CN117987539A - 用于检测abcg8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用。其中，在上述应用中，ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。能够解决现有技术中对于谷甾醇血症1型的检测不能满足临床需求的问题，适用于ABCG8突变基因检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及ABCG8突变基因检测领域，具体而言，涉及一种用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用。
背景技术
谷甾醇血症，也称为植物甾醇血症，是一种常染色体隐性代谢疾病，其特征是肠道对胆固醇和植物衍生的胆固醇样分子（如谷甾醇）的吸收不受限制。患有这种疾病的患者血浆中植物甾醇水平非常高，并会出现肌腱和结节性黄瘤、加速动脉粥样硬化和过早冠状动脉疾病。
谷固醇血症1型，由ABCG8基因突变引起，ABCG8位于常染色体2p21，基因全长约28kb，包含13个外显子和12个内含子，编码6732个氨基酸，ABCG8蛋白含有N端ATP结合基序和ABC转运蛋白特征基序，并且预计两者的C端均含有6个跨膜片段。两者在肝脏中高度表达，并且在小肠和结肠中也可检测到。胆固醇喂养诱导小鼠中ABCG8 mRNA水平的协调增加。ABCG8通常合作限制肠道吸收并促进甾醇的胆汁排泄，并且这些转运蛋白的突变形式容易导致甾醇积累和动脉粥样硬化。
基因突变是导致谷甾醇血症1型发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊谷固醇血症1型的金标准，临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，但现有技术中对于能够导致谷甾醇血症1型的突变类型知晓的仍不全面，难以满足临床需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用，以解决现有技术中对于谷甾醇血症1型的检测不能满足临床需求的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用，上述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
进一步地，试剂盒包括扩增c.892C>T和/或c.490C>T的引物。
进一步地，扩增c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；优选地，扩增c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步地，用于检测ABCG8突变基因的试剂还包括扩增已知突变位点的引物，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT；优选地，试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种用于检测ABCG8突变基因的探针在制备检测谷固醇血症1型患者或携带者的基因芯片中的应用，上述 ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
进一步地，基因芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针；优选地，基因芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种ABCG8突变基因的检测试剂盒，该 ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
进一步地，试剂盒包括扩增c.892C>T和/或c.490C>T的引物；优选地，扩增c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；优选地，扩增c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；优选地，检测试剂盒还包括扩增已知突变位点的引物，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT；优选地，检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种ABCG8突变基因的基因检测芯片，该ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T，基因检测芯片上含有能够与c.892C>T和/或c.490C>T特异性结合的探针。
进一步地，基因检测芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针；优选地，基因检测芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
应用本发明的技术方案，将利用上述能够检测ABCG8突变基因的试剂制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒，此种试剂盒通过对受试者DNA中是否含有ABCG8突变基因、突变类型是纯合子还是杂合子，实现对于谷固醇血症1型的诊断或预测，实现对于不发病的谷固醇血症1型携带者的检测。通过检测受试者是否携带有上述突变，能够指导治疗和优生优育，为谷固醇血症1型患者的治疗提供全新的理论依据。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的家系样本的家系图谱示意图。
图2示出了根据本发明实施例1的家系成员的c.490C位点sanger测序结果图。
图3示出了根据本发明实施例1的家系成员的c.892C位点sanger测序结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，谷固醇血症1型是一种常染色体隐性遗传的疾病，基因诊断是确诊的金标准，但ABCG8基因全长较长，且现有技术中对于能够导致谷甾醇血症1型的突变类型知晓的仍不全面，难以满足临床检测和诊断的需求。不是所有无义突变都会导致该疾病，需要同时满足复合杂合或纯合的遗传条件，同时该位点ACMG评级为致病/可能致病/或与临床相符合的vus（意义未明变异）位点，才可能导致谷固醇血症1型，因此在临床中对于该种疾病的诊断存在困难。在本申请中发明人尝试探究新的能够导致谷固醇血症1型的突变，在此基础上开发能够诊断或预测谷固醇血症1型的试剂盒和探针，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用，上述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。野生型ABCG8基因的登录号为NM_022437.3。
在上述应用中，利用能够检测ABCG8突变基因的试剂制备试剂盒，利用此种试剂盒通过对ABCG8突变基因c.892C>T和/或c.490C>T进行检测，丰富了致病基因突变谱，从而实现对于谷固醇血症1型的诊断或预测。若检测结果为野生型ABCG8基因892位置C碱基突变为T碱基，此种无义突变的发生会导致ABCG8基因所编码的蛋白质第298位置氨基酸Gln发生终止，第298位置后续的氨基酸缺失（ABCG8:NM_022437.3:exon6:c.892C>T:p.Gln298*）。若检测结果为野生型ABCG8基因490位置C碱基突变为T碱基导致无义突变，ABCG8基因所编码的蛋白质第164位置氨基酸Arg发生终止，第164位置后续的氨基酸缺失（ABCG8:NM_022437.3:exon4:c.490C>T:p.Arg164*）。
谷固醇血症1型是一种常染色体隐性遗传的疾病，若受试者的一对同源染色体上的ABCG8基因均发生致病突变，两条染色体上的致病突变可以相同也可以不同，会导致谷固醇血症1型疾病。上述试剂盒中含有能够检测ABCG8突变基因c.892C>T和/或c.490C>T的试剂， c.892C>T和/或c.490C>T能够作为诊断谷固醇血症1型的生物标志物，通过检测受试者是否携带该变异，用于谷固醇血症1型的遗传学诊断、筛查和优生优育指导。
在一种优选的实施例中，试剂盒包括扩增c.892C>T和/或c.490C>T的引物。
在一种优选的实施例中，扩增c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；优选地，扩增c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述能够扩增出突变位点c.892C的扩增引物，包括但不限于以待测样本DNA为模板进行PCR扩增的引物，或以通过mRNA反转录获得的cDNA文库为模板进行PCR扩增的引物，或其他现有技术中能够检测c.892C位置基因情况的引物。上述能够捕获c.892C>T的探针包括但不限于能够特异性捕获突变DNA的探针。利用现有技术，包括但不限于测序、探针捕获或蛋白检测（检测野生型ABCG8的长度或是否存在），从而判断样本基因组中c.892C位置是C或T的试剂均可设置在上述试剂盒中。
利用上游引物和下游引物能够实现对于突变位点c.892C的PCR扩增，进一步地对于PCR产物进行测序即能够实现对于ABCG8基因中是否发生c.892C>T突变的检测，从而实现对于谷固醇血症1型的诊断或预测。
SEQ ID NO：1：ATCTCCCTCCACCAGCCTC；
SEQ ID NO：2：CCCATGTTCTTCCCCATCA。
同样地，利用能够扩增出突变位点c.490C的扩增引物，能够实现对于ABCG8基因中是否发生c.490C>T突变的检测。
SEQ ID NO：3：GAGGTCACGGCGGCAAGA；
SEQ ID NO：4：CAAGGCAGCAGGGGAGGAG。
在一种优选的实施例中，用于检测ABCG8突变基因的试剂还包括扩增已知突变位点的引物或捕获已知突变位点的探针；已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del（InDel突变）、c.64-2A>G、c.72_73delinsC（72、73位原始碱基缺失，插入C碱基）、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del（408位碱基缺失）、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C（剪切突变）、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup（InDel突变）、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT（1938、1939位原始碱基缺失，插入T碱基）。
上述已知突变位点是clinvar数据库中记载的谷固醇血症1型的致病（Pathogenic）和可能致病（Likely pathogenic）位点，在上述试剂盒中同时含有能够对上述已知突变位点的基因型进行检测的试剂，从而实现对于常染色体隐性遗传病的谷固醇血症1型的更加完善的诊断或预测。上述已知突变位点的详细信息如表1所示。
表1
。
在一种优选的实施例中，试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种用于检测ABCG8突变基因的探针在制备检测谷固醇血症1型患者或携带者的基因芯片中的应用，该ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
在一种优选的实施例中，基因芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针。
在一种优选的实施例中，基因芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
在上述基因芯片中，利用探针对c.892C>T和/或c.490C>T进行检测，能够实现对于样本中突变位点基因型的判断。进一步地，基因芯片上还分别设置有能够与一个或多种已知突变位点特异性结合的探针，实现对于已知突变位点的基因型的判断。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种ABCG8突变基因的检测试剂盒，上述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
在一种优选的实施例中，试剂盒包括扩增c.892C>T和/或c.490C>T的引物；优选地，扩增c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；优选地，扩增c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；优选地，检测试剂盒还包括扩增已知突变位点的引物，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT；优选地，检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂；优选地，用于PCR扩增的试剂包括用于提取目标DNA的试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液或镁离子中的一种或多种。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种ABCG8突变基因的基因检测芯片，上述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T，基因检测芯片上含有能够与c.892C>T和/或c.490C>T特异性结合的探针。
在一种优选的实施例中，基因检测芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针；优选地，基因检测芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，已知突变位点包括如下任意一种或多种：c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
一、依据知情同意书规则，收集家系样本，绘制家系图谱，分析遗传模式。
依据知情同意书的原则，对谷固醇血症1型患者及家系进行全血的收集和家系基本信息采集，信息如表2所示。绘制家系图谱（见图1），判断谷固醇血症1型在家族中的遗传方式。图1中，表示男性c.490C>T携带者，/>表示女性c.892C>T携带者，/>表示复合杂合c.490C>T和c.892C>T女性患者，↗ 表示先证者。
表2
。
二、全外显子测序
基因诊断DNA分析谷固醇血症1型致病基因突变，外显子测序。分别对来源于先证者、父亲和母亲的DNA样本进行处理。
本申请实施例中所用的试剂盒包括：
天根磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒（血液/组织）（厂家：天根，货号：DP705）；
DNA建库试剂盒：NEBNext® Ultra™II DNA Library Prep Kit for Illumina®（厂家：NEB，货号：Z1723L）；
全外显子捕获试剂盒：Agilent SureSelectXT Human All Exon V6（厂家：安捷伦，货号5190-8864）。
利用现有技术中其他方法或试剂盒也能够实现对于全外显子测序。
1、DNA提取
1）常温（或4℃）EDTA抗凝管中保存全血，核对样本编号和标签，将全血移入离心管中；
2）向装有全血的离心管中加入500μL裂解液，56℃孵育0.5小时；
3）将经过孵育处理的液体加入96孔板中，所有标本加入完成后，放入核酸提取室，仪器自动完成DNA提取。
2、建库
1）取提取好的DNA，稀释100倍，振荡混匀，用Qbuit精确测定浓度。
2）使用Bioruptor仪器超声打断样本。
3）DNA打断后进行检测，将样本和配制好的marker进行点胶、电泳检测，电泳条带在处于200bp-300bp位置时，进行纯化。
4）末端修复和加A。
反应体系如下表3。
表3
。
反应程序如下表4。
表4
。
5）接头连接：反应结束后将样本放置于冰上，反应体系如下表5所示。
表5
。
反应程序为20℃，30min。
6）将连接后的产物进行XP磁珠纯化，纯化后的样本进行PCR扩增，反应程序如下表6。
表6
。
7）将扩增后的产物使用XP磁珠纯化：
8）文库定量： 文库浓度应≥12.5ng/μL，否则文库视为构建失败。
9）文库杂交：取出杂交试剂和封闭试剂，配制成杂交反应体系，浓缩DNA文库，加入杂交缓冲溶液，变性后加入探针，过夜杂交。
10）捕获和洗脱杂交的文库：用XP磁珠捕获杂交文库，并进行PCR扩增，使其不断富集。
PCR运行程序如下表7。
表7
。
11）扩增后的DNA文库用XP磁珠纯化：
12）用Qubit准确定量文库浓度，稀释文库，送库检。
三、Sanger测序：
1、设计NM_022437.3(ABCG8)：c.892C>T(p.Gln298*)变异的引物为：
引物：
ABCG8-c.892C>T-正向引物：ATCTCCCTCCACCAGCCTC（SEQ ID NO：1），
ABCG8-c.892C>T-反向引物：CCCATGTTCTTCCCCATCA（SEQ ID NO：2）。
设计NM_022437.3(ABCG8)：c.490C>T(p.Arg164*)变异的引物为：
引物：
ABCG8-c.490C>T-正向引物：GAGGTCACGGCGGCAAGA（SEQ ID NO：3），
ABCG8-c.490C>T-反向引物：CAAGGCAGCAGGGGAGGAG（SEQ ID NO：4）。
2、DNA提取同外显子测序的DNA提取；
3、对样本进行PCR扩增，运行表8所示程序。
表8
。
4、产物大小分别为272bp和292bp，进行sanger测序，测序结果如图2和图3所示；
c.490C>T sanger测序图如图2所示，c.892C>T sanger测序图如图3所示。
5、比对测序结果，在该家系成员中检测到先证者（II 2）携带NM_022437.3(ABCG8)：c.490C>T(p.Arg164*)杂合变异和NM_022437.3(ABCG8)：c.892C>T(p.Gln298*)，
父亲（I 1）携带NM_022437.3(ABCG8)：c.490C>T(p.Arg164*)杂合变异，
母亲（I 2）携带NM_022437.3(ABCG8)：c.892C>T(p.Gln298*)杂合变异。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在本发明中发现了和谷固醇血症1型有关的突变c.892C>T和c.490C>T，均能导致无义突变，影响ABCG8蛋白功能。对上述2个位点的发现丰富了致病基因谱，利用上述应用、试剂盒或探针，能够实现对于谷固醇血症1型患者的检测诊断，以及对此种常染色体隐性遗传病的携带者的检测。丰富了致病基因突变谱，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断谷固醇血症1型的遗传学诊断，可作为谷固醇血症1型的产前诊断筛查位点，也能够用于优生优育的筛查检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.用于检测ABCG8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括扩增所述c.892C>T和/或所述c.490C>T的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，扩增所述c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
扩增所述c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测ABCG8突变基因的试剂还包括扩增已知突变位点的引物，所述已知突变位点包括如下任意一种或多种：
c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。
6.用于检测ABCG8突变基因的探针在制备检测谷固醇血症1型患者或携带者的基因芯片中的应用，其特征在于，所述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述基因芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，所述已知突变位点包括如下任意一种或多种：
c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
9.一种ABCG8突变基因的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T，所述试剂盒包括扩增所述c.892C>T和/或所述c.490C>T的引物。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，扩增所述c.892C>T的引物包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
扩增所述c.490C>T的引物包括第二上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
11.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括扩增已知突变位点的引物，所述已知突变位点包括如下任意一种或多种：
c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。
13.一种ABCG8突变基因的基因检测芯片，其特征在于，所述ABCG8突变基因包括c.892C>T和/或c.490C>T，所述基因检测芯片上含有能够与所述c.892C>T和/或所述c.490C>T特异性结合的探针。
14.根据权利要求13所述的基因检测芯片，其特征在于，所述基因检测芯片中的探针还包括分别能够与野生型位点c.892C和/或c.490C特异性结合的探针。
15.根据权利要求13或14所述的基因检测芯片，其特征在于，所述基因检测芯片中的探针还能够与已知突变位点的引物或特异性结合，所述已知突变位点包括如下任意一种或多种：
c.2T>C、c.3G>T、c.63_63+53del、c.64-2A>G、c.72_73delinsC、c.120C>A、c.196G>T、c.295C>T、c.320C>G、c.361C>T、c.386C>A、c.408del、c.490C>T、c.547del、c.562-1G>C、c.562-1G>A、c.641del、c.647del、c.647_657dup、c.687G>A、c.691C>A、c.751del、c.811C>T、c.881T>G、c.904C>T、c.964+1G>T、c.965-1G>C、c.965-1G>A、c.1083G>A、c.1213C>T、c.1234C>T、c.1288del、c.1405_1406del、c.1411+1G>T、c.1412-2A>G、c.1444del、c.1476T>A、c.1488+2T>G、c.1608G>A、c.1709_1711del、c.1720G>A、c.1752G>A、c.1756+2T>A、c.1757-2A>G、c.1787T>G、c.1938_1939delinsT。
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