ、カバー層２０の蓋部２２によって、各切片をそれぞれに覆い、図４（ｃ）に示すように、各切片を蓋部２２と配置面１０ａとで挟み込んで密封する。
（染色工程）
　当該切片封入標本の製造方法は、切片中に病変部分が含まれているか否かを検査するための染色を行う染色工程を有する。染色工程では、切片を染色する工程を全ての切片に対して施すのではなく、スライスの順番に配置された切片に対して、所定数の切片の間隔をおいた特定の切片に対して施す。
　染色工程は、切片封入用デバイスの第１の態様の場合、（ｉ）上記の切片配置工程中に切片を配置しながら実施されてもよいし、（ｉｉ）該切片配置工程の後であって密封工程の前に実施されてもよいし、（ｉｉｉ）密封工程の後で、密封された特定の切片に対して蓋部を開いて実施されてもよい。好ましい実施のタイミングは、所定の切片のみに染色を施し、他の切片への染色液などの付着を防ぐ点から、前記（ｉｉｉ）のタイミングである。また、上記染色工程は、切片封入用デバイスの第２の態様の場合、（ｉ）上記の切片配置工程中に切片を配置しながら実施されてもよいし、（ｉｉ）該切片配置工程の後であって密封工程の前に実施されてもよいし、（ｉｉｉ）密封工程の後で、密封された特定の切片を再度カバー層からベース層ごと剥離して実施されてもよい。好ましい実施のタイミングは、所定の切片のみに染色を施し、他の切片への染色液などの付着を防ぐ点から、前記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のタイミングである。
　切片中に病変部分が含まれているか否かを検査するための染色方法は、検出する対象病変部分によって当業者が適宜採用することができるが、最初に選択される染色方法としては、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が挙げられる。ＨＥ染色によって、細胞核、細胞質、間質、軟骨組織、赤血球など広範囲の染色対象を容易に染色することができ、顕微鏡観察によって組織構造を把握することができる。ＨＥ染色は、切片に脱パラフィン処理を施し、ヘマトキシリン染色液、エオジン染色液で順次切片を染色処理し、脱水処理、透徹処理ののち、封入剤と共に蓋部またはカバー層で密封処理することによって行うことができる。
　以下、切片封入用デバイスの第１の態様の場合の各処理を記載する。
　脱パラフィン処理は、具体的には、脱パラフィン液を切片に滴下し、切片表面全体に行き渡らせた後、脱パラフィン液を吸い取る操作を２～３回行うことによって実施することができる。脱パラフィン液としては、アルカン系有機溶剤を使用する。アルカン系有機溶剤としては具体的には、ヘプタン、オクタンなどが挙げられる。また市販の脱パラフィン液として、Clear Plus(株式会社ファルマ)を使用することもできる。その他、キシレンも脱パラフィン液として使用し得る。
　ヘマトキシリン染色液およびエオジン染色液による染色処理は、具体的には、切片を流水で洗浄し、ヘマトキシリン染色液を切片に滴下して反応させ、再度切片を流水で洗浄し、エオジン染色液を切片に滴下して反応させることによって実施することができる。図６に例示するように、切片封入用デバイスのフレーム部２１によって囲まれた配置面１０ａに配置された切片をヘマトキシリン溶液４０で染色する。
　脱水処理は、具体的には、アルコール系列（メタノールまたはエタノール）を切片に滴下して、吸い取ることによって実施することができる。
　透徹処理は、上記脱パラフィン処理と同様の操作で実施することができる。
　密封処理は、具体的には、封入剤を切片に滴下し、蓋部で切片を密封することによって実施することができる。封入剤としては、アルカン系有機溶剤に溶解させたアクリル樹脂を使用する。アルカン系有機溶剤としては具体的には、ヘプタン、オクタンなどが挙げられる。また、アクリル樹脂としては、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸メチルなどが挙げられる。さらに、市販の封入剤として、PARA mount D(株式会社ファルマ)を使用することもできる。図７（ａ）および（ｂ）に例示するように、染色された組織３１は封入剤４１に満たされ、蓋部２２によって密封される。染色された切片は、組織３１中には、病変部分３３が含まれている。また、図８においても、染色された組織３１は封入剤４１に満たされ、蓋部２２によって密封される。
　また、切片封入用デバイスの第２の態様の場合の各処理は、脱パラフィン処理、ヘマトキシリン染色液およびエオジン染色液による染色処理、脱水処理および透徹処理については、ベース層と切片が一体の状態で行うことができる。具体的には、一体状態のベース層と切片が浸漬できる程度に任意の容器内を脱パラフィン液、ヘマトキシリン染色液、エオジン染色液、水、またはアルコール等で満たし、その中に所定の時間、回数、浸漬することによって、上記各処理を実施することができる（図１５）。密封処理は、染色後の一体状態のベース層と切片を封入剤と共にカバー層で覆い、切片を密封することによって実施することができる。
　複数の短冊状の切片封入標本部分を形成する場合（即ち、図１２（ｂ）または図２２に示すように、切片配置工程において、当該切片封入用デバイスを複数用い、複数の切片を複数の切片封入用デバイスにわたってスライスの順番に配置する場合）、染色工程では、各切片封入用デバイス（各短冊状の切片封入標本部分）におけるそれぞれの複数の切片のうちの先頭の切片に対して染色を行うことが好ましい。これにより、各短冊状の切片封入標本部分がどのような切片を含んでいるかが一目でわかるようになる。
（病変部分を含んだ切片を特定する方法）
　次に、本発明による病変部分を含んだ切片を特定する方法（以下、当該特定方法ともいう）を説明する。
　当該特定方法は、上記で説明した切片封入標本の製造方法（ただし、該製造方法には染色工程が必須に含まれる）によって製造された１以上の切片封入標本を用いる。図１２（ａ）に示すように、スライス前のもとの組織試料３０Ａ中の組織３１Ａには、病変部分３３Ａが含まれている。この病変部分３３Ａは、図１２（ａ）の例では、スライスされることで、第６番の切片から第２２番の切片までに含まれているとする。上記で説明した切片封入標本の製造方法によって製造された切片封入標本には、所定の数の切片のうち１つの切片に染色が施されており、好ましい態様では、スライスの順番に沿って、所定の数の切片のうち先頭の切片に染色が施されている。
　当該特定方法では、染色された切片に着目し、病変部分が含まれているか否かをスライスの順番に沿って判定する。スライスの順番に沿って判定するとは、スライスの順番と判定とを対応付けることを意味し、判定の順番を限定するものではない。図１２（ｂ）の例では、第１番目の切片Ｓ１、第７番目の切片Ｓ７、第１３番目の切片Ｓ１３、第１９番目の切片Ｓ１９、第２５番目の切片Ｓ２５を判定する。
　そして、染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最初の切片（図１２（ｂ）の例では、第７番目の切片Ｓ１７）と、染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片（図１２（ｂ）の例では、第１９番目の切片Ｓ１９）との間に位置する全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する。
　当該特定方法により、病変部分が含まれている第６番目、第２０番目～第２２番目の各切片（Ｓ６、Ｓ２０～Ｓ２２）は、対象から外れるが、少ない切片の染色によって、病変部分を含んだ切片の存在範囲を素早く特定することができ、未染色の病変部分を含んだ切片をさらに別の検査に供試することが可能となる。
　図１２（ｂ）の例では、好ましい態様として、切片封入標本が、短冊状の複数（図の例では５枚）の切片封入標本部分によって構成されている。この場合には、染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す切片を含んだ切片封入標本部分（図１２（ｂ）の例では、左から２番目、３番目、４番目の切片封入標本部分）のうち、染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片を含んだ切片封入標本部分（左から４番目の切片封入標本部分）以外の切片封入標本部分（左から２番目、３番目の切片封入標本部分）に含まれた全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する。この特定方法では、１つの短冊状の切片封入標本部分を最小単位として、病変部分を含んだ切片だけからなる切片封入標本部分であるか否かを管理することができるので、管理者にとって分かり易く好ましい。
　当該特定方法の一実施形態においては、切片封入標本に密封される切片は、腫瘍組織からスライスされた切片であり、染色はＨＥ染色であり、HE染色により染色された切片中で特定される病変部分は腫瘍部分であってよい。その場合、切片中に腫瘍部分が含まれているか否かを判定するための基準は、例えば、細胞の極性の乱れ、細胞核の腫大や変形、クロマチン濃染などを基準として判定することができる。
　以下において、実施例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　５つのウェルを備える切片封入用デバイスの作製と切片の密封
　発明者らは、ウェルを５つ含む切片封入用デバイスを作製した（図２）。支持体層およびカバー層の素材としてポリエチレンテレフタラート、粘着剤層の粘着剤としてアクリル系粘着剤が使われているものを用いた。支持体層の厚さは２０μｍ、粘着剤層の厚さは５μｍ（ベース層としては２５μｍ）、カバー層の厚さは約１００μｍであった。また、Ａ４クリアファイルなどにも納まるように、ベース層およびカバー層の大きさは幅３０ｍｍ、長さ２４０ｍｍに設定した。カバー層の開口部の大きさは幅２４ｍｍ、長さ４２ｍｍに設定し、開口部間の間隔が均等になるように蓋部を切り取った。
　さらに、該切片封入用デバイスに実際に切片の接着が可能か試みた（図３）。未染色の切片が密封された切片封入用デバイスの具体的な作製方法を下記に示す。
１．正常肺のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックをミクロトームにセットした。なお、ミクロトームは、ロータリー式とスライド式のどちらでもよい。
２．組織試料から厚さ３～５μｍの切片をスライスできるようにミクロトームの刃を調節した後、ベース層を組織試料面に貼り付け、そのまま組織試料をスライスすることによって、切片をベース層に接着した。なお、スライスの際には、ベース層が他の場所に接着してスライスを阻害しないように、ピンセット等で把持した。また、ベース層を組織試料面に貼り付ける際には、下記４．においてベース層にカバー層を接着した際に、カバー層の開口部の位置に切片が位置するように位置取りした。
３．上記２．の操作をさらに４回繰り返し、ベース層に５枚の連続切片を順番に接着した（図３）。
４．気泡が入らないようにベース層にカバー層を貼り付け、さらに蓋部をウェルに貼り付け、切片を密封した（図４、５）。
　各切片は、蓋部を外すことでアクセスが可能であった。蓋部が切片の周囲の粘着剤と接着するため、切片は密封されていた。遺伝子検査に用いる場合、このウェルから切片を削り取っても、パンチなどでフィルムごと切片を切り取ることもできる。
実施例２　切片封入用デバイスに密封された切片のＨＥ染色
　切片封入用デバイスに密封された切片をウェル内でＨＥ染色が可能か試みた。流水で洗い流す場合以外は、切片封入用デバイスを染色液などに直接浸漬せず、ウェル上に液を０．１～０．３ｍＬ（ｍＬはミリリットル）を滴下することで反応を行った。また、カバー層や粘着剤層の粘着剤と染色液との反応を最小限にするために、切片の脱パラフィン処理と透徹処理の際には、ＨＥ染色で一般的に用いられるキシレンでなく、アルカン系有機溶剤であるClear Plus(株式会社ファルマ)を用いた。
　具体的な手順を下記に示す。
１．実施例１に従い作製された切片封入用デバイスの１枚目切片の蓋部を剥離した。
２．切片封入用デバイスを３０～４５度傾けた状態で、ウェルにClear Plusを０．１～０．３ｍＬ滴下して切片の表面上を流した後、切片に触れないように紙などでClear Plusを吸い取った。この操作を２～３回繰り返すことで切片の脱パラフィン処理を行った。
３．上記２．の操作をClear Plusに代えて１００％エタノールで行った。
４．切片を流水で３０秒から１分洗い流した。
５．ウェルにヘマトキシリン溶液を０．１～０．３ｍＬ滴下し、切片と１～３分反応させた（図６）。
６．切片を流水で３０秒から１分洗い流した。
７．ウェルにエオジン溶液を０．１～０．３ｍＬ滴下し、切片と３０秒から１分反応させた。
８．切片封入用デバイスを１０～３０度傾けた状態で、ウェルに１００％エタノールを０．１～０．３ｍＬ滴下し、脱水しつつ流した。
９．上記２．の操作を行うことで切片の透徹処理を行った。
１０．アルカン系有機溶剤にアクリル樹脂を溶解した封入剤(PARA mount D(株式会社ファルマ))と共に、蓋部で切片を密封した（図７、８）。
　上記のようにして得られた切片封入用デバイス内のＨＥ染色された切片は、対物レンズ４～２０倍拡大での検鏡でも明瞭に観察できた（図９、１０）。また、管状腺癌や印環細胞癌を含む５例の胃生検標本を用いて診断性を検討したところ、いずれもの症例も、組織や細胞の染色性、判別性においてガラススライドを用いた場合とほぼ同程度で、ガラススライドと同じ診断を得ることができた（図１１）。
実施例３　３０症例の組織標本を用いた、切片封入用デバイスに密封された切片のＨＥ染色による診断性の検討
　発明者らは、切片封入用デバイスに密封された切片のＨＥ染色による組織診断が可能か、比較的多数の症例の過去標本を用いて検討した。
　検討には、胃、食道、大腸、肺、皮膚、子宮頸部を各５症例含んだ、計３０症例のホルマリン固定パラフィン包埋組織標本を用いた。この中には、切除方法としては生検、切除生検、外科的切除を、診断としては良性、異型、悪性を含む様々な症例が含まれていた。
　組織標本の観察者として病理専門医２名が参加した。観察者は上記３０症例のガラススライドを検鏡して診断を記載し、２週間のインターバルを挟んだ後、切片封入用デバイスで作製された同じ３０症例の標本を検鏡して診断を記載した。この方法により、ガラススライドによる診断と切片封入用デバイスによる診断の一致率を求めた。
　本実施例では、切片封入用デバイスとして、図１４（ａ）、（ｂ）に示した第２の態様を用いた。支持体層およびカバー層の素材としてポリエチレンテレフタラート、粘着剤層の粘着剤としてアクリル系粘着剤が使われているものを用いた。支持体層の厚さは２０μｍ、粘着剤層の厚さは５μｍ（ベース層としては２５μｍ）、カバー層の厚さは約２００μｍであった。ベース層とカバー層の大きさは、通常のガラススライドやカバーガラスと概ね同じ大きさに設定し、一つの切片封入用デバイスに一症例分の切片を載置した。具体的には、ベース層の１つあたりの大きさは幅３０ｍｍ、長さは５０ｍｍに設定し、組織ブロックの大きさに合わせて余剰部分を適宜切り取った。また、カバー層の大きさは幅３０ｍｍ、長さ７５ｍｍに設定した。
　また、カバー層や粘着剤層と染色液との反応を最小限にするために、切片の脱パラフィンと透徹の際には、ＨＥ染色で一般的に用いられるキシレンでなく、飽和脂肪族炭化水素の有機溶剤であるFast Solve（株式会社ファルマ）を用いた。
　具体的な手順を下記に示す。
１．ベース層とともに切片をFast Solveに３回から５回手早く浸漬し、脱パラフィンした（以下の各工程の操作もベース層と切片は一体となった状態で行った）。
２．上記１．の操作をFast Solveに代えて１００％エタノールで行った。
３．切片を蒸留水に２分から３分浸漬して洗い流した（図１５）。
４．切片をヘマトキシリン溶液に５分浸漬した。
５．切片を蒸留水に２分から３分浸漬して洗い流した。
６．切片をエオジン溶液に１分浸漬した。
７．切片を蒸留水に３０秒浸漬して洗い流した。
８．上記１．の操作をFast Solveに代えて１００％エタノールで行い、脱水した。
９．上記１．の操作を行い、透徹した。
１０．ベース層とカバー層間に封入剤と共に切片を挟むことによって、切片を封入した（図１６、図１７）。
　上記のようにして得られた切片封入用デバイス内のＨＥ染色された切片は、対物レンズ４～４０倍拡大での検鏡でも明瞭に観察できた（図１８、図１９）。
　一方の観察者の診断一致数は、一致２６例、不一致４例であった。不一致症例を再検討したところ、ガラススライドのＨＥ染色の脱失によるものが１例、臨床的に影響のない軽微な不一致が１例、臨床的に影響を与えうる不一致が２例であった。また診断後に、この観察者に切片封入用デバイスに封入された切片のＨＥ染色について所感を求めたところ、組織の微細なひび割れや切片の厚さなど、切片の質に関して改善の余地はあるが、組織診断は可能であると述べていた。
　他方の観察者は、６例を切片封入用デバイスでは診断困難とし、これを除く２４症例中の診断一致数は、一致１７例、不一致７例であった。診断困難と考えた６例について意見を求めたところ、６例中６例が通常の切片よりも厚く、また３例は組織の微細なひび割れが多数あり、いずれも診断に影響する可能性があると述べていた。不一致症例を再検討したところ、ガラススライドのＨＥ染色の脱失によるものが１例、臨床的に影響のない軽微な不一致が３例、臨床的に影響を与えうる不一致が３例であった。
　組織の微細なひび割れにはいくつかの原因が推定された。第一に、組織の微細な組織剥脱によるものではないかと考えられた。線維などの成分の多い結合組織は、細胞成分の多い上皮組織と比して帯電性が低いため、ガラススライド上において接着性や安定性が低く、染色過程で剥脱しやすい。これと同様の現象が、今回切片封入用デバイスでも起こった可能性があった。第二に、薄切時のブロックに対する力学的ストレスによるものではないかと考えられた。ただし今回使用した組織ブロックは、作製から８年程度経過したものがほとんどであり、標本の乾燥や劣化により脆弱性が増加している可能性があった。このことから、比較的最近作製された組織ブロックを用いることで改善できると考えられた。それでも改善されない場合、ミクロトームの改良によって改善できると考えられた。
　また、切片が厚くなった原因はこの組織の微細なひび割れや剥脱に対する一時的な改善策として、ベース層に切片を載置する際にブロックを意図的にやや厚くスライスしたためであると考えられた。
　以上より、切片封入用デバイスにおいてもガラススライドと同様に組織診断をすることができることが示唆されたと、発明者らは結論づけた。
実施例４　切片封入用デバイスに密封された切片の免疫染色
　発明者らは、切片封入用デバイスに密封された切片の免疫染色が可能か検討した。検討には、食道腺癌の過去症例のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを用いた。
　本実施例では、切片封入用デバイスとして、実施例３と同様に、図１４（ａ）、（ｂ）に示した第２の態様を用いた。支持体層およびカバー層の素材としてポリエチレンテレフタラート、粘着剤層の粘着剤としてアクリル系粘着剤が使われているものを用いた。支持体層の厚さは２０μｍ、粘着剤層の厚さは５μｍ（ベース層としては２５μｍ）、カバー層の厚さは約２００μｍであった。ベース層の大きさは、通常のカバーガラスと概ね同じ大きさである幅３０ｍｍ、長さは５０ｍｍに設定し、一つのベース層に一枚の切片を載置した。対してカバー層は、連続切片を６枚載置できるように幅３０ｍｍ、長さ３００ｍｍに設定した（図２０、図２１）。
　ミクロトームを用いて組織ブロックから厚さ４μｍの切片を薄切し、切片をベース層に接着し、次にベース層をカバー層上に順に載置することで、６つの連続切片が密封された切片封入用デバイス２枚（第一切片封入用デバイスおよび第二切片封入用デバイス）と１３枚目の連続切片のみが密封された切片封入用デバイス１枚（第三切片封入用デバイス）を作製した（図２２）。各切片封入用デバイス内の第一切片は、実施例３と同様の方法を用いてＨＥ染色を施した。なお、第三切片封入用デバイスは簡易化のため実施例３と同様の大きさに設定した。各切片封入用デバイスの第一切片を顕微鏡で観察することにより、それらの間にある未染色切片に、腫瘍細胞が含まれているか否か、また含まれているとすればどの位置にあるかを確認することができた（図２３）。
　この結果に準じ、第一切片封入用デバイスからベース層とともに切片３枚（第一切片封入用デバイスの第二から第四切片）を剥離し、免疫染色を施した。以下に具体的な手順を示す。
１．ベース層とともに切片をFast Solveに３回から５回手早く浸漬し、脱パラフィンした（以下の各工程の操作もベース層と切片は一体となった状態で行った）。
２．上記１．の操作をFast Solveに代えて１００％エタノールで行った。
３．切片を蒸留水に２分から３分浸漬して洗い流した。
４．切片を９８℃の抗原賦活化溶液（Epitope retrieval solution, 株式会社Leica Biosystems）に４０分浸漬した。
５．切片をバッファー液（Bond Wash Solution, 株式会社Leica Biosystems）に２分から３分浸漬して洗い流した。
６．清潔なガラスの平板（今回はガラススライドを用いた）上に、過酸化水素溶液を１００μＬ滴下し、切片側が毛細管現象で溶液に浸るように載置し、３０分反応させた。
７．切片をバッファー液に２分から３分浸漬して洗い流した。
８．上記６．と同様の方法で、切片を一次抗体と３０分反応させた。なお、第二切片にはｐ５３に対する抗体（株式会社Leica Biosystems）、第三切片にはpancytokeratinに対する抗体（AE1/AE3、株式会社Nichirei Biosciences）、第四切片にはＣＥＡに対する抗体（株式会社Dako）を用いた。
９．切片をバッファー液に２分から３分浸漬して洗い流した。
１０．上記６．と同様の方法で、切片を増感液（Mouse LINKER, 株式会社Dako）と１５分反応させた。
１１．切片をバッファー液に２分から３分浸漬して洗い流した。
１２．上記６．と同様の方法で、切片を二次抗体（Bond Polymer Refine Detection, 株式会社Leica Biosystems）と３０分反応させた。
１３．切片をバッファー液に２分から３分浸漬して洗い流した。
１４．切片にジアミノベンジジン溶液（DAB+ Liquid, 株式会社Dako）を滴下して標識した。なお反応時間については、顕微鏡下で確認し、適度に反応が進行した時点で終了とした。
１５．切片を蒸留水に２分から３分浸漬して洗い流した。
１６．切片をヘマトキシリン溶液に２分浸漬した。
１７．切片を蒸留水に３０秒浸漬して洗い流した。
１８．上記１．の操作をFast Solveに代えて１００％エタノールで行い、脱水した。
１９．上記１．の操作を行い、透徹した。
２０．ベース層とカバー層間に封入剤と共に切片を挟むことによって、切片を封入した。
　上記のようにして得られた切片封入用デバイス内の免疫染色された切片は、適切に染色が施されていることが確認できた（図２４から図２７）。
実施例５　切片封入用デバイスに密封された切片からの核酸抽出
　発明者らは、切片封入用デバイスに密封された切片から、遺伝子検査に必要な核酸の抽出が可能か検討した。検討に際しては、実施例４で作製された切片封入用デバイスからベース層とともに未染色切片（各４μｍ）６枚を剥離して、核酸抽出に供した。
　抽出には株式会社Qiagenの研究用試薬RNeasy FFPE kitを用い、そのプロトコールに則した。以下に具体的な手順を示す。
１．ベース層とともに切片をキシレンに３回から５回手早く浸漬し、脱パラフィンした（以下の各工程の操作もベース層と切片は一体となった状態で行った）。
２．上記１．の操作を１００％エタノールで行った。
３．切片を乾燥させた。
４．各切片封入用デバイスの第一切片のＨＥ染色の観察から、乾燥した切片内において腫瘍と同定された領域を切り取り、試験チューブに挿入した（図２８）。
５．バッファー液をチューブに滴下し、１００００回／分で１分間遠心した。
６．プロテアーゼＫ溶液をチューブに滴下し、５６℃で１５分、８０℃１５分反応させた。
７．３分間氷冷し、反応を停止させた。
８．１３５００回／分で１５分遠心した後、上澄み液を抽出した。
９．上澄み液にDNase BoosterとDNase I Stock Solutionを滴下し、室温で１５分反応させた。
１０．反応液にBuffer RBCと１００％エタノールを滴下し、スピンカラムを用いて１００００回／分で１分間遠心した。
１１．スピンカラムにBuffer RPEを滴下し、１００００回／分で１分間遠心した。
１２．スピンカラムにBuffer RPEを滴下し、１００００回／分で２分間遠心した。
１３．スピンカラムの蓋を開けた状態で１５０００回／分で５分遠心した。
１４．スピンカラムにRNase-free Waterを滴下し、１５０００回／分で１分遠心して、RNA抽出液を得た。
　超微量分光計（NanoDrop, 株式会社Thermo Scientific）を用いて得られたRNA抽出液を計測したところ、RNA純度の指標ではＡ２６０／Ａ２８０＝１．７４、Ａ２６０／Ａ２３０＝１．７９と十分に高かった（図２９）。またRNA濃度は１８．２ｎｇ／μｌであり、抽出に使用された切片の厚さや枚数に相応のRNA量が得られた。
　組織標本作製の際に、組織試料から連続的にスライスした切片を、従来のガラスではなく、本発明の切片封入用デバイスに連続的に密封することによって、切片全体の管理および長期保存が容易になる。また、連続切片のうち数枚を染色に供することによって、連続切片に含まれる組織全体の情報を間接的に予測することが可能となり、かつ未染色の切片に対して容易にアクセスできるため、目的の切片に対して必要な試験を迅速に行うことが可能となる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１７－２３６５０４（出願日：２０１７年１２月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
　１０　　　ベース層
　１０ａ　　配置面
　１１　　　支持体層
　１２　　　粘着剤層
　２０　　　カバー層
　２０ａ　　カバー面
　２１　　　フレーム部
　２２　　　蓋部

Claims (17)

  1. 　有機高分子材料からなるフィルム状のベース層を有し、該ベース層の一方の主面は、粘着性を有し、かつ、切片を配置するための配置面であり、
    　有機高分子材料からなるフィルム状のカバー層を有し、該カバー層の一方の主面は、前記ベース層の配置面に配置された前記切片を覆い、かつ、前記配置面に貼り付くための、カバー面であり、
    　前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの少なくとも一方が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、
    　前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの他方が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記一方に対して着脱可能な構造を有する、
    切片封入用デバイス。
  2. 　前記ベース層の一方の主面は、粘着性を有し、かつ、複数の切片を間隔をおいて配置するための配置面であり、
    　前記カバー層は、前記配置面上に配置された複数の切片のそれぞれの周囲を個別に取り囲む複数のフレーム部と、各フレーム部によって囲まれた各切片をそれぞれに覆う蓋部とを有し、
    　各フレーム部同士は互いにつながっており、
    　各蓋部は、各フレーム部によって囲まれた各切片を覆って密封し、各切片から離れるように、各フレーム部に対して着脱可能または可動である、
    請求項１に記載の切片封入用デバイス。
  3. 　前記カバー層のフレーム部と蓋部が、同じ１枚のフィルム中に含まれた互いに異なる部分であり、各フレーム部に囲まれた部分が各蓋部であり、
    　各蓋部の外周のうちの一部または全部が各フレーム部から切断され、それにより、各蓋部は、各フレーム部に対して着脱可能または可動である、
    請求項２に記載の切片封入用デバイス。
  4. 　フレーム部と蓋部とが、部分的に互いにつながっており、該つながっている部分は分断可能であり、該つながっている部分を分断することにより、各蓋部は、各フレーム部に対して着脱可能である、請求項３に記載の切片封入用デバイス。
  5. 　各蓋部の外周形状が、線対称の形状および点対称の形状ではない、請求項３または４に記載の切片封入用デバイス。
  6. 　当該切片封入用デバイスが所定長さと所定幅とを持った帯状であり、前記ベース層および前記カバー層も、それぞれ前記の所定長さと所定幅とを持った帯状であり、
    　前記ベース層は、自体の配置面の長手方向に前記複数の切片が所定の間隔をおいて所定数だけ一列に配置されるように、予め決定された帯幅と長さとを有する、
    請求項２～５のいずれか１項に記載の切片封入用デバイス。
  7. 　前記ベース層の配置面および前記カバー層のカバー面のうちの、少なくとも前記カバー層のカバー面が、互いに隣り合って並んだ複数の切片を包含する広さを持っており、
    　前記ベース層の配置面が、前記の互いに隣り合って並んだ複数の切片を個別に密封しかつ個別に該密封を解除するように、前記カバー層のカバー面に対して着脱可能な構造を有する、
    請求項１に記載の切片封入用デバイス。
  8. 　前記ベース層の配置面が、１つの切片を配置する広さを持っており、かつ、
    　１つのカバー層のカバー面が、複数のベース層の各配置面が互いに隣り合って貼り付く広さを持っており、
    　前記ベース層の配置面と前記カバー層のカバー面とによって、複数の切片が、互いに隣り合って並んだ状態で、ベース層とカバー層との間に個別に密封され、かつ個別に該密封を解除される、
    請求項７に記載の切片封入用デバイス。
  9. 　前記ベース層が、下層側の支持体層と、上層側の粘着材層とを有してなる積層体であって、粘着材層の表面が配置面となっている、請求項１～８のいずれか１項に記載の切片封入用デバイス。
  10. 　ベース層とカバー層のうちの少なくとも一方が、密封された切片を外部から観察し得るように透明である、請求項１～９のいずれか１項に記載の切片封入用デバイス。
  11. 　前記複数の切片が、もとの組織試料から順次スライスされることによって得られる連続切片である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の切片封入用デバイス。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の切片封入用デバイスを１以上用い、該切片封入用デバイスのベース層の配置面に、組織試料をスライスしてなる切片を配置する、切片配置工程と、
    　前記切片封入用デバイスのカバー層によって、前記ベース層の配置面に配置された切片を覆って密封し、前記組織試料をスライスしてなる複数の切片が、互いに間隔をおいてスライスの順番に配置された切片封入標本を得る、密封工程とを有する、
    切片封入標本の製造方法。
  13. 　請求項２～６のいずれか１項に記載の切片封入用デバイスを１以上用い、該切片封入用デバイスのベース層の配置面に、組織試料をスライスしてなる複数の切片を、互いに間隔をおいてスライスの順番に配置する、切片配置工程と、
    　前記切片封入用デバイスのカバー層のフレーム部によって、前記ベース層の配置面に配置された各切片のそれぞれの周囲を個別に取り囲み、かつ、該カバー層の蓋部によって、各切片をそれぞれに覆い密封する、密封工程とを有する、
    請求項１２に記載の切片封入標本の製造方法。
  14. 　さらに染色工程を有し、該染色工程は、
    　切片配置工程中に、または、切片配置工程の後であって密封工程の前に、または、密封工程の後で、
    　スライスの順番に沿った所定の数の切片の組ごとに、各組中の最初の切片に対して、切片中に病変部分が含まれているか否かを検査するための染色を行う工程である、
    請求項１２または１３に記載の切片封入標本の製造方法。
  15. 　前記切片配置工程において、前記切片封入用デバイスを複数用い、複数の切片を複数の切片封入用デバイスにわたってスライスの順番に配置し、
    　前記染色工程において、各切片封入用デバイス中の複数の切片のうちの先頭の切片に対して前記染色を行う、
    請求項１４に記載の切片封入標本の製造方法。
  16. 　請求項１４または１５に記載の切片封入標本の製造方法によって製造された１以上の切片封入標本を用い、
    　前記染色された切片に病変部分が含まれているか否かをスライスの順番に沿って判定し、
    　該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最初の切片と、該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片との間に位置する全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する、
    病変部分を含んだ切片を特定する方法。
  17. 　請求項１５に記載の切片封入標本の製造方法によって製造された複数の切片封入標本を用い、
    　前記染色された切片に病変部分が含まれているか否かをスライスの順番に沿って判定し、
    　該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す切片を含んだ切片封入標本のうち、該染色により切片中に病変部分が含まれていることを示す最後の切片を含んだ切片封入標本以外の切片封入標本に含まれた全ての切片を、病変部分を含んだ切片であると特定する、
    請求項１６に記載の病変部分を含んだ切片を特定する方法。
PCT/JP2018/011192 2017-12-08 2018-03-20 切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途 WO2019111427A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019557983A JPWO2019111427A1 (ja) 2017-12-08 2018-03-20 切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017236504 2017-12-08
JP2017-236504 2017-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019111427A1 true WO2019111427A1 (ja) 2019-06-13

Family

ID=66750853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/011192 WO2019111427A1 (ja) 2017-12-08 2018-03-20 切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2019111427A1 (ja)
WO (1) WO2019111427A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021518571A (ja) * 2018-03-28 2021-08-02 ストラテオス, インク.Strateos, Inc. 生物切片の操作方法及び装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09210877A (ja) * 1996-02-06 1997-08-15 Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad 粘着テープを用いた組織観察用薄切片作製装置
JP2008076136A (ja) * 2006-09-20 2008-04-03 Murazumi Kogyo Kk 顕微鏡標本用プレート
JP2011188835A (ja) * 2010-03-16 2011-09-29 Japan Health Science Foundation 組織マイクロアレイ及び組織解析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09210877A (ja) * 1996-02-06 1997-08-15 Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad 粘着テープを用いた組織観察用薄切片作製装置
JP2008076136A (ja) * 2006-09-20 2008-04-03 Murazumi Kogyo Kk 顕微鏡標本用プレート
JP2011188835A (ja) * 2010-03-16 2011-09-29 Japan Health Science Foundation 組織マイクロアレイ及び組織解析方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021518571A (ja) * 2018-03-28 2021-08-02 ストラテオス, インク.Strateos, Inc. 生物切片の操作方法及び装置

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019111427A1 (ja) 2020-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11241220B2 (en) Biopsy tissue sample transport device and method of using thereof
Kawamoto et al. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamoto’s film method (2020)
Milner et al. Degenerating processes identified by electron microscopic immunocytochemical methods
JP4792586B2 (ja) 生物組織固定・包埋・薄切用カセット及びその操作方法
Shidham CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making–A detailed review of various historical options with recent advances
EP2726840B1 (en) Matrix for receiving a tissue sample and use thereof
AU2011220513B2 (en) System and method for anatomical pathology sample handling, storage, and analysis
EP2420813A2 (en) Apparatus and method for histological processing of a tissue specimen with means for maintaining the orientation of the specimen throughout the processing
US20080227144A1 (en) Tissue sample support and orientation device
US10168259B2 (en) Microfluidic devices, systems, and methods for imaging tissue samples
US20140038227A1 (en) Apparatus and method for preparing cytological specimens for analyses
WO2011140374A1 (en) Tissue analysis instrument
WO2006039396A2 (en) Non-embedded tissue microarray technology for protein and nucleic acid analyses
WO2019111427A1 (ja) 切片封入用デバイスおよびその製造方法と用途
KR100458860B1 (ko) 생검시료의 검사를 위한 보조기구
EP3524957B1 (en) Tissue dividing jig
Latimer et al. Protocol for the systematic fixation, circuit-based sampling, and qualitative and quantitative neuropathological analysis of human brain tissue
US5858781A (en) Method of tissue transfer and retrieval
Zhang et al. Immunostaining of Drosophila brains to study optic lobe development
JP2011188835A (ja) 組織マイクロアレイ及び組織解析方法
JP5681387B2 (ja) 生検・細胞試料の紛失・移動や挫滅の防止の為の用具
Carrara et al. Histological examination of the diabetic kidney
JP2012220280A (ja) 患者生検試料とスポンジ状裏打ち用紙の接着・定着固定剤とその病理学的使用法
RU2332172C1 (ru) Способ дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы
Kilic et al. Methods to evaluate the formation and stabilization of blood vessels and their role in tumor growth and metastasis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18886206

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019557983

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18886206

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1