CN117957311A - 视网膜色素上皮细胞的扩增 - Google Patents

视网膜色素上皮细胞的扩增 Download PDF

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Abstract

本文提出了用于使用悬浮性细胞支持物基质扩增RPE细胞的方法和组合物。还提供了含有RPE细胞的药物组合物，以及使用RPE细胞治疗眼睛疾患或疾病的方法。

Description

视网膜色素上皮细胞的扩增
相关申请
本申请主张2021年7月28日提交的美国临时申请第63/226,741号的优先权权益，该美国临时申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
视网膜色素上皮(RPE)是神经上皮衍生的色素细胞的单层，其位于光感受器外段(POS)与脉络膜脉管系统之间的布鲁赫膜(Bruch's membrane)上。RPE单层对光感受器的功能和健康至关重要。视网膜色素上皮(RPE)细胞功能障碍、损伤和丧失是某些眼睛疾病和疾患的显著特征，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、遗传性黄斑变性，包括Best病(卵黄样黄斑营养不良的早发形式)和视网膜色素变性(RP)的亚型。将RPE(和光感受器)移植至受此类疾病影响的人的视网膜中，可以用作RPE已退化的视网膜疾病的细胞置换疗法。
人胎儿和成人RPE已经被用作同种异体移植的供体来源。然而，在获得足够的组织供应方面的实际问题和关于使用来自流产胎儿的组织的伦理问题限制了这些供体来源的广泛使用。鉴于成人和胎儿RPE移植物供应的限制，已经研究了替代供体来源的潜力。
人多能干细胞作为用于移植的RPE细胞来源具有显著优势。其多能发育潜力使其能够分化成真正的功能性RPE细胞，并且鉴于其具有无限自我更新的潜力，其可以用作RPE细胞的无限供体来源。事实上，已经证明人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)可在体外分化成RPE细胞，减轻视网膜退化并在视网膜下植入后保留视觉功能。因此，hESC可以成为生产用于细胞疗法的RPE细胞的无限来源。
然而，全世界需要使用RPE细胞进行治疗的患者数量预计超过2亿。巨大的数量提出了制造挑战，因为所需的工业同种异体批次大小必须增加到数十亿个RPE细胞。用于贴壁依赖性细胞类型诸如RPE细胞的制造平台传统上采用二维培养方法。这些平台对于工业制造而言不是最佳的，因为它们是劳动密集型的，具有非常大的占地面积，并且消耗过多的资源。作为不受控制的开放系统，它们还具有高污染风险和批次之间的可变性。
本公开解决了再生医学和RPE细胞疗法领域中的这些和其他缺点。
发明内容
本文描述了用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法、RPE细胞的药物组合物，以及用使用该方法产生的药物组合物治疗眼睛的疾患的方法。在实施例中，该疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在实施例中，该疾病是包括Best病(卵黄样黄斑营养不良的早发形式)的遗传性黄斑变性、或视网膜色素变性(RP)的亚型。
在一方面，本文提供了一种用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：提供RPE细胞群，其中该RPE细胞群是从多能干细胞分化而来；以该RPE细胞群接种包含第一悬浮性细胞支持物基质诸如微载体的培养基；以及在动态悬浮中在该第一悬浮性细胞支持物基质上扩增该RPE细胞群，以提供经扩增的RPE细胞群。
在一方面，本文提供了包含通过用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法产生的RPE细胞的药物组合物，该方法包括：提供RPE细胞群，其中该RPE细胞群是从多能干细胞分化而来；以该RPE细胞群接种包含第一悬浮性细胞支持物基质的培养基；以及在动态悬浮中在该第一悬浮性细胞支持物基质上扩增该RPE细胞群，以提供经扩增的RPE细胞群。
在一方面，本文提供了一种治疗眼睛的疾患或疾病的方法，该方法包括将含有通过用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法产生的RPE细胞的药物组合物移植至有此需要的患者的视网膜组织中，该方法包括：提供RPE细胞群，其中该RPE细胞群是从多能干细胞分化而来；以该RPE细胞群接种包含第一悬浮性细胞支持物基质的培养基；以及在动态悬浮中在该第一悬浮性细胞支持物基质上扩增该RPE细胞群，以提供经扩增的RPE细胞群。
附图说明
通过参考以下附图，将更全面地理解本文所述的技术，附图仅用于说明目的：
图1是在RPE扩增的传代1(P1)期间RPE细胞的一系列图像。放大倍数为10倍。图像显示(从左至右)：接种后第4天、接种后第7天、接种后第8天和接种后第9天(收获日)的RPE细胞。RPE细胞在接种后第4天开始显示多边形单层膜，并在第9天(收获日)达到高密度多边形形态。
图2显示所指示的MCS研究的形态学评估，显示了微载体(MC)表面上的RPE细胞外层。接近传代结束时附着至MC的RPE细胞的代表性相位图(4x物镜)(标明了天数)。
图3是显示在约10-12天的过程中，在一次性生物反应器(SUB)中的多次RPE细胞扩增轮次期间，溶解氧百分比(DO％)趋势的比较图。MCS 14的第三次馈料批次在第10天，收获前四天开始。(由于技术原因，截至第6天的MCS14数据丢失。)
图4是显示整个研究MCS11B中MC细胞群密度演变的一系列图像。尽管目标是120×103个细胞/cm2的接种细胞密度，但是细胞不会均匀分散在MC上。这种不均匀的分散导致一部分MC最终被更密集地填充，从而导致随着时间的推移，更成熟的RPE细胞填充那些MC中。箭头指向在不同日子采集的样品中被不均匀地填充的MC。早在接种后第4天，MC细胞密度的变化就很明显。从左至右为第4天、第4天(放大)、第14天、和第14天。
图5是说明大规模RPE细胞生产过程的实施例的流程图。
图6是经PMEL17和DAPI染色的用RPE细胞涂覆的微载体粒子的显微图像。
图7显示RPE细胞单层在微载体上的生长(顶部列)对比在T175烧瓶上的生长(底部列)。在接种每种培养物后的第3天、第7天和第14天拍摄显微图像。
图8是从分化的RPE细胞制备中间体细胞库(ICB)的示例性方法的示意图。如所示，在分化结束时(P0)收获细胞并以等份冷冻。来自ICB的细胞可用于在大规模生物反应器接种微载体以扩增RPE细胞。
图9显示生产RPE细胞的示意图的两个实例。顶部示意图显示不使用中间体细胞库(ICB)的RPE细胞扩增阶段。底部示意图显示使用中间体细胞库(ICB)的RPE细胞扩增阶段。
图10是显示用于大规模细胞生产过程的分化扩增方法的实例的流程图，包括使用微载体(MC)和中间体细胞库(ICB)。
图11是说明用于从hESC分化和扩增RPE细胞的示例性方法的流程图。
图12是说明使用中间体细胞库(ICB)的示例性RPE细胞扩增方法的流程图。
图13A和图13B显示示例性RPE细胞效价测定结果。图13A显示高效价成熟RPE样品对比低效价成熟RPE样品的显微图像。高效价成熟RPE细胞表现出汇合的、均匀的、多边形单层形态。低效价成熟RPE细胞表现出亚汇合、不均匀的有孔形态。图13B，左小图，显示(1)高效价RPE细胞和(2)低效价RPE细胞在第14天的跨上皮电阻(TEER，单位为Ω*cm2)的柱状图。右小图中的柱状图显示(1)高效价成熟RPE细胞和(2)低效价成熟RPE细胞的PEDF:VEGF极化分泌比率。
图14显示RPE细胞扩增和成熟不同阶段的流式细胞术(FCM)分析的散点图，其中细胞用CRALBP_FITC_488和PMEL_AlexaFlour_647双重标记。左上方的散点图显示hESC扩增期间的细胞群。右上方的散点图显示分化结束时的细胞群。左下方的散点图显示RPE扩增期间的细胞。右下方的散点图显示RPE扩增和成熟过程结束时的细胞。在扩增/成熟过程结束时的细胞是>95％的RPE细胞。
图15从左至右显示生产期间RPE纯度/识别生物标志物表达(CRALBP/PMEL17)的柱状图、/>生产期间RPE成熟生物标志物(PEDF)分泌的柱状图，以及分化、扩增和成熟过程结束时的成熟RPE细胞形态。
图16A和图16B显示对所示6种类型的微载体进行1天的EXP27A初步筛选研究以评估RPE附着。图16A是在20％ HS存在下附着于所有MC类型的RPE细胞的代表性相位图。图16B是显示在所有测试的HS浓度下24h时附着至每种MC类型的百分比的图，如通过每孔总接种细胞中收获细胞的百分比计算的。(每组中从左至右的柱条：20％ HS；5％ HS；0.5％HS；0％HS)
图17是显示对所示6种类型的微载体进行7天的EXP27A初步筛选研究以评估RPE附着和扩增的图像。图像描述了在所有MC类型中细胞达到汇合和多边性。
图18是显示通过在Star-Plus MC上接种RPE细胞获得的最高产率的柱状图。(每组中从左至右的柱条：20％ HS；5％ HS；0.5％ HS；0％ HS)
图19A是显示针对用指定细胞密度接种的旋转式培养瓶计算的总细胞的柱状图。
图19B是显示针对用指定细胞密度接种的旋转式培养瓶计算的细胞产率的图。
图20A和图20B是比较旋转式培养瓶中沿着RPE细胞扩增的两种馈料方案的数据。收获P1旋转式培养瓶(通过1/2培养基交换进行馈料)和T175烧瓶，并在对照T烧瓶或旋转式培养瓶中接种P2。使用源自P1旋转式培养瓶的两个旋转式培养瓶来测试2种馈料方案，馈料批次和1/2培养基交换。接收馈料批次的旋转式培养瓶具有更高的产率(图20A)。对照P1旋转式培养瓶(EXP 27E MC)和两个P2旋转式培养瓶(EXP27F MC 1A/2A)在流式细胞术测试中显示出相似的解冻后纯度(％CRALBP/PMEL17)值(图20B)。
图21A和图21B是显示其中馈料方案是1/2培养基交换的研究对比使用馈料批次的研究的结果总结的图。分析显示产率(图21A)和传代结束时每平方厘米收获的细胞总数(图21B)。
图22是显示RPE细胞在3天、10天和12天时在各种微载体上的生长的图像。
具体实施方式
在阅读本描述之后，对于技术人员而言，如何在各种替代实施例和替代应用中实施本发明将变得显而易见。然而，本文将不描述本发明的所有各种实施例。应理解，本文呈现的实施例仅以实例的方式呈现，而非限制性的。因此，各种替代实施例的此详细描述不应解释为限制如下文所阐述的本发明的范围或广度。
在公开和描述本发明之前，应理解，以下描述的方面不限于特定组合物、制备组合物的方法或其用途(当然可改变)。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而无意于进行限制。
仅为了读者的方便而将本发明的详细描述分为多个部分，见于任何部分的公开内容均可与另一部分中的内容组合。为了方便读者，可在说明书中使用标题或副标题，其不意图影响本发明的范围。
为了满足迅速扩大的患者群体的需求，需要大规模生产视网膜色素上皮(RPE)细胞。已经证明，人胚胎干细胞(hESC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)可以在体外一致地分化为功能性RPE细胞。在临床试验中，在患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的患者中使用此类RPE细胞显示出有希望的功能恢复。本文公开了一种用于使用悬浮性细胞支持物基质或微载体(MC)进行RPE扩增的平台。MC的特性(诸如悬浮在溶液中，与此同时提供贴壁细胞可以生长的表面)，使其成为用于使贴壁细胞培养物在封闭和受控环境中生长的理想选择。使用MC进行大规模生产的另一个益处是表面积与体积的比率，该比率相比于传统的静态培养方法大大增加。因此，可以增加细胞密度，与此同时减少所需的占地面积。
本文描述了使用RPE细胞在悬浮性细胞支持物基质(例如但不限于由出售的Star-Plus微载体)上生长的潜能来在大规模封闭和受控环境中扩增hESC衍生的RPE的方法。例如，在本文所述的封闭系统中，分化的RPE细胞可以接种在含有悬浮性细胞支持物基质的单一生物反应器中，该悬浮性细胞支持物基质经筛选以用于实现最佳的RPE产率和质量。细胞的耗氧量可以进行自动监测和控制，pH值、代谢产物和温度也如此。馈料方案可以以馈料批次模式进行，在该馈料批次模式中根据需要添加新鲜培养基和葡萄糖。所有操纵，包括悬浮性细胞支持物基质和培养基添加、细胞采样、收获和过滤，可在受控和封闭的环境中，使用一次性袋的管焊进行，直到冷冻培养基中的细胞悬浮液的最终产物自动分配到冷冻小瓶中。可以实现数千个小瓶的受控大规模冷冻，每一个小时的冷冻过程中高达约2300个小瓶。
定义
术语“治疗(treating/treatment)”是指治疗或改善损伤、疾病、病理或病况的任意的成功标志，包括任意客观或主观参数，诸如减轻；缓解；减轻症候或使患者更容易忍受损伤、病理或状况；减慢退化或衰退的速度；使退化的最终点不那么衰弱；改善患者的身体或心理健康。症候的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其词形变化可以包括预防损伤、病理、病况或疾病。在实施例中，治疗为预防。在实施例中，治疗不包括预防。如本文所用(并且如本领域所熟知的)“治疗”还广泛地包括用于在受试者的病况中获得有益或所需结果(包括临床结果)的任意方法。有益或所欲的临床结果可以包括但不限于，减轻或改善一种或多种症候或病况、减轻疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病的传播或扩散、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、减少和缓解疾病复发，无论是部分的还是全部的，无论是可侦检的还是不可侦检的。换言之，本文所用的“治疗”包括疾病的任意治愈、改善或预防。治疗可以预防疾病的发生；抑制疾病的传播；缓解疾病的症候，完全或部分地消除疾病的根本原因；缩短疾病的持续时间；或将这些事情结合起来。
如本文所用，“治疗”包括预防性治疗。治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以由单次施用组成或可以包括一系列施用。治疗期的长短取决于多种因素，诸如病况的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、治疗中使用的组合物的活性或其组合。还应理解，用于治疗或预防的药剂的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量的改变可以通过本领域已知标准诊断检定法获得并且变得显而易见。在某些情况下，可能需要长期施用。例如，将组合物以足以治疗患者的量和持续时间施用至受试者。在实施例中，“治疗”不是预防性治疗。
术语“预防”是指减少患者疾疾患状的发生。如上所述，预防可为完全的(非可检测到的症候群)或部分的，使得观测到的症候群比没有治疗时可能出现的要少。
“患者”或“有需要的受试者”涉及罹患或易患疾病或症状的生物体，其可通过施用如本文中所提供的药物组合物来治疗。非限制性示例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿及其他非哺乳动物。在一些实施例中，患者为人。
“有效量”是组合物足以在组合物不存在下完成规定目的(例如，达成施用的效果、治疗疾病、减弱酶活性、增加酶活性、减弱传讯通路，或减弱疾病或病况的一种或多种症候群)的量。“有效量”的示例为足以有助于治疗、预防或减弱疾病的一种或多种症候的量，其还可称为“治疗有效量”。一种或多种症候的“减弱”(以及该短语的语法等价物)意指降低症候的严重程度或频率，或消除症候。药物(例如本文所描述的细胞)的“预防有效量”为当施用至受试者时将具有预期的预防效果，例如预防或延迟损伤、疾病、病理或病况的发作(或复发)，或降低损伤、疾病、病理或状况或其症候群发作(或复发)的可能性的药物量。完全的预防效果不一定通过施用一次剂量而发生，并且可能仅在施用一系列剂量后发生。因此，预防有效量可在一次或多次给药中施用。如本文所用，“活性降低量”是指相对于拮抗剂不存在时降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”是指相对于拮抗剂不存在时破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(卷1-3，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro编，Lippincott,Williams&Wilkins)。
对于本文所描述的任意组合物，治疗有效量可以最初由细胞培养分析测定。目标浓度将为那些能够达成本文所描述的方法的活性组合物的浓度(例如细胞浓度或数目)，如使用本文所描述或本领域已知的方法测量。
如熟悉本领域人员所知，用于人的治疗有效量还可以从动物模型测定。例如，可以配制用于人的剂量以达成已发现对动物有效的浓度。如上文所描述，可以通过监测组合物有效性和上调或下调剂量来调整人体剂量。基于以上公开的方法和其他方法调整剂量以在人中达成最大效力完全在普通技术人员的能力范围内。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以改善上文所描述疾患的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或降低。治疗效力也可以表示为“倍”增加或降低。例如，治疗有效量可以具有比对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的效果。
剂量可根据患者和所使用的组合物的需要而变化。在本公开的上下文中，施用至患者的剂量应足以随着时间经过而在患者中产生有益的治疗反应。剂量的大小还将取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。确定用于特定情况的适当剂量是在执业人员的技术范围内。通常，以少于组合物最优剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小的增量增加，直到在某种情况下达到最优效果。可个别地调节剂量和间隔以对所治疗的特定临床适应症提供有效的施用组合物的含量。此将提供与受试者疾病状态严重程度相称的治疗方案。
“共同施用”意指在施用一种或多种额外疗法例如癌症疗法的同时、就在之前或就在之后，施用本文所描述的组合物。本文所提供的组合物可以单独施用或可以共同施用至患者。共同施用意指包括将组合物单独或以组合方式(一种以上的组合物)同时或顺序施用。因此，当需要时，制剂还可与其他活性物质组合(例如为了减少代谢降解)。
“对照”或“对照实验”是按照其完全普通的含义使用，并涉及其中实验的受试者或试剂以平行实验方式处理的实验，除了省略步骤、试剂或实验变量之外。在一些情况下，对照用作评估实验效果的比较标准。在一些实施例中，对照是在不存在如本文所描述的组合物(包括实施例和实例)的情况下对蛋白质活性的测量。
“药用赋形剂”和“药用载体”涉及有助于向受试者施用活性剂并被其吸收的物质，并且可被包括在本公开的组合物中而不会对患者产生明显的不良毒理作用。药用赋形剂的非限制性示例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏(Ringer)液、正常蔗糖(normalsucrose)、正常葡萄糖(normal glucose)、黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如，林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和着色剂等。可对制剂进行灭菌，并且如果需要，可与不会与本公开的组合物有害地反应的辅助剂混合，诸如与润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等。本领域技术人员将认识到，其他药物赋形剂可用于本公开。
如本文所用，“细胞”是指执行足以保存或复制其基因体DNA的代谢或其他功能的细胞。可以通过本领域熟知的方法来鉴别细胞，包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、产生子代的能力，或者在配子的情况下，与第二配子结合以产生一个可行的后代的能力。细胞可包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和衍生自植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如，甜菜夜蛾(spodoptera))和人细胞。当细胞天然不附着或经过处理不附着表面时(例如通过胰蛋白酶消化)，细胞可能是有用的。
如本文所用，“干细胞”是指能够在培养中长时间保持未分化状态的细胞(例如，多能或多能干细胞)，直至经诱导分化成具有特定、特化功能的其他细胞类型(例如，完全分化的细胞)。在实施例中，“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、成人干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。在实施例中，RPE细胞由多能干细胞(例如，ESC或iPSC)产生。
如本文所用，“诱导多能干细胞”或“iPSC”可以通过体细胞的遗传操作，例如，通过用转录因子对体细胞如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞的逆转录病毒转导从体细胞产生的细胞，诸如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,1(1):39-49；Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver andStomach Cells.Science.2008年2月14日(电子版提前印刷)；IH Park、Zhao R、West JA等人，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors.Nature 2008；451:141-146；K Takahashi、Tanabe K、Ohnuki M等人，Inductionof pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell 2007；131:861-872]。若受体细胞在有丝分裂中停滞，其他胚胎样干细胞可以通过核转移至卵母细胞、与胚胎干细胞融合或核转移至受精卵中来产生。此外，iPSC可使用非整合方法生成，例如，通过使用小分子或RNA。
术语“胚胎干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即，内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。词组“胚胎干细胞”包含自妊娠后形成的胚胎组织(例如，囊胚)在胚胎植入前获得的细胞(即，植入前囊胚)、扩展的囊胚细胞(EBC)，其从一个植入后/原肠胚形成前期阶段的囊胚(参见WO 2006/040763)和胚胎生殖(EG)细胞，其在妊娠期间的任何时间，优选在妊娠10周之前从胎儿的生殖组织获得。在实施例中，胚胎干细胞使用众所周知的细胞培养方法获得。例如，人胚胎干细胞可以从人胚泡中分离出来。
人胚泡通常自人活体内植入前胚胎或体外受精(IVF)胚胎中获得。或者，可以将单细胞人胚胎扩大到胚泡阶段。例如，为了分离人ES细胞，自囊胚中去除透明带，并通过裂解饲养外胚层细胞并通过温和移液自完整ICM中去除的程序分离内细胞团(ICM)。然后将ICM置于含有适当培养基的组织培养瓶中，使其能够生长。9至15天后，ICM衍生的生长物通过机械分离或酶降解分离成团块，并且然后将细胞重新铺盘在新鲜的组织培养基上。通过微量移液器单独选择表现出未分化形态的菌落，机械分离成团块，然后重新铺盘。然后每4-7天例行地分裂产生的ES细胞。有关制备人ES细胞的方法的更多详细信息，请参见Reubinoff等人，Nat Biotechnol 2000年5月：18(5):559；Thomson等人，[美国专利第5,843,780号；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995]；Bongso等人，[Hum Reprod 4:706,1989]；以及Gardner等人，[Fertil.Steril.69：84,1998]。
应理解，可商购获得的干细胞还可以用于本公开的方面和实施例中。人ES细胞可自NIH人胚胎干细胞注册处www.grants.nih.govstem_cells/或其他hESC注册处购买。可商购获得的胚胎干细胞株的非限制性实例为HAD-C 102、ESI、BGO 1、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY1O、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES1、HUES2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WAO 1、UCSF4、NYUES 1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUESS、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA 13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT I、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR 1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBRS、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef6、BINhem19、BJNhem20、SAGO 1、SAOO1。
根据一些实施例，胚胎干细胞株为HAD-C102或ESI。
此外，ES细胞可以获得自其他物种，包括小鼠(Mills和Bradley，2001)、金仓鼠[Doetschman等人，1988，Dev Biol.127:224-7]、大鼠[lannaccone等人，1994,DevBiol.163:288-92]、兔子[Giles等人1993,Mol Reprod Dev.36：130-8；Graves&Moreadith,1993,Mol Reprod Dev.1993,3036:424-33]、几种家畜动物物种[Notarianni等人，1991,JReprod Fertil增刊.43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6：563-8；Mitalipova等人，2001,Cloning.3：59-67]和非人灵长类物种(恒河猴和狨猴[Thomson等人，1995,ProcNatl Acad Sci U S A.92:7844-8；Thomson等人，1996,Biol Reprod.55:254-9]。
扩展的囊胚细胞(EBC)可以自受精后至少九天在原肠胚形成之前的阶段的囊胚中获得。在培养囊胚之前，透明带经消化[例如通过Tyrode的酸性溶液(Sigma Aldrich,StLouis,MO,USA)]以暴露内细胞团。然后使用标准胚胎干细胞培养方法将囊胚作为完整胚胎在体外受精后培养至少九天(且优选地不超过十四天)(即，原肠胚形成事件之前)。
制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等人，Cell Stem Cell，第2卷，第2期，113-117，2008年2月7日。该方法包括在体外受精过程中自胚胎中去除单细胞。在此过程中胚胎未经破坏。
EG(胚胎生殖)细胞可以使用技术人员已知的实验室技术自妊娠约8-11周的胎儿(在人胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备。生殖脊经解离并切成小部分，然后通过机械分离分解成细胞。然后EG细胞在具有适当培养基的组织培养瓶中生长。每天更换培养基培养细胞直至观测到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4代后。对于制备人EG细胞的方法的额外细节，参见Shamblott等人，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998]和美国专利第6,090,622号，文献全文以引用方式并入本文。
另一种制备ES细胞的方法是通过孤雌生殖。胚胎也不会在此过程中被破坏。
在分化步骤之前，可以在没有饲养层的情况下扩增ESC或其他多能干细胞。例如，无饲养细胞系统可用于ES细胞培养中。此类系统利用补充有血清置换物、细胞介素和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的置换物。干细胞可以在存在培养基(例如Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、)的情况下在固体表面诸如细胞外基质(例如，MATRIGELTM、层连蛋白或玻连蛋白)上生长。与需要饲养细胞和干细胞同时生长并可能导致混合细胞群的基于饲养细胞的培养不同，在无饲养细胞的系统上生长的干细胞很容易自表面分离。用于使干细胞生长的培养基含有有效抑制分化并促进其生长的因子，诸如MEF条件培养基和bFGF。本文描述和说明的方法和方案中未使用无饲养层培养基TeSRTM-E8TM。
在一些实施例中，在扩增后，多能干细胞，例如ESC，在附着表面上进行定向分化(没有中间生成球状体或胚状体)。参见，例如，国际专利申请公开第WO 2017/072763号，该国际专利申请公开针对其中所公开的所有方法、细胞、试剂、组合物和所有其他信息而全文以引用方式并入本文。
因此，根据本公开的一方面，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的在附着表面上进行定向分化的细胞是未分化的多能干细胞(PSC)，例如ESC，并表达多能性标志物。例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞为Oct4+TRA-I-60+。未分化的PSC可表达其他多能性标志物，诸如NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGFβ、SSEA-3、SSEA-4、SSEA-5、OCT4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。
在一个示例性分化方案中，使用悬浮性细胞支持物基质；例如动态悬浮的微载体(MC)，将未分化的多能干细胞在附着表面上朝向RPE细胞谱系分化。例如，可以使用来自的Star-Plus微载体。可以使用分化剂，诸如转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员(例如TGF 1、TGF2和TGF 3亚型，以及同源配体，包括活化素(例如，活化素A、活化素B和活化素Ab)、nodal、抗穆勒氏管荷尔蒙(AMH)、一些骨成形蛋白(BMP)(例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7)以及生长和分化因子(GDF))。
根据一些实施例，分化剂，诸如烟酰胺(NIC)，可以以介于约1-100mM之间、5-50mM之间、5-20mM之间和例如10mM的浓度使用。该浓度可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
NIC，也称为“烟酰胺”或NA，是维生素B3(烟酸)的酰胺衍生物形式，其被认为保护和改善β细胞功能。NIC对于生长和食物转化为能量是必不可少的，并且其已用于关节炎治疗和糖尿病的治疗和预防。NA具有化学式C6H6N20和以下结构：
根据一些实施例，烟酰胺是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如本文所用，术语“烟酰胺(NA)的衍生物”表示作为天然NA的化学改性衍生物的化合物。在一个实施例中，化学改性可为经由酰胺部分的氮或氧原子取代基本NA结构的吡啶环(经由环的碳或氮成员)。当经取代时，一个或多个氢原子可经取代基置换和/或取代基可附接至N原子以形成带正电荷的四价氮。因此，本发明的烟酰胺包括取代或未取代的烟酰胺。在另一个实施例中，化学改性可为单个基团的缺失或置换，例如形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些类似物均为有机化学专业人士所理解。本发明上下文中的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。描述了多种NA衍生物，其中一些还与PDE4酶的抑制活性有关(WO 03/068233；WO 02/060875；GB2327675A)，或作为VEGF受体酪胺酸激酶抑制剂(WO 01/55114)。例如，制备4-芳基-烟酰胺衍生物的方法(WO 05/014549)。其他例示性烟酰胺衍生物公开于WO 01/55114和EP2128244中。参考文献中的每一篇都全文以引入方式并入本文。
烟酰胺模拟物包括烟酰胺的修饰形式和烟酰胺的化学类似物，其概括烟酰胺在RPE细胞自多能细胞分化和成熟中的作用。例示性烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。可作为烟酰胺模拟物的另一类化合物为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARR)的抑制剂。例示性PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib(BSI 201)、Olaparib(AZD-2281)、Rucaparib(AG014699、PF-01367338)、Veliparib(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。
额外考虑的分化剂包括例如头蛋白、Wnt拮抗剂(Dkk1或IWR1e)、nodal拮抗剂(Lefty-A)、视黄酸、牛磺酸、GSK3b抑制剂(CHIR99021)和缺口抑制剂(DAFT)。
术语“视网膜色素上皮”或“RPE”也称为“视网膜色素层”，是指视网膜外的细胞色素层。RPE层位于布鲁赫膜(脉络膜内边界)与光感受器之间。RPE是为视网膜供应营养的中间体，并有助于许多功能，包括视网膜发育、吸收光、分泌生长因子和介导眼睛的免疫反应。RPE功能障碍可能导致视力丧失或失明，包括视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变、西尼罗河病毒和黄斑部病变。
如本文所用，词组“成熟RPE细胞的标志”是指在成熟RPE细胞中相对于非RPE细胞或未成熟RPE细胞升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白质)。
如本文所用，词组“RPE先驱细胞的标志物”是指与非RPE细胞相比在RPE先驱细胞中升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白质)。
根据一些实施例，RPE细胞具有类似于形成视网膜色素上皮细胞层的天然RPE细胞的形态。例如，细胞可经着色并具有特征性的多边形形状。
根据其他实施例，RPE细胞能够治疗诸如黄斑部病变的疾病。
根据额外实施例，RPE细胞满足上文列出的至少1个、2个、3个、4个或所有要求。
术语“疾病”或“病况”是指能够用本文提供的组合物或方法治疗的患者或受试者的状态或健康状况。年龄相关性黄斑变性或AMD是中央视网膜的一种进行性慢性疾病，并且是全球视力丧失的主要原因。大多数视力丧失发生在疾病的晚期，其是由于以下两个过程中的一者：新生血管(“湿性(wet)”)AMD和地图状萎缩(GA，“干性(dry)”)。在GA中，会出现视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管和光感受器的进行性萎缩。AMD的干性形式更为常见(占所有病例的85-90％)，但可能会发展为“湿性”形式，若不及时治疗，会导致快速和严重的视力丧失。在美国和其他发达国家，AMD的估计患病率为2,000人中有1人。预计此患病率将随着老年人在一般人群中的比例而增加。该疾病的危险因素包括环境因素和遗传因素两者。该疾病的发病机制涉及四种功能相关组织，即视网膜色素上皮(RPE)、布鲁赫膜、脉络膜毛细血管和光感受器的异常。然而，RPE细胞功能的损伤是导致临床相关AMD变化的分子途径中的早期和关键事件。目前没有批准的干性AMD治疗方法。预防措施包括维生素/矿物质补充剂。这些方法降低发展为湿性AMD的风险，但不影响地图状萎缩(GA)进展的发展。
可以根据本文提供的方法测量治疗效果的疾病的非限制性列表包含视网膜色素变性、莱伯氏先天性黑蒙症、遗传性或后天黄斑部病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图状萎缩(Ga)、Best病、视网膜脱离、回旋萎缩(gyrate atrophy)、无脉络膜症、图形样营养不良(pattern dystrophy)以及RPE的其他营养不良、斯特格病、RPE和视网膜损伤(由光、雷射、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一者引起的损伤)、视网膜发育不良、视网膜萎缩、视网膜病变、黄斑部营养不良、视锥细胞营养不良、视锥-视杆细胞营养不良、家族性显性玻璃膜疣(Malattia Leventinese)、多因蜂窝营养不良(Doyne honeycombdystrophy)、索斯比营养不良(Sorsby'sdystrophy)、图形样/蝴蝶营养不良(pattern/butterfly dystrophies)、贝斯特卵黄状营养不良(Best vitelliform dystrophy)、北卡罗来纳营养不良(North Carolina dystrophy)、中心性晕轮状脉络膜营养不良(centralareolar choroidal dystrophy)、血管状痕、毒性黄斑部病变、病理性近视、视网膜色素变性和黄斑部病变。在实施例中，疾病为干性AMD。在实施例中，疾病为GA。
“地图状萎缩”或“GA”或“萎缩性视网膜”，也称为萎缩性年龄相关性黄斑变性(AMD)或晚期干性AMD，是一种晚期形式的年龄相关性黄斑变性，其可以导致进行性和不可逆转的视网膜损失(光感受器、视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管)，随着时间的推移可能导致视觉功能丧失。
在实施例中，RPE缺陷可能由以下一种或多种引起：高龄、吸烟、不健康的体重、抗氧化剂摄入量低或心血管疾患。在其他实施例中，RPE缺陷可能由先天性异常引起。“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”，在上下文允许的情况下可以互换使用，是指一种细胞类型的细胞，例如，在功能上、表观遗传上或表达谱类似于形成视网膜色素上皮细胞层的天然RPE细胞(例如，在眼内移植、施用或递送后，其表现出与天然RPE细胞相似的那些功能活性)。
如本文所用，术语“OpRegen”是指谱系受限的人RPE细胞株。RPE细胞是在补充有活化素A、转化生长因子β(TGF-b)家族和烟酰胺的分化培养基下衍生的，以富集RPE群体。是在眼用平衡盐溶液(BSS Plus)中配制的单细胞悬液，或者作为在5中配制的即用型(RTA)解冻和注射(TAI)制剂。
如本文所用，术语“中间体细胞库”或“ICB”是指在生产中的中间阶段已经以等份冷冻的细胞储库。在实施例中，本文所提及的中间体细胞库包括在PSC分化成RPE细胞后，但在RPE细胞扩增前冷冻的RPE细胞。可将ICB解冻并用于接种培养物以扩增RPE细胞，例如在悬浮性细胞支持物基质上扩增。解冻和接种可能是在细胞冷冻后几天、几周、几个月或甚至几年。
如本文所用，术语“悬浮性细胞支持物基质”是指允许贴壁细胞在动态或静态细胞培养物中生长，并且可以在温和混合下保持悬浮的可悬浮支持物基质。悬浮性细胞支持物基质的实例为微载体。
如本文所用，术语“微载体”或“MC”是指允许贴壁细胞在动态或静态细胞培养物中生长，并且可在温和混合下保持悬浮的可悬浮支持物基质。微载体可由包括但不限于聚苯乙烯、表面改性聚苯乙烯、化学改性聚苯乙烯、交联的葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、胶原、海藻酸盐、明胶、玻璃、DEAE-葡聚糖或其组合构成。微载体可以用生物支持物基质涂覆，该生物支持物基质包括但不限于层连蛋白、基质胶(Matrigel)、胶原、聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白(tenascin)、葡聚糖、肽或其组合。许多不同类型的微载体可商购获得，包括但不限于HyQSphere(HyClone)、Hillex(SoloHillEngineering)和Low Concentration II(Corning)牌。微载体可由交联葡聚糖，诸如Cytodex牌(GE Healthcare)制成。微载体可以是球形且光滑的，可以具有微孔表面，诸如CYTOPORE牌(GE Healthcare)，和/或可以是棒状载体，诸如DE-53(Whatman)。可以用磁性颗粒浸渍微载体，磁性颗粒可以有助于细胞与珠粒)例如，来自Global CellSolutions的GEM颗粒)分离。基于芯片的微载体诸如μHex产品(Nunc)为细胞生长提供了平坦的表面，与此同时维持了传统微载体的高表面积与体积比率。微载体的特性可能显著影响扩增速率和细胞多潜能性或多能性。
在实施例中，微载体(MC)浓度可以为约10cm2/mL。在实施例中，MC浓度为10cm2/mL。在一些实施例中，MC浓度为约1cm2/mL至约30cm2/mL、或约1cm2/mL至约20cm2/mL、或约1cm2/mL至约10cm2/mL、或约1cm2/mL至约5cm2/mL。在一些实施例中，MC浓度为约1cm2/mL、或约2cm2/mL、或约3cm2/mL、或约4cm2/mL、或约5cm2/mL、或约6cm2/mL、或约7cm2/mL、或约8cm2/mL、或约9cm2/mL、或约10cm2/mL、或约11cm2/mL、或约12cm2/mL、或约13cm2/mL、或约14cm2/mL、或约15cm2/mL、或约16cm2/mL、或约17cm2/mL、或约18cm2/mL、或约19cm2/mL、或约20cm2/mL、或更多。在实施例中，MC浓度在5-10cm2/mL的范围内。
在实施例中，悬浮性细胞支持物基质是未经涂覆的。在实施例中，悬浮性细胞支持物基质是未经处理的。在实施例中，处理或涂覆悬浮性细胞支持物基质以促进细胞附着。表面化学改性可以改善细胞附着，包括但不限于施加正或负电荷，或者用细胞外基质蛋白诸如层连蛋白或玻连蛋白涂覆的方法。
如本文所用，术语“生物反应器”是指任何能够支持生物活性环境的系统。生物反应器可以是厌氧或需氧的开放或封闭系统。生物反应器可以是连续或稳定流动的。生物反应器可以连续或批次馈料。生物反应器可以监测例如溶解氧(DO)、pH的量，以及包括N2、O2、CO2和空气的气体的流量。生物反应器可包括用于混合或搅拌细胞悬浮液的手段，例如通过生物反应器内的任何类型的叶轮或搅拌器，或通过摇动平台来提供动态培养条件。生物反应器可以是一次性使用的。
如本文所用，术语“群体倍增量”是给定群体中的细胞在体外培养期间已经倍增的总倍数。群体倍增的数学表达式为：log2(收获的活细胞/接种的活细胞)。例如，若接种100万个活细胞并且收获800万个活细胞，则log2(8/1)＝3。即，平均细胞群体倍增3。
RPE细胞扩增方法
本文的实施例大体而言是关于用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括使用悬浮性细胞支持物基质，诸如微载体。
在一些实施例中，RPE细胞分化自人胚胎干细胞(hESC)。在一些实施例中，RPE细胞分化自人多能干细胞(iPSC)。
根据某些实施例，分化如下进行：(a)在高度受控的培养系统中扩增无饲养细胞的hESC(FF hESC)；(b)在包含TGFβ超家族成员(例如活化素A)和分化剂(例如烟酰胺)的培养基中进行从步骤(a)获得的细胞的FF单层定向分化；(c)在涂覆有明胶的容器上进行RPE扩增；以及(d)在悬浮性细胞支持物基质上培养第二传代RPE。步骤(a)可在不存在TGFβ超家族成员(例如活化素A)的情况下进行。从多能干细胞生产RPE细胞的非限制性实例可见于国际专利申请第WO 2021/242788 A1号、第WO 2017/021973A1号、第WO 2017/021972 A1号、第WO2017/017686 A1号、第WO 2016/108239 A9号、第WO 2016/108239 A9号、第WO 2016/108239A9号、第WO 2008/129554 A1号、第WO 2006/070370 A3号、第WO 2019/028088 A1号、第WO 2021/242788 A1号、第WO/2020/223226号和第WO 2013/114360 A1号。参考文献中的每一者都针对其中所公开的所有组合物、试剂和细胞，以及所有的方法、制造方法和使用组合物、试剂和细胞的方法，以及所有其他信息而全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，步骤(a)中的培养基完全不含TGFβ超家族成员。在其他实施例中，培养基中TGFβ超家族成员的量少于20ng/mL、少于10ng/mL、少于1ng/mL或甚至少于0.1ng/mL。该浓度可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
上述方案之后可以是验证流程。验证流程可包括以下标准：(a)高纯度RPE细胞，其通过CRALBP/PMEL17流式细胞术测量的纯度超过95％；(b)产生解冻后极化单层以及PEDF和VEGF的极化分泌，该极化单层具有>100Ω/cm2的净跨上皮电阻(TEER)；和/或(c)通过高精度模糊C-均值(FCM)方法确认无残留干细胞，例如hESC，通过流式细胞术测量到缺乏TRA-1-60/Oct-4。
然后可以将使用上述方案获得的细胞悬浮液移植到例如有此需要的患者体内。细胞可以重新填充广阔的区域，定位于所需的受损空间以通过约定的RPE细胞扩增进行扩增，直至达到接触抑制。如通过TEER以及极化的PEDF和VEGF分泌所测量的，细胞可以产生成熟和极化的RPE层，其具有针对批次放行(BR)效价的屏障功能。所获得的细胞悬浮液可以准备好进行解冻并注射到患者体内，而无需在手术前进行细胞制备。
上述方案可以产生每3L生物反应器约2500个小瓶，小瓶具有5×109个RPE细胞。生物反应器的数量和生物反应器的体积可以相对容易地增加。
根据一些实施例，如通过免疫染色所测量的，至少50％、60％、70％、80％、85％、87％、89％、90％或95％的细胞表达细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。例如，95-100％的细胞表达CRALBP。百分比可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
根据另一实施例，如通过免疫染色所测量的，至少50％、60％、70％、80％、85％、87％、89％、90％或95％的细胞表达细胞黑素细胞谱系特异性抗原GP100(PMEL17)。例如，介于95-100％之间的细胞表达PMEL17。百分比可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
在一方面，本文提供了一种用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：提供RPE细胞群；以该RPE细胞群接种包含第一悬浮性细胞支持物基质的培养基；以及在动态悬浮中在该第一悬浮性细胞支持物基质上扩增该RPE细胞群，以提供经扩增的RPE细胞群。在实施例中，在提供步骤之前，RPE细胞群分化自多能干细胞。
在实施例中，RPE细胞群在是静态条件下在固体表面上扩增的。在一些实施例中，固体表面为培养板。在一些实施例中，固体表面为培养瓶。在一些实施例中，固体表面为多孔培养皿。
在实施例中，在第一接种步骤之前，RPE细胞群是在动态条件下在固体表面上扩增的。在一些实施例中，固体表面含有第二悬浮性细胞支持物基质。
在一些实施例中，固体表面经涂覆。在一些实施例中，固体表面涂覆有层连蛋白、基质胶、胶原、聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、葡聚糖、肽或其组合。在一些实施例中，固体表面涂覆有层连蛋白。在一些实施例中，固体表面涂覆有基质胶。在一些实施例中，固体表面涂覆有胶原。在一些实施例中，固体表面涂覆有聚赖氨酸。在一些实施例中，固体表面涂覆有聚-L-赖氨酸。在一些实施例中，固体表面涂覆有聚-D-赖氨酸。在一些实施例中，固体表面涂覆有玻连蛋白。在一些实施例中，固体表面涂覆有纤连蛋白。在一些实施例中，固体表面涂覆有腱生蛋白。在一些实施例中，固体表面涂覆有葡聚糖。在一些实施例中，固体表面涂覆有肽。
在实施例中，RPE细胞群从中间体细胞库提供。在一些实施例中，在提供RPE细胞之前，RPE细胞群是在静态条件下在固体表面上扩增一次传代。
在实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质是未经涂覆的。在实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆。
在实施例中，RPE细胞群从多能干细胞的分化包括：i)在维持多能干细胞的多能性的条件下在固体表面上扩增多能干细胞以提供扩增的多能干细胞；以及ii)将扩增的多能干细胞在包含分化剂和任选的生长因子的培养基中分化一段时间以提供RPE细胞群。
在一些实施例中，固体表面为培养板。在一些实施例中，固体表面包含第二悬浮性细胞支持物基质。在一些实施例中，多能干细胞在动态培养中扩增。
在实施例中，方法步骤ii)包括分化扩增的多能干细胞。在一些实施例中，多能干细胞在动态培养中在第三悬浮性细胞支持物基质上扩增。在一些实施例中，来自步骤i)的扩增的多能干细胞在步骤ii)中保持附着于第二悬浮性细胞支持物基质。在一些实施例中，方法步骤ii)包括在静态培养中在培养板上分化扩增的多能干细胞。
在实施例中，多能干细胞生长成粘附于第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质的单层。在一些实施例中，多能干细胞生长成粘附于第二悬浮性细胞支持物基质的单层。在一些实施例中，多能干细胞生长成粘附于第三悬浮性细胞支持物基质的单层。在一些实施例中，多能干细胞生长成粘附于第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质的单层。
在实施例中，用于维持多能干细胞的多能性的条件是无饲养细胞的。在一些实施例中，维持多能性的条件包括饲养细胞群。
在实施例中，分化试剂是烟酰胺。
在实施例中，生长因子是TGFβ家族成员。在一些实施例中，转化生长因子-B(TGFβ)超家族成员是TGF 1、TGF2和TGF 3亚型，以及同源配体，包括活化素(例如，活化素A、活化素B和活化素Ab)、nodal、抗穆勒氏管荷尔蒙(AMH)、一些骨成形蛋白(BMP)(例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7)、以及生长和分化因子(GDF)。根据特定实施例，转化生长因子-B(TGFβ)超家族成员是活化素A。
在实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质由聚苯乙烯、表面改性聚苯乙烯、化学改性聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、胶原、海藻酸盐、明胶、玻璃、DEAE-葡聚糖或其组合构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由聚苯乙烯构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由表面改性聚苯乙烯构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由化学改性聚苯乙烯构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由交联葡聚糖构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由纤维素构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由丙烯酰胺构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由胶原构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由海藻酸盐构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由明胶构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由玻璃构成。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质由DEAE-葡聚糖构成。
在实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质是未经涂覆的。在一些实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质经涂覆。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有层连蛋白、基质胶、胶原、聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、葡聚糖、肽、或其组合。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有层连蛋白。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有基质凝胶。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有胶原。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有聚赖氨酸。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有聚-L-赖氨酸。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有聚-D-赖氨酸。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有玻连蛋白。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有纤连蛋白。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有腱生蛋白。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有葡聚糖。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质经涂覆有肽。
在实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质是球形的、椭球形的、棒状的、盘状的、多孔的、无孔的、光滑的、平坦的、或其组合。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质是球形的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质是椭球形的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质是棒状的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质是盘状的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质为多孔的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质为无孔的。在一些实施例中，悬浮性细胞支持物基质是光滑的。在实施例中，悬浮性细胞支持物基质是平坦的。
在实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质是相同的。在一些实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质中的至少两者是相同的。在一些实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质是不同的。
在实施例中，悬浮性细胞支持物基质为微载体。在一些实施例中，第一悬浮性细胞支持物基质为第一微载体。在一些实施例中，第二悬浮性细胞支持物基质为第二微载体。在一些实施例中，第三悬浮性细胞支持物基质为第三微载体。
在实施例中，RPE细胞群在P0期间(分化后的初始生长期，或从ICB接种后)具有介于2至4之间的群体倍增量，在P1期间(P0后的第一次传代)具有介于2至3之间的群体倍增量，并且在P2期间(第二次传代)具有介于1至2之间的群体倍增量。
在一些实施例中，如本文所述的RPE细胞的扩增可以导致在给定的时间量内生长更多数量的细胞。例如，在一年的过程期间，在没有ICB的情况下，若在相同的位置生长2个不同的批次，则每个套装可能生长4个批次；相比之下，在使用ICB的情况下，在一年中每个相同大小的套装可以生长10个批次，例如，量是不同时生长2个批次的情况下的量的3倍。在一些实施例中，与没有使用ICB相比，在使用ICB时扩增结束时的RPE细胞数量为约2倍高。在一些实施例中，使用ICB时扩增结束时的RPE细胞数量为约3倍高。在一些实施例中，使用ICB时扩增结束时的RPE细胞数量为约4倍高。在一些实施例中，使用ICB时RPE扩增生长的成本比不使用ICB时低。
在实施例中，用于RPE细胞扩增的条件包括维持高于30％的溶解氧％。
在实施例中，用于RPE细胞扩增的条件包括以开始于系统生长室总体积的50％的生长培养基体积为初始。在实施例中，定期添加占系统生长室总体积的约10％至约25％，例如约16.6％的生长培养基体积。在实施例中，每2天至4天添加生长培养基体积。
在实施例中，RPE细胞是成熟RPE细胞的特性。在一些实施例中，成熟RPE细胞对于细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和前黑素体蛋白(PMEL17)以大于95％呈双阳性，如通过流式细胞术测量的。在一些实施例中，成熟RPE细胞产生解冻后极化单层和PEDF和VEGF的极化分泌，该极化单层具有>100Ω/cm2的净跨上皮电阻(TEER)。
在一些实施例中，成熟RPE细胞是经冷冻保存的且在解冻后即可施用至受试者。在实施例中，RPE细胞是在冷冻保存介质中冷冻保存的。在实施例中，低温保存介质包含低温保护剂，例如甘油、蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)或其他合适的低温保护剂。在实施例中，冷冻保护剂包括甘油。在实施例中，冷冻保护剂包括蔗糖。在实施例中，冷冻保护剂包括DMSO。在实施例中，冷冻保护剂包括葡聚糖。
在实施例中，低温保存介质包含约0.1％至约40％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约0.1％至约30％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约0.1％至约20％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约0.1％至约10％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约0.1％至约5％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约1％至约40％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约1％至约30％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约1％至约20％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约1％至约10％的低温保护剂。在实施例中，低温保存介质包含约1％至约5％的低温保护剂。该百分比可以作为每体积介质中冷冻保护剂的重量来测量。该百分比可以作为每单位体积介质中冷冻保护剂的体积来测量。百分比可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
在一些实施例中，成熟RPE细胞包含<0.01％的多能干细胞，如通过高精度流式细胞术方法(FCM)所证实的，并且对于TRA-1-60/Oct-4呈阴性，如通过流式细胞术所测量的。
在一些实施例中，RPE细胞在其分化后增殖直至制剂期间，并且在作为细胞悬浮液注射后，在每次传代时产生多边形单层。
在实施例中，该方法之一或多个步骤是在一次性生物反应器中执行的。在实施例中，RPE细胞的扩增是在一次性生物反应器中执行的。在实施例中，RPE细胞的分化是在一次性生物反应器中执行的。
治疗方法
本文的实施例一般涉及用于治疗包括诸如黄斑部病变的视网膜病况的眼睛疾患和疾患的方法、物质组合物和装置。
在一方面，一种治疗眼睛的疾患或疾病的方法，该方法包括将含有RPE细胞的药物组合物移植到有此需要的患者的视网膜组织中，RPE细胞是由如本文所述的视网膜色素上皮(RPE)细胞扩增方法产生的
在实施例中，眼睛的疾患或疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、包括Best病(卵黄样黄斑营养不良的早发形式)的遗传性黄斑变性或视网膜色素变性(RP)的亚型。在实施例中，眼睛的疾患或疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在实施例中，眼睛的疾患或疾病是遗传性黄斑变性。在实施例中，眼睛的疾患或疾病是Best病(卵黄样黄斑营养不良的早发形式)。在实施例中，眼睛的疾患或疾病是视网膜色素变性(RP)的亚型。
在实施例中，基于产物放行确定，该RPE细胞群在患者中是即用的，该产物放行确定包括：确定成熟RPE细胞对于细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和前黑素体蛋白(PMEL17)以大于95％呈双阳性，如通过流式细胞术测量的；确定成熟RPE细胞产生解冻后极化单层和PEDF和VEGF的极化分泌，该极化单层具有>100Ω/cm2的净跨上皮电阻(TEER)；和/或成熟RPE细胞包含<0.01％的多能干细胞，如通过高精度流式细胞术方法(FCM)所证实的，并且对于TRA-1-60/Oct-4呈阴性，如通过流式细胞术所测量的。
在一些实施例中，RPE细胞在其分化后增殖直至制剂期间，并且在作为细胞悬浮液注射后，在每次传代时产生多边形单层。
在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50-200微升10,000–500,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50-200微升15,000–300,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50-200微升25,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50-200微升50,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50微升10,000–500,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50微升15,000–300,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50微升25,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每50微升50,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每100微升10,000–500,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每100微升15,000–300,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每100微升25,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每100微升50,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每150微升10,000–500,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每150微升15,000–300,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每150微升25,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每150微升50,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每200微升10,000–500,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每200微升15,000–300,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每200微升25,000–250,000个细胞的范围内。在实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每200微升50,000–250,000个细胞的范围内。该浓度可为包括端点的引述范围内的任何值或子范围。
在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升25,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升50,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升75,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升100,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升125,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升150,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升175,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升200,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升225,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每50微升250,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升25,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升50,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升75,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升100,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升125,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升150,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升175,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升200,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升225,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升250,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升25,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升50,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升75,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升100,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升125,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每100微升150,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升175,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升200,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升225,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每150微升250,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度在每200微升25,000个细胞的范围内。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升50,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升75,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升100,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升125,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升150,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升175,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升200,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升225,000个细胞。在一些实施例中，成熟RPE细胞的浓度为约每200微升250,000个细胞。
在一些实施例中，药物组合物经配制可经解冻并注射至受试者，而无需在注射之前的细胞制备。
根据一个实施例，移植是通过帕尔斯平面玻璃体切除手术进行的，随后经由小的视网膜开口或通过直接注射将细胞递送至视网膜下腔。
在某些实施例中，施用可包含玻璃体切除术，然后通过小视网膜切开术经由套管将RTA治疗细胞组合物递送至黄斑区的视网膜下腔中。根据细胞剂量，总体积为50-100μL的细胞悬浮液可植入有潜在GA扩增风险的区域。
在一些实施例中，进行单次外科手术，其中在玻璃体切除术后，RTA治疗细胞组合物经由小的视网膜切开术沿着GA区域(若存在)之间的边界被递送至在黄斑区域中产生的视网膜下腔中，并且更好地保留中央凹外视网膜和RPE层。置放盖窥器后，可以进行标准的3端口玻璃体切除术。此可包括置放一个23G或25G输液套管和两个23G或25/23G端口(套管针)。然后可以使用23G或25G器械进行核心玻璃体切除术，然后分离后玻璃体面。RTA治疗细胞组合物可在后极内的预定位点处注射至视网膜下腔中，优选的是在接近GA(若存在)边界处仍相对保留的区域中穿透视网膜。
药物组合物
在一些方面，本公开涉及包含衍生自多能细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞的细胞治疗剂。这些细胞治疗剂包括但并非意图限于
在一方面，本文提供了一种包含RPE细胞的药物组合物，RPE细胞是由本文所述的RPE细胞扩增方法产生的。
在实施例中，组合物在用于患者中之前是冷冻的。在实施例中，组合物经配制为可经解冻并注射至受试者，而无需在注射之前的细胞制备。
实例
实例1
此实例的目的是证明在高度受控的培养系统中使用无饲养层的hESC(FF hESC)扩增培养的RPE细胞的膜形成。随后在包含TGFβ超家族成员(例如活化素A)和分化剂(例如烟酰胺)的培养基中细胞的无饲养层单层定向分化可用于在经明胶涂覆的容器上进行RPE扩增；并且在微载体(MC)上培养的第二传代RPE可用于移植。FF hESC的扩增可能在不存在TGFβ超家族成员(例如活化素A)的情况下进行。
使用本文所述的方法培养的RPE细胞可以产生多边形单层膜，甚至当作为细胞悬浮液注射时也如此。RPE细胞在其分化后扩增且直至制剂期间的每一次传代中都产生此类多边形单层膜。图1显示在RPE扩增的P1传代期间的RPE细胞，该P1传代从接种后第4天开始，并在第9天(收获日)变得有组织且达到高密度多边形形态。
实例2
此实例的目的是总结用于在Corning一次性使用0.1L旋转式培养瓶中扩增RPE细胞的小规模方法的开发。
这种在小规模容器中的开发是在生物反应器中扩大RPE细胞扩增规模之前的初步步骤，用于在受控的生长条件下制造在此方法中，将经分化的RPE接种在塑料MC上并扩增1-2传代。测试并优化了几个参数，诸如塑料的类型、MC浓度和每MC面积的接种细胞密度。
RPE细胞在旋转式培养瓶中的MC上扩增。以逐步方式相对于对照T烧瓶测试几个条件。其他方法改进在每个轮次期间实施，并沿着方法开发进行记录。所测试的参数包括：
MC型筛选-Pall Sollohil(Star Plus,Plastic Plus,Hillex II)CorningSynthmax(Hi,Low,CellBind)；
接种密度-以在60,000个细胞/cm2至120,000个细胞/cm2范围内的各种细胞密度接种细胞；
接种搅拌-40RPM，每30min休息5min，在水平管中10RPM，恒定40RPM；
馈料方案-通过培养基交换或馈料批次方案来补加细胞。生长培养基每周更换(一半体积)或添加(28-56％)2-3次；
血清浓度降低-对在TC-烧瓶中进行的后续研究(EXP29 A-C)，用2％ HS/Nutminus/HSA或0％ HS/Nut minus/HAS更换20％ HS/DMEM的标准接种培养基；
烟酰胺-向生长培养基中添加或不添加烟酰胺；以及
MC浓度-在旋转式培养瓶中以5-20cm2/mL(360cm2/gr，0.5-2gr/旋转式培养瓶)的范围测试了几种MC浓度；
表1：研究设计
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实验流程：
将RPE细胞直接解冻或在T-烧瓶中扩增，然后接种在6孔盘孔(EXP27A)中或0.1LCorning旋转式培养瓶(EXP27 B-C，G-K)中的不同类型MC(表2)上。
在旋转式培养瓶(EXP27D-F，L)中，在Star plus MC(表2–第1行)上扩增衍生自无饲养层的hESC的分化RPE细胞的未冷冻来源。
使用NC-200细胞计数器对细胞进行计数，并通过除以接种细胞的数量来计算产率。
沿着传代检查细胞形态以及乳酸和葡萄糖量。
在传代结束时，收获每种条件下的RPE培养物，并将产率与对照烧瓶进行比较。在一次或多次连续传代中，将产率和形态与对照T-烧瓶进行比较。
在一些实验中，测试传代结束时的冷冻细胞样品的恢复率、识别和效价
筛选合适的MC类型
表2–在EXP27研究中测试的微载体。
最佳细胞密度
在研究EXP27C、EXP27D、EXP27F和EXP27H中进行了接种细胞密度对RPE扩增的影响
表3：-在Star-Plus MC上以各种密度接种的RPE细胞的结果总结
*产率通过将传代最后一天收获的细胞数除以传代第0天接种的细胞数来计算。
结论：RPE细胞在所有测试的接种密度下在MC上的生长与在组织培养瓶中的一样有效。
馈料批次对比1/2培养基交换
在研究EXP27C、EXP27D、EXP27F和EXP27H中测试了各种馈料方案对MC上RPE扩增的影响
表4-为了优化馈料过程，在旋转式培养瓶中沿着RPE细胞扩增测试两种馈料方案 的结果总结
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表5-在研究REC编号3，RM119中测试了解冻后的恢复率、纯度和效价(TEER，以及分 泌的PEDF和VEGF)
结论-结果显示两种馈料方法的数值相似。选择馈料批次是因为它对于成规模放大更简单。
MC浓度
沿着P2在研究EXP27H和EXP27L中测试了接种时的各种MC浓度对RPE扩增的影响。
表6-测试MC浓度。以约56,000个细胞/cm2(EXP27H)或约88,000个细胞/cm2 (EXP27L)的细胞密度接种P2 RPE细胞
结论：
1.MC浓度在5-10cm2/mL范围处是最佳的。被确定为最佳的MC浓度为7.2cm2/mL，即在旋转式培养瓶中的50mL接种培养基中有1克MC(360cm2)。
2.最有效的MC浓度是10cm2/mL，因为其使得能够在传代结束时达到最高的细胞密度。即使以20cm2/mL接种两倍多的细胞，最终产率也非常接近通过一半的该MC浓度所实现的产率。
减少接种培养基中的血清
表7：测试减少的
/>
结论-类似于在TC烧瓶中进行的其他研究，Nut/HSA中的2％ HS浓度可以代替标准的20％ HS/DMEM接种培养基，因为其使得能够在传代结束时实现更高的细胞密度，从而导致更高的产率和每容器总细胞数。
表8：沿着MC上的扩增Nic的存在
结论：添加Nic导致每次传代的最终细胞产率增加50％。结果是显著的(P<0.05)
对于0.1L旋转式培养瓶中mc上的RPE扩增的发育阶段的结论：
1.从所测试的六种类型的MC中，发现Star-Plus MC最能支持RPE生长。
2.RPE细胞在90,000个细胞/cm2至120,000个细胞/cm2的范围中生长良好。此密度范围与TC烧瓶上发现的范围相同。
3.在使用两种馈料方法时RPE的生长是相当的。选择馈料批次而不是1/2培养基交换，是因为当使用MC时，馈料批次更易于扩大规模，且更具成本效益。
4.发现最有效的MC浓度为10cm2/mL，因为其使得能够在传代结束时达到最高的细胞密度。即使以20cm2/mL接种两倍多的细胞，最终产率也非常接近通过一半的该MC浓度所实现的产率。
5.类似于在TC烧瓶中进行的先前研究，nut/HSA中的2％ HS浓度可以代替标准的20％ HS/DMEM接种培养基，因为其使得能够在传代结束时实现更高的细胞密度。每容器的产率和总细胞数还更高。
6.添加Nic导致每次传代的最终细胞产率增加50％。结果是显著的(p<0.05)
实例3
筛选额外合适的MC类型
在RPE-Pro-05研究中，筛选了额外的MC类型支持RPE扩增的合适性。本研究中所测试的可商购获得的微载体在表9中展示
表9：额外测试MC对RPE扩增的适用性
实例4
本实施例的目的是总结用于在Eppendorf的一次性3L生物反应器(SUB)BioBlu 3C中进行RPE细胞扩增的成规模放大过程的开发，该开发由Eppendorf的BioFlo 320生物处理系统监测。
旋转式培养瓶中Star Plus微载体(MC)上RPE扩增的开发为过程参数提供了基础，过程参数可进一步应用于初步研究中以在生物反应器中在受控条件下在微载体(MC)上扩增RPE细胞。参数为接种细胞密度、接种搅拌速度、MC浓度和馈料方案。
此系统利用其专有软件来监测和控制细胞培养应用，应用要求对细胞培养中所需的过程参数进行变化和连续控制，过程参数包括通气方式(空气、O2、CO2、N2)、pH、温度和搅拌速度。
利用生物焊机连接含培养基的袋子使SUB维持作为‘封闭系统’。用于使RPE细胞与MC和其它大颗粒(基质和细胞聚集体)分离的当前过滤流程被更换，目的是维持能够支持显著成规模放大的封闭系统，该过滤流程先前是使用开放的40微米筛网手动进行的。
材料、设备和细胞
表10：材料
表11设备
设备 CCN ID编号
Accutrend Plus代谢物测试仪 600-AP-002
Clipster 372-CL-002
Eppendorf的BioFlo 320生物处理系统 530-BR-001
NC-200 135-NC-005
Sartorius Biowelder TC 540-BW-001
缩写和定义
CS5–CryoStor 5％
DP–药物产品。
FFMD-无饲养层的单层分化
HSA-人血清白蛋白
ICB-中间体细胞库
MC-微载体
Nic-烟酰胺
NUTS–NutriStem(细胞培养基)
‘解冻并注入’
RPE–视网膜色素上皮细胞。
RPM-每分钟转数
SF-旋转式培养瓶
SUB-一次性使用生物反应器
实验设计
将来自P0(RPE细胞分化结束和扩增开始)的RPE细胞在T175烧瓶中扩增9-14天，直到第一次传代P1结束。然后收获细胞，并以90,000-120,000个细胞/cm2的细胞密度和3.6-7.2cm2/mL的MC浓度接种SUB。在接种后3至4天，用含或不含HSA的生长培养基Nutristem-(Nut(-))更换培养基(20％ HS/DMEM)。在培养基添加之前测量葡萄糖和乳酸盐量，并将葡萄糖补充至2-3克/L(周末时根据当前消耗加上额外的葡萄糖以进行补偿)。
作为MC上扩增的对照，将接种后约10min的细胞从SUB取样并转移到旋转式培养瓶中，将该旋转式培养瓶并行培养。在每次轮次期间测试和实施其他过程改进，并记录在表12中。
表12：按照执行次序的研究设计列表
表12(续)
表12(续)
实验流程
分化的RPE细胞的经解冻或正在进行的来源衍生自在人脐带上或在无饲养层条件下生长的hESC，在SUB中接种于MC上之前在T-烧瓶中扩增。使用NC-200细胞计数器对细胞进行计数，并通过除以接种细胞的数量来计算产率。沿着传代进行检查细胞形态和乳酸盐和葡萄糖量。在传代结束时，收获每种条件下的RPE细胞培养物，并将产率与对照旋转式培养瓶(用在用1/30(50ml)的SUB接种体积进行SUB接种后10分钟取样的RPE细胞培养的)进行比较。在一些实验中，测试传代结束时的冷冻细胞样品的恢复率、识别和效价
表13-开发中使用的细胞
结果
主要发现概述如下。形态在图2中显示。所指示的MCS研究的形态学评估显示了MC表面上的RPE细胞外层。使用4x物镜获得的接近传代结束时附着至MC的RPE细胞的代表性相位图(在图2中标明了天数)。
产率
/>
葡萄糖和乳酸盐测量
表15：沿着传代的葡萄糖消耗率
表16：沿着传代的乳酸盐消耗率
通过从当前量减去先前量(nmol/mL)，并将结果除以自先前测量以来的持续时间(天数)来计算葡萄糖消耗和乳酸盐产生。尽管在于生物反应器中培养的大多数细胞株，诸如CHO细胞中，乳酸盐生产量不断增加，但在RPE细胞培养物中却没有。葡萄糖消耗的相对减少表明培养物达到汇合，而乳酸盐生产的减少表明从糖酵解至氧化磷酸化的迁移，其中RPE细胞可能消耗乳酸盐。
表17 TEER测量值(根据QC-WIN-11改进的测定的结果)
研究 TEER(Ohm*cm2)
MCS1 d17 NA
MCS2 d14 NA
MCS3 d11 0.48
MCS6 d17 NA
MCS7 d14 236
MCS7 d16 35
MCS8 d14 293
结论
BioBlu 3C SUB与BioFlo 320生物处理系统的组合已经在受控和被监测的环境下，在维持和支持MC上的RPE细胞扩增方面表现出了可重复性和稳健性。3气体混合算法(O2、CO2和空气)在将RPE生长维持在30％DO设定点方面是有效的。搅拌是沿着过程进行而调整的；以便实现足够的细胞附着，以22RPM进行接种，然后进一步将搅拌增加到29RPM以完全悬浮MC，并且最后将搅拌增加到40RPM以增加培养物中气体溶解的效率，以便促进扩增的细胞的氧消耗速率增加。四次独立轮次(MCS3、MCS6、MCS7和MCS8)在过滤前在BioBlu 3C SUB中的扩增结束时产生了良好的细胞产率。使用Sartopure 50μm过滤器的过滤在2个轮次中成功，而在另外2个轮次中观察到了细胞的显著损失。正在努力进一步改进过滤过程。在3个轮次中的2个轮次中，解冻的小瓶通过了效价测定，表明在SUB中于MC上扩增的RPE细胞保留了其特性和生物活性。发现最佳收获日是第14天，因此未来的细胞收获将在第13-14天进行以允许操作灵活性。
表18中汇总了最终过程参数。
表18：溶液体积、MC量和过程参数设定点
/>
表19.数据汇总
表19(续)
实例5
本实施例总结了在3L一次性生物反应器中使用Eppendorf的Bioflo320生物处理系统，基于先前建立的过程开发，在MC上扩增RPE细胞(用于一次扩增传代)的成规模放大生产过程的开发。
‘解冻和注射’(/>TAI)过程开发包括在被监测和受控条件下实施大规模生产过程—涵盖视网膜色素上皮(RPE)细胞的接种、扩增和收获。这种成规模放大过程的开发聚焦于RPE细胞在其最终(P2)扩增阶段中的扩增，其中早期扩增阶段(P0和P1)目前仍然是烧瓶依赖性的并且相对于目前的实践没有变化。
从烧瓶依赖性过程至大规模、半自动封闭系统的这种转变的基础依赖于两个基本变化：一个变化是融入了台式生物处理系统—例如Eppendorf的BioFlo 320—具有控制细胞培养过程中的一次性容器的灵活性。该系统利用其专有软件来监测和控制要求对细胞培养中所需的过程参数进行变化和连续的控制的细胞培养应用。第二个变化是使RPE细胞在微载体(MC)上生长的能力，该微载体提供了RPE细胞附着所需的表面，取代了明胶涂覆的组织培养瓶表面，而不影响的质量属性和特征。此开发的过程还将有助于降低生产过程期间的无菌风险。
目标和范围
总结了在3L一次性生物反应器中使用Eppendorf的Bioflo 320生物处理系统在MC上扩增RPE细胞(一次传代扩增)的成规模放大生产过程的开发。介绍并描述TAI成规模放大生产过程。
缩写和定义
BioFlo 320–Eppendorf的自动监测和控制生物处理系统。
BLOD–低于检测限制。
死区-在输出没有变化的指定范围内的输入的跨度。
DMEM–达尔柏克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium)。
DO–溶解氧(％)。
DS–药物物质。
ECM-细胞外基质。
馈料批次-操作技术，其中在培养期间将一或多种营养物馈料(供应)至生物反应器中，并且其中产物保留在生物反应器中直至轮次结束。
FF–无饲养层的hESC。
FFMD–无饲养层的单层分化。
GRP–基团
HS–人血清。
HSA–人血清白蛋白。
ICB-中间体细胞库。
接种–将细胞转移至生物反应器中。
LM521–层连蛋白521。
MC–微载体。
NUT(-)/HSA–含有HSA的NutriStem(细胞培养基)。
‘解冻并注入’(新的/>制剂)。
PBS–磷酸盐缓冲生理食盐水。
RPE–视网膜色素上皮细胞。
RPM–每分钟转数。
SF–旋转式培养瓶。
SLPM–每分钟的标准升数。
SP–设定点。
SUB–一次性生物反应器。
Temp.–温度。
w/v–重量与体积的比率。
表20.材料和一次性用品。
项 制造商 目录号
2L/2端口袋子 Meissner MEIDUF3102B-N00-B8304-01
2L/3端口袋子 Meissner MEIDUF4102B-N00-B8304-01
45％(w/v)D-葡萄糖溶液 Sigma-Aldrich G8769
40μm网格的筛网 pluriSelect 43-50040-01
50μm过滤器 Sartorius 5055350P9FF
5L袋子 Meissner MEIDUF2104B-N00-B9126-01
60μm过滤器 Meissner CL2MN60772
Bioblu 3C SUB Eppendorf 1386000300
DMEM Biological Industries SH30081.01
葡萄糖测量条 Roche 11447475
HS Akron AK99050100
乳酸盐测量条 Roche 03012654
L-麸酰胺酸 Hyclone SH30034.01
MC PALL AMDS05SPS100
NUT(-)+HSA Biological Industries 065100011A
P/S Biological Industries 030311B
PBS(-) Hyclone SH30028.02
Tryple Select Gibco 12563029
Via-1盒 Chemometec 9410011
表21.设备。
实验流程：
在P1结束时，收获在T175烧瓶上生长的经分化的RPE细胞。收获在重组人明胶涂覆的T175烧瓶上生长的处于FFMD过程中的经分化的RPE细胞(除了在MCS 9中，细胞从ICB解冻并在SUB接种前在烧瓶上扩增)。用从烧瓶中正在进行的RPE FFMD分化流程收获的RPE细胞接种SUB(除了在来源于ICB的MCS9外)，以进行一次至P2的RPE扩增传代(除了以P1接种的MCS11A外)。下表22描述了每个轮次的细胞来源。
表22：开发研究中的细胞来源
1来自ICB的解冻细胞。
SUB接种。MC类型的选择、接种所需的细胞数和接种参数(培养基体积和搅拌速度)是使用Corning旋转式培养瓶开发的。取决于从收集烧瓶获得的RPE细胞的最终产率，用MC上收获的RPE细胞接种SUB被优化至100,000-120,000个活细胞/cm2的MC。在接种前，将接种培养基(20％HS/DMEM)和MC在37℃的SUB中平衡至少20分钟，以允许用HS涂覆MC，以便改善细胞附着，并在SUB中实现均质的MC悬浮液。其他参数，诸如DO、pH、出气和培养基更换/添加，如在MCS1至MCS8研究期间所确立的。
搅拌速度
由于旋转式培养瓶和SUB在叶轮和容器的大小和几何形状方面有很大的不同，所以通过应用‘恒定叶轮尖端速度(constant impeller tip)’原理来确立搅拌速度，以在从旋转式培养瓶至SUB的转变期间维持相对恒定的剪切力量，与此同时允许充分的混合和氧转移。根据以下公式，公式I，来计算‘恒定尖端速度’：
尖端速度＝π×d×N，
其中d＝叶轮的外部直径(m)
N＝搅拌速度(rpm)
表23：SUB接种条件
编号 环 SF SUB
1 搅拌 40rpm 22rpm
2 温度 37℃ 37℃
3 DO NA 30％
4 pH NA 7.25
在培养基更换之前，将接种条件维持4天。
表24：每次研究的SUB接种量
1关于如在方案中所记录的各种研究对照，从SUB中取样总接种活细胞数的约3.3％。
在3L SUB中于MC上扩增RPE细胞
在接种后第4天，用NUT(-)/HSA逐体积(1.5L)更换接种培养基，并观察细胞至MC的附着以验证细胞附着。RPE细胞的扩增是在馈料批次馈料方案和受控的温度、DO、pH、搅拌和出气参数下进行的。尽管先前已经使用T-烧瓶和SF确立了馈料方案、温度和搅拌速度，但是环境参数—DO、pH和出气—不能基于先前使用SF的经验进行成规模放大。那些参数设定点是基于先前的MCS1-8轮次和惯例开发和确立的。
如先前所述，通过应用‘恒定叶轮尖端速度’原理，结合我们对MC行为的观察，确立了搅拌速度的成规模放大，目的是保持MC悬浮在培养基中，具有最小沉降至无沉降。首先在第4天将搅拌速度从22rpm增加至29rpm，紧接着用NUT(-)/HSA更换培养基。这种增加提高了SUB和MC悬浮液两者中的温度稳定性，使得培养物的整体均匀性较好，同时保持了相对较低的剪切应力。搅拌在第7天进一步增加至40rpm并在过程持续期间保持不变，以改善较大体积的MC悬浮液。
表25：扩增期SP
pH设定点设定为7.25，死区为1.25，无主动控制。在此过程期间，pH随着时间的推移逐渐降低，从接种步骤中相对较高的pH约7.9(主要归因于HS的存在)降低至扩增结束时的pH约7.3。通过使用外部模拟pH计测量SUB样品来验证pH，并且在实际pH值偏离BioFlo320pH值大于±0.05pH单位的情况下，将pH重新标准化为实际测量值。RPE细胞扩增期间的馈料方案先前被确立为馈料批次连同葡萄糖添加。在3个单独的日子，以2-3天的间隔，向培养物中补充0.5L NUT(-)/HSA，直至最终体积为3L。基于使用代谢物测试仪测量的实际每日培养物的葡萄糖量，将葡萄糖补充至2-2.5gr/L(用45％w/v的d-葡萄糖溶液)。下表26详细列出了每个轮次的培养基更换、馈料批次方案和收获的时间表。
表26：培养基更换、馈料批次方案和收获时间表
D＝天
最佳收获日设定为第14天，因此，为了操作灵活性，已经确定了13-14天的最小扩增。
出气方案
经由迭加和喷雾器两者进行的出气方案是基于3种气体—空气、氧气和二氧化碳—的混合物，这是通过BioFlo系统的自动3气体混合算法主动控制的。操作范围是基于使用hESC的行业惯例设定的。该SUB具有两个通风入口。主要通风入口是针孔烧结物，经由该针孔烧结物供应维持氧气浓度(DO)所需的3气体混合物。第二通风入口是用于维持顶部空间通风的迭加入口。两种入口都预安装了0.2μm的5cm圆盘过滤器，以用于过滤进入的气体。如在烧结物中的小孔隙尺寸产生具有高表面积的小气泡，从而提高了到培养基中的气体转移速率。然而，如此高量的小气泡可能导致泡沫形成，这可能导致液体-顶部空间边界处的气体交换减少，并最终甚至堵塞排气过滤器。气体流入量非常低，并且在研究期间尚未观察到明显的泡沫层形成。
表27：3气体混合SP
编号 环 SP(SLPM)
1 喷雾器 0.002–0.050
2 迭加 0.0–1.0
容器压力影响培养物中的溶解气体，从而影响pH和DO。总气体压力的降低可能导致气体溶解度的降低，并由此导致总气体需求的增加。SUB被设计为在正压下操作，并且根据制造商的建议，SUB中的气体压力不应超过0.44barg(6psig)。然而，维持培养需要气体的正向流动，但是由于在RPE细胞培养期间需要相对较低的气体流量(参见表18的第20行和第21行，以及表27)，因此已经预期在研究期间还不会观察到临界压力升高。此外，该SUB预安装的排气过滤器被设计为承受高达5bar的最大压力。
接种、培养基更换和馈料批次培养基添加
与烧瓶中的RPE扩增相反，将SUB维持为封闭系统要求在整个过程中所有培养基的添加和更换都在不将培养物暴露于外部环境的情况下进行，并将培养物保持在无菌条件下。自动Biowelder用于以无菌和安全的方式将容纳有培养基的袋子焊接至SUB的端口。在焊接至SUB之前，将一次性袋子在生物安全柜中用所需的培养基进行预填充。
收获
使用40μm网格筛网确立了从T-烧瓶和SF收获的RPE细胞的过滤。成规模扩大该流程并将其确立为‘封闭系统’需要使用50μm或60μm的过滤器，该两种过滤器的表面积均为0.15m2。过滤器的孔隙大小最接近40μm网格筛网，并且因此确保DS悬浮液中将不存在大于60μm的颗粒。
使用维持封闭系统的50μm或60μm/>高容量过滤器过滤每个SUB，以从MC分离出RPE细胞并从溶液中清除残留的大细胞聚集体和ECM，并且在与TrypLE Select一起酶促孵育后立即淬灭。此外，在酶促孵育结束时，紧接在淬灭之前，对SUB进行取样，并将该样品淬灭并使用40μm网格过滤，以评估成规模放大的过滤过程并获得SUB的产率估计。
在过滤悬浮液之前，将过滤器先装填约0.5L淬灭溶液，随后经由蠕动泵使经孵育的悬浮液穿过过滤器。间歇地过滤细胞悬浮液，其中在过滤的最后阶段期间，含有最大可见聚集体的细胞悬浮液级分穿过过滤器，以最小化过滤器堵塞和潜在的细胞损失。过滤流程的该部分是在MCS9中获得相对较低的细胞产率后开发和确立的(参见表28，MCS9-14的估计产率对比最终产率)。
结果
以下结果代表了MCS 9、MCS11A、MCS11 B、MCS13和MCS14的成规模放大开发研究。结果是从以下测定获得的：活力％、恢复率％、纯度、HES残留、生物活性(效价)，以及细胞核学。
QC测定的接受度标准
活力％≥70％。恢复率％：100％±25％活细胞/ml，相对于所靶向的最终批次浓度2×106个细胞/ml计算的。效价：净TEER(第14天)：>100Ω*cm2；基部VEGF/顶部VEGF比率(第14天)：>1.00；顶部PEDF/基部PEDF比率(第14天)：>1.00。纯度：P2时的细胞对CRALBP和PMEL17以≥95.00％呈双阳性。HES残留：细胞对TRA1-60和Oct-4两者以<0.01000％呈双阳性。细胞核学：染色体上少于三个相同的缺失或两个相同的添加。
DO趋势
如图3所示，紧接在接种后直到更换培养基，DO％的急剧下降是明显的。此DO％下降表明接种成功且有活力。MCS 9由于其较小的接种大小而在接种期间显示出较高的DO％值。在第2次馈料批次和第3次馈料批次中，所添加的培养基的相对分数较小，此导致减小的DO％峰值减少，因为每次馈料时进入SUB的空气相对较少。
最终DS产率
表28：估计的对比实际的最终产率
此外，在酶促孵育结束时，紧接在淬灭之前，对SUB进行取样(60mL)，并将该样品淬灭并使用40μm网格过滤以评估成规模放大的过滤过程并获得SUB的产率估计。所有研究的平均估计产率(在表28中呈现)为约4.09，接近在过滤后的DS中测量的其实际最终产率，平均最终产率为约2.87，此构成了约30％的平均过滤器损失。MCA11 A、MCS11 B和MCS13在过滤后实现了约3.35的最终平均DS产率，此类似于其相应的估计产率。研究MCS 9的最终产率是在确立过滤前装填过滤器的要求之前获得的，比其估计产率低约44％(4.78对比2.68)。与其他研究相比，MCS 14采用不同的馈料批次方案，具有的最终产率比预期低60％。
活力％和恢复率％评估
解冻每项研究的5个小瓶(2×106个细胞/ml)，并评估活力％和恢复率％。结果汇总于表29中。
表29：活力％和恢复率％结果
/>
来自所有在解冻后立即进行的研究的所有小瓶的活力％和恢复率％符合TAI接受度标准(呈现在表29中)。活力％维持在NLT 90％。恢复率％为NLT78％，平均值为90％。
生物活性(效价)评估
测定解冻的细胞的生物活性，并且结果汇总在表30中。
表30：效价测定结果
所有研究都符合两种效价方法中的生物活性测定接受度标准。
纯度测定结果
测定解冻的细胞的纯度，并且结果汇总在下表31中。
表31：纯度(CRALBP/PMEL17)测定结果
批次 CRALBP PMEL17％
MCS 9 86.37
MCS 11A 97.73
MCS 11B 96.65
MCS 13 96.07
MCS 14 90.58
从研究MCS 11A、MCS 11B和MCS 13获得的RPE细胞符合纯度测定的接受度标准，而从MCS 9和MCS 14获得的细胞不合格。需注意，MCS 9和MCS 14的馈料批次方案都不同于其他研究。此外，MCS 9和MCS 14都给出了最低的最终产率，此可能影响最终的细胞群。
hESC％残留测定结果
测定解冻的细胞的hESC％残留，并且结果汇总在表32中。
表32：hESC％残留(Oct-4/TRA1-60)测定结果
从所有五项研究获得的RPE细胞符合hESC％残留测定的接受度标准(表32)。
核型分析
将P2时的冷冻小瓶解冻，培养两传代并固定用于核型分析。来自研究中的每一项研究的细胞的核型都是正常的；没有发现3个相同的染色体缺失或2个相同的添加。一个例外是MCS11A，在其中发现了isoq20并且此结果正在调查中。
讨论
为了建立生产的成规模放大过程，在受控和被监测的条件下，在3LSUB中于MC上培养RPE细胞以进行一次扩增传代。五项连续开发研究—MCS 9/11A/11B/13/14—在建议的成规模放大过程参数下执行，建议的成规模放大过程参数是在早期的成规模放大研究MCS1-8中逐渐改进的。参数表明提供了稳健的和可再现的成规模放大过程。对研究中DO趋势的检查公开了几乎相同的行为；持续最初几天的接种后立即急剧下降表明接种成功和活力％。随后DO％稳定在SP 30％，之后出现间为歇性峰值，间歇性峰值对应于培养基更换和随后的馈料批次培养基添加。当以2-3天的间隔馈料时，馈料批次方案已显示出产生优选的最终细胞产率(如在表26中所呈现—在培养基更换、馈料批次方案和收获时间表处)；4天的间隔(MCS 9和MCS 14)可能会诱发对培养物的某种压力，该压力随后影响过滤效率以及与RPE成熟相关的最终群体组合物。
在开发期间，在MC细胞分离之前用淬灭溶液装填过滤器以使细胞损失最小化，这被证明是改进。此外，改进的过滤流程，包括仅在过滤的最后阶段中使含大聚集体的悬浮级分穿过，而不是连续混合和过滤整个总体积(如在MCS 9中所执行的)，已被证明对于获得较高的细胞产率至关重要。至于在MCS14中获得的显著较低的最终产率，其可能是由于不同的馈料方案，在那次轮次期间，第2次馈料批次是在第1次馈料批次后4天，而不是3天补充的。这可能有助于通过RPE细胞进行更大的ECM生产，其最终在收获和过滤期间截留更多的成熟细胞。
所开发的成规模放大过程被证明是有效的且可再现的，最终平均细胞产率为约3.35(参见表28，其中3.35的平均数与MCS11A、11B和MCS 13有关)，假定细胞是在所建议的馈料批次方案(馈料之间不大于3天)和改进的过滤流程(即，MCS11A、MCS11B和MCS13)下扩增和获得的。
研究MCS11A、MCS11B和MCS13的纯度测定结果(如在表31中所呈现)符合测定的验收标准，而MCS 9和MCS14不符合验收标准。原因是由于MCS 9和MCS14的过程的参数不同。其相应的实际FACS图显示了表现出较低PMEL值的更广泛的细胞群，这对于不太成熟的(较年轻的)RPE细胞是典型的。这些通常相对更广泛(即，与MCS13相比)的不太成熟细胞群，最可能源于非优化的收获流程。由于更成熟的细胞产生更多的ECM，这使得与不太成熟的RPE细胞相比，在用TrypLe Select进行酶促孵育期间更难将成熟RPE细胞与MC分离。因此，在过滤期间成熟细胞被截留在ECM聚集体中；并且因此在过滤后，DS变得相对富含不太成熟的RPE细胞。
研究MCS11A、MCS11B和MCS13符合纯度测定的验收标准，表明成功的成规模扩大RPE扩增需要优化的分批补料方案和过滤工序。最终RPE群体中的成熟差异可能导致固有的异质MC细胞密度，这可能是接种的结果。与2D静态组织培养瓶相反，作为3D搅拌细胞扩增平台，MC在接种期间倾向于不均匀分布细胞(如图4所示)。最终群体的多种成熟度可能对RPE细胞有益。
hESC％残留测定结果符合TAI接受度标准。在两种测定方法下，所有研究都符合生物活性(效价)测定的接受度标准。五(5)项研究中的四(4)项研究的核型分析结果是正常的；研究中的一项研究显示异常核型(Isoq20(3/50))并且对此进行了调查。
总之，通过维持所需的质量属性和特征，一般的生物处理系统，特别是成规模放大的扩增平台，能够维持和支持稳健的RPE细胞扩增和可再现的过程。
结论
BioBlu 3C SUB与BioFlo 320生物处理系统的组合，在当前的过程中，在维持和支持MC上的RPE细胞扩增方面表现出了稳健性。通过在受控和被监测的条件下，在3L SUB中在表面积为10.8×103cm2的MC上培养RPE细胞，可以获得约4×109个TAI细胞(在最终过滤后)。成规模放大的过滤流程已被证明当实施确立的细胞扩增过程的馈料批次方案和改进的过滤流程时是有效的和可再现的，从而导致最终DS细胞产率为约3.35。
表33：溶液体积、MC量和过程参数设定点
实例6
本实施例的目的是总结GMP FF种子批次库的非GMP工程化轮次。
朝向商业生产的制造过程包括无饲养层和单层分化(FFMD)过程的开发。FFMD过程应高度受控，具有最小的无菌风险，并且应该是稳健的且较少依赖于自发分化步骤。
所开发的商业过程依赖于细胞的四个阶段：第一阶段—无饲养层(FF)人胚胎干细胞在层连蛋白521(LN521)上扩增3周；第二阶段—执行6-7周hESC的FFMD流程，该流程使hESC分化成RPE细胞并且是基于当前的/>解冻和注入(TAI)过程开发的；第三阶段—两次传代(P0、P1)的RPE扩增，当前在明胶涂覆的烧瓶上进行额外4周，如针对/>TAI所做的；第四阶段—在半自动控制的封闭系统(Eppendorf的BioFlo320控制台，其监测BioBlu一次性生物反应器(SUB))中在微载体(MC)上进行RPE细胞的大规模培养。
缩写和定义
CoA-分析报告
CS5–CryoStor 5
DMEM–达尔柏克氏改良伊格尔氏培养基
DO–溶解氧
馈料批次-生物技术过程中的培养技术，其中在培养期间将一种或多种营养物馈料至生物反应器中，并且其中产物保留在生物反应器中直至轮次结束
FF–无饲养层的
FFB–无饲养层的库
FFMD–无饲养层的和单层的分化
GRP-基团
hESC–人胚胎干细胞
HS–人血清
HSA–人血清白蛋白
IPC–过程中对照
LN521–层连蛋白521
MC–微载体
MCB–主细胞库
NIC-烟酰胺
Nut(-)w/HSA–含HSA的NutriStem-
Nut+w/HSA–含HSA的NutriStem+
PDL–群体倍增量
POC–概念验证
QC–质量控制
R&D–研究和开发
RPE–视网膜色素上皮
RPM–每分钟转数
SD–标准偏差
TAI–解冻并注入
TEER-跨上皮电阻
TS–TrypLE Select
V–版本
w/-含
w/o-不含
流程和方法：
细胞：冷冻保存在CCN GMP设施中。
实验流程
hESC扩增和hESC解冻
将一小瓶冷冻细胞解冻并以6,000个活细胞/cm2接种于5μg/ml LN521涂覆的培养皿上的Nut+w/HSA培养基中。培养hESC。当细胞培养到>50％汇合率时，收获细胞，计数并以3,500个活细胞/cm2接种以用于hESC扩增I。
hESC扩增I
将hESC在具有Nut+w/HSA培养基的5μg/ml LN521涂覆的培养皿中传代额外一次。当细胞培养到>50％汇合率时，收获细胞，计数并以4,000个活细胞/cm2接种以用于hESC扩增II。此外，对来自收获的hESC的样品进行多能性标志物评估。
hESC扩增II
将hESC接种在具有Nut+w/HSA培养基的5μg/ml LN521涂覆的培养皿上。从培养的第6天开始评估细胞形态和汇合，直到细胞培养达到≥80％汇合。此外，收获一个等效烧瓶(在相同条件下培养)，以测试多能性标志物。
hESC分化成RPE
NIC I
在hESC扩增II结束时，通过将培养基从Nut+w/HSA改变为补充有10mM NIC的Nut-w/HSA，并通过将细胞在5％O2、5％ CO2和37℃下培养2周，来启动分化过程。
NIC+活化素A
将细胞在5％O2、5％ CO2和37℃下，用补充有10mM NIC和140ng/ml活化素A的Nut-w/HSA培养两周。在14天结束时，收集培养基样品以进行因子分泌测试。
NIC II
将细胞在5％O2、5％ CO2和37℃下，用补充有10mM NIC的Nut-w/HSA培养5天，直到在双目显微镜下观察到轻度着色的区域。然后，将细胞在常氧(20％O2，5％ CO2和37℃)中培养额外10天。在15天结束(分化结束)时，评估分化细胞的形态，收集培养基样品以进行因子分泌测试，并使用TS收获细胞并以60,000个活细胞/cm2接种在具有20％ HS-DMEM的0.1％rh-明胶涂覆的培养皿上，以得到RPE扩增阶段的P0。此外，测试了细胞样品的RPE纯度/识别。
RPE扩增
T175烧瓶中的RPE(P0、P1)
在5％ CO2中和37℃下，将细胞在20％ HS-DMEM中培养4天，并在Nut-w/HSA培养基中再培养11天以得到P0(直至达到100％汇合和RPE多边形典型形态)(在P0时总共15天)。在P0结束时，收获细胞，以120,000个活细胞/cm2接种在0.1％rh-明胶涂覆的培养皿上。此外，评估细胞的RPE纯度/识别和残留的hESC。将细胞在P1时再培养13天，然后收获并接种以得到P2。
SUB中的RPE(P2)
将收获的P1细胞在最佳条件下接种于SUB中。将含有MC的20％HS-DMEM接种培养基在SUB中平衡至少20分钟。此后，在37℃；22rpm搅拌；30％ DO；pH 7.25的接种条件下，以每10,800cm2的MC中1.26×109个活细胞(按117,000个活细胞/cm2的MC)接种细胞。在4天后，将20％ HS-DMEM改变成Nut(-)w/HSA培养基，而RPE细胞的扩增条件保持相同，不同之处为搅拌速度(在第3-7天29rpm并且在第7-14天40rpm)。在P2扩增阶段期间的馈料方案是作为馈料批次连同葡萄糖添加执行的。在3个不同的日子(第7天、第10天和第12天)用0.5L Nut(-)w/HSA培养基补充细胞培养物，直至最终体积为3L。基于使用代谢物测试仪测量的实际每日培养物的葡萄糖量，将葡萄糖补充至2.5g/L(用45％w/v的d-葡萄糖溶液)。在13天培养结束时，收获SUB并使用60μm过滤器(Vanguard)过滤出RPE细胞，并将其以2×106个细胞/小瓶冷冻保存。
表34：针对FFMD大规模 生产过程的批次放行测试
结果
过程中对照
多能性。在每个hESC扩增阶段结束时测试多能性标志物(SSEA-5/TRA-1-60、Oct-4/Nanog)的表达，通过FACS测量每个测定中双阳性细胞的百分比，并将其显示在下表35中。
表35：沿着hESC扩增阶段多能性标志物的表达
在所有hESC扩增阶段中多能性标志物的表达都很高—SSEA-5/TRA-1-60、双阳性细胞的百分比分别超过97.91％和95.36％，并且Oct-4/Nanog双阳性细胞％分别为98.09％和96.96％。结果显示，在FFMD流程开始前，所培养的hESC胞维持其多能性。与hESC扩增步骤II结束时相比在hESC扩增步骤I结束时观察到的标志物表达的轻度减少与在分化过程所需的FFMD启动之前预期的较高接种密度和细胞汇合有关。
纯度和识别
沿着FFMD和RPE扩增期的不同阶段测试了RPE标志物(CRALBP/PMEL17)的表达。
表36：沿着RPE分化和P0的RPE标志物的表达。
RPE细胞％由CRALBP/PMEL17阳性细胞％表示。分化阶段结束时的RPE细胞的百分比为45.96％。在P0结束时RPE细胞的传代和富集之后，RPE细胞％为97.96％，并且此时满足批次放行验收标准(>95.00％的RPE细胞)。
残留hESC
为了确定剩余的hESC，在P0结束时对RPE细胞进行hESC多能性标志物TRA-1-60/Oct-4染色。TRA-1-60/Oct-4％低于检测限制(<0.0004％)。
沿着过程进行的PEDF分泌
在先前的TAI V1.1轮次中，在最终分化阶段(活化素A结束，分化结束)时和早期RPE扩增阶段(P0结束)时观察到分泌到培养基中的PEDF量的量级增加；因此，选择那些IPC来测试FFMD过程中以及在这种非GMP工程化轮次-FFMD大规模/>生产过程中的PEDF浓度。发现用于评估PEDF的那些3点是作为FFMD大规模/>生产过程的IPC的重要和指示性的点。根据—NIC+活化素A结束、分化结束(NIC II结束)和P0结束三个点来评估培养基中的PEDF浓度。结果呈现于表37中。
表37：沿着过程至培养基中的PEDF分泌
如所预期的，随着细胞群变得更纯并且RPE群体变得更成熟(沿着该过程的进展)，PEDF量升高。在NIC和活化素A步骤结束与分化步骤结束之间，PEDF量升高(超过10倍高)；在分化结束与P0结束之间，PEDF的升高是中等的(超过2倍高)。
沿着过程的PDL
在RPE分化期间，计算产率值以确定从每个经接种用于分化过程的hESC收获了多少RPE细胞。
表38：细胞在分化和RPE扩增期间的PDL
沿着过程的细胞倍增数为约16，类似于FFMD方案的以前轮次。
批次放行
活力％和总细胞数/小瓶
将P2(MCS11B)结束时浓度为2×106个活细胞/mL/小瓶的冷冻小瓶解冻，并测试恢复率％和活力％。
表39：解冻的小瓶的活力％和恢复率％。
平均活力(％) SD活力(％) 平均恢复率(％) SD恢复率(％) 所测试的小瓶数(n)
96 0.9 78 4.0 5
结果已符合高于75％的恢复率％和高于70％的活力％的接受度标准。相对较低的恢复率％可能是由于并行冷冻保存几组而导致长DP孵育时间(超过两小时)的结果。此外，恰好在装入小瓶之前在CS5中进行的细胞计数指示低活细胞浓度(1.75×106个活细胞/mL)。解冻后的细胞计数相对于恰好在装入小瓶前计数的实际细胞数的归一化结果导致了约89％的恢复率。
在批次放行时评估RPE纯度/识别(CRALBP/PMEL17)。P2结束时的RPE细胞的对于RPE纯度/识别呈96.65％双阳。
极化
执行效价测定。除了极化的细胞因子分泌之外，下表40中还呈现了第14天细胞的净TEER的结果。
表40：当前的正式效价测定。
净TEER(Ω*cm2)* PEDF比率(顶部/基部) VEGF比率(基部/顶部)
293 4.00 1.89
*按照QC-REP-012和图1
此外，将冷冻样品解冻并在改良的效价测定中进行测试。结果汇总于表41中。
表41：改良的直接效价测定。
净TEER(Ω*cm2)* PEDF比率(顶部/基部) VEGF比率(基部/顶部)
262 4.36 1.77
*按照QC-REP-012和图1
hESC残留
将细胞解冻并进行TRA-1-60/Oct-4染色，以确定残留hESC的存在。hESC％低于检测限制(0.0004％)。
核型分析
将P2时的冷冻小瓶解冻，培养两传代，并固定用于核型分析。细胞的核型是正常的-在样品中没有发现3个相同的染色体缺失或2个相同的添加。
讨论
除了在被监测和受控的条件下在大规模系统中培养RPE细胞之外，朝向商业过程的制造过程开发还包括FF hESC的FFMD流程。本报告总结了涉及在CCN GMP设施中制造的细胞在3L SUB中的FFMD和RPE扩增的生产过程。FFMD过程的第一阶段涉及FFhESC的扩增。在每个hESC扩增传代时的细胞多能性是高的，并且对于所有测试的标志物超过95％。如所预期的，在hESC扩增I步骤与hESC扩增II步骤之间观察到了多能性标志物表达的适度减少。
在分化结束时和P0结束时对RPE纯度/识别的评估表明，在分化阶段结束时，来自细胞库的细胞成功分化成45.96％的表达CRALBP/PMEL17的RPE细胞。分化细胞的传代和培养富集了RPE群体，并且在P0结束时，CRALBP/PMEL17标志物的共表达为97.96％。结果在阶段处的RPE纯度范围内，如在先前的FFMD轮次中所看到的。此外，随着RPE扩增流程的分化至P0的进行，培养基中的PEDF浓度升高；从NIC和活化素A步骤结束时的256.19ng/ml/天至P0阶段结束时的4,687.02ng/ml/天，从而证实了根据PEDF选择结果所选择的指示点的RPE群体的富集和成熟。
最终，在该过程结束时，在监测BioBLU 3L SUB的半自动受控封闭系统(Eppendorf的BioFlo 320控制台)中，在MC上培养细胞以得到P2传代。在P2结束时，收获细胞并作为TAI冷冻保存。在此开发的FFMD和大规模非GMP工程化轮次中生产的RPE细胞在所有执行的批次放行测试中符合所有/>要求的接受度标准。总之，结果证明了CCN-FFHESC-01MCB的/>非GMP工程化轮次的开发过程是合格的。
结论
非GMP工程化轮次-FFMD大规模生产过程符合/>TAIIPC和放行标准；在/>TAI中不存在hESC残留，并且RPE细胞的纯度没有受到影响。此外，细胞保留了其生物活性，并符合活力％和恢复率％的/>接受度标准。
表42
实例5
开发了使RPE在Star Plus微载体(Solohil)上生长的方法，如针对胎儿来源的RPE所确立的，以用于在大规模封闭且受控的环境中扩增hESC来源的RPE。在我们人的封闭系统中，将分化的RPE细胞接种在容纳有微载体的单一生物反应器中，微载体筛选最佳的RPE产率和质量。细胞耗氧量被自动监测和控制，以及监测PH代谢产物和温度。馈料方案以馈料批次模式进行，其中根据需要添加新鲜培养基和葡萄糖。所有操纵，包括微载体和培养基添加、细胞采样、收获和过滤，都是在受控且封闭的环境中通过使用一次性使用袋子的管焊接来完成的，直到在每1小时冷冻时期数千直至2300个小瓶的受控大规模冷冻后，冷冻培养基中的细胞悬浮液的最终产物被自动分配到冷冻小瓶中。
尽管本文的描述包含许多细节，但是不应被解释为限制本公开的范围，而是仅仅提供对一些当前优选的实施例的说明。因此，应理解本公开的范围完全涵盖对本领域的技术人员而言显而易见的其他实施例。
在权利要求书中，除非明确声明，否则对单数形式的要素的提及并非意图意味着“一个(种)且仅一个(种)”，而是“一个(种)或多个(种)”。本领域普通技术人员已知的所公开的实施例的要素的所有结构、化学和功能等同物以引用方式明确地并入本文，并且意图由被本权利要求书所涵盖。此外，本公开中的任何要素、部件或方法步骤非意图奉献给公众，而无论该要素、部件或方法步骤是否在权利要求书中明确记载。本文权利要求要素不能被解释为“手段加功能”要素，除非该要素使用短语“用于……的构件”明确陈述。本文权利要求要素不能被解释为“步骤加功能”要素，除非该要素使用短语“用于……的步骤”明确陈述。

Claims (54)

1.一种用于扩增视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，所述方法包括：
a)提供RPE细胞群，其中所述RPE细胞群是从多能干细胞分化而来；
b)用所述RPE细胞群接种包含第一悬浮性细胞支持物基质的培养基；以及
c)在动态悬浮中在所述第一悬浮性细胞支持物基质上扩增所述RPE细胞群，以提供扩增的RPE细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前，在静态条件下在固体表面上扩增所述RPE细胞群。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述固体表面包含培养板。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前，在动态条件下在固体表面上扩增所述RPE细胞群。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述固体表面包含第二悬浮性细胞支持物基质。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述固体表面经涂覆。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，在静态条件下在所述固体表面上扩增所述RPE细胞群，进行一次传代。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中用于在所述固体表面上进行扩增的所述RPE细胞群是从中间体细胞库获得的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述悬浮性细胞支持物基质包含微载体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞群从中间体细胞库提供。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮性细胞支持物基质未经涂覆。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述RPE细胞群从多能干细胞的分化包括：
i.在维持多能干细胞的多能性的条件下在固体表面上扩增所述多能干细胞以提供扩增的多能干细胞；
ii.将所述扩增的多能干细胞在包含分化剂和任选的生长因子的培养基中分化一段时间以提供所述RPE细胞群。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述固体表面为培养板。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述固体表面包含第二悬浮性细胞支持物基质并且所述多能干细胞在动态培养中扩增。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中步骤ii包括在动态培养中在第三悬浮性细胞支持物基质上分化所述扩增的多能干细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中来自步骤i的所述扩增的多能干细胞在步骤ii中保持附着于所述第二悬浮性细胞支持物基质。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述第二悬浮性细胞支持物基质包含第二微载体。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述第三悬浮性细胞支持物基质包含第三微载体。
19.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质中的至少两者是相同的。
20.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和第三悬浮性细胞支持物基质是不同的。
21.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中步骤ii包括在静态培养中在培养板上分化所述扩增的多能干细胞。
22.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述多能干细胞生长成粘附于所述第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质的单层。
23.根据权利要求12至22中任一项所述的方法，其中用于维持多能性的条件是无饲养细胞的。
24.根据权利要求12至23中任一项所述的方法，其中用于维持多能性的条件包括饲养细胞群。
25.根据权利要求12至24中任一项所述的方法，其中分化试剂为烟酰胺。
26.根据权利要求12至25中任一项所述的方法，其中所述生长因子为TGFβ家族的成员。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质包含聚苯乙烯、表面改性聚苯乙烯、化学改性聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、胶原、藻酸盐、明胶、玻璃、DEAE-葡聚糖或其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一微载体、第二悬浮性细胞支持物基质r和/或第三悬浮性细胞支持物基质是球形的、椭球形的、棒状的、盘状的、多孔的、无孔的、光滑的、平坦的、或其组合。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第一悬浮性细胞支持物基质、第二悬浮性细胞支持物基质和/或第三悬浮性细胞支持物基质涂覆有层粘连蛋白、基质胶、胶原、聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、葡聚糖、肽、它们的衍生物、或其组合。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述固体表面未经涂覆或涂覆有层粘连蛋白、基质胶、胶原、聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、葡聚糖、肽、它们的衍生物、或其组合。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RPE细胞群在步骤c)中的P0期间具有2至4的群体倍增水平、在P1期间具有2至3的群体倍增水平并且在P2期间具有1至2的群体倍增水平。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的P0期间、P1期间和P2期间，在2％至20％人血清/DMEM存在的情况下接种所述RPE细胞群。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的P0期间、P1期间和P2期间，在动态培养中将所述RPE细胞群接种在固体基底上。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的P0期间、P1期间和P2期间，在动态培养中以50,000个细胞/cm2至120,000个细胞/cm2的细胞密度将所述RPE细胞群接种在固体基底上。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的P0期间、P1期间和P2期间，在动态培养中以2.5cm2表面积/ml至10cm2表面积/ml将所述RPE细胞群接种在固体基底上。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于步骤c)期间的扩增的条件包括维持高于30％的溶解氧％。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于步骤c)中的扩增的条件包括以系统生长室总体积的50％开始的初始生长培养基体积，并且其中每2至4天添加系统生长室总体积的16.6％的生长培养基体积。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RPE细胞具有成熟RPE细胞的特性。
39.根据权利要求39所述的方法，其中根据流式细胞术测量，所述成熟RPE细胞对于细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和前黑素体蛋白(PMEL17)呈大于95％的双阳性。
40.根据权利要求40所述的方法，其中所述成熟RPE细胞产生具有>100Ω*cm2的净跨上皮电阻(TEER)的解冻后极化单层以及PEDF和VEGF的极化分泌。
41.根据权利要求41所述的方法，其中所述成熟RPE细胞被冷冻保存并已准备好用于在解冻后施用于受试者。
42.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中根据高精度流式细胞术方法(FCM)证实，所述成熟RPE细胞包含<0.01％的多能干细胞，并且根据流式细胞术测量，所述成熟RPE细胞对于TRA-1-60/Oct-4呈阴性。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RPE细胞在其分化后扩增且直至配制期间以及当作为细胞悬液注射时，在每次传代均产生多边形单层。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中动态细胞生长悬浮在一次性生物反应器中进行。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RPE细胞群在烟酰胺存在的情况下扩增。
46.一种治疗眼睛的疾患或疾病的方法，所述方法包括将药物组合物移植到有此需要的患者的视网膜组织中，所述药物组合物包含通过根据权利要求1至33中任一项所述的方法产生的RPE细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述眼睛的疾患或疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)、包括Best病(卵黄样黄斑营养不良的早发形式)的遗传性黄斑变性、或视网膜色素变性(RP)的亚型。
48.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中基于产品放行确定，
所述RPE细胞群已准备好用于患者中，所述产品放行确定包括：
a)根据流式细胞术测量，确定所述成熟RPE细胞对于细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和前黑素体蛋白(PMEL17)呈大于95％的双阳性；
b)确定所述成熟RPE细胞产生具有>100Ω*cm2的净跨上皮电阻(TEER)的解冻后极化单层以及PEDF和VEGF的极化分泌；以及
c)根据高精度流式细胞术方法(FCM)证实，所述成熟RPE细胞包含<0.01％的多能干细胞，并且根据流式细胞术测量，所述成熟RPE细胞对于TRA-1-60/Oct-4呈阴性。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RPE细胞在其分化后扩增且直至配制期间以及当作为细胞悬液注射时，在每次传代均产生多边形单层。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中用于移植的成熟RPE细胞的浓度为100,000个细胞/50微升。
51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中将用于移植的所述成熟RPE细胞注射到所述患者的视网膜下腔中。
52.根据权利要求47至51中任一项所述的方法，其中所述药物组合物被配制为解冻并且注射到受试者中而无需在注射之前的细胞制备。
53.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求1至46中任一项所述的方法产生的细胞。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述组合物被配制为解冻并且注射到受试者中而无需在注射之前的细胞制备。
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