CN117987538A - 用于检测depdc5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的试剂盒中的应用。其中，在上述应用中，DEPDC5突变基因为c.3459C>G。能够解决现有技术中对于FFEVF1的检测不能满足临床需求的问题，适用于DEPDC5突变基因检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及DEPDC5突变基因检测领域，具体而言，涉及一种用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型试剂盒中的应用。
背景技术
家族性局灶性癫痫伴可变灶(familial focal epilepsy with variable foci,FFEVF)是一种常染色体显性遗传癫痫综合征。是一种少见的常染色体显性遗传性癫痫，以临床表现复杂、家族中不同成员发作部位起源于不同部位、发作严重程度也各不相同为主要特征。导致家族性局灶性癫痫伴可变灶疾病的基因包含DEPDC5、NPRL2、NPRL3和SCN3A。
家族性局灶性癫痫伴可变灶1型（Epilepsy, familial focal, with variablefoci 1,FFEVF1）是一种诱发于不同家庭成员的不同皮质区域的常染色体显性遗传局灶性癫痫。许多患者在癫痫发作期有先兆和自动症，而有些人可能在夜间发作。该病经常继发性全身扩散。一些患者发作间期脑电图显示异常，一些患者可能有智障或自闭症。癫痫发作通常发生在 10-20岁，存在临床异质性和外显率不全。
FFEVF1由DEPDC5基因突变引起的，DEPDC5位于22q12.2-q12.3，基因全长约154kb，包含43个外显子和42个内含子。DEPDC5是mTOR通路的重要组成之一，而mTOR通路对于神经元活性和大脑发育有重要作用。但目前对于FFEVF1的发病原因仍了解甚少，难以满足对于临床的需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型试剂盒中的应用，以解决现有技术中对于FFEVF1的检测不能满足临床需求的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的试剂盒中的应用，该DEPDC5突变基因为c.3459C>G。
进一步地，试剂盒包括扩增c.3459C>G的扩增引物或捕获c.3459C>G的探针。
进一步地，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。
进一步地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种用于检测DEPDC5突变基因的探针在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的基因芯片中的应用，上述DEPDC5突变基因为c.3459C>G；优选地，探针能够与c.3459C>G特异性结合；优选地，基因芯片中的探针还包括能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种DEPDC5突变基因的检测试剂盒，该DEPDC5突变基因为c.3459C>G。
进一步地，检测试剂盒包括扩增c.3459C>G的扩增引物或捕获c.3459C>G的探针。
进一步地，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；优选地，检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种DEPDC5突变基因的基因检测芯片，该DEPDC5突变基因为c.3459C>G，基因检测芯片上含有能够与c.3459C>G特异性结合的探针；优选地，基因检测芯片中的探针还包括能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针。
应用本发明的技术方案，将能够检测DEPDC5突变基因的试剂用于制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的试剂盒中，获得的试剂盒能够根据对受试者DNA中是否含有DEPDC5突变基因进行判断，从而实现对于受试者是否患有或可能患有家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的诊断或预测。通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断家族性局灶性癫痫伴可变灶1型，以指导治疗和优生优育，为家族性局灶性癫痫伴可变灶1型患者的治疗提供全新的理论依据。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的家系样本的家系图谱示意图。
图2示出了根据本发明实施例1的家系成员的sanger测序结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，家族性局灶性癫痫伴可变灶1型（FFEVF1）是一种常染色体显性遗传局灶性癫痫，癫痫发作通常发生在10-20岁，存在临床异质性和外显率不全，在发病时或发病前的诊断困难。Clinvar数据库中收录DEPDC5基因约300个有害变异，包含错义变异、移码变异、剪接变异和无异变异等，其中经典剪接、移码变异和无异变异占比较大。从致病性位点看，均匀分布在各外显子上。
在本申请中发明人尝试进一步探究FFEVF1与染色体突变的关系，发现了一种和FFEVF1有关的罕见变异NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )，在此基础上开发了相关应用和试剂盒，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型（FFEVF1）的试剂盒中的应用，在该应用中，DEPDC5突变基因为c.3459C>G；野生型DEPDC5基因的登录号为NM_001242896.3。
Clinvar数据库中，相同位置上发生了同义突变NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>T (p.Tyr1153=)，Clinvar数据库评级该同义突变为良性变异。而在本申请中，在该位点上发现了能够致病的c.3459C>G。
在上述应用中，利用能够检测DEPDC5突变基因的试剂制备试剂盒，利用此种试剂盒通过对DEPDC5突变基因c.3459C>G进行检测，从而实现对于FFEVF1的诊断或预测。若检测结果为野生型DEPDC5基因3459位置C碱基突变为G碱基，包括但不限于纯和突变或杂合突变，此种突变会导致DEPDC5基因所编码的蛋白质第1153位置氨基酸Tyr发生终止，第1153位置后续的氨基酸缺失，从而导致FFEVF1的病情发生。因此利用检测DEPDC5突变基因的试剂能够制备能够诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型试剂盒。
在一种优选的实施例中，试剂盒包括扩增c.3459C>G的扩增引物或捕获c.3459C>G的探针。
上述能够扩增出突变位点c.3459的扩增引物，包括但不限于以待测样本DNA为模板进行PCR扩增的引物，或以通过mRNA反转录获得的cDNA文库为模板进行PCR扩增的引物，或其他现有技术中能够检测c.3459位置基因情况的引物。上述能够捕获c.3459C>G的探针包括但不限于能够特异性捕获突变DNA的探针。利用现有技术，包括但不限于测序、探针捕获或蛋白检测（检测野生型DEPDC5的长度或是否存在），从而判断样本基因组中c.3459位置是C或G的试剂均可设置在上述试剂盒中。
在一种优选的实施例中，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
利用上游引物和下游引物能够实现对于突变位点c.3459的PCR扩增，进一步地对于PCR产物进行测序即能够实现对于DEPDC5基因中是否发生c.3459C>G突变的检测，从而实现对于FFEVF1的诊断或预测。
SEQ ID NO：1：CCTGCAGGTATCTGTGGACC；
SEQ ID NO：2：ACAGCTTCCTTTTCCTCCGG。
在一种优选的实施例中，试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂和/或用于建库的试剂。
在一种优选的实施例中，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
上述PCR缓冲液即现有技术中常见的PCR buffer，用于提供适合DNA聚合酶的反应条件。上述用于提取目标DNA的试剂，能够从目标样本中提取获得DNA，为后续的PCR反应提供扩增模板。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种用于检测DEPDC5突变基因的探针在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的基因芯片中的应用，DEPDC5突变基因为c.3459C>G；优选地，探针能够与c.3459C>G特异性结合。
在上述基因芯片中含有能够与c.3459C>G特异性结合的探针，若待测样品中含有c.3459C>G突变，即基因探针能够实现对突变的检测。优选地，上述基因芯片中还含有能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针，从而实现对于检测的质量控制和/或对于待测样品中该位点为纯和突变或杂合突变的判断。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种DEPDC5突变基因的检测试剂盒，其中上述DEPDC5突变基因为c.3459C>G；野生型DEPDC5基因的登录号为NM_001242896.3。
利用上述检测试剂盒中，能够实现对于样本中是否存在DEPDC5突变基因的检测。
在一种优选的实施例中，检测试剂盒包括扩增c.3459C>G的扩增引物或捕获c.3459C>G的探针。
在一种优选的实施例中，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一种优选的实施例中，检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种DEPDC5突变基因的基因检测芯片，该DEPDC5突变基因为c.3459C>G，基因检测芯片上含有能够与c.3459C>G特异性结合的探针；优选地，基因芯片中的探针还包括能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
一、依据知情同意书规则，收集家系样本，绘制家系图谱，分析遗传模式。
依据知情同意书的原则，对家族性局灶性癫痫伴可变灶1型患者及家系其他个体进行全血的收集和家系基本信息采集，信息如表1所示。绘制家系图谱（见图1），判断家族性局灶性癫痫伴可变灶1型在家族中的遗传方式。图1中，↗表示先证，表示健康男性，/>表示女性携带者，/>表示男性携带者，I表示家族第一代，II表示家族第二代，数字代表成员编号。
表1
。
二、全外显子测序
提取、建库、测序，生物信息学分析发现NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )有害变异，与家族性局灶性癫痫伴可变灶1型相关。
分别对来源于先证者、父亲和母亲的DNA样本进行处理。
本申请实施例中所用的试剂盒包括：
天根磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒（血液/组织）（厂家：天根，货号：DP705）；
DNA建库试剂盒：NEBNext® Ultra™II DNA Library Prep Kit for Illumina®（厂家：NEB，货号：Z1723L）；
全外显子捕获试剂盒：Agilent SureSelectXT Human All Exon V6（厂家：安捷伦，货号5190-8864）。
利用现有技术中其他方法或试剂盒也能够实现对于全外显子测序。
1、DNA提取
1）常温（或4℃）EDTA抗凝管中保存全血，核对样本编号和标签，将全血移入离心管中；
2）向装有全血的离心管中加入500μL裂解液，56℃孵育0.5小时；
3）将经过孵育处理的液体加入96孔板中，所有标本加入完成后，放入核酸提取室，仪器自动完成DNA提取。
2、建库
1）取提取好的DNA，稀释100倍，振荡混匀，用Qbuit精确测定浓度。
2）使用Bioruptor仪器超声打断样本。
3）DNA打断后进行检测，将样本和配制好的marker进行点胶、电泳检测，电泳条带在处于200bp-300bp位置时，进行纯化；
4）末端修复和加A。
反应体系如下表2。
表2
。
反应程序如下表3。
表3
。
5）接头连接：反应结束后将样本放置于冰上，反应体系如下表4所示：
表4
。
反应程序为20℃，30min。
6）将连接后的产物进行XP磁珠纯化，纯化后的样本进行PCR扩增，反应程序如下表5：
表5
。
7）将扩增后的产物使用XP磁珠纯化：
8）文库定量: 文库浓度应≥12.5ng/μL，否则文库视为构建失败。
9）文库杂交：取出杂交试剂和封闭试剂，配制成杂交反应体系，浓缩DNA文库，加入杂交缓冲溶液，变性后加入探针，过夜杂交。
10）捕获和洗脱杂交的文库：用XP磁珠捕获杂交文库，并进行PCR扩增，使其不断富集。
PCR运行程序如表6所示。
表6
。
扩增后的DNA文库用XP磁珠纯化：
得到文库后，使用nova 6000测序仪测序并分析；
分析最终得到NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )变异，为致病变异；在该家系成员中检测到先证者（II-1）携带NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )变异，同时具有癫痫症状的母亲（I-2）也携带这个变异，同时无症状的父亲（I-1）没有发生该变异。
三、Sanger测序：位点引物，PCR扩增，Sanger测序，一代序列图分析，采用常规方法和常规试剂进行。
设计NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )变异的引物为：
上游引物：DEPDC5-F：CCTGCAGGTATCTGTGGACC（SEQ ID NO：1）；
下游引物：DEPDC5-R：ACAGCTTCCTTTTCCTCCGG（SEQ ID NO：2）。
DNA提取同外显子测序的DNA提取；
对样本进行PCR扩增，运行程序如表7所示。
表7
。
产物大小为598bp，进行sanger测序；
比对结果如图2所示，在该家系成员中检测到先证者（II-1）携带NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* ) 变异，同时具有癫痫症状的母亲（I-2）也携带这个变异，同时无症状的父亲（I-1）没有发生该变异。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在本发明中发现了一种和FFEVF1有关的罕见变异NM_001242896.3(DEPDC5):c.3459C>G(p.Tyr1153* )，具体为DEPDC5基因3459位置C碱基突变为G碱基导致无义突变，DEPDC5基因所编码的蛋白质第1153位置氨基酸Tyr发生终止，第1153位置后续的氨基酸缺失（DEPDC5:NM_001242896.3:exon34:c.3459C>G:p.Tyr1153* ），影响蛋白的重要功能；该变异在hg19参考基因组位置为chr22:32266704。对该位点的发现丰富了致病基因突变谱，利用上述应用和/或试剂盒，对该变异的检测能够实现对家族性局灶性癫痫伴可变灶1型进行诊断。该变异位点能够作为家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的产前诊断筛查位点，也可用于群体的优生优育的指导。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.用于检测DEPDC5突变基因的试剂在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的试剂盒中的应用，其特征在于，所述DEPDC5突变基因为c.3459C>G。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括扩增所述c.3459C>G的扩增引物或捕获所述c.3459C>G的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
6.用于检测DEPDC5突变基因的探针在制备诊断或预测家族性局灶性癫痫伴可变灶1型的基因芯片中的应用，其特征在于，所述DEPDC5突变基因为c.3459C>G；
所述探针能够与所述c.3459C>G特异性结合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因芯片中的探针还包括能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针。
8.一种DEPDC5突变基因的检测试剂盒，其特征在于，所述DEPDC5突变基因为c.3459C>G。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括扩增所述c.3459C>G的扩增引物或捕获所述c.3459C>G的探针。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
11.根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。
12.一种DEPDC5突变基因的基因检测芯片，其特征在于，所述DEPDC5突变基因为c.3459C>G，所述基因检测芯片上含有能够与所述c.3459C>G特异性结合的探针。
13.根据权利要求12所述的基因检测芯片，其特征在于，所述基因检测芯片中的探针还包括能够与野生型位点c.3459C特异性结合的探针。
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