CN117964671A - 一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从三七茎叶中提取、制备高纯度人参黄酮苷的方法。该方法的具体步骤为：三七干燥茎叶粗粉碎后，高醇提取，经大孔吸附树脂和硅胶柱层析得人参黄酮苷粗品。粗品通过创新的聚酰胺和反相色谱材料混装色谱柱，一次柱层析即可兼顾聚酰胺的氢键吸附和反相材料的层析纯化功能制备高纯度人参黄酮苷（纯度大于95%）。本发明工艺简便可行，转移率高，能稳定获得高纯度的人参黄酮苷，可实现大批量制备和工业化生产，且所用溶剂易回收、可重复使用，成本较低，对环境污染小，所得最终产物基本不含有机溶剂残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种从三七茎叶中提取、制备高纯度人参黄酮苷的方法。
背景技术
三七[Panax notoginseng (Buck.) FH. Chen]为五加科（Araliaccac）人参属（Panax）多年生植物。三七最早载于《本草纲目》，以根入药，性温，味辛，具活血化瘀、消肿止痛之功效，是治疗跌打损伤之主要药物，素有“金不换”、“南国神药”等美誉，根茎和肉质根为名贵之中药，是我国最早的药食同源的植物之一。三七作为血塞通、片仔癀、复方丹参滴丸等中药制剂的主要原料，是中药市场上销售额最大的品种之一。三七是云南最著名的道地中药材，其自适应能力低，对生长环境要求苛刻，主要分布于西南地区。虽然已有大量的人工种植，但是对三七的研究开发主要集中于地下部分。据《本草纲目》记载：“三七叶，治折伤、跌朴出血，敷之即止，青肿经夜即散，余功同根”，说明传统用药的三七茎叶的功效与其根部相似。
三七茎叶中主要有皂苷和黄酮苷类成分，总皂苷占总成分的4%~6%，富含维生素、氨基酸和多糖等营养元素。与三七其他部位相比，三七茎叶中黄酮类含量较高，两种主要的黄酮类成分人参黄酮苷[山柰酚-3-O-葡糖基(1→2)半乳糖苷]和槲皮素-3-O-葡糖基(1→2)半乳糖苷的含量分别可达0.21%和0.38%。黄酮类化学成分对多种疾病具有较佳的治疗作用，尤其对心脑血管疾病具明显疗效。现代药理研究亦证实三七茎叶对血液系统、心血管系统、神经系统和代谢系统均有药效，这可能与三七茎叶的黄酮类成分有莫大的关系。近年来，随着三七茎叶的药用和食用价值受到人们的广泛关注，对三七茎叶的研究开发也成为了热点之一。进一步研究三七茎叶的药理活性和临床应用，明确其人参黄酮苷成分的药效活性机制成为主要的研究方向之一。故人参黄酮苷的制备工艺尤为重要。
人参黄酮苷[山柰酚-3-O-葡糖基(1→2)半乳糖苷]，英文名：Panasenoside，分子式：C27H30O16，CAS号：31512-06-8。1969年，Komatsu等人（Komatsu M, Studies on theconstituents of the herb of Pana ginseng C. A. Meyer. II. on the flavonoidconstituents [J]. Yakugaku Zasshi, 1969, 89(1): 122-126.）首次从人参中分离得到人参黄酮苷，随后，研究者们相继发现，人参黄酮苷亦存在于人参及其同属植物西洋参和三七（茎叶和花蕾）中。孙晓娟（三七茎叶的化学成分及生物活性研究[D]. 昆明理工大学,2023. 04.）， 魏春雁（国产西洋参叶黄酮成分研究[J]. 吉林农业大学学报, 1999, 21(3): 7-11.）， 徐斐（人参花蕾的化学成分研究[D]. 大连大学, 2016.05.）， 王志学（人参茎叶黄酮类成分的研究 [J]. 沈阳药学院学报, 1985, (04): 284-287.）， 曲正义（三七果化学成分及抗肿瘤活性研究[D]. 中国农业科学院, 2021.06.）， 张晶（西洋参根中人参黄酮苷的分离鉴定 [J]. 天然产物研究与开发, 2002, (04): 29-30.），刘昌达（西洋参花蕾化学成分的研究[D]. 沈阳药科大学, 2008.）， 李清民（HPLC法测定人参叶中人参黄酮苷的质量分数[J]. 吉林大学学报, 2010, 48(5): 865-867.）， 杨杰（基于 UPLC-Q-TOF-MS 和 HPLC-DAD 的三七黄酮类成分定性与定量研究[J]. 中国中药杂志, 2023, 48(13): 3462-3471.）， 孟祥颖，（西洋参不同部位中黄酮的含量测定 [J]. 长春中医学院学报, 2002, (02): 45-46.）等都在对不同的药材进行化学成分研究时，分离得到过人参黄酮苷，但所采用的均为实验室小规模的分离纯化方法，人参黄酮苷的得率和纯度未见报道。
中国发明专利：制备人参黄酮苷的方法（公开号CN 11454827 A），采用在线HPLC-SP-NMR-MS联动系统，直接可以从人参叶粉末中快速高效制备并鉴定人参黄酮苷单体，但其技术条件苛刻，只能实现少量单体的制备纯化；人参黄酮苷在制备促进血管新生药物中的用途（公开号CN 114272255 A）,发现人参黄酮苷的促血管新生活性，可应用于临床表现为血管生成不足相关疾病的预防和治疗，疗效明显，具有广泛的应用前景。专利：一种从人参茎叶中获取黄酮苷元的方法（CN 104784231 B）、一种从西洋参叶中提取黄酮类化合物的方法（CN 107595909 A）、一种同时制备人参茎叶总皂苷、总黄酮和油脂不皂化物的方法（CN110917228 B）提取制备过程中使用大量有机试剂如石油醚、乙酸乙酯等，最终得到的产物也均为黄酮苷元的混合物。
发明内容
本发明在于提供一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法。三七干燥茎叶粗粉碎后，高醇提取，经大孔吸附树脂和硅胶柱层析得人参黄酮苷粗品。粗品通过创新的聚酰胺和反相色谱材料混装色谱柱，一次柱层析即可兼顾聚酰胺的氢键吸附和反相材料的层析纯化功能制备高纯度人参黄酮苷（纯度大于95%）。本发明工艺简便可行，转移率高，能稳定获得高纯度的人参黄酮苷，可实现大批量制备和工业化生产，且所用溶剂易回收、可重复使用，成本较低，对环境污染小，所得最终产物基本不含有机溶剂残留。
本发明涉及一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，包括以下步骤：
1）三七干燥茎叶粗粉碎，50%~80%乙醇溶液提取，料液比1:5~1:50，提取1~5次，提取温度20℃~100℃，每次提取30min~200min，提取液经过滤，浓缩至料液比1:2~1:15，静置2~24h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂，用2~10倍柱体积20%~60%乙醇溶液洗脱，移弃；后用70%~90%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将70%~90%乙醇溶液洗脱液浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物进行硅胶柱层析，用1~5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比6:1~4:1）作为流动相去除杂质，移弃；再用5~10倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比3:1~1:1）作为流动相收集含人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用80%~100%乙醇溶液溶解，经1~4倍样品量的聚酰胺材料吸附拌样后，装填于6~30倍样品量的反相色谱材料顶端，用10%~20%乙醇溶液洗脱，移弃；再用30%~40%乙醇溶液洗脱，将30%~40%乙醇溶液洗脱液合并，回收溶剂至干，冷冻干燥，即得人参黄酮苷。
所述步骤1）中提取方式为渗漉、浸渍、回流中的一种。
所述步骤2）中大孔吸附树脂为HPD-100、HPD-700、D-101、ADS-8中的一种。
所述步骤4）中的聚酰胺材料为锦纶6、锦纶66、锦纶11、锦纶1010中的一种。
所述步骤4）中的反相色谱材料为C8、C18、RP18、ODS中的一种。
5）人参黄酮苷的含量采用高效液相色谱法进行检测，检测方法包括：
色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.1%磷酸水=17:83为流动相，人参黄酮苷检测波长为365nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。理论塔板数按人参黄酮苷计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取供试品溶液稀释1000倍即得（0.01mg/ml）。
供试品溶液的制备：取本品粉末适量，精密称定，加入50%甲醇溶液制成每1ml含10mg的溶液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，既得。
步骤5）中的HPLC分析：采用高效液相色谱仪，对步骤4）中制备的样品进行HPLC分析。
所述的一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，所得人参黄酮苷采用HPLC检测纯度大于95%，转移率30%~50%。
稳定性研究，按照2020版《中国药典》四部9001稳定性研究有关技术指导原则要求进行加速条件下稳定性研究：
1）将本发明所得人参黄酮苷装入棕色样品瓶中密封包装、在加速条件（温度40℃、相对湿度75%）下进行为期6个月的稳定性试验，结果见下表：
2）试验结果表明，本发明所得人参黄酮苷在加速条件（温度40℃、相对湿度75%）下放置6个月（相当于常温条件下保存3年），人参黄酮苷含量降低1.04%（按要求考察期内含量降幅应小于5%），本发明所得人参黄酮苷原料稳定。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作出进一步的描述。附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图：
图1为实施例1提供的制备方法所得的人参黄酮苷的HPLC检测结果图；
图2为实施例2提供的制备方法所得的人参黄酮苷的HPLC检测结果图；
图3为实施例3提供的制备方法所得的人参黄酮苷的HPLC检测结果图；
图4为实施例4提供的制备方法所得的人参黄酮苷的HPLC检测结果图；
图5为实施例5提供的制备方法所得的人参黄酮苷的HPLC检测结果图。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明进一步详细说明，本领域技术人员可以通过借鉴本发明内容，根据具体实际设备适当改进相关参数实现。本发明的方法已经对人参黄酮苷制备进行了比较详细的描述，相关人员可在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述方法进行改动或适当变更和组合，以实现和应用本发明方法。但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，使用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
1）三七茎叶（50kg）粗粉碎，60%乙醇溶液渗漉提取，料液比1:40，流速100L/h，提取1次，提取温度常温（20℃），提取液经过滤，浓缩至料液比1:5，静置18h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂（HPD-100），用6倍柱体积40%乙醇溶液洗脱，移弃；后用70%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物用适量甲醇溶解，用2倍样品量的100~200目硅胶拌样，蒸干；用10倍样品量的200~300目硅胶干法装柱。先用5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比6：1）作为流动相洗脱除去小极性杂质部分和前沿色素带后，改用5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比3：1）作为流动相进行洗脱，流出液通过TLC与标准品共薄层对照，收集含有人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用80%乙醇溶液溶解，经2倍样品量的30~60目聚酰胺材料（锦纶6）吸附拌样，蒸干；装填于10倍样品量的反相材料ODS顶端进行柱层析。用5倍柱体积的20%乙醇溶液洗脱，移弃；再用6倍柱体积的40%乙醇溶液洗脱进行TLC/HPLC分析监测后合并，回收溶剂，冷冻干燥，即得人参黄酮苷，重量33.73g，转移率35.32%，经HPLC检测，纯度96.53%，水分1.02%。
实施例2
1）三七茎叶（50kg）粗粉碎，80%乙醇溶液回流提取，料液比1:10，提取3次，提取温度100℃，每次提取60min，提取液经过滤，浓缩至料液比1:8，静置4h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂（ADS-8），用4倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，移弃；后用75%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物用适量甲醇溶解，用1.8倍样品量的100~200目硅胶拌样，蒸干；用6倍样品量的200~300目硅胶干法装柱。先用3倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比5：1）作为流动相洗脱除去小极性杂质部分和前沿色素带后，改用7倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比2：1）作为流动相进行洗脱，流出液通过TLC与标准品共薄层对照，收集含有人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用80%乙醇溶液溶解，经1.5倍样品量的30~60目聚酰胺材料（锦纶11）吸附拌样，蒸干；装填于8倍样品量的反相材料C8顶端进行柱层析。用4倍柱体积的20%乙醇溶液洗脱，移弃；再用5倍柱体积的40%乙醇溶液洗脱进行TLC/HPLC分析监测后合并，回收溶剂，冷冻干燥，即得人参黄酮苷，重量28.33g，转移率32.78%，经HPLC检测，纯度97.36%，水分1.34%。
实施例3
1）三七茎叶（50kg）粗粉碎，50%乙醇溶液浸渍提取，料液比1:5，提取5次，提取温度室温（28℃），每次提取200min，提取液经过滤，浓缩至料液比1:2，静置2h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂（HPD-700），用2倍柱体积20%乙醇溶液洗脱，移弃；后用90%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物用适量甲醇溶解，用2倍样品量的100~200目硅胶拌样，蒸干；8倍样品量的200~300目硅胶干法装柱。先用5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比4：1）作为流动相洗脱除去小极性杂质部分和前沿色素带后，改用8倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比1：1）作为流动相进行洗脱，流出液通过TLC与标准品共薄层对照，收集含有人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用100%乙醇溶液溶解，经1倍样品量的30~60目聚酰胺材料（锦纶1010）吸附拌样，蒸干；装填于6倍样品量的反相材料C18顶端进行柱层析。用8倍柱体积的10%乙醇溶液洗脱，移弃；再用4倍柱体积的30%乙醇溶液洗脱进行TLC/HPLC分析监测后合并，回收溶剂，冷冻干燥，即得人参黄酮苷，重量28.73g，转移率40.24%，经HPLC检测，纯度96.43%，水分1.22%。
实施例4
1）三七茎叶（50kg）粗粉碎，60%乙醇溶液渗漉提取，料液比1:50，流速100L/h，提取1次，提取温度常温（25℃），提取液经过滤，浓缩至料液比1:15，静置24h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂（D-101），用10倍柱体积50%乙醇溶液洗脱，移弃；后用80%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物用适量甲醇溶解，用3倍样品量的100~200目硅胶拌样，蒸干；12倍样品量的200~300目硅胶干法装柱。先用1倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比4：1）作为流动相洗脱除去小极性杂质部分和前沿色素带后，改用10倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比2：1）作为流动相进行洗脱，流出液通过TLC与标准品共薄层对照，收集含有人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用85%乙醇溶液溶解，经4倍样品量的30~60目聚酰胺材料（锦纶66）吸附拌样，蒸干；装填于30倍样品量的反相材料C8顶端进行柱层析。用8倍柱体积的10%乙醇溶液洗脱，移弃；再用5倍柱体积的30%乙醇溶液洗脱进行TLC/HPLC分析监测后合并，回收溶剂，冷冻干燥，即得人参黄酮苷，重量41.48g，转移率43.56%，经HPLC检测，纯度96.63%，水分1.40%。
实施例5
1）三七茎叶（50kg）粗粉碎，80%乙醇溶液渗漉提取，料液比1:30，流速100L/h，提取1次，提取温度常温（25℃），提取液经过滤，浓缩至料液比1:2，静置2h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂（HPD-100），用2倍柱体积60%乙醇溶液洗脱，移弃；后用90%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物用适量甲醇溶解，用1.5倍样品量的100~200目硅胶拌样，蒸干；10倍样品量的200~300目硅胶干法装柱。先用5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比5：1）作为流动相洗脱除去小极性杂质部分和前沿色素带后，改用5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇（体积比1：1）作为流动相进行洗脱，流出液通过TLC与标准品共薄层对照，收集含有人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用90%乙醇溶液溶解，经2倍样品量的30~60目聚酰胺材料（锦纶6）吸附拌样，蒸干；装填于10倍样品量的反相材料RP18顶端进行柱层析。用6倍柱体积的20%乙醇溶液洗脱，移弃；再用4倍柱体积的40%乙醇溶液洗脱进行TLC/HPLC分析监测后合并，回收溶剂，冷冻干燥，即得人参黄酮苷，重量33.96g，转移率39.45%，经HPLC检测，纯度97.01%，水分1.37%。
Claims (5)
1.一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）三七干燥茎叶粗粉碎，50%~80%乙醇溶液提取，料液比1:5~1:50，提取1~5次，提取温度20℃~100℃，每次提取30min~200min，提取液经过滤，浓缩至料液比1:2~1:15，静置2~24h，备用；
2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂，用2~10倍柱体积20%~60%乙醇溶液洗脱，移弃；后用70%~90%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将70%~90%乙醇溶液洗脱液浓缩至干，即得富含人参黄酮苷的粗提取物，备用；
3）步骤2）得到的粗提取物进行硅胶柱层析，用1~5倍柱体积的二氯甲烷：甲醇，体积比6:1~4:1，作为流动相去除杂质，移弃；再用5~10倍柱体积的二氯甲烷：甲醇，体积比3:1~1:1，作为流动相收集含人参黄酮苷的流份，浓缩即得人参黄酮苷粗品，备用；
4）步骤3）粗品用80%~100%乙醇溶液溶解，经1~4倍样品量的聚酰胺材料吸附拌样后，装填于6~30倍样品量的反相色谱材料顶端，用10%~20%乙醇溶液洗脱，移弃；再用30%~40%乙醇溶液洗脱，将30%~40%乙醇溶液洗脱液合并，回收溶剂至干，冷冻干燥，即得人参黄酮苷。
2.根据权利要求1所述的一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，其特征在于，步骤1）中提取方式为渗漉、浸渍、回流中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，其特征在于，步骤2）中所述大孔吸附树脂为HPD-100、HPD-700、D-101、ADS-8中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，其特征在于，步骤4）的聚酰胺材料为锦纶6、锦纶66、锦纶11、锦纶1010中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种从三七茎叶中制备人参黄酮苷的方法，其特征在于，步骤4）的反相色谱材料为C8、C18、RP18、ODS中的一种。
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| GR01 | Patent grant |