CN117969850A - 一种液态肌红蛋白校准品稀释液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学检验技术领域，具体涉及一种液态肌红蛋白校准品稀释液及制备方法，包括称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液；称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解；完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液；在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液，解决了现有的校准品中含有的蛋白酶抑制剂具有毒性，危害健康，不宜大量使用的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其涉及一种液态肌红蛋白校准品稀释液及制备方法。
背景技术
肌红蛋白(MYO)是一种17.8KD的小分子蛋白质，由珠蛋白与正铁血红素(Heme)结合而成，其分子结构与血红蛋白相似，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。当心肌或横纹肌有损伤时，肌红蛋白由于细胞膜的破裂而被释放到血管系统，血清中的肌红蛋白即可明显升高。肌红蛋白是目前能最快地反映心肌坏死的生物标志。相比于乳酸脱氢酶(130KD)等酶，肌红蛋白的分子量较小，因此能更快地融入血循环。测定肌红蛋白可作为早期诊断心肌梗死的指标。肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、肌红蛋白(MYO)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)联合检测可对急性心肌梗死(AMI)进行早期诊断。
目前，临床实验室测定肌红蛋白(MYO)方法主要是免疫学方法，如荧光免疫层析法及磁微粒化学发光法。这两种方法在定量检测肌红蛋白(MYO)的过程中，需要用到肌红蛋白校准品及质控品。但肌红蛋白校准品、质控品极易降解，保存困难。目前，国外体外诊断试剂生产企业研发的肌红蛋白校准品多数为冻干品，冻干校准品存在以下缺点：生产工艺复杂，增加企业生产成本；使用前需要手动复溶，给操作带来不便；复溶过程中操作者操作误差可能对准确度带来影响，导致检测结果出现偏差；且复溶后校准品不易保存。采用加入蛋白酶抑制剂的方法也能有效缓解肌红蛋白的降解过程，在破碎细胞提取肌红蛋白的同时，去抑制蛋白酶的释放，从而保持蛋白质不被降解，该操作较为简便，但蛋白酶抑制剂普遍具有毒性，危害健康，不宜大量使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液态肌红蛋白校准品稀释液及制备方法，旨在解决现有的校准品中含有的蛋白酶抑制剂具有毒性，危害健康，不宜大量使用的问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，包括以下步骤：
称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液；
称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解；
完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液；
在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
其中，所述称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液，包括：
称取Tris 10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L和氯化钠1.8％，并在25±5℃温度条件下，用配制量为80％的纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解，然后用6mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值在7.4±0.1范围内，得到溶解液。
其中，所述称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解，包括：
称取蔗糖、甘露醇10-20g/L和牛血清白蛋白20-50g/L加入所述溶解液中进行溶解。
其中，所述完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液，包括：
完全溶解后加入蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％和防腐剂0.3％搅拌混匀，得到混合液。
其中，所述在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液，包括：
在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀10分钟后，静置30分钟后用0.2μm～0.8μm孔径尼龙滤膜过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
第二方面，本发明提供了一种液态肌红蛋白校准品稀释液，包括Tris10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇10-20g/L、牛血清白蛋白20-50g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％-0.1％、防腐剂0.3％和纯化水。
其中，非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80和Triton X-100中的任意一种；
防腐剂为Proclin-300(PC-300)、Proclin-950(PC-950)、KroVin-300(KV-300)和KroVin-400(KV-400)中的任意一种。
本发明的一种液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，通过称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液；称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解；完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液；在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液，本发明中的液态肌红蛋白校准品稀释液，校准品/质控品不需要做冻干处理，在液态条件下也可以长期保存，稳定性良好，在满足简化生产工序、降低成本的生产企业要求的同时，对人体无危害风险。解决了现有的校准品中含有的蛋白酶抑制剂具有毒性，危害健康，不宜大量使用的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是肌红蛋白临床相关性图。
图2是本发明提供的一种液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1至图2，第一方面，本发明提供一种液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，包括以下步骤：
S1称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液；
具体的，称取Tris 10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L和氯化钠1.8％，并在25±5℃温度条件下，用配制量为80％的纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解，然后用6mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值在7.4±0.1范围内，得到溶解液。
S2称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解；
具体的，称取蔗糖、甘露醇10-20g/L和牛血清白蛋白20-50g/L加入所述溶解液中进行溶解。
S3完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液；
具体的，完全溶解后加入蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％和防腐剂0.3％搅拌混匀，得到混合液。
S4在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
具体的，在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀10分钟后，静置30分钟后用0.2μm～0.8μm孔径尼龙滤膜过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
试验目的
验证使用MYO稀释液配制的肌红蛋白样本的稳定性。
实验材料
优利特肌红蛋白测定试剂盒(磁微粒化学发光法)，底物液，清洗液，优利特系列全自动化学发光免疫分析仪IA-260，肌红蛋白抗原，2-8℃冰箱，37℃烘箱。
测试方法
加速稳定性实验：使用MYO稀释液与含0.1％BSA的PBS溶液分别配制不同浓度的肌红蛋白样本(S1-S3)，将其分装后分别放置在2-8℃冰箱及37℃烘箱保存7天后，使用化学发光免疫分析仪分别测定其发光值并计算相对偏差。结果见表1。
表1：肌红蛋白样本在2-8℃/37℃保存7天后的信号保留率
计算方法：
实施例1使用以下稀释液配制MYO校准品，并进行加速稳定性实验
A、Tris 10.9/L、MES11.0/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇10g/L、牛血清白蛋白(BSA)50g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.05％、Tween-200.05％、PC-3000.3％、纯化水，调节稀释液pH值在7.4±0.1范围内。
B、Tris 12.1g/L、MES10.0/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇15g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.1％、Triton X-1000.05％、PC-9500.3％、纯化水，调节稀释液pH值在7.4±0.1范围内。
C、Tris 13.3g/L、MES 9.0/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇20g/L、牛血清白蛋白(BSA)35g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.1％、Tween-800.1％、KV-3000.3％、纯化水，调节稀释液pH值在7.4±0.1范围内。
D、Tris 10.9/L、MES11.0/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇10g/L、牛血清白蛋白(BSA)50g/L、Tween-200.05％、PC-3000.3％、纯化水，调节稀释液pH值在7.4±0.1范围内。
E、Tris 12.1g/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇15g/L、鱼明胶10g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.05％、PC-9500.3％、纯化水，调节稀释液pH值在7.4±0.1范围内。
使用上面配制的稀释液A-E分别加入不同质量的肌红蛋白抗原配制成对应的六种浓度梯度的校准品(称作S0、S1～S5)。
检测结果比较
加速稳定性实验
各取一套实施例1配制的校准品在37℃条件下放置7天，与相应在2-8℃保存的标准品比较，考核其稳定性降幅，结果见表2。
表2：MYO校准品2～8℃/37℃处理7天的稳定性比较
实验结论：根据表2，从稀释液A、B、C和D的对比结果分析，肌红蛋白在添加了蛋白稳定剂Prionex的稀释液中，在37℃条件下加速7天，发光值信号保留率在90-110％内，而在E中将牛血清白蛋白替换成鱼明胶，发光值信号保留率只有60％-70％，其稳定性不如A、B、C好，说明不同基质的蛋白对肌红蛋白的稳定性有所影响；从A、B、C的结果来看，稀释液中的蛋白稳定剂Prionex含量>0.05％,牛血清白蛋白(BSA)在20-50g/L，再加入蔗糖、甘露醇和非离子表面活性剂，能有效增强肌红蛋白抗原在液态状态下的稳定性。
长期稳定性实验
对本发明校准品在2-8℃条件下放置18个月的实时稳定性进行考核，其稳定性考核结果如表3所示。
表3：MYO校准品2-8℃0、3、6、12、15、18个月的稳定性结果
实验结论：将MYO校准品放在2-8℃贮存温度下保存18个月的贮存稳定性实验中，校准品外观无明显变化，2至8℃时15个月的偏差均在±10％以内。
肌红蛋白校准品的临床相关性验证
在MYO稀释液加入校准所需浓度的肌红蛋白配制成肌红蛋白校准品。使用上述肌红蛋白校准品为检测体系定标，测试100例临床样本，采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为X轴，以校准品发光强度对数值为Y轴，建立定标曲线。根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值；再以市售的罗氏肌红蛋白检测试剂盒测试该100例样本。两组结果进行比对，比对结果如图1所示。结果显示两组数据线性相关系数R2大于0.99，表明本发明的稀释液配制液态MYO校准品在临床测试结果上具有良好相关性。
第二方面，本发明提供了一种液态肌红蛋白校准品稀释液，包括Tris10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇10-20g/L、牛血清白蛋白20-50g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％-0.1％、防腐剂0.3％和纯化水。
具体的，非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80和Triton X-100中的任意一种；防腐剂为Proclin-300(PC-300)、Proclin-950(PC-950)、KroVin-300(KV-300)和KroVin-400(KV-400)中的任意一种。
有益效果
1、本发明提供的稀释液能够提高肌红蛋白校准品在液态条件下的稳定性，在37℃条件下放置7天，信号保留率在90％-110％之间。
2、性能稳定、成本低廉，稀释液所用成分安全，用其配制的肌红蛋白校准品存取使用方便。
3、肌红蛋白校准品可在2℃-8℃避光密封条件下长时间储存，无须冻存，避免反复冻融造成的变性。
4、本发明在提供的MYO稀释液中添加牛血清白蛋白及蛋白稳定剂Prionex能够有效维持肌红蛋白的稳定性，同时添加蔗糖、甘露醇、非离子表面活性剂能够进一步提高其在液态条件下的稳定性。
以上所揭露的仅为本发明一种液态肌红蛋白校准品稀释液及制备方法较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (7)
1.一种液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液；
称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解；
完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液；
在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
2.如权利要求1所述的液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，其特征在于，
所述称取Tris、MES和氯化钠，并在预设温度条件下采用纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解后调节pH值至预设范围，得到溶解液，包括：
称取Tris 10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L和氯化钠1.8％，并在25±5℃温度条件下，用配制量为80％的纯化水对所述Tris、所述MES和所述氯化钠进行逐一溶解，然后用6mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值在7.4±0.1范围内，得到溶解液。
3.如权利要求1所述的液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，其特征在于，所述称取蔗糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入所述溶解液中进行溶解，包括：
称取蔗糖、甘露醇10-20g/L和牛血清白蛋白20-50g/L加入所述溶解液中进行溶解。
4.如权利要求1所述的液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，其特征在于，
所述完全溶解后加入蛋白稳定剂、非离子表面活性剂和防腐剂，搅拌混匀，得到混合液，包括：
完全溶解后加入蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％和防腐剂0.3％搅拌混匀，得到混合液。
5.如权利要求1所述的液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法，其特征在于，
所述在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀后静置，然后过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液，包括：
在所述混合液中加纯化水定容至稀释液总配制量，搅拌混匀10分钟后，静置30分钟后用0.2μm～0.8μm孔径尼龙滤膜过滤，得到液态肌红蛋白校准品稀释液。
6.一种液态肌红蛋白校准品稀释液，采用权利要求1所述的液态肌红蛋白校准品稀释液制备方法进行制备，其特征在于，
包括Tris 10.9-13.3g/L、MES 9.0-11.0g/L、氯化钠1.8％、蔗糖、甘露醇10-20g/L、牛血清白蛋白20-50g/L、蛋白稳定剂Prionex 0.05％-0.1％、非离子表面活性剂0.05％-0.1％、防腐剂0.3％和纯化水。
7.如权利要求6所述的液态肌红蛋白校准品稀释液，其特征在于，
非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80和TritonX-100中的任意一种；
防腐剂为Proclin-300(PC-300)、Proclin-950(PC-950)、KroVin-300(KV-300)和KroVin-400(KV-400)中的任意一种。
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