CN117987419A - 核酸适配体、传感器、检测试剂盒及其在检测四氢叶酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了核酸适配体、传感器、检测试剂盒及其在检测四氢叶酸中的应用。本发明利用指数级富集配体的系统进化技术，以磁珠为分离介质以及以四氢叶酸为靶标，通过9轮筛选获得与靶标特异结合的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核酸适配体，该核酸适配体与四氢叶酸亲和力极高，解离常数达到μM，对四氢叶酸的主要干扰物质叶酸和五甲基四氢叶酸不能进行结合，只特异性结合四氢叶酸，具有良好的亲和力和特异性；本发明提供的核酸适配体可人工合成、成本低、生产周期短、易于化学修饰，可将该适核酸配体制备成传感器、分子探针或检测试剂等用于生物样本中四氢叶酸的检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸适配体，尤其涉及特异识别四氢叶酸的核酸适配体以及含有该核酸适配体的传感器、检测探针或检测试剂盒及其在检测四氢叶酸中的应用，属于核酸适配体及其应用领域。
背景技术
四氢叶酸（THF)是叶酸在体内的活性形态之一，是一碳基团转移酶的辅酶，具有传递一碳基团的作用，是许多生物合成反应所必需的辅酶。若生物体内缺乏四氢叶酸，会使多种生物合成反应受阻，最典型的表现为血红细胞的发育和成熟受到影响，易发生巨幼红细胞性贫血症等。因此，在生物组织中监测THF，对早期疾病的发生有重要作用。
目前，检测叶酸及其活性形态的主要检测方法是采用高效液相质谱（HPLC-MS）法，联用技术基于高效液相质谱法检测，但是其成本高，操作复杂，很大程度限制了其在检测行业的广泛应用。市场上销售的快速检测试剂盒，多针对叶酸受体进行检测，几乎未见针对叶酸或者四氢叶酸直接检测的试剂盒。鉴于目前四氢叶酸检测难度大、成本高等问题，因此，发展一种新型识别分子，对生物样品中四氢叶酸含量测定具有重要的实践意义，可进一步开发四氢叶酸快速检测方法，如试剂盒等。
核酸适配体（Aptamer）是一种新型识别分子，近几年来得到广泛关注。核酸适配体能通过折叠成二级或三级结构，与靶标分子以氢键作用和形状匹配等作用方式高效结合，靶标包括，小分子、抗生素、蛋白、金属离子等。具有亲和力高，特异性好，易合成等优点，是一种理想的识别分子，可广泛应用于分析检测领域。
迄今为止，未有特异性识别四氢叶酸核酸适配体的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供特异性识别四氢叶酸的核酸适配体；
本发明的目的之二是提供含有所述特异性识别四氢叶酸的核酸适配体的传感器或检测试剂盒；
本发明的目的之三将所述的识别四氢叶酸的核酸适配体应用于检测生物样品中的四氢叶酸。
为实现上述的目的，本发明所采取的主要技术方案包括：
本发明的一方面是提供识别四氢叶酸的核酸适配体，所述的核酸适配体选自以下(a)-(d)所述的任何一种多核苷酸序列：
(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；
或(c)由SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列转录的RNA序列；
或(d)与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；优选的，与SEQID No.1的多核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；更优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸。
本发明的一种优选的具体实施方案，所述核酸适配体的核苷酸序列可被修饰，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化修饰；或者，所述核酸适配体的序列的5’端或3’端连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶等。
本发明的另一方面是提供一种检测四氢叶酸的核酸适配体传感器，该核酸适配体传感器包括PCR引物、特异结合四氢叶酸的核酸适配体；所述的特异结合四氢叶酸的核酸适配体是本发明所筛选得到的核酸适配体，其中，在所述的核酸适配体的5’端或3’端修饰荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶等。
本发明的再一方面是一种检测四氢叶酸的试剂盒，该试剂盒包括：PCR管修饰溶液，PCR体系溶液，特异结合四氢叶酸的核酸适配体；其中，上述的特异结合四氢叶酸的核酸适配体的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述的PCR体系溶液可以为商购DNA聚合酶时所带的反应液，也可以为根据反应原理配制而成的反应液，其中包括以下组分：SYBR Green染料，Taq DNA 聚合酶，PCR缓冲液，dNTP和水。
本发明利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)，以磁珠为分离介质，以四氢叶酸（THF）为靶标，通过9轮筛选获得与靶标特异结合的适配体，亲和力极高，解离常数达到μM,，能特异性结合THF小分子；本发明所筛选获得的核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，成本低、生产周期短，易于化学修饰，可将该适配体制备成传感器、分子探针或检测试剂等用于食品中THF小分子的快速检测。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85%或更高，更优选地90%或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍）。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（Tm）约5-10℃。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、pH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 M钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×SSC和1% SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1% SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
附图说明
图1为本发明筛选得到的核酸适配体（SEQ IDNo.1）与四氢叶酸（THF）小分子亲和力检测ITC数据图及K值。
图2 为本发明筛选得到的核酸适配体（SEQ IDNo.1）与干扰物叶酸（FA）和五甲基四氢叶酸（5-mTHF）小分子亲和力检测数据图；A：采用ITC 对SEQ IDNo.1与干扰物FA小分子的亲和力检测结果；B：采用ITC 对SEQ IDNo.1与干扰物5-mTHF小分子的亲和力检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料和仪器：
1.SA磁珠
2.DPBS
3.Q-PCRmix：
表1 Q-PCRmix反应体系
4. PCRmix（制备ssDNA所用）
表2 PCRmix反应体系
5. 8%变性PAGE胶
6. 标签引物PCRmix；
lib3文库标签引物PCRmix
表3 PCRmix反应体系
7. 各轮筛选所得pool ；
8. UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒（上海生工）；
9. 无水乙醇；
10. DNA marker；
11. 10*变性 DNA loading buffer；
12. 4S Red Plus 核酸染色剂（10,000 X 水溶液）；
13. TAE溶液；
14. 5-甲基四氢叶酸（THF）；
15. 20*PBS；
16. 超纯水；
17. Bio-rad荧光定量PCR仪；
18. Bio-rad T100普通PCR仪；
19. Bio-radPowerPac Basic 电泳仪；
20. ITC 200。
试验例1 四氢叶酸核酸适配体的筛选
1试验方法
1.1 合成随机单链DNA(ssDNA)文库和引物
随机单链DNA(ssDNA) Lib2-76nt 文库为：引物区序列+58nt随机序列+引物区序列，可变区碱基序列58个，两端引物区序列碱基数为 20 个：
5’-GGGACCAGCACACGCATAAC-N36-GAGTTATGCGTGCTACCGTG -3’ (SEQ ID No.2)；
上游引物： 5’-FAM- GGGACCAGCACACGCATAAC -3’ (SEQ ID No.3)，
下游引物： 5’- 15A-spacer 18-CACGGTAGCACGCATAACGC -3’ (SEQ ID No.4)，
其中，下游引物中，15A表示由15个腺苷酸（A）组成的polyA尾，Spacer 18表示18原子的六乙二醇间臂，以上文库均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
文库的固定和筛选
(1)、取1OD文库（pool0，lib3-76nt）干粉，12000g离心10min。加入137μL DPBS涡旋溶解后，12000g再次离心10min。
(2)、向溶解好的pool中加入lib1S1CS-biotin引物205.5μL*10uM,离心混匀分装到PCR管中，分装到PCR 8联排中，PCR仪变复性，95℃10min，57℃1min，最后降温至25℃（速率0.1℃降温）。UV测定文库与biotin修饰引物混合物的浓度即为C1。
(3)、吸取1500μL SA磁珠，200μL DPBS清洗磁珠5次，最后一遍是暂时将磁珠保存于缓冲液中。
(4)、将变复性好的文库加入磁珠中，室温摇晃30min。磁铁垂钓磁珠，去上清，UV测定上清浓度为C2。
(5)、200μLDPBS加入磁珠中，进行漂洗，总共洗6遍。
(6)、取100μLDPBS加入到上步SA磁珠中，摇床孵育30min，磁铁垂钓磁珠，吸取上清Elution到EP管中，用100μL DPBS 清洗磁珠一次，加入到Elution EP管中，记为 Elution-。
(7)、将小分子靶标(四氢叶酸，用DPBS溶解成1mM*100μL)，加入到上步SA磁珠中，摇床孵育30min。磁铁垂钓磁珠，吸取上清Elution到EP管中，用100μL DPBS 清洗磁珠一次，加入到Elution EP管中，记为Elution+。
(8)、取八联管，每孔加入30μL mix，将elution-和elution+各取1μL用DPBS稀释10倍后，各取1μL加入到mix中，离心混匀。荧光定量PCR检测。
1.3 制备单链
(1)、将2ml ePCR mix从-20℃拿出，加入到剩下的Elution+中，转移到50ml离心管中混匀。
(2)、加入8ml EM90 油，放在大功率涡旋振荡器上振荡，制备乳浊液。
(3)、将乳浊液分装到PCR管，每管90μL，PCR 25循环。程序为：95℃ 2min；95℃1min，60℃ 1min，72℃ 1min，25循环。
(4)、回收ePCR产物。
(5)、正丁醇浓缩ePCR产物，将ePCR产物转移到10ml离心管中，加正丁醇加满，混匀，离心10000g*2min。离心后，分层，吸除上层清澈液，将下层扩增产物转移到小EP管中（约100μL)。取90μL转移至小离心管，加入100μL Urea loading buffer混匀，PCR仪95度加热10min。
(6)、变性PAGE电泳分离单链(电泳，切胶，煮胶)。
(7)、正丁醇浓缩ssDNA。
(8)、3.5KD透析袋，DPBS 过夜透析ssDNA,微量紫外测定浓度。
1.4 重复进行第二轮至第九轮。
1.5 Q-PCR检测文库亲和力实验
(1)、将pool1用DPBS稀释成500nM*100μL,各加入lib1S1CS-biotin引物10μL*10uM,离心混匀分装到PCR管中。分装到PCR 8联排中，PCR仪变复性，95℃10min，57℃1min，最后降温至25℃（速率0.1℃降温）。UV测定文库与biotin修饰引物混合物的浓度分别为C1-2。
(2)、吸取100μL SA磁珠，200μL DPBS清洗磁珠5次，最后一遍是暂时将磁珠保存于buffer中，不让其干了。
(3)、将变复性好的文库分别加入到100μL磁珠中，室温摇晃30min。磁铁垂钓磁珠，去上清，UV测定上清浓度分别为C2-1。
(4)、200μLDPBS加入磁珠中，进行漂洗，总共洗6遍。
(5)、取200μLDPBS加入到上步SA磁珠中，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。
(6)、将磁珠分成两等份，其中一份加入200μLDPBS，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中。记为 elution1-。另外一份加入200μL 1mM 的THF,摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中，记为 elution1+。
(7)、将pool6用DPBS稀释成500nM*100μL,各加入lib1S1CS-biotin引物10μL*10uM,离心混匀分装到PCR管中。分装到PCR 8联排中，PCR仪变复性，95℃10min，57℃1min，最后降温至25℃（速率0.1℃降温）。UV测定文库与biotin修饰引物混合物的浓度分别为C1-2。
(8)、吸取100μL SA磁珠，200μL DPBS清洗磁珠5次，最后一遍是暂时将磁珠保存于buffer中，不让其干了。
(9)、将变复性好的文库分别加入到100μL磁珠中，室温摇晃30min。磁铁垂钓磁珠，去上清，UV测定上清浓度分别为C2-2。
(10)、200μLDPBS加入磁珠中，进行漂洗，总共洗6遍。
(11)、取200μLDPBS加入到上步SA磁珠中，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。
(12)、将磁珠分成两等份，其中一份加入200μLDPBS，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中，记为 elution6-。另外一份加入200μL 1mM 的THF,摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中，记为 elution6+。
(13)、将pool9用DPBS稀释成500nM*100μL,各加入lib1S1CS-biotin引物10μL*10uM,离心混匀分装到PCR管中。分装到PCR 8联排中，PCR仪变复性，95℃10min，57℃1min，最后降温至25℃（速率0.1℃降温）。UV测定文库与biotin修饰引物混合物的浓度分别为C1-3。
(14)、吸取100μL SA磁珠，200μL DPBS清洗磁珠5次，最后一遍是暂时将磁珠保存于缓冲液中，不让其干了。
(15)、将变复性好的文库分别加入到100μL磁珠中，室温摇晃30min。磁铁垂钓磁珠，去上清，UV测定上清浓度分别为C2-3。
(16)、200μLDPBS加入磁珠中，进行漂洗，总共洗6遍。
(17)、取200μLDPBS加入到上步SA磁珠中，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。
(18)、将磁珠分成两等份，其中一份加入200μLDPBS，摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中。记为 elution9-。另外一份加入200μL 1mM 的THF,摇床孵育20min，磁铁垂钓磁珠。吸取上清Elution到EP管中，记为 elution9+。
(19)、取8联管，每孔加入30μL mix，elution-和elution+各取1μL加入到mix中，离心混匀，进行荧光定量PCR检测。
、试验结果
本试验利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)，以磁珠为分离介质，四氢叶酸（THF）为靶标，通过9轮筛选最终筛选得到能够特异性识别THF的小分子核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如下所示：
5’-CACGCATAACCGTCCCTGTCGGTTATGTGTGGGCTGTGCGGGAGTTGAGTTATGCGT G-3’（SEQID No .1）。
试验例2 ITC检测THF小分子与筛选得到ssDNA核酸适配体亲和力试验
采用ITCT200仪器对试验例1所筛选到的识别THF的小分子ssDNA核酸适配体（SEQID No .1）进行亲和力检测，具体检测方法如下：
1、样品准备：将THF用PBS稀释到1mM；将合成的核酸适配体（SEQ ID No .1）离心完毕后加入PBS溶解于10uM。
2、仪器清洗过程：分别用超纯水和PBS缓冲溶液清洗样品池和滴定针各5min，为避免残留，清洗完之后再干燥1-2min；
3、小分子滴缓冲液：重复上述仪器清洗过程，将样品池加入PBS缓冲溶液，滴定针中加入1mM靶标THF，进行小分子滴定缓冲液，共20滴，热量与水滴水没有明显差异；
4、THF滴核酸适配体：重复上述清洗过程，将样品池加入20uM核酸适配体（SEQ IDNo .1），滴定针中加入1mM靶标THF，开始进行滴定，共20滴；
5、仪器计算给出K值；
6、THF小分子ssDNA核酸适配体亲和力用解离常数Kd表示，Kd=1/K。
最终测定的与THF特异性结合的小分子ssDNA核酸适配体（SEQ ID No .1）解离常数Kd=0.1908 e-6 ± 0.04878 e-6 M（图1）；测定结果表明，本发明试验例1所筛选得到的小分子ssDNA核酸适配体（SEQ ID No .1）与THF具有优异的亲和力。
试验例3 THF小分子ssDNA核酸适配体特异性验证试验
采用与试验例2相同的ITC技术，对试验例1所筛选的小分子ssDNA核酸适配体（SEQID No .1）进行特异性验证。
使用同一核酸适配体（SEQ ID No .1）对THF的主要干扰物质叶酸(FA)和五甲基四氢叶酸（5-mTHF）进行反向筛选，试验结果表明，该核酸适配体对叶酸(FA)和五甲基四氢叶酸（5-mTHF）ITC滴定结果与水类似，无法拟合出解离常数Kd值（图2），说明该核酸适配体对FA和5-mTHF无亲和力，同时反向说明该核酸适配体能特异性识别小分子THF。
试验例4应用ssDNA核酸适配体检测生物样品中THF的检测试验
应用试验例1所筛选到的识别THF的小分子ssDNA核酸适配体（SEQ ID No .1）结合被金纳米粒子修饰的ITO电极，通过CHI660E电化学工作站对样品中THF进行电化学传感检测，具体检测方法如下：
1.电化学传感器准备：通过离子注入的方式使金纳米粒子均匀喷射到ITO电极表面（电压：10keV；注入剂量：1 × 1017ions cm﹣2；离子束流量：0.6mA），再经过300℃退火2h，得到退火后的金纳米粒子修饰的ITO电极（T-Au-ITO）；
2.核酸适配体修饰过程：分别用超纯水和无水乙醇清洗电极片（T-Au-ITO），将清洗后的电极片置于200nM的核酸适配体（SEQ ID No .1）溶液中并放在振荡器上振荡，振荡器设置为300rpm，24±2 ℃，孵育8h；取经过孵育8h的电极，使用5%的SDS溶液和PBS缓冲溶液分别冲洗三次，氮气吹干待用；
3.血清样品准备过程：采集经过富叶酸日粮饲养的海兰褐鸡的血液，离心后获得血清，血清储存于-80℃冰箱；使用前将血清样品放入4℃冰箱中解冻1天，然后移入室温，3mL血清溶解于27mLPBS缓冲溶液（0.01M，pH=7.4）中，振荡混合2min，得到稀释10倍的血清，用于电化学检测。
4.电化学传感检测过程：经过核酸适配体（SEQ ID No .1）修饰后的电极片作为工作电极，银-氯化银电极作为参比电极，铂电极作为对电极，在三电极体系下通过CHI660E电化学工作站对待测样品溶液进行电化学检测。
5.电化学传感检测方法确定：选择循环伏安法（CV）作为检测方法，扫描电位从0.2V到1.2V，扫描速率为100mV/s;
最终检测结果证明试验例1所筛选到的识别THF的小分子ssDNA核酸适配体（SEQID No .1）成功修饰在ITO电极上，通过电化学传感检测方法，基于核酸适配体（SEQ ID No.1）的电化学传感器对THF的检测范围从1 pM可达100 nM，检测限为1 pM；实际应用于鸡血清样品中THF的检测，发现饲喂叶酸后的鸡血清中的THF含量范围在55.29 ng/mL-94.62ng/mL。
Claims (10)
1.特异性识别四氢叶酸的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体选自以下(a)-(d)所述的任何一种核苷酸序列：
(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸；
或(c)由SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列转录的RNA序列；
或(d)与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的多核苷酸序列与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有80%以上同源性，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的多核苷酸序列与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性，且该多核苷酸序列仍能特异性结合四氢叶酸。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的核酸适配体，其特征在于，将所述核酸适配体序列进行修饰，其中，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化修饰；或者所述的修饰的方式是将所述核酸适配体的序列的5’端或3’端连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶。
5.一种检测四氢叶酸的核酸适配体传感器，该核酸适配体传感器包括PCR引物以及特异结合四氢叶酸的核酸适配体；其特征在于，所述的特异结合四氢叶酸的核酸适配体是权利要求1-3任何一项所述的核酸适配体。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体传感器，其特征在于，将所述核酸适配体的核苷酸序列进行修饰，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化修饰；或者所述的修饰的方式是将所述核酸适配体的序列的5’端或3’端连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶。
7.一种检测四氢叶酸的试剂盒，该试剂盒包括PCR管修饰溶液，PCR体系溶液和核酸适配体；其特征在于，所述的核酸适配体是权利要求1-3任何一项所述的核酸适配体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，将所述核酸适配体的核苷酸序列进行修饰，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化修饰；或者所述的修饰是将所述核酸适配体的核苷酸序列的5’端或3’端连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶。
9.权利要求1-3任何一项所述的核酸适配体在检测四氢叶酸中的应用。
10.权利要求5所述的核酸适配体传感器或权利要求7所述的试剂盒在检测四氢叶酸中的应用。
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