CN118006677A

CN118006677A - 一种人工抗马铃薯y病毒属病毒的抗病体系及其应用

Info

Publication number: CN118006677A
Application number: CN202410161724.8A
Authority: CN
Inventors: 程晓非; 孙家兴; 武晓云; 季苇芹; 范馨月; 喻心炜
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2024-02-05
Filing date: 2024-02-05
Publication date: 2024-05-10

Abstract

一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系及其应用，植物基因工程技术领域。本发明为解决现有技术中马铃薯Y病毒属抗性资源较少、防治困难、防治过程易造成环境污染的技术问题，提供了一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系，提供了抗病体系相关载体9×UAS::ICS1‑GFP 35S::TGB2‑PS‑G4V16的应用原理及构建方法，并利用上述载体获得转基因拟南芥。本发明发现接种病毒后，转基因拟南芥与野生型拟南芥相比病毒积累量显著降低，而PR基因表达量显著提升，表明本发明提供的抗病体系抑制了病毒的积累，提高了植物抗病性，尤其是抗马铃薯Y病毒属病毒的能力，在抗病育种领域发挥重要作用。

Description

一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种提高植物抗病性的技术，具体涉及抗马铃薯Y病毒属病毒。

背景技术

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是目前世界上植物RNA病毒种类最多的病毒属，根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）2022年报道，马铃薯Y病毒属包含191个确定种病毒和30多个暂定种病毒（Inoue-Nagata AK, Jordan R, Kreuze J, et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae 2022[J]. Journal of General Virology, 2022, 103(5): 001738.），例如马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）等；马铃薯Y病毒属病毒寄主范围广，传播能力强，常与其他病毒发生复合侵染，是我国农业生产中危害最为严重的病毒属之一。

PVY、TuMV和SMV是马铃薯Y病毒属的常见典型种，主要危害大豆、马铃薯、白菜、甘蓝等作物。其中，感染TuMV的植物症状表现为叶片花叶、皱缩、斑驳，严重时会畸形、矮化甚至死亡，对作物产量造成了巨大的影响。马铃薯Y病毒属基因组全长约10000个核苷酸的正义单链RNA（+ssRNA），5′端与VPg（viral protein genome-linked）相连，3′端为多聚腺苷酸尾巴（Poly A），编码一个开放阅读框（Open reading frame，ORF），翻译的多聚蛋白在P1、Hc-Pro和NIa-Pro的作用下可水解为P1、Hc-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP等10个蛋白。其中，P3内部存在一个聚合酶滑移基序（GAAAAAA），产生一个短的多肽，水解为P1、Hc-Pro和P3N-PIPO蛋白等3个蛋白（Olspert A, Chung B Y W, Atkins J F, et al.Transcriptional slippage in the positive-sense RNA virus family Potyviridae[J]. Embo Reports, 2015, 16(8): 995.1004）。NIa-Pro是一种具半胱氨酸蛋白酶，定位于病毒侵染细胞的细胞质和细胞核中，负责P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIb和CP的成熟（Adams MJ, Antoniw J F, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavagesites in the family Potyviridae[J]. Molecular Plant Pathology, 2005, 6(4):471-487），NIa-Pro能识别一段6个氨基酸多肽，并在第4和第5位氨基酸之间进行水解；例如，TuMV的NIa-Pro能识别VYHQAG，并在Q与A之间断裂；研究发现，TuMV NIa-Pro第151位氨基酸的半胱氨酸（C）是蛋白酶的水解活性的关键氨基酸，将它突变为丙氨酸（A）会导致酶活的丧失（Xiao H, Lord E, Sanfaçon H. Proteolytic Processing of Plant Proteinsby Potyvirus NIa Proteases[J]. Journal of Virology. 2022; 96(2): e0144421.）。值得注意的是，将NIa-Pro识别序列中一个或多个氨基酸进行突变可能对水解活性造成影响，甚至导致完全不能水解；同时，马铃薯Y病毒属不同病毒的NIa-Pro识别氨基酸序列存在差异。

在自然界的长期进化中，植物为防卫病原菌侵染进化出一系列防御机制。系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）是一种植物在受到自然或非自然胁迫后由侵染部位诱导的、全身性的、长时间、广谱的抗性，病原物接触、化学或物理性胁迫都可以诱导植物启动防御机制，这种植物免疫机制可以在植物整个生长发育期发挥作用（MétrauxJ P, Nawrath C, Genoud T. Systemic acquired resistance[J]. Euphytica, 2002,124: 237-243.）；水杨酸（Salicylic acid，SA）是SAR的关键信号分子之一，外施SA即可诱导PR（Pathogenesis-related gene）基因过量表达建立SAR；其中，植物体内SA有两种合成路径分别为苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）途径和异分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS）途径，其中ICS1基因是编码SA合成过程中的关键基因，植物中SARD1和CBP60g两个转录因子在转录水平上调控ICS1基因，促进SA的合成，进而诱导SAR（Ding P, Ding Y. Stories of salicylic acid: a plant defense hormone.Trends in Plant Science, 2020, 25: 549-565）。

GAL4是酵母的一个转录激活因子，它可与半乳糖基因启动子中一段称为上游激活序列（Upstream Activation Sequence，UAS）的DNA结合，从而激活半乳糖基因的表达。GAL4可以分为两个功能结构域，分别是负责与UAS结合的DNA结合结构域和激活基因表达的转录激活结构域。

VP16是单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）中的转录激活因子，在真核生物细胞中可以高效招募转录相关因子，启动基因表达。将VP16的转录激活结构域和GAL4的DNA结合结构域融合，组成人工转录因子GAL4-VP16，再结合UAS序列，可以在真核细胞中构建转录可控、并具有强激活功能的人工转录激活体系，即GAL4-VP16/UAS系统（Waki T,Miyashima S, Nakanishi M, Ikeda Y, Hashimoto T, Nakajima K. A GAL4-basedtargeted activation tagging system in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal,2013, 73: 357-367； Radoeva T, ten Hove CA, Saiga S, Weijers D. Molecularcharacterization of Arabidopsis GAL4/UAS enhancer trap lines identifies novelcell-type-specific promoters[J]. Plant Physiology, 2016, 171: 1169-1181）。

本领域一直渴望研发一种增强植物抗病性的抗病体系，针对于马铃薯Y病毒属病毒，以解决目前马铃薯Y病毒属抗性资源较少、防治困难、化学防治昆虫传播介体易造成环境污染的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术中马铃薯Y病毒属抗性资源较少、防治困难、化学防治昆虫传播介体易造成环境污染的技术问题，本发明提供一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系及其应用。

本发明的目的之一在于提供一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系，所述抗病体系包括膜定位GAL4-VP16人工转录因子和ICS1-GFP抗性诱导基因两个分子模块。

在本发明的一个优选实施例中，所述膜定位GAL4-VP16人工转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个优选实施例中，所述的膜定位GAL4-VP16人工转录因子利用花椰菜花叶病毒CaMV的35S组成型启动子进行表达。

在本发明的一个优选实施例中，所述的膜定位GAL4-VP16人工转录因子从N端至C端分别为马铃薯X病毒的膜蛋白TGB2、TuMV NIa-Pro蛋白酶核苷酸序列、GAL4的DNA结合结构域和VP16转录激活结构域。

在本发明的一个优选实施例中，所述的TuMV NIa-Pro蛋白酶核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一个优选实施例中，所述的ICS1-GFP抗性诱导基因由ICS1基因全长cDNA与绿色荧光蛋白组成。

在本发明的一个优选实施例中，所述的ICS1抗性诱导基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一个优选实施例中，所述ICS1-GFP抗性诱导基因的启动子由9个串联重复GAL4的DNA结合结构域识别序列和CaMV 35S启动子中决定转录启始位置的35 nt序列组成。

本发明的目的之二在于提供一种抗马铃薯Y病毒属病毒转基因植物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：构建重组载体，将上述重组载体转化到农杆菌中获得重组农杆菌，再将重组农杆菌转入到植物中，获得转基因植物。

在本发明的一个优选实施例中，所述的重组载体为9×UAS::ICS1-GFP 35S:: TGB2-PS-G4V16。

在本发明的一个优选实施例中，所述的农杆菌为GV3101。

在本发明的一个优选实施例中，所述的植物为拟南芥。

本发明的目的之三在于提供一种上述抗病体系在防治马铃薯Y病毒属病毒侵染植物方面的应用。

在本发明的一种优选实施例中，所述的马铃薯Y病毒属病毒为芜菁花叶病毒TuMV。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系，经验证发现表达膜定位GAL4-VP16人工转录因子的转基因植株的生长状态与野生型对照植株完全一致，这是由于膜定位GAL4-VP16人工转录因子不能直接进入转基因植物细胞核中进行表达，从而不能够激活抗性诱导基因的表达。然而，当TuMV侵染植物时，病毒NIa-Pro蛋白酶识别并剪切TuMV的NIa-Pro蛋白酶识别氨基酸序列，将膜定位GAL4-VP16人工转录因子从膜上释放，并进入转基因植物细胞核中，与9×UAS相结合，进而激活下游ICS1-GFP基因的表达，诱导合成水杨酸，激发植物的系统获得性抗性，从而实现提高植物对TuMV的抗性。

注射接种TuMV-6K2mCherry 14天时，在紫外灯下仅观察6K2mCherry荧光计算侵染面。经验证发现，TuMV-6K2mCherry在转基因植物上的侵染面积约占总叶面积的1/6，而TuMV-6K2mCherry在野生型拟南芥上侵染面积约占总叶面积的2/5，证明本发明提供的抗病体系有效减少了芜菁花叶病毒TuMV的侵染面积。通过qPCR检测证明，转基因植物中抗性诱导基因ICS1-GFP和PR基因表达量上调，TuMV的CP基因表达量下调，证明本发明提供的抗病体系通过促进抗性诱导基因ICS1-GFP的表达，促进水杨酸的合成，诱导PR基因的表达，实现增强植物抗马铃薯Y病毒属病毒病能力的目的。

本发明提供的人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系可应用于防治马铃薯Y病毒属病毒引起的病害，防治过程中不需要使用化学药剂，绿色环保，在植物转基因抗病育种领域具有重要作用。

附图说明

图1为实施例1中抗病体系中载体构建示意图；

图2为实施例2中膜定位GAL4-VP16人工转录因子瞬时表达结果图；其中，A为紫外灯（UV）照射下浸润接种48 hpi的本氏烟叶片，左图为接种次序，与右图接种位置相对应；B和C为Western-blot检测GFP和Myc的表达情况图，用GFP-N抗体（B）和Myc多克隆抗体（C）检测；CBB为考马斯亮蓝染色，箭头表示特异性条带，^*表示非特异性条带；

图3为实施例3中膜定位GAL4-VP16人工转录因子诱导ICS1-GFP瞬时表达结果图；其中，A为激光共聚焦显微镜下观察ICS1-GFP基因的表达情况图；ICS1表示9×UAS::ICS1- GFP+35S::TGB2-PS-G4V16；所有共聚焦照片均在48 hpi拍摄，比例尺=50 μm，所有照片采用相同参数进行拍摄；B和C为Western-blot检测ICS1-GFP和Myc的表达情况图，用GFP-N抗体（B）和Myc多克隆抗体（C）检测；Pro表示pBA-TuPro，ProM表示pBA-TuProM，TuMV表示pCambia-TuMV-GFP，CBB为考马斯亮蓝染色，箭头表示特异性条带，^*表示非特异性条带；

图4为实施例4中转基因植物验证结果图；其中，A为转基因拟南芥的PCR检测电泳图；泳道M为DL2000 Plus DNA marker，泳道I为CK，泳道WT为野生型，泳道S为质粒对照，泳道1-3分别为3株不同的转基因植物提取DNA样品；B和C为Western-blot检测ICS1-GFP的表达情况图，用VP16抗体（B）和Myc多克隆抗体（C）检测；CBB为考马斯亮蓝染色，箭头表示特异性条带，^*表示非特异性条带；

图5为实施例4中转基因的抗性表型及抗性分析结果图；其中，A为TuMV-6K2mCherry侵染WT野生型和转基因植物在14 dpi的表型图；WL为白光，UV为特定波长激光，PC为ImageJ处理后生成，红色表示无病毒区，黄色表示病毒感染区域；B为TuMV-mcherry相对全株叶片的侵染面积统计结果图；C为WT与转基因拟南芥9×UAS::ICS1-GFP在14 dpi时PR基因的qRT-PCR检测图，D为病毒CP基因积累量图，qRT-PCR的内参基因为At-EF1α，WT中的病毒CP基因和PR基因表达量设为1，柱状图表示平均值±标准差（n=3）。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

本发明涉及的英文名称：

马铃薯Y病毒属：Potyvirus；

马铃薯Y病毒：Potato virus Y，PVY；

芜菁花叶病毒：Turnip mosaic virus，TuMV；

大豆花叶病毒：Soybean mosaic virus，SMV；

核内含体蛋白a蛋白酶：Nuclear inclusion protein a protease，NIa-Pro；

系统获得性抗性：Systemic acquired resistance，SAR；

水杨酸：Salicylic acid，SA；

病原相关基因：Pathogenesis-related gene，PR gene；

衣壳蛋白基因：Coat protein，CP；

苯丙氨酸解氨酶：Phenylalanine ammonia lyase，PAL；

异分支酸合成酶：Isochorismate synthase，ICS；

上游激活序列：Upstream Activation Sequence，UAS；

N端的DNA结合区域：DNA-binding Domain，BD；

C端的转录激活区域：Activation Domain，AD；

单纯疱疹病毒：Herpes Simplex Virus，HSV；

乙酰丁香酮：Acetosyringone，AS；

2-吗啉乙磺酸：2-（4-Morpholino）ethanesulfonic acid，MES。

实施例1：抗病体系中载体的构建

（1）9×UAS::GFP载体的构建：用引物SynJ-GFP-F（SEQ ID NO.4）和pMDC107-R（SEQID NO.5），以pMDC107质粒为模板，进行PCR扩增，获得线性化的pMDC107质粒；用引物UAS-F（SEQ ID NO.6）和UAS-35sR（SEQ ID NO.7），以pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro]质粒（普洛麦格公司；货号E1370）为模板，进行PCR扩增，获得9×UAS序列，同源重组连接9×UAS片段和线性化pMDC107质粒，获得重组载体9×UAS::GFP。

（2）9×UAS::ICS1-GFP载体的构建：从NCBI GenBank上获得拟南芥ICS1基因的mRNA序列（GenBank登录号：AY056055.1），利用植物总RNA提取试剂盒（普洛麦格公司；货号：LS1040），按照说明书从野生型拟南芥植物叶片中提取RNA，用Oligo-dT₁₈引物和反转录试剂盒（南京诺唯赞（Vazyme）公司；货号：R333）进行反转录，获得cDNA；使用引物107ICS1-F（SEQID NO.8）和107ICS1-R（SEQ ID NO.9）进行PCR扩增，获得ICS1基因cDNA片段；以9×UAS:: GFP为模板，使用引物GFP-F（SEQ ID NO.10）和GFP-R（SEQ ID NO.11）进行PCR扩增，获得线性化9×UAS::GFP质粒；同源重组连接ICS1基因和线性化9×UAS::GFP载体，获得重组载体9 ×UAS::ICS1-GFP。

（3）35S::GAL4-VP16表达载体的构建：以pEarley205为模板，使用引物TAP-F（SEQID NO.12）和35s-saR（SEQ ID NO.13）进行PCR扩增，获得线性化pEarley205载体；以质粒pECE-Gal4-VP16（Addgene登录号：71728）为模板，使用引物G4V16-F（SEQ ID NO.14）和G4V16-R（SEQ ID NO.15）进行PCR扩增，获得GAL4-VP16片段；同源重组连接GAL4-VP16片段和线性化pEarley205质粒，获得重组载体35S::GAL4-VP16。

（4）35S::TGB2-PS-G4V16表达载体的构建：从NCBI上获得马铃薯X病毒编码的膜蛋白TGB2的编码序列（GenBank登录号：MF405302.1），以马铃薯X病毒侵染性克隆pGR107为模板，使用引物synJ TGB2-F（SEQ ID NO.16）和TGB2 site-R（SEQ ID NO.17）进行PCR扩增TGB2基因片段；利用TuMV site-F（SEQ ID NO.18）和35s-saR（SEQ ID NO.13），以35S::GAL4-VP16质粒为模板进行PCR扩增，获得线性化的35S::GAL4-VP16，通过同源重组将TGB2连入35S::GAL4-VP16表达载体上，获得重组载体35S::TGB2-PS-G4V16质粒。

（5）TuMV 编码的NIa-Pro表达载体的构建：用引物207-F（SEQ ID NO.19）和207-R（SEQ ID NO.20），以pDONR207m载体为模板，进行PCR扩增，获得线性化的pDONR207m载体；使用引物207 Pro-F（SEQ ID NO.21）和207 Pro-R（SEQ ID NO.22），以TuMV-6K2mCherry侵染性克隆为模板，扩增TuMV的NIa-Pro基因片段（GenBank登录号：AB194802.1），利用同源重组将TuMV的NIa-Pro基因片段和线性化的pDONR207m载体连接，获得重组载体pDONR207-TuPro；通过LR重组法将TuMV NIa-Pro基因片段从pDONR207-TuPro连入pBA-Flag-4×Myc-DC表达载体中，获得重组载体pBA-TuPro。

（6）无酶活性TuMV NIa-Pro突变体NIa-ProM表达载体的构建：使用引物NIa-ProM-F（SEQ ID NO.23）和207 Pro-R（SEQ ID NO.22），NIa-ProM-R（SEQ ID NO.24）和207 Pro-F（SEQ ID NO.21），分别以pDONR207-TuPro为模板进行PCR扩增，再用引物207 Pro-F（SEQ IDNO.21）和207 Pro-R（SEQ ID NO.22）进行重叠PCR，获得NIa-ProM片段；将NIa-ProM片段与线性化的pDONR207m利用同源重组连接，构建pDONR207-TuProM载体；再通过LR重组法将TuProM连入pBA-Flag-4×Myc-DC表达载体中，获得重组载体pBA-TuProM。

（7）9×UAS::ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16载体构建：使用引物pMDC107-TGB2-F（SEQ ID NO.25）和OCS-205-R（SEQ ID NO.26），以9×UAS::ICS1-GFP为模板，进行PCR扩增，获得9×UAS::ICS1-GFP片段；以引物205-35s-F（SEQ ID NO.27）和35s-pMDC107-R分别扩增（SEQ ID NO.28），以35S::TGB2-PS-G4V16为模板进行PCR扩增，获得线性化35S::TGB2-PS- G4V16；同源重组9×UAS::ICS1-GFP片段和线性化35S::TGB2-PS-G4V16，获得载体9×UAS:: ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16。

如图1为本实施例抗病体系中载体构建流程图。

实施例2：GAL4-VP16/UAS系统可行性的检验

S1：通过电击法将实施例1中获得的9×UAS::GFP、9×UAS::ICS1-GFP、35S::GAL4- VP16、35S::TGB2-PS-G4V16、pBA-TuPro及pBA-TuProM转化至农杆菌GV3101中，将含有目标载体的农杆菌涂布于含有50 mg/ml对应抗生素和10 mg/ml利福平的固体LB培养基中；28℃培养至出现单菌落，挑阳性单菌落于含有50 mg/l的卡那霉素和10 mg/l利福平的液体LB培养基中（蛋白胨tryptone 10 g、酵母粉Yeast extract 5 g、氯化钠 Nacl 10 g，用水定容至1000 ml），28℃培养过夜，离心富集菌体，菌体重悬于0.01 mol/l MES和0.01 mol/lMgCl₂组成的洗菌Buffer，调至OD₆₀₀值0.4-0.8之间，以1000：1的比例加入AS，室温静置1 h，获得农杆菌悬浮液；

S2：取培养至4周龄的本氏烟，利用1 ml无针头的无菌注射器将S1中获得的农杆菌悬浮液注射入叶片背部，将接种后的本氏烟置于光照培养箱中进行培养，接种后48 h取样观察，在紫外光（UV）下观察荧光情况，同时对其进行Western-blot检测。

结果如图2A所示，接种9×UAS::GFP和35S::TGB2-GAL4-VP16，以及接种9×UAS:: GFP、35S::TGB2-PS-G4V16及pBA-TuPro的叶片区域出现明亮的绿色荧光，接种9×UAS::GFP和35S::TGB2-PS-G4V16及同时接种TuMV-6K2mCherry的叶片区域出现轻微绿色荧光，而接种9×UAS::GFP和35S::TGB2-PS-G4V16，或者接种9×UAS::GFP、35S::TGB2-PS-G4V16及pBA-TuProM的叶片区域未出现绿色荧光。

取接种后48 h的本氏烟接种叶进行Western-blot检测，使用兔源抗GFP抗体（购自Sigma公司；货号：G1544）和Myc标签抗体（购自Abcam公司；货号：ab9106）分别检测GFP和TuMV NIa-Pro或NIa-ProM的表达情况，结果如图2B.C所示，表明共浸润pBA-TuPro或接种TuMV-6k2mcherry叶片样本中检测到GFP特异性条带，同时能检测到pBA-TuPro及pBA-TuProM的特异性条带，且大小符合预期。

上述结果证明，GAL4-VP16可以特异性识别UAS，并激活下游基因GFP的表达，TGB2-PS-G4V16由于定位于细胞膜，不能进入细胞核激活GFP的表达，但是表达TuMV NIa-Pro或接种TuMV时，NIa-Pro可以水解TGB2-PS-G4V16，产生GAL4-VP16，再进入细胞核激活GFP的表达。

实施例3：ICS1基因的诱导与检测

本实施例将图3A所示的重组载体浸润接种至本氏烟，接种42 h后取样观察，用刀片小心切下接种处，背面向上小心放置于载玻片上，用盖玻片覆盖，置于激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光，并同时进行Western-blot检测。

结果图3A所示，共浸润接种9×UAS::ICS1-GFP、35S::TGB2-PS-G4V16以及pBA-TuPro或接种TuMV-6K2mCherry的本氏烟组织可以观察到绿色荧光，而接种9×UAS::ICS1- GFP和35S::TGB2-PS-G4V16，或者接种9×UAS::ICS1-GFP、35S::TGB2-PS-G4V16以及pBA-TuProM的本氏烟组织观察不到绿色荧光。对上述样品进行Western-blot检测，结果图3B.C所示，发现共浸润接种9×UAS::ICS1-GFP、35S::TGB2-PS-G4V16以及pBA-TuPro或接种TuMV-6K2mCherry的本氏烟组织中能检测到ICS1-GFP特异性条带。

实施例4：转基因拟南芥的制备及抗病性的检测

S1：取长势良好并处于花期的野生型拟南芥，减去种荚，备用；取100 μl实施例2中获得的含有9×UAS::ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16载体的农杆菌悬浮液，置于3 ml含有50 mg/ml Kana和25 mg/ml Rif抗性的液体LB培养基中过夜培养，再将菌液置于200 ml具有相同抗性的LB液体培养基中，28℃恒温摇床过夜摇菌，至菌液浑浊；用50 ml离心管分四次富集菌液，室温6000 rpm/min离心10 min，弃上清液；在离心管中加入10 ml 5%的蔗糖溶液，使沉淀完全溶解，使用巴氏吸管轻轻吹打混匀，加入5%蔗糖溶液定容至50 ml，后稀释至OD₆₀₀值为1.0，每50 ml液体中加入15 μl silwet L-77，吹打混匀，将花序充分浸泡20 s，固定花序，利用保鲜膜在竹签外包裹拟南芥并在黑暗环境中放置18 h，置于恒温培养箱中培养，等待收种；

S2：S1中培养的拟南芥种荚成熟后进行收种，将种子和砂土以1：3的比例均匀施撒于土中，4℃春化后置于恒温培养箱中培养，待种子出芽后喷施150 μg/ml的潮霉素，喷施5次，选取长势良好的拟南芥移苗，待拟南芥长至适宜大小后用于后续试验。

提取T₀代9×UAS::ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16载体拟南芥DNA进行PCR检测，WT为阴性对照，以9×UAS::ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16载体为阳性对照，使用引物107-ICS1-F（SEQ ID NO.8）和GFP-cexu-R2（SEQ ID NO.29）进行PCR验证，选取检测正确的转基因拟南芥并用于后续实验，如图4A所示。

取含有pBA-TuPro和pBA-TuProM农杆菌浸润接种转基因拟南芥，接种40 h后取样，并用VP16抗体和Myc标签抗体进行Western-blot检测，结果如图4B.C所示，VP16抗体检测结果表明浸润接种pBA-TuPro的拟南芥样品可以检测到两条特异性条带，这是由于NIa-Pro识别水解位点后，将部分GAL4-VP16被切割下来；而接种pBA-TuProM及未接种的转基因拟南芥，仅能检测到单一条带；Myc标签抗体检测结果说明，pBA-TuPro和pBA-TuProM正常表达；以上结果证明，TuMV的NIa-Pro能识别，并水解TGB2-PS-G4V16中的NIa-Pro序列。

本实施选取长势相同的WT和转基因植物，注射接种TuMV-6K2mCherry，接种后第14天时在紫外灯（UV）下可观察到少量的6K2mCherry荧光，侵染面积约占总面积的1/6，约占野生型拟南芥侵染面积的2/5，结果如图5A.B所示。

本实施以AtEF1α-F（SEQ ID NO.30）和AtEF1α-R（SEQ ID NO.31）为引物，以拟南芥的EF1α为内参基因，以PR1-RTF（SEQ ID NO.32）和PR1-RTR（SEQ ID NO.33）为引物，对9× UAS::ICS1-GFP的PR基因进行qPCR检测；再以TuMV CP-RTF（SEQ ID NO.34）和TuMV CP-RTR（SEQ ID NO.35）为引物，对TuMV-CP基因的表达量进行qPCR检测。结果如图5C.D所示，与WT相比，9×UAS::ICS1-GFP的PR基因表达量上调，而TuMV-CP基因表达量下调。

综上所述，当TuMV入侵植物时，病毒所编码的NIa-Pro蛋白酶识别并剪切本发明改造后的膜定位GAL4-VP16人工转录因子中的TGB2-PS-G4V16，致使GAL4-VP16从膜上被释放，进入植物细胞核与9×UAS相结合，促进抗性诱导基因ICS1-GFP的表达，进而促进SA合成，诱导PR基因的表达，实现建立系统获得性抗性增强植物抗病能力的目的。

本发明说明书中未详细描述内容为本领域技术人员公知技术。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种人工抗马铃薯Y病毒属病毒的抗病体系，其特征在于，所述抗病体系包括膜定位GAL4-VP16人工转录因子和ICS1-GFP抗性诱导基因两个分子模块。

2.根据权利要求1所述的抗病体系，其特征在于，所述膜定位GAL4-VP16人工转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的膜定位GAL4-VP16人工转录因子利用花椰菜花叶病毒CaMV的35S组成型启动子进行表达。

3.根据权利要求1所述的抗病体系，其特征在于，所述的膜定位GAL4-VP16人工转录因子从N端至C端分别为马铃薯X病毒的膜蛋白TGB2、TuMV NIa-Pro蛋白酶核苷酸序列、GAL4的DNA结合结构域和VP16转录激活结构域。

4.根据权利要求3所述的抗病体系，其特征在于，所述的TuMV NIa-Pro蛋白酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的抗病体系，其特征在于，所述的ICS1-GFP抗性诱导基因由ICS1基因全长cDNA与绿色荧光蛋白组成，所述ICS1抗性诱导基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述的抗病体系，其特征在于，所述ICS1-GFP抗性诱导基因的启动子由9个串联重复GAL4的DNA结合结构域识别序列和CaMV 35S启动子中决定转录启始位置的35 nt序列组成。

7.一种抗马铃薯Y病毒属病毒转基因植物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：构建重组载体，将上述重组载体转化到农杆菌中获得重组农杆菌，再将重组农杆菌转入到植物中，获得转基因植物。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的重组载体为9×UAS::ICS1-GFP 35S::TGB2-PS-G4V16。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为GV3101，所述的植物为拟南芥。

10.权利要求1-6任一项所述的抗病体系在防治马铃薯Y病毒属病毒侵染植物方面的应用，其特征在于，所述的马铃薯Y病毒属病毒为芜菁花叶病毒TuMV。