JP2020530839A - 疾患または外傷性損傷を原因とする視覚喪失を回復させるまたは予防するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

幹細胞由来組織および／または細胞を含むバイオ補綴網膜グラフト（またはデバイス）を、対象の、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、RPE、PRC、およびRCG欠損の治療、または他の目的に用いることができる。バイオ補綴網膜グラフトは、バイオ補綴網膜パッチを形成するために、対象の眼の眼内スペースへの植え込みに適したバイオ補綴担体および足場を含み得る。特定の態様では、バイオ補綴網膜パッチは、担体または足場上に複数の幹細胞由来組織片または細胞片を含み得、大面積の網膜変性もしくは破損の治療、または他の目的に用いることができる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2017年7月31に提出された米国特許仮出願第62/539,542号、2017年10月25日に提出された米国特許仮出願第62/577,154号、2017年11月30日に提出された米国特許仮出願第62/593,228号、2018年3月21日に提出された米国特許仮出願第62/646,354号、および2018年3月1日に提出された米国特許仮出願第62/665,483号の優先権および利益を主張するものであり、これらの文書はそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み入れられる。

背景
網膜変性（RD）疾患は、最終的に光受容体（PR）の変性をもたらし、世界第3位の失明原因に数えられる。遺伝的条件、年齢、および外傷（軍人および民間人）が、網膜変性関連の視覚喪失の主な原因である。光受容体が変性してしまうと、現在の技術では網膜を回復させて視覚を取り戻すことはできない。

先進国では、加齢黄斑変性（AMD）が、55歳以上の人のRDの主な原因である。米国では現在約1500万人がAMDに罹患しており、米国およびカナダにおける全視覚喪失の約50%を占めている。網膜色素変性（RP）は、遺伝性視覚障害の最多原因であって、罹患率は1:4000であり、患者数は米国では5万〜10万人、全世界ではおよそ1500万人と推定される。重度の視覚喪失をもたらすその他の網膜疾患としては、レーバー先天黒内障（LCA）が挙げられ、これは多くの場合生まれつきの網膜機能不全が視覚喪失の原因となる希少な遺伝障害である。視覚喪失の度合いは患者によって異なるが、かなり重篤になり得る（光知覚がほぼ無しから皆無まで）。

戦闘時に頭部および胴体部を守る身体防護具の性能が高まる一方で、防護が手薄な顔や眼などの身体部位に損傷を負った兵士が増えている。爆風曝露による眼球損傷は、軍の戦闘で最も被りやすい損傷の第4位に数えられる。眼球損傷は失明につながることが多く、生活の質も独立性も大きく損なわれることになる。穿通性の損傷は重篤な組織損傷または組織損失をもたらすことが多いが、非穿通性または閉鎖性の眼球損傷も同様に、眼の高次組織構成の破壊をもたらすことがあり、網膜剥離、光受容体細胞死、および視神経破損の原因となり、不可逆的な視覚喪失をもたらす。眼球の閉鎖性損傷がしばしば示す損傷パターンは、眼の構造は概ね無傷のままであるが、悲惨な視覚喪失をもたらす網膜および視神経の変性を予防するために介入を要する、というものである。

RD患者の視覚回復のために最近開発された戦略は、電子的神経補綴チップの植え込みであり、これは光を捉えるセンサーを網膜下スペースに導入して、患者の網膜の残存ニューロンに視覚信号を電気的に送信させる、というものである。この取り組みに関する一つの問題は、進行中の網膜変性、網膜の再構築および菲薄化、ならびにグリオーシスにより電子部品と生体部位とが徐々に離れ、電気信号の変換に重要なチップと網膜との相互作用が減っていくことである。生体組織内ではチップに使われている金属および配線が生体の体液により酸化し、生体組織における電子デバイスの安定性が制限されることで、さらなる問題が生じる。

ヒト胎児網膜を使った網膜組織移植も、盲目動物の視知覚を回復させること、および網膜変性患者の視覚も改善することが実証されている。この取り組みは有望で、患者の網膜下スペースに健康なヒト網膜の新たな層が生成するが、治療の選択肢として胎児組織を使用することは、倫理的な問題により、また胎児組織の供給が不十分かつ予測不可能であるため、妨げられる。また、この視覚回復手順の成功は、特定の発生年齢（8〜17週）のヒト胎児網膜を選択すること、そしてそれを患者の網膜下スペースに精密に配置することにかかっている。成人自体の網膜は移植後すぐに死滅するため、この用途には一般に適していない。

網膜幹細胞療法は、あらゆる幹細胞置換治療法のなかでも最も喫緊の未解決課題の一つとして突出している。眼は、免疫特権をもつ、包まれた小さな器官である。移植のために眼内スペースにアクセスすることが可能であり、非侵襲的な方法により網膜を可視化できる。しかし、機能細胞の置換により神経網膜を修復することは、複雑なタスクである。最良の結果を得るためには、新細胞が網膜層の特定の場所まで遊走し、かつホストとの特異的なシナプス結合性を再建する必要がある。RDが進行した状態での神経回路のシナプス再構築は、このタスクをさらに複雑化させる。

したがって、重篤な網膜破損となり得る、または網膜の大部分に影響を及ぼし得る、または時間の経過とともに進行性の変性をもたらし得る網膜の損傷または疾患後の、構造および機能の回復および保護を対象とした、視覚回復テクノロジーの頑健かつ実現可能な治療法の需要がある。

本開示は、再生医療および細胞療法の分野における上記のおよびその他の短所に対処するものである。

概要
一局面では、網膜破損の治療、網膜破損の進行の緩慢化、網膜破損の予防、網膜組織の置換、および破損網膜組織の回復のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜組織グラフトを対象に適用することを含む方法が、提供される。

別の局面では、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、遺伝性網膜疾患の進行の緩慢化、網膜疾患の安定化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、視覚もしくは視知覚の改善、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜組織グラフトを対象に適用することを含む方法が、提供される。

別の局面では、網膜破損は、爆風曝露、遺伝子障害、網膜疾患、および網膜損傷のうち1つまたは複数を原因とする。別の局面では、網膜疾患には、網膜変性疾患が含まれる。別の局面では、網膜破損は、加齢黄斑変性（AMD）、網膜色素変性（RP）、およびレーバー先天黒内障（LCA）のうち1つまたは複数を原因とする。

一態様では、網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、および光受容体（PR）細胞を含むhESC由来網膜組織を使用する方法が記載される。別の態様では、RPE細胞、RGC細胞、およびPR細胞は、網膜色素上皮（RPE）細胞の中心層があって、このRPE細胞層から半径方向外側に向かうように、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層（成熟網膜の内顆粒層に相当）、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層が存在するように構成される。別の態様では、該層のそれぞれが、相当するヒト網膜組織層内の細胞の特徴である分化細胞を含む。別の態様では、該層のそれぞれが前駆細胞を含み、適用後、前駆細胞の一部または全部が、相当するヒト網膜組織層の成熟細胞へと分化する。

別の態様では、各層は、実質的に完全に分化した細胞を含む。さらに別の態様では、hESC由来網膜組織は、バイオ補綴網膜パッチを形成するための生体適合性足場をさらに含む。他の態様では、バイオ補綴網膜グラフトは、約1万個〜10万個の光受容体細胞を含む。他の態様では、数片のhESC由来網膜組織が生体適合性足場に付加されて、大きなバイオ補綴パッチが形成される。他の態様では、hESC由来網膜組織グラフト、またはhESC由来網膜組織グラフトの解離細胞は、神経栄養因子、神経栄養性エキソソーム、およびマイトジェンのうち1つまたは複数を対象に送達することができる。さらに他の態様では、神経栄養因子およびマイトジェンは、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、ニューロトロフィン-34（NT34）、ニューロトロフィン4/5、神経成長因子-ベータ（βNGF）、proNGF、PEDF、CNTF、生存促進性マイトジェン塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF=FGF-2）、およびWNTファミリーの生存促進性メンバーのうち1つまたは複数を含む。

他の局面では、hESC由来網膜組織グラフトを適用すると、適用した場所で、網膜層の厚さが約1〜約3カ月間保存される。さらに他の局面では、適用は、免疫抑制剤の投与をさらに含む。他の局面では、適用は、網膜グラフトを適用する前、途中、および／または後に、エピネフリンを使用することを含む。

さらに他の局面では、免疫抑制剤は、適用の前、途中、および／または後に投与される。

他の態様では、方法は、眼圧の調節をさらに含む。他の局面では、眼圧の調節は、網膜組織の適用の前、途中、および／または後に行われる。

特定の態様では、組織は、眼内移植ツールを用いて適用される。

他の態様では、hESC由来網膜組織は、網膜下または網膜上に適用される。

他の態様では、hESC由来網膜組織グラフトを適用すると、hESC由来網膜組織と対象の網膜組織との、腫瘍無しでの統合が得られる。

他の態様では、網膜グラフトの統合は、適用後約2〜10週間で生じる。他の態様では、統合は構造的統合を含む。他の態様では、統合は機能的統合を含み、適用後約1〜6カ月で生じる。他の態様では、適用は網膜の炎症を引き起こさない。

他の態様では、適用後、網膜組織は積層を生じる。

他の態様では、適用後、網膜組織ニューロンが、Na⁺、K⁺および／またはCa⁺⁺電流の兆候を示す。

他の態様では、方法は、網膜組織と既存組織との結合性を実証することをさらに含む。他の態様では、結合は、WGA-HRP経シナプストレーサー、組織学、IHC、または電気生理学のうち1つまたは複数により実証される。

他の態様では、方法は、機能回復レベルの測定をさらに含む。

他の態様では、機能回復レベルは、少なくともベースラインの10%の電気生理学的応答の増大を含む。

他の態様では、対象の眼球に移植される網膜組織グラフトであって、網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、二次網膜ニューロン、および光受容体（PR）細胞を含み、これらのRPE細胞、RGC細胞、およびPR細胞が中心コアを形成するように構成されている、網膜組織グラフトが提示される。

他の態様では、約1,000個〜25万個の光受容体がある。

他の態様では、二次網膜ニューロンは、成熟網膜の内顆粒層に相当する。

他の態様では、細胞は、コアから半径方向外側に向かうように配置され、網膜組織は、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層を含む。他の態様では、グラフトは、1,000個〜約25万個の細胞を含む。

他の態様では、グラフトは、網膜下スペースまたは網膜上スペースに移植される。

他の態様では、グラフトは、黄斑付近の網膜下スペースまたは網膜上スペースに移植される。他の態様では、シナプス形成の増加が電気活性の増加と同時に生じる。

他の態様では、移植後、ニューロンがグラフトを既存組織と結合させる。

他の態様では、ニューロンはCALB2陽性である。他の態様では、結合性は、WGA-HRP経シナプストレーサーにより実証される。他の態様では、移植後、軸索がグラフトを既存組織と結合させる。他の態様では、軸索はCALB2陽性である。

他の態様では、移植後、グラフトの細胞はRGCへと成熟する。

他の態様では、移植後、グラフトは、既存ニューロンとシナプスを形成する。

他の態様では、移植後、グラフトと既存組織とが結合を形成する。

他の態様では、結合は、移植後１日〜約5週間で形成する。

他の態様では、移植後、グラフトは、既存組織ONLにかかる軸索を形成する。

他の態様では、グラフトは、パラクリン因子を生産する。

他の態様では、パラクリン因子は、適用の前および／または後に生産される。

他の態様では、グラフトは、神経栄養因子を生産する。

他の態様では、グラフトは、神経栄養因子を、適用の前または後に生産する。

他の態様では、神経栄養因子は、BDNS、GDNF、bNGF、NT4、bFGF、NT34、NT4/5、CNTF、PEDF、セルピン、またはWNTファミリーメンバーのうち1つまたは複数を含む。

他の態様では、移植後、機能回復レベルは、電気生理学的応答の増大として測定される。

他の態様では、機能回復レベルは、少なくともベースラインの10%までの電気生理学的応答の増大として測定される。

他の態様では、移植後、グラフトの軸索は、既存組織を穿通してそれに統合される。

他の態様では、組織は、ヒト多能性幹細胞に由来する。

他の態様では、グラフトは、対象の、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、遺伝性網膜疾患の進行の緩慢化、網膜疾患の安定化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、視覚もしくは視知覚の改善、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療に有用である。

他の態様では、グラフトは、レシピエントの眼内スペースへの植え込み後、PR層およびRPE層が積層しかつ発達し、PR外節の伸長、シナプス形成、電気生理学的活性、およびレシピエントの網膜細胞との結合性を含め、少なくとも約6〜24カ月は腫瘍無しで生着することができる。

他の態様では、グラフトは、レシピエントの眼の眼内スペースへの植え込み後5週間で、レシピエントの外顆粒層（ONL）、内顆粒層（INL）、および神経節細胞層（GCL）内へ軸索を伸ばすことができ、かつ該軸索をこれらの層に統合させることができる。

本明細書では、網膜パッチの適用による、視覚喪失の回復または視覚喪失の進行の緩慢化のための方法が提供される。一局面では、視覚回復または改善のための製品が提供され、これを患者の眼の網膜上または網膜下スペースに注入または導入することができる。

別の局面では、網膜を破損した対象の視覚喪失を矯正する方法が提供され、該方法は、破損部位に網膜組織を復元することを含む。さらに別の局面では、対象の視覚喪失を矯正する方法が提供され、破損部に生物学的網膜パッチを適用することにより、破損した網膜組織を復元する。別の局面では、網膜を破損した対象の視覚喪失を、生物学的網膜パッチの適用により矯正する方法が提供され、該生物学的網膜パッチは、工学的に操作された網膜組織;エレクトロスパン・バイオポリマー足場;および接着剤を含み、該網膜組織は該接着剤により該バイオポリマーに固着される。

さらなる局面および態様を以下に記載する。

本明細書に記載の技術は、以下の図面を参照することにより、より完全に理解されよう。これらの図面の目的は説明のみである。

本開示の特定の態様による、網膜下グラフトの図を示す。 特定の態様による、hPSC由来網膜組織（オルガノイド）およびバイオ補綴足場サポートを含む、バイオ補綴網膜パッチの図を示す。 特定の態様による、多数のhPSC由来網膜組織片および1つのバイオ補綴足場サポートを含む、バイオ補綴網膜パッチを示す。 特定の態様による、hPSC由来網膜組織（オルガノイド）、バイオ補綴足場サポート、およびRPE構成要素を含む、バイオ補綴網膜パッチの図を示す。 特定の態様による、hPSC由来網膜組織、バイオ補綴足場サポート、および感光性ダイオード（フォトダイオード）構成要素を含む、バイオ補綴網膜パッチの図を示す。 Birmingham Eye Trauma Terminology System（BETTS）を記載したチャートを示す。 網膜を含めニューロンで発現するカルレチニンマーカー CALB2に対し特異的な抗体で染色された、hPSC由来網膜組織の画像を示す。 網膜細胞質マーカー リカバリン（RCVRN）に対し特異的な抗体で染色された、hPSC由来網膜組織の画像を示す。 ヒト胎児網膜と比較される、網膜オルガノイド（網膜組織バイオ補綴グラフト）のFACS分別PR細胞のグラフトを示す。 図4Aは、マウスモデルの網膜上スペースに移植されたhESC由来網膜前駆細胞（hESC-RPC）の網膜との統合および成熟のICH画像を示す。図示のように、ヒト前駆細胞の大半が早期ニューロンマーカー Tujl陰性であり、それらが遊走し、そしてホストの網膜神経節細胞（RGC）層または内顆粒層（INL）に統合されているのがわかる。図4Bは、植え込まれたhESC由来網膜前駆細胞がホスト網膜下部位の大面積へ遊走しているICH画像を示す。図4Cは、植え込まれた網膜上hESC-RPCの細胞がホストの網膜神経節細胞（RGC）層、内網状層、および内顆粒層（INL）に統合されているICH画像を示す。 図5Aは、網膜組織バイオ補綴グラフトの移植の画像を示す。図5Bは、ウサギ眼内の染色されたhESC-RPC網膜上グラフトのICH画像を示す。ヒト網膜オルガノイドの一部がヒト核マーカー HNuで染色されて、ウサギ眼内の網膜上スペースに移植されたヒト網膜オルガノイドのヒト網膜前駆細胞を示している。この試料はDAPIで対比染色も実施した。図5Cは、ウサギ眼内の染色されたhESC-RPC網膜上グラフトのICH画像を示す。ヒト網膜オルガノイドの一部がヒト核マーカー HNuで染色されて、ウサギ眼内の網膜上スペースに移植されたヒト網膜オルガノイドのヒト網膜前駆細胞を示している。図5Dは、大型動物モデル（ウサギ）におけるヒト網膜オルガノイドのICH画像を示し、ウサギ（眼の大きい動物モデル）の眼内スペースに、本明細書に記載の網膜オルガノイドを、毛様体扁平部切開を介しガラスカニューレを用いて眼球に破損を与えずに送達することができることを、実証している。眼球は首尾よく保存され、染色されて、ヒト網膜細胞の場所を示している。 特定の態様による、衝撃波管の概略図および対応する画像を示す。 図7Aは、網膜に対するリスク曲線を示す。特定の爆風強度（比推力をkPa-msで表す）で所与のCISの損傷を受ける確率を曲線で示す（赤=CIS 1；緑=CIS 2；CIS 3；黒=CIS 4）。図7Bは、視神経に対するリスク曲線を示す。特定の爆風強度（比推力をkPa-msで表す）で所与のCISの損傷を受ける確率を曲線で示す（赤=CIS 1；緑=CIS 2；CIS 3；黒=CIS 4）。 眼の大きい動物モデル（野生型ネコ）の網膜下スペースに移植後のhESC由来網膜組織グラフトのOCT画像である。 ネコの眼球に移植後のhESC由来網膜のHNu抗体による免疫染色の画像であり、正しい場所にある網膜グラフトの存在を示している。 図10Aは、移植前にシャーレから切り出されたhESC-3D由来網膜組織（網膜オルガノイド）の画像を示す。図10Bは、移植前にシャーレで成長している、切り出されたhESC-3D由来網膜オルガノイドの画像を示す。図10Cは、シャーレで成長しているhESC-3D由来網膜オルガノイドのさらなる画像を示す。図10Dは、盲目免疫不全ラットの眼内のhESC-3D由来網膜組織バイオ補綴グラフトが、適用後に層をなし重なることを実証する、IHC画像を示す。図10Eは、hESC-3D由来網膜組織バイオ補綴グラフトが、層をなし重なることを実証する、IHC画像を示す。図10Fは、盲目免疫不全ラットの眼内に植え込まれたhESC-3D由来網膜組織バイオ補綴グラフトが、ラットRPEにすぐ隣接する外層に外節様突起を有している、ICH画像を示す。 Hib-E中4℃で一晩かけて輸送された後に網膜組織の生存率が維持されたことを実証するICH画像を示す。矢印は、植え込まれた生存可能なヒト細胞を強調している。 図12Aから図12Cは、手術チームがhESC-3D網膜組織を野生型ネコの網膜下スペースに移植している画像を示す。図12Dは、眼圧調節装置、およびグラフトを撮像するRetCam装置を示す。図12Eは、眼内手術のためにネコの眼内に挿入された2つのポートを示す。図12Fは、網膜下スペースにhESC-3D網膜組織バイオ補綴グラフトを移植するための、網膜剥離（ブレブ）を示す。図12Gは、hESC-3D網膜組織を注入するためのカニューレを示す。図12hは、RetCamで撮像した野生型ネコの網膜下スペースのhESC-3D網膜組織を示す。図12Iは、野生型ネコの網膜下スペースに配置された移植後5週間のhESC-3D網膜組織の、OCT画像の場所を示す。図12Jは、野生型ネコの網膜下スペースに配置された移植後5週間のhESC-3D網膜組織の断面OCT画像を示す。図12Kは、グラフトの全寸法を見積もるためのOCT画像の3D再構築を示す。 図13Aは、薄切の準備としてPFA固定され、凍結保護され、OCT飽和された、網膜下グラフトを有するネコの眼球を示す。図13Bは、OCT中凍結されたネコの眼球の断面を示す。図13Cは、OCT中のネコの眼球の、厚さ16μmの切片を示し、網膜中心の膨らみとしてグラフトが示されている。図13Dは、hESC-3D網膜組織グラフトの保存を示す、凍結切片の部位の拡大画像を示す。 図13Eは、網膜下スペースに移植後5週間のhESC-3D網膜組織グラフトを有するネコ網膜切片のIHC画像を示す。グラフトは、多数のCALB2（カルレチニン）陽性ニューロンの存在を示しており、矢印はヒトグラフトとネコのONLとを結合しているCALB2[+]軸索を指している。図13Eから図13Gは、それぞれHNu、Ku80、およびSC121（ネコではなく）ヒト特異性抗体で染色された、ネコの網膜下スペースのhESC-3D網膜組織グラフトの画像を示す。これらの結果は、実にヒト組織がネコの網膜下スペースの正しい場所に移植されていることを実証する。図13Hは、BRN3A（RGCのマーカー）およびヒト核マーカーによる染色の画像を示す。アステリスクは、メイン画像中のマーカーを有する部分を示し、差し込み図で拡大されている。これらの結果は、グラフト内の細胞の一部が、RGCへと成熟中であることを示す。 図13Iから図13Kは、（ネコではなく）ヒト-シナプトフィジン（hSYP）に対し特異的な抗体および軸索マーカーNFL（ネコとヒト両方のニューロンに特異的）での染色を示し、また、点状染色（矢印）の存在が示されているが、それはネコニューロンに統合されているヒトニューロンにより形成されている可能性があるシナプスを示す。 図13Lから図13Mは、（ネコではなく）ヒト-シナプトフィジン（hSYP）に対し特異的な抗体および軸索マーカーNFL（ネコとヒト両方のニューロンに特異的）での染色を示し、また、点状染色（矢印）の存在が示されているが、それはネコニューロンに統合されているヒトニューロンにより形成されている可能性があるシナプスを示す。 図14Aおよび図14Bは、（ネコではなく）ヒト特異性シナプトフィジン抗体hSYP（赤）、およびネコとヒト両方のニューロンを染色するカルレチニン（緑）の画像を示す。図14Cおよび図14Dは、より低倍率の画像を示し、hESC-3D網膜組織グラフトを有する大片のネコ網膜の概略を提供する。 図15Aから図15Cは、ネコINLとグラフト中のカルレチニン[+]ヒト細胞とを結合しているカルレチニン[+]軸索（矢印）の画像を示す。図15Dおよび図15Eは、成熟しているように見えるグラフト中のカルレチニン[+]ニューロン、およびグラフト全体に見られたカルレチニン[+]軸索の画像を示す。 図16Aから図16Cは、ネコ網膜下スペースにおけるhESC-3D網膜組織グラフト縁部の染色の画像を示す。SC121ヒト細胞質特異性抗体（赤）およびKu80ヒト核特異性抗体（緑）は、ネコ網膜ではなくヒト網膜グラフトを染色する。これらの画像から、グラフトとホストとの間に結合性があることがわかる。 図16Dおよび図16Eは、hESC-3D網膜組織グラフトからの軸索が、グラフトにすぐ隣接する層内のネコPRに巻き付いているのを示す画像であり（矢印）、また、一部のSC121+ヒト軸索がネコのONLにかかっているのがわかる（矢印）。 ネコに植え込まれた網膜オルガノイドの、網膜下スペースへの移植直後に撮像されたRetCam画像を示す。 図18Aおよび図18Bは、ヒトとネコの眼球構造を比較する図を示す。 特定の態様による、網膜オルガノイドの分化のタイムラインの一例を示す。 図20Aから図20Eは、hESC由来網膜組織における網膜前駆細胞マーカーおよび早期光受容体マーカーの画像を示す。 図20Fから図20Iは、hESC由来網膜組織における網膜前駆細胞マーカーおよび早期光受容体マーカーの画像を示す。 経扁平部硝子体切除術後にガラスカニューレを使って野生型ネコの眼球の網膜下スペースにhESC由来網膜組織バイオ補綴グラフトを移植する画像を示す。 hESC由来網膜組織バイオ補綴グラフトが中に移植される網膜下ブレブの画像を示す。 hESC由来網膜組織バイオ補綴グラフトの移植後3週間で撮影したカラー眼底画像およびOCT画像を示す。 マイクログリアおよびマクロファージに対し特異的な抗体を用いて染色された、第1群（+プレドニゾン、-シクロスポリンA）のネコ網膜切片の画像を示す。 同じくマイクログリアおよびマクロファージに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）から採取したネコ網膜切片の画像を示す。 第1群（+プレドニゾン、-シクロスポリンA）と第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片中のマイクログリアおよびマクロファージ細胞マーカー陽性細胞数を比較したグラフを示す。 図27Aは、光受容体マーカー CRXに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片の画像を示す。図27Bは、ヒト特異性抗体、HNuを用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片の画像を示す。図27Cは、CRXおよびHNu両方に対する抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片の画像を示す。 図28Aは、網膜神経節細胞（RGC）マーカー BRN3Aに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片の画像を示す。図28Bは、BRN3A、およびヒト特異性マーカー KU80の両方で染色された、第2群のネコ網膜切片の画像を示す。図28Cは、BRN3A、ヒト特異性マーカー KU80、およびDAPIで染色された、第2群のネコ網膜切片の画像を示す。 図29Aは、網膜を含めてニューロンで発現するカルレチニンマーカー CALB2に対し特異的な抗体を用いて染色されたネコ網膜切片の画像を示す。図29Bは、マーカー SC121のIHC染色の画像を示す。SC121に対する抗体は、ヒト細胞の細胞質に対し特異的である。図29Cは、マーカー CALB2、SC121、およびDAPIに対し特異的な抗体を用いて染色されたネコ網膜切片の画像を示す。 図30Aは、ネコ網膜に向かって伸びている網膜グラフトの軸索（CALB2マーカーに対し特異的な抗体を用いて染色されている）のICH画像を示す。図30Bは、ヒト細胞マーカー HNuおよびCALB2に対し特異的な抗体を用いて染色されている網膜グラフトのICH画像を示し、そうすることでネコ網膜からのグラフトを描写している。図30Cは、グラフト軸索のGABA陽性染色のICH画像を示し、レシピエント網膜に統合されている植込み組織の軸索が、ニューロンとなるように分化していることを示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 網膜変性（RD）を有するCRX-変異体ネコの網膜下および網膜上スペース内のヒトESC由来網膜オルガノイドのOCT画像を示す。 野生型ネコの眼球の網膜下スペースへの適用後5週間の、BDNF発現陽性hESC由来網膜組織を含むバイオ補綴網膜グラフトのICH画像を示す。

詳細な説明
本明細書に記載のバイオ補綴網膜グラフト（またはデバイス）は、網膜変性疾患および障害の治療に用いることができる。たとえば、バイオ補綴網膜グラフトは、幹細胞由来の組織または細胞を含む場合がある。いくつかの態様では、バイオ補綴網膜グラフトは、バイオ補綴網膜パッチを形成するために、対象の眼の眼内スペースへの植え込みに適した担体および足場も含む場合がある。特定の態様では、バイオ補綴網膜パッチは、担体または足場上に複数の幹細胞由来組織片または細胞片を含む場合があり、大面積の網膜変性または破損の治療に用いることができる。

本開示は、対象の、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療における治療用途に適した、細胞および／または組織組成物、ならびに細胞および／または組織組成物を調製する方法に関する。

「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、限定ではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ならびに野生動物、飼育動物、および家畜などの、あらゆる哺乳類を含む非ヒト脊椎動物、たとえばネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、げっ歯類、たとえばマウスおよびラットを含む。いくつかの態様では、「対象」という用語は、雄性を指す。いくつかの態様では、「対象」という用語は、雌性を指す。

「治療」「治療する」「治療される」または「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、治療的処置または予防もしくは予防対策を指すことができ、その目的は望ましくない生理学的状態、症状、障害、または疾患を予防するか緩慢化（軽減）すること、あるいは有益なまたは所望の臨床結果を得ることである。いくつかの態様では、この用語は、治療と予防の両方を指す場合がある。本開示の目的では、有益なまたは所望の臨床結果には、限定ではないが、症状の寛解；状態、障害、または疾患の程度の減衰；状態、障害、または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）；状態、障害、または疾患の発症の遅延または進行の緩慢化；状態、障害、または疾患の状態の緩和；ならびに検出可能であってもなくても軽快（部分的または完全）、あるいは状態、障害、または疾患の改良または改善のうち１つまたは複数が含まれる。治療には、臨床的に意味のある応答を引き出すことも含まれる。治療にはまた、治療を受けなかった場合に予測される生存率と比べて生存率を延ばすことも含まれる。

網膜インプラント
本開示の諸局面は、対象の外傷性損傷または疾患を原因とする視覚喪失を、破損部位に網膜組織を復元することにより、治療、回復、かつ／または改善する組成物および方法を提供する。特定の態様では、本開示は、たとえば生体適合性吸収性マトリックス、足場、および／または担体を用いて、工学的に操作された網膜組織を罹患部位に送達して、対象の視覚喪失を回復させる方法を提供する。網膜組織の工学的操作および送達の用途では、大面積の破損組織がある場合、大量の、工学的に操作された網膜組織を付着させる生体適合性足場を作製して、対象の眼球に制御下で配置することが有益である。

一局面では、対象の広範な眼球および網膜の閉鎖性損傷後の視覚の回復、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療に有用な、ヒト多能性幹細胞（hPSC）、ヒト胚性幹細胞（hESC）および／または組織、および／またはヒト胎児網膜組織または成体網膜組織に由来する、移植可能な生物学的網膜パッチまたは生物学的網膜補綴デバイスを提供する。

図1Aは、本開示の特定の態様による、対象の眼球の網膜下スペースに植え込まれている網膜下グラフトの図を示す。図1Bは、hPSC由来組織（オルガノイド）およびバイオ補綴足場サポートを含む、バイオ補綴網膜パッチの図を示す。

一局面では、ヒト多能性（または胚）幹細胞由来組織（hPSC由来網膜組織またはhPSC-3D網膜組織）を、対象の眼球の網膜下または網膜上スペースへの移植に用いることができる。hPSC-3D網膜組織は、視覚回復治療法の大きな進歩の代表格であり、hESCから生産された網膜組織は、移植後も完全に分化し、そしてレシピエントの網膜とのシナプス結合性を再建する、本来の能力を維持している。hESC-3D網膜組織の小切片は、重要な光覚細胞である光受容体を、約1,000〜2,000、または2,000〜3,000、または1,000〜5,000、3,000〜1万、または5,000〜10万、または5万〜50万、または10万〜100万、またはそれ以上含む場合がある。極薄の生体材料の1枚のパッチに多数の個々のhESC-3D網膜組織片を配置することで、視覚改善のための、大きくかつ可撓性の（しかし移植可能な）生物学的網膜組織バイオ補綴パッチを生産することができる。この網膜組織視覚矯正製品は、本明細書に記載のグラフトおよびパッチが網膜組織グラフトの精密かつ制御下の配置を可能にするので、手術ミスを減じることができる。

特定の態様では、平たくした筒（つまりディスク）に似た形状の、インビトロで工学的に操作された三次元網膜組織が、網膜色素上皮（RPE）細胞の中心コア、ならびに該RPE細胞コアから半径方向外側に向かうように、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層（成熟網膜の内顆粒層に相当）、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層を含む。これらの各層は、完全に分化している、層を特徴づける細胞を有する場合があり、また任意で、層を特徴づける分化した細胞の前駆体を含む場合もある。たとえば、RPE細胞層（またはコア）は、RPE細胞および／またはRPE前駆細胞を含む場合があり；PR細胞層はPR細胞および／またはPR前駆細胞を含む場合があり；内顆粒層は二次網膜ニューロンおよび／または二次網膜ニューロンの前駆体を含む場合があり；RGC層はRGCおよび／またはRGC前駆細胞を含む場合がある。いくつかの態様では、本明細書に記載の異なる層内の前駆細胞は、移植後、完全に分化する能力を有する。

「hPSC由来3D網膜組織」、「hPSC由来3D網膜オルガノイド」、「hPSC-3D網膜組織」、「インビトロ網膜組織」、「hPSC由来網膜組織」、「網膜オルガノイド」、「網膜スフェロイド」、および「hPSC-3D網膜オルガノイド」という用語は、本開示では交換可能に用いられ、網膜組織を含む多能性幹細胞由来の三次元凝集物を指す。hPSC由来3D網膜オルガノイドは、ほとんどのまたは全ての網膜層（RPE、PR、内側網膜ニューロン（すなわち、内顆粒層）および網膜神経節細胞）を発達させ、特定のオルガノイドでは早くもおよそ4〜8週間でシナプス形成および軸索形成の開始を見せ、hESC-3D網膜発達のおよそ3カ月か4カ月でより顕著になる。本明細書で開示される3D網膜オルガノイドは、成体の幹細胞マーカーであって、WNT経路の重要なメンバーである、LGR5遺伝子を発現し得る。また、hPSC由来3D網膜オルガノイドを、遺伝子工学的操作により、分化を強化するために関心対象の導入遺伝子を一過的にまたは安定的に発現させること、および／またはレポーターとすること、および／またはhPSC-3D由来組織コンストラクトもしくはそのような組織コンストラクトに由来する細胞の神経保護特性を強化することができる。

本開示はhESC由来3D網膜組織に言及しているが、当業者であれば、あらゆる多能性細胞（ES細胞、iPS細胞、pPS細胞、単為生殖生物由来ES細胞など）、ならびに胚の、胎児の、および／または成体の網膜を本開示の方法の3D網膜組織の供給源として使用できることを理解しよう。

本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」（ES）は、（胚の、人工の、または両方の）多能性幹細胞を指し、（1）細胞が三胚葉へと実質的に分化する前の、胚盤胞に由来する（ES）；または（2）もう一つの選択肢として株化細胞系から得られる（iPS）。特に断らない限り、この用語は、ES細胞の表現型特徴をもつ初代組織および株化細胞系、ならびにそれらの細胞系の多能性表現型をもつ子孫を含む。ES細胞は、ヒトES細胞（hES）であってもよい。プロトタイプのhES細胞がThomsonらにより記載されており（Science 282:1145 (1998);および米国特許第6,200,806号）、また、UK Stem Cell Bank （英国ハートフォードシャー）およびNational Stem Cell Bank （米国ウィスコンシン州マディソン）などの確立された数々の幹細胞バンクのいずれか1つから入手することもできる。

本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞」（pPS）は、あらゆる供給源に由来し得、そして適切な条件下で、三胚葉（内胚葉、中胚葉、および外肺葉）全ての類縁体である異なる細胞型の子孫を生産することができる細胞を指す。pPS細胞は、8〜12週齢SCIDマウスのテラトーマを形成する能力、および／または組織培養において三肺葉全ての同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。多能性幹細胞の定義には、ヒト胚幹（hES）細胞（たとえばThomson et al. (1998) Science 282:1145参照）およびヒト胚性生殖（hEG）細胞（たとえばShamblott et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 13726参照）；他の霊長類の胚性幹細胞、たとえばアカゲザル幹細胞（たとえばThomson et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844参照）、マーモセット幹細胞（たとえば(1996) Thomson et al., Biol. Reprod. 55:254参照）、核移植技術により作製された幹細胞（米国特許出願公開第2002/0046410号）、ならびに人工多能性幹細胞（たとえばYu et al., (2007) Science 318:5858参照）;Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861）などの様々な種類の胚細胞が含まれる。pPS細胞は、細胞系として株化されている場合があり、したがってpPS細胞の連続的な供給源になり得る。

本明細書で使用する場合、「人工多能性幹細胞」（iPS）は、成体体細胞の脱分化により得られる、胚様幹細胞を指す。iPS細胞は多能性である（すなわち、胚の三胚葉それぞれに見られる少なくとも１種の細胞型へと分化することができる）。そのような細胞は、分化組織（たとえば皮膚などの体組織）から得ることができ、細胞が胚性幹細胞特徴を獲得するようにプログラムし直す遺伝子操作により、脱分化させることができる。たとえば、人工多能性幹細胞は、体性幹細胞においてOct-4、Sox2、Kfl4、およびc-Mycの発現を誘導することにより得ることができる。したがって、iPS細胞は、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞にOct-3/4、Sox2、c-Myc、およびKLF4などの転写因子をレトロウイルス的に遺伝子導入することで生成することができる。Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, l(l):39-49; Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb. 14. (印刷前Epub); 111 Park, Zhao R, West J A, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451 : 141-146; K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131 :861-872。他の胚様幹細胞は、レシピエント細胞が有糸分裂で停止している場合、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、または接合体への核移植により、生成することができる。

本開示の方法では、以下に定義する胚性幹細胞（hES細胞など）、胚様幹細胞（iPS細胞など）、およびpPS細胞がどれでも使用できることが理解されよう。具体的には、hESC由来3D網膜オルガノイド／網膜組織は、あらゆる種類の多能性細胞から誘導できることが理解されよう。

3D網膜オルガノイドを誘導するための、ある例示的方法では、多能性細胞（たとえば、hESC、iPS細胞）を、ノギンタンパク質の存在下（たとえば最終濃度50〜500 ng/mlの最終濃度）、3〜30日間培養する。次に、培養物に、ノギンのほかに、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を添加し（たとえば、最終濃度5〜50 ng/ml）、さらに0.5〜15日間培養を続ける。そして、培養物に、既存のノギンおよびbFGFのほかに、モルフォゲン、Dickkopf関連タンパク質1（Dkk-1）およびインスリン様増殖因子-1（IGF-1）（それぞれたとえば5〜50 ng/ml）を添加し、さらに1〜30日間培養を続ける。そして、培養物からDkk-1およびIGF-1を除去し、培養物に、ノギンおよびbFGFのほかに、線維芽細胞増殖因子-9（FGF-9）を添加する（たとえば5〜10ng/ml）。ノギン、bFGF、およびFGF-9の存在下、網膜組織が形成するまで、たとえば1〜52週間培養を続ける。3D網膜オルガノイド／組織を誘導するための追加の方法が、2017年10月12日公開の国際公開公報第2017/176810号に記載されており、参照により全体が本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様では、適用前にオルガノイド（hPSC由来網膜組織）を分離させる場合がある。オルガノイドは、発生または培養から約1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間で分離させる場合がある。いくつかの態様では、オルガノイドを、発生または培養から10週間後に分離させる場合がある。オルガノイドは、溶液中懸濁により、または機械的に、たとえばガラス棒、ふるい、ブレード、疎水性もしくは親水性表面、または任意の他の適切な手段により、その成分の細胞型へと分離させることができる。特定の態様では、細胞組成物は、hESC-3D網膜組織の、パパインを用いた分離により、hESC-3D網膜組織から調製される。

本明細書に記載のオルガノイド、または発生中もしくは分化中のオルガノイドは、非付着条件で、または付着・非付着条件を組み合わせて、培養かつ／または生産してもよい。いくつかの態様では、オルガノイドまたは発生中のオルガノイドを、基質上で培養し操作する場合があり、それに続いて非付着条件で培養する場合がある。いくつかの態様では、オルガノイドを、基質上で培養し操作する場合があり、それに続いて付着条件で培養する場合がある。いくつかの態様では、オルガノイドを、非付着条件で培養し操作する場合があり、それに続いて付着条件で培養する場合がある。いくつかの態様では、オルガノイドを、非付着条件で培養し操作する場合があり、それに続いて非付着条件で培養する場合がある。

特定の態様では、バイオ補綴網膜グラフトは、約0.5 mm x 0.5 mm〜約2 mm x 2 mmの寸法を有する、hPSC由来オルガノイドを含む。他の態様では、バイオ補綴網膜グラフトは、約0.5 mm〜約2 mmの寸法を有する、hPSC由来オルガノイドを含む。

特定の態様では、ヒト眼細胞療法の治験で試験済みの、補充可能な幹細胞供給源となる、商標権等を有するcGMPグレードのhPSC株を用いることができる。

いくつかの態様では、治療用途に適した細胞組成物が、変性中の網膜細胞に栄養サポートを送達することができる、cGMPグレードのヒト網膜前駆細胞の凍結保存ストックを含む細胞療法製品として、調製される場合がある。さらに、図3A〜図3Cに示すように、シャーレ内で誘導されるオルガノイドの網膜組織は、ヒト胎児網膜に非常に似ていて、光受容体の含有率はほぼ同じであり（図3C）、初代ヒト網膜前駆細胞の優れたかつ補充可能な供給源である。図3Aは、網膜を含めニューロンで発現するカルレチニンマーカー CALB2に対し特異的な抗体で染色された、hPSC由来網膜組織の画像を示す。図3Bは、網膜細胞質マーカー リカバリン（RCVRN）に対し特異的な抗体で染色された、hPSC由来網膜組織の画像を示す。

一局面では、移植可能な生物学的網膜補綴デバイスは、ヒト多能性幹細胞由来組織（hPSC-3D網膜組織またはhPSC由来網膜組織またはオルガノイド）、ヒト胚性幹細胞（hESC）および／または組織、および／またはヒト胎児網膜組織もしくは成体網膜組織、ならびに生体適合性担体または足場を含んで、バイオ補綴網膜パッチを形成する。

いくつかの局面では、生体材料担体または足場またはマトリックスまたは送達ビヒクルは、シート、エマルジョン、ネットワーク、スラリー、または溶液などの構造物の場合がある。いくつかの局面では、生体材料担体は、エレクトロスピニング、印刷、固着、被覆、凍結乾燥、または架橋されている場合がある。生体材料担体または足場またはマトリックスは、繊維、リッジ、マイクロ針、および／または他の構成特徴などの、複数の構造または特質を含み得る。生体材料担体は、ポリホスファゼン、ポリ無水物、ポリアセタール、ポリオルソエステル、ポリホスホエステル、ポリカプロラクトン、ポリウレタン、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリサッカライド、ポリアミノ酸、他のポリマー、タンパク質、金属、またはセラミックスなどの生体適合性材料で構成され得る。いくつかの局面では、生体材料担体は、全体的または部分的に、ヒアルロナンベースのヒドロゲルの誘導物、たとえばHYSTEM（登録商標）ヒドロゲル（BioTime, Inc.）で構成され得る。いくつかの態様では、生体材料担体または足場は、前述の特質および材料の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、担体または足場は、熱可逆性材料および／または形状記憶金属を含み得る。足場（およびバイオ補綴網膜パッチ）は、hPSC組織および／または細胞および／または他の構成要素、たとえばエキソソームまたは栄養因子の送達に適したどのような形状であってもよい。

生物学的足場またはサポートは、たとえばエレクトロスパン・ポリマーを含み得る。一態様では、エレクトロスパン・ポリマー足場は、ブルッフ膜（Brunch's membrane）の特徴をもつ。いくつかの局面では、生体材料の細いエレクトロスパン・ナノファイバーは、HYSTEM（登録商標）ヒドロゲル（BioTime, Inc.）の誘導物を含む。

いくつかの態様では、生体材料担体または足場は、複雑で脆い細胞およびマクロ分子の成功裏の送達および／またはインサイチューの固定に必要な特徴を全て有するものが用いられ得る。

最近、3D細胞培養、幹細胞の増殖および分化、組織工学、再生医療、ならびに細胞ベースの治療用の、天然の細胞外マトリックス環境（ECM）を模倣したヒアルロナンベースのヒドロゲルのファミリー（商品名HYSTEM（登録商標）およびRENEVIA（登録商標））が開発された。HYSTEMヒドロゲルは、機能的な細胞外マトリックスを得るのに必要な最小限の組成を再現するよう設計された。ヒドロゲルの各構成要素は、インサイチューで架橋可能であり、インビボ注入前に細胞を播種することができ、細胞もレシピエント組織も損なうことがない。

HYSTEM（登録商標）ヒドロゲルの根底にある技術は、独特のチオール架橋戦略に基づくもので、チオール修飾ヒアルロナンおよび他のECM構成成分から、ヒアルロナンベースのヒドロゲルを調製する。これを土台として、生体適合性吸収性ヒドロゲルのユニークなファミリーが開発された。HYSTEM（登録商標）ヒドロゲルの基本要素は、ヒアルロナンおよびゼラチンであり、これらがそれぞれ、カルボジイミドが媒介するヒドラジドの化学反応によりチオール修飾されている。ヒドロゲルは、これらのチオール化マクロ分子とポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDA）との架橋性混合物により形成される（米国特許第7,928,069号および同第7,981,871号を参照。参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ゲル化速度およびヒドロゲルの堅さは、架橋剤の量を変えることで制御することができる。これらのヒドロゲルの一つの属性は、98%超の高い水分含有量であり、その結果として、酸素、栄養分、および他の水溶性代謝物の透過性が高くなる。

HYSTEM（登録商標）などのヒドロゲルは、2D培養でも3D培養でも多様な細胞型および組織の付着および増殖をサポートすることがわかっており、動物試験ではインビボの植え込みで高度な生体適合性を示している。これらのヒドロゲルは、インビトロでは容易に分解し、インビボではコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ酵素を介した加水分解により吸収される。これらのヒドロゲルに植え込まれると、細胞はヒドロゲル内に付着し局在化したままであるが、植え込まれたマトリックスを徐々に分解し、該マトリックスを該細胞の天然のECMで置換する。

架橋剤は、たとえば、チオールに反応する二官能分子、三官能分子、多官能分子（たとえばマレイミド基）、架橋を開始する酸化剤（たとえばGSSG）、グルタルアルデヒド、および環境的影響（たとえば、熱、ガンマ線／電子線）を含み得る。いくつかの態様では、架橋剤は必要ない。

本開示の態様で使用される、吸収性マトリックスを提供するのに適したヒドロゲルの具体例が記載されているが、あらゆる好適な生体適合性マトリックスを使用してもよいことが理解されよう。たとえば、酸化グルタチオン（GSSG）を架橋剤として用いて作製されたゲルを使用してもよい（米国特許出願公開第20140341842号を参照。参照により全体が本明細書に組み入れられる）。

担体または足場は、網膜組織などの脱細胞組織からなり得る。脱細胞組織は、無傷でも、破壊されていても、または操作されていても、または成熟組織であってもよい。バイオ補綴網膜インプラントは、全体的または部分的に、複数片のヒト胚様体網膜、または胎児網膜組織、または成体網膜組織から、またはオルガノイド細胞またはその他から、または生体材料から、あるいはそれらの組み合わせからなり得る。

本明細書に記載の細胞、組織、および生体適合性担体、マトリックス、および足場の組成物は、適用された組織の増殖を誘起するので、治療結果はたとえば18カ月を超えて長続きし得る。いくつかの態様では、担体または足場は、栄養分、栄養因子、および酸素を透過させる。

いくつかの態様では、バイオ補綴担体または足場は、細胞培養物と送達基質を兼ねる場合がある。

いくつかの態様では、バイオ補綴網膜パッチは、長さx幅x厚さが約0.5 mm x 1 mm x 1 μm〜8 mm x 12 mm x 100 μmの寸法を有する。いくつかの態様では、バイオ補綴網膜パッチは、長さx幅x厚さが約2 mm x 4 mm x 50 μmである。他の態様では、バイオ補綴網膜パッチは、長さx幅x厚さが約4 mm x 6 mm x 10 μmである。いくつかの態様では、バイオ補綴網膜パッチの面積は、約3 mm x 6 mm、約4 mm x 6 mm、約4 mm x 5 mmである。

いくつかの態様では、バイオ補綴網膜グラフトまたはパッチは、植え込み後、任意の好適な材料を用いて係留される場合がある。

一局面では、網膜組織と生体適合性足場とは、生体適合性接着剤で互いに接合される。

別の局面では、オルガノイド片を生体適合性足場に埋め込むことを含む方法により細胞療法が調製され、ここで生体適合性足場は当初は液体の形態で調製され、次いでゲルを形成するが、完全に固化する前に片が液体足場中に入れられ、したがって足場がゲル化するとオルガノイド片はゲルに埋め込まれることになる。一態様では、グラフトは、足場が完全にゲル化する前に適用される場合がある。別の態様では、グラフトは、生体材料のサスペンション中、または生体材料もしくは生体適合性接着剤と一緒に、またはそれらの組み合わせで適用される場合がある。

いくつかの態様では、オルガノイドは、インテグリンまたはフィブロネクチンなどの天然のタンパク質または小分子架橋剤により、生体適合性足場に架橋される場合がある。いくつかの局面では、数片の網膜組織が大きな生体材料足場に固定されまたは付着して、大きな網膜インプラントまたは生物学的網膜補綴デバイスを作る。

いくつかの態様では、オルガノイドは、担体、基質、またはレシピエント組織への付着力が増すように改造されている場合がある。

いくつかの局面では、図1Cに示すように、数片の網膜組織が生体材料の薄膜に固定されまたは付着して、インプラントまたは生物学的網膜補綴デバイスを作っている。いくつかの局面では、図1Dに示すように、生体材料の薄膜は、オルガノイドを含むものとは別の、RPE層、RPEシート、RPE細胞、前駆細胞または細胞型などの生物学的構成要素を含む場合がある。

いくつかの局面では、オルガノイドまたは生物学的構成要素を、培養することができ、または酵素的に溶解する非生物分解性担体または足場に付着させることができ、網膜組織および／または他の生物学的構成要素を生物分解性担体または足場に付着させて植え込むことができる。

特定の態様では、網膜組織および生物学的足場は、インプラントとして記載される場合がある。特定の態様では、網膜組織および生体適合性担体または足場は、医療デバイスまたは生物学的網膜補綴デバイスとして記載される場合がある。

いくつかの局面では、それぞれが約1,000〜2,000または2,000〜3,000、または1,000〜5,000、3,000〜1万、または5,000〜10万、または5万〜50万または10万〜100万の光受容体を担持する複数の三次元（3D）網膜組織片を、薄いまたは極めて薄い可撓性生体材料に設置することができ、該光受容体は視覚情報を捉えて対象のRGCに、シナプス的に（または他の手段により）送信し、該情報は次に対象の視覚野に伝えられることになる。植え込まれた全組織片は、およそ1,000〜2,000または2,000〜3,000、または1,000〜5,000、3,000〜1万、または5,000〜10万、または5万〜50万または10万〜100万またはそれ以上の個々の光センサー、すなわち光受容体を有する、広い視角（生物学的網膜パッチの寸法に応じて最大30°）を作ることができるパッチまたは生物学的網膜補綴デバイスを生産することができ、有用かつ機能的な視覚をサポートする。これに比べて、ArgusII神経補綴デバイスには60個しかセンサーがなく、網膜下スペースに正確に配置されても、レシピエントは物体の形状の区別しかできない。

いくつかの態様では、オルガノイドを合成材料、センサー、チップ、または電子デバイスと組み合わせることができる。一態様では、hPSC由来網膜組織と、感光性構成要素もしくは層を形成する感光性ダイオード（フォトダイオード）を有する生体適合性材料を含むフィルムまたは生物学的足場またはマトリックスとを含む、バイオ補綴網膜パッチが記載されている。hPSC由来網膜組織またはオルガノイドは、本明細書に記載のいずれかの材料および方法を用いて感光性層と組み合わされ、またはそれに付着している。図1Eは、フォトダイオードを有するバイオ補綴足場の図を示す。フォトダイオード層は、ホストの、残存している機能的光受容体、およびパッチの網膜組織構成要素、特に網膜グラフト組織がなおも発生または分化している部位により、光に対する応答（光の捕捉、光を電気信号に変換して信号を送信すること）を強化することができる。

他の態様では、多数のhESC-3D網膜組織片および1つの生体適合性足場を含む大きなグラフトを対象の網膜下スペースに移植し、結果として腫瘍無しでのシナプス統合が得られる。いくつかの態様では、生体適合性足場は多孔性なので、シナプス結合ならびに細胞間および細胞層間の分子移動がより容易になる。

そのような技術の治療ターゲットは、PR死および失明と関連のあるヒトRDの諸状態、たとえば限定ではないが、網膜色素変性（RP）、および加齢黄斑変性（AMD）である。網膜オルガノイドから錐体のみのhPSC-3D網膜組織を誘導して、AMDなどの障害または疾患を治療することができる。生体工学チップ（たとえばSecondSight、ARGUS（登録商標）Π、60ピクセル）も同様の働きをするが、電子工学の限界および移植された電子チップの短寿命により、生物学的設計の性能が電子工学的設計を上回る可能性がある。生物学的網膜パッチは、ホストの組織に統合され、網膜オルガノイド一切片あたり数千個のPR（すなわちピクセル）を搭載し、また個々の疾患を治療するように合わせる（構築する）ことができる。

特定の態様では、眼内移植は、任意の許容可能な方法により、たとえば国際公開公報第2016/108219号（参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている方法により、実施することができる。

他の態様では、眼内移植は、機械的な電動の送達デバイス、たとえばMicro4 Controller付きUMP3 UltraMicroPump III（World Precision Instruments社）またはその変更形態を、メーカーの指示にしたがい使用することにより、実施することができる。

特定の態様では、送達デバイスは、カニューレを含む場合がある。カニューレは、約0.5 mm〜約2.5 mmまたは約1 mm〜約2 mmまたは約1.12 mmの内径を有し得る。また、カニューレは、約0.5 mm〜約3 mm、または約1 mm〜約2.5 mmまたは約1.25 mm〜約1.5 mmまたは約1.52 mmの外径を有し得る。

特定の態様では、バイオ補綴網膜グラフトまたはパッチは、カニューレを用いて対象の眼内スペースに送達される場合があり、図1Gに示すように、カニューレにはバイオ補綴網膜グラフトまたはパッチの前および／または後に気泡が導入されて、バイオ補綴網膜グラフトまたはパッチが所定位置にくる前にカニューレから出てしまうのを予防する。特定の態様では、バイオ補綴網膜グラフトまたはパッチの植え込みと同時に対象の眼球に眼内圧力を加えて、植え込み後にバイオ補綴網膜グラフトまたはパッチが所定の位置に留まるよう支援することができる。別の態様では、硝子体スペースにエピネフリンを注入して、網膜切開術などの切開を要する手順を用いてバイオ補綴網膜グラフトまたはパッチを適用した結果生じ得る出血を抑えることができる。

特定の態様では、手術手順は、限定ではないが、硝子体切除術、減張硝子体切除術、減張網膜切開術、網膜タックの使用、網膜剥離および黄斑の転位置を含む場合がある。クリニックでは、患者の網膜の大きな片を剥がして再度貼り付けることができる、減張網膜切開術が用いられている。これらの術法の目的を、対象の網膜下スペースに大きなバイオ補綴網膜を配置することに替えて、対象の眼球の大面積が視知覚を取り戻せるようにしてもよい。特定の態様では、本明細書に記載のバイオ補綴網膜グラフトおよびパッチの適用もしくは固定ならびに／または手術創の治癒の支援に適した接着剤、ステープル、または任意の他の好適な材料を用いる場合がある。

特定の局面では、より小さい切開部（約3 mm以下）に嵌るように、バイオ補綴グラフトまたはパッチを巻くことまたはそれ以外に圧縮することができる。その後グラフトまたはパッチは、図1Fに示すように、インサイチューで広がることができ、または拡張してもとの形状に戻ることができる。いくつかの態様では、グラフトまたはパッチは、対象の眼球に植え込まれると、さらなる外科的介入または操作なしに、もとの形状に戻ることができる。いくつかの態様では、グラフトまたはパッチは、さらなる操作なしで、植え込み後約2〜15秒以内にもとの形状に自ら戻ることができる。特定の態様では、グラフトまたはパッチは、対象の眼内に送達される前に一定の時間だけ送達デバイスに前もって装填および／または格納されていてもよい。

特定の態様では、いくつかのバイオ補綴網膜グラフトまたはパッチが、たとえばカニューレなどの送達構成要素を含む送達デバイスに装填される場合があり、それらが次々に眼内スペースに適用されて、大面積を覆う。

本開示の諸局面は、患者に、特に網膜の破損がひどすぎて神経保護のみでは保存できない患者に、頑健な視覚回復療法を提供し、該療法では個々の光受容体が、レシピエントの神経節細胞および／または他の網膜細胞もしくは支持細胞に恒久的にシナプス接続することができ、そして移植後12カ月以内に広い視角の回復または視覚緩和をもたらすことができる。この視覚回復法は、個々のセンサー（光受容体）が対象のRGCにシナプス接続するので、高効率かつ恒久的である。対照的に、網膜下に植え込まれた人工神経補綴デバイスは、たとえば爆風損傷または変性性疾患後に、網膜が概して無傷で残ってはいるが不可逆的変性が徐々に生じやすい網膜損傷部のRGCとの接触が徐々に減少する。

本明細書で使用する場合、「シナプス活性」または「シナプス的に」という用語は、2つのニューロン間のシナプス形成の特徴であるあらゆる活性または現象を指す。

本明細書に記載のバイオ補綴グラフトおよびバイオ補綴グラフトを作製する方法の治療効果の評価はたとえば、（たとえば爆風損傷後の選択時点での）視覚誘発電位（VPE）の増加により測定することができる。これは、脳に到達する視覚信号の強度を評価する信頼性の高い方法である。網膜電図検査、多焦点ERG、多電極アレイ（MEA）および／またはRetiMap法も使用することができる。

いくつかの態様では、グラフト（hPSC-3D網膜組織および／または細胞他）および／またはバイオ補綴網膜パッチ（hPSC-3D網膜組織および／または細胞等、ならびに生体適合性担体または足場）と、レシピエント網膜とのシナプス結合性を評価する、遺伝子経シナプストレーサー、WGA-HRP（レシピエント網膜ではなくインプラントにより発現）、WGA-Cre、ヒトSYP、SC121抗体または免疫電子顕微鏡法などの高度な方法の使用が提供されて、キメラ的（グラフト：レシピエント）シナプス結合性が実証される。この追跡によって、グラフトとホストとの結合が突き止めやすくなるだけでなく、細胞融合および神経保護と特異的シナプス統合との区別も可能になる。

いくつかの態様では、遺伝的網膜変性状態、網膜疾患、または網膜損傷を有するヒト対象と同様のPR変性、網膜変性および／または視神経変性を各々有する眼の大きい動物モデル、たとえばPde6a-/-イヌ、Aipl-/-ネコ、Cngb3-変異体イヌ、およびCrx-変異体[+/-]ネコ、Aipl-1変異体ネコ、または爆風による眼内損傷ウサギを、hPSC-3D網膜組織またはhPSC-3Dバイオ補綴網膜インプラント／グラフトの有効性を評価するために用いることができる。

いくつかの態様では、行動試験に加えて、限定ではないが、フルフィールドERG、多焦点ERG微小電極アレイ（MEA）、瞳孔撮像、および視覚誘発電位（VEP）などのインビボ読み取りアプローチにより、対象の網膜下スペースにhPSC-3D網膜組織を移植した後の視覚回復の程度を評価することができる。

いくつかの態様では、hPSC-3D網膜組織の網膜下グラフト（網膜オルガノイド；バイオ補綴網膜インプラント／パッチ）は、神経補綴デバイスの生物学的アナログとして作用することができ、視覚情報を捉えてシナプス的に網膜神経節細胞へ、そして視覚野へ送信することができる。別の態様では、インプラントは、対象の視知覚（光検出）の回復をサポートする。

さらに他の態様では、PR層および二次ニューロン層を担持するhPSC由来網膜オルガノイドバイオ補綴インプラント／パッチまたは生物学的網膜補綴デバイスは、対象のRGCに視覚情報をシナプス的に送信することができる光センサーを提供し、それらはPRがすべて変性した後も残存する。電子補綴チップとは異なり、hPSC由来網膜オルガノイドをベースとする「バイオ補綴」インプラントは、長期間持続するシナプス統合を可能にすることができ、また、黄斑を修復し再建するために杆体よりも錐体のほうを多く担持するように調節することもできる。いくつかの態様では、網膜下移植されたhPSC-3D網膜組織を使用している大多数の対象において、長期にわたる感光性の回復が見られ得る。

いくつかの態様では、対象の網膜回路と、hPSC-3D網膜組織グラフトとのシナプス結合性および機能的統合が、プレエンベディング免疫EM、網膜電図の記録、および多電極アレイの記録により実証され得る。

いくつかの態様では、網膜下スペースに移植されたhESC-3D網膜組織の、腫瘍無しでの生着が、少なくとも約6〜24カ月にわたり生じ、PR外節の伸長、シナプス形成、電気生理学的活性、およびレシピエント網膜細胞との結合性、ならびにより成熟した網膜免疫表現型への発達を含む、PR層およびRPE層の積層および発達を伴う。いくつかの態様では、hESC-3D網膜組織グラフトは、移植後約5〜10カ月以内に対象の視知覚を改善するが、それは一つには、ゆっくりと成熟しシナプス統合するためである。いくつかの態様では、グラフトとホストとの特異的シナプス結合性に加えて、グラフトとホストとの細胞質融合が実証される。

視覚障害患者の網膜下スペースへの胎児網膜の移植により、最大で10件中7件に視覚改善が見られている。胎児網膜グラフトが変性中の患者網膜に対し神経保護機構を介してプラスに影響した、と考えて差し支えなかろうが、グラフトとレシピエント網膜との間に特異的シナプス結合性が確立されている証拠もある。RDラットおよびRD患者の両方で、ヒト胎児網膜グラフトが視覚応答を改善することが見出されている（ラットでは上丘活性化、患者では視力改善[ClinicalTrials.gov ##NCT00345917, NCT00346060]）。

同様に、本開示のhPSC-3D網膜組織は、機能的PRをもたない盲目RDラットにおいて光誘起性の上丘応答を可能にすることがわかっており、グラフトのPRが脳に視覚情報を送信したことを示している。また、hPSC-3D網膜オルガノイドが、網膜下グラフト中、該グラフトが連続的な積層構造を維持していなかったにもかかわらず、PRの内節／外節および繊毛を発達させる証拠もある。hPSC-3D網膜組織は、ヒト胎児網膜に非常に似ていて、発生の約6〜8週間後に頑健なシナプス形成および電気活性を示し、かつピーナッツ凝集素（PNA）に対し免疫陽性の未発達の内節様突起を含んでおり、これらを総合すると、組織は、網膜下に移植されるとすぐに発達し、成熟し、かつシナプス統合していくことがわかる。したがって、本明細書では、免疫抑制された野生型ネコの網膜下スペースに移植されたhPSC-3D網膜組織のグラフト／ホスト結合性の証拠が提供される。まとめると、これらのデータは、hPSC由来3D組織およびバイオ補綴グラフトが、少なくともグラフトを受けた部位の網膜の感光性を回復させることができることを示している。

このアプローチの一利点は、自体がRPE層を担持するヒト胎児様網膜組織を誘導する能力である。このRPE層は、移植後のhPSC-3D網膜組織の生着を支援することができる。競合する技術では、神経網膜層を作製することはできるが、hPSC培養物からRPEを作製することはできない。神経網膜とRPEとは一緒に生じ、発生中は構造的および機能的成熟を互いに誘発し、そして互いに依存し合って視覚機能を実行する。RPE層なしのhPSC由来神経網膜を移植すると、発生中のPRからRPEのパラクリンおよび構造的サポートを奪うことになる。網膜下スペースでレシピエント網膜のRPE層とグラフトのPRとの間に空隙が生じ得る。RPEの微絨毛と発達中のPRとの物理的相互作用が不足すると、頂端RPEがPR外節伸長を誘発する能力が阻害される場合がある。あるいは、本明細書に記載される方法により得られたhPSC-3D網膜組織は、レシピエントのRPEへの近接に依存せず、網膜下グラフトにおいて（独立したパッチとして）高度に生着し、分化する。それによって、hESC-3D網膜組織パッチが視覚機能を回復させる能力が増加する。網膜＋移植RPEが、ともにRD患者の視覚のより良い改善をもたらす証拠もある。しかし、これらのパイロット治験ではヒト胎児網膜組織を用いており、それは倫理的制限および組織の入手可能性により、ルーチンの治療では使用できない。ヒトES細胞は、網膜組織を誘導するための無限の細胞供給源となる。したがって、本開示のhPSC-3D網膜組織グラフトは、網膜変性疾患および損傷の治療の二大障害である、ヒト胎児網膜の入手可能性および倫理的制限を、克服するものである。

PR変性網膜に光の知覚を取り戻せるように、対象の残存網膜に電気的に結合して、電気信号の送信を可能にすることができる、新式の「センサー」が必要とされている。ヒトESC由来網膜組織（網膜オルガノイド、サイズは長さ0.3〜0.5 mm）は、ヒト胎児網膜と（組織学的に、およびマーカー発現に基づき）似ており、基質に付着した凝集体として成長させると、インビトロの発生6〜8週でRPE、PR、二次網膜ニューロン、およびRGCの各層を発達させる。hPSC-3D網膜組織は、基質に付着した凝集体として成長させると、軸索（特にRGC特異的な長軸索）および複数のシナプス終末ボタンを発生6〜8週までに発達させる。また、このhPSC-3D網膜組織は、インビトロの発生第8週〜第12週の間にますます電気的活性になり得る。網膜下スペースに移植された一片の網膜オルガノイドが、盲目動物が光知覚を取り戻すことができるような十分な数のPRをもたらすことができる。

神経栄養因子は、可溶性タンパク質（ニューロトロフィン）、および神経新生サイトカインの多様なグループであり、ニューロンの成長、生存、および機能をサポートする。神経栄養因子は、ニューロンの複数の経路を活性化することができ、神経変性を緩和することができ、シナプス結合性を保存することができ、網膜組織における細胞死を抑制することができる。小分子、脳由来神経栄養因子（BDNF）などの神経保護タンパク質、または細胞の形態で神経保護が提供され、かつ細胞死および／または網膜再構築開始および瘢痕化を抑止するのに十分効率よく迅速に送達されれば、急性的に損傷した網膜は生存する。しかし、治療なしにそのまま変性が進行すれば、光受容体、RGC、および他の網膜ニューロンの喪失、ならびに網膜再構築および瘢痕化により、進行性視覚喪失が予測される場合がある。

網膜は、非常に繊細な神経組織の薄層であり、光刺激を受けてこれを電気インパルスに変換し、それが視神経経由で脳（外側膝状核）へ、最終的には視覚野へ送信される。視神経の起点は網膜であり、網膜組織に見られる7つの細胞型の一つ、網膜神経節細胞（RGC）の軸索によって形成される。挫傷損傷の原因は、眼球がまずは爆風の力により圧縮され、次いで通常の形状に戻るが、そのとき通常の形状を通り過ぎてより遠位まで伸長することにある。したがって、戦闘地では非穿通性眼球損傷が頻発し、結果としてたとえば、網膜剥離、視神経破損、網膜再構築、軸索求心路遮断（神経細胞の求心性結合部の破断）などの網膜外傷となることがあり、その場合、網膜構造が当初保存されていても、緩慢な細胞死（最大で数カ月かかる）および進行性視覚喪失をもたらすことが多い。

いくつかの態様では、hESC由来網膜組織グラフトは、植え込み後に神経栄養因子および／またはマイトジェンを送達することができる。いくつかの態様では、hESC由来網膜組織から解離した細胞を含むhESC由来網膜グラフトまたはパッチも、植え込み後に神経栄養因子および／またはマイトジェンを送達することができる。いくつかの態様では、hESC由来網膜組織および／または細胞は、植え込み後に神経栄養性エキソソームを対象に送達することができる。本明細書に記載のグラフトが対象に送達することができる神経栄養因子およびマイトジェンとしては、限定ではないが、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、ニューロトロフィン-34（NT34）、ニューロトロフィン4/5、神経成長因子-ベータ（βNGF）、proNGF、PEDF、CNTF、生存促進性マイトジェン塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF=FGF-2）、およびWNTファミリーの生存促進性メンバーが挙げられる。

外傷による、または爆風の過剰圧力による損傷を原因とする眼球損傷の現行の軍隊の治療標準は、Birmingham Eye Trauma Terminology System （BETTS）およびOcular Trauma Classification Groupを採用して、適切な処置を決定している（図2参照）。爆風損傷は、おおまかに次の四つの機構に起因する：一次的爆風（過剰圧力インパルス）；二次的作用、たとえば爆風の力で吹き飛ばされた破片による穿通性の負傷；三次的損傷、たとえば人が硬い構造物に激突することによる；および、毒性煙霧、化学物質による火傷、または長期心理的作用など、付随のプロセスを原因とする四次的損傷（Morleyら 2010）。眼球の閉鎖性外傷は、それぞれ独特の損傷パターンをもつ数ゾーンに分けられる。ゾーンIには結膜および角膜表面が含まれ、ゾーンIIには前眼房、レンズ、および毛様体ひだ部が含まれる。ゾーンIIIには網膜および視神経が含まれる。各ゾーンを図3に示す。

高圧爆風損傷に対する網膜／視神経の応答に関する、試験済みのいくつかの指針がある。ゾーンIIIの主要な破損が網膜剥離の場合、損傷後数日から数週間で光受容体層の急激なアポトーシスが始まり、次いで内顆粒層（INL）の変性、網膜再構築、視覚の歪み、および視覚喪失が生じる。しかし、網膜神経節細胞（RGC）層は、RGC神経線維（視神経を形成している）と視覚野のニューロンとの軸索結合性が保存されている限り、損傷後数カ月から数年は生存する。

RGCの生存可能性は、視覚野ニューロンとの結合性にかかっており、上述の求心性線維はRGCと視覚野ニューロンとの間でサポート的（栄養）因子を運搬する。爆風曝露により求心路遮断が生じ得、したがって栄養因子の流れが断たれ、ゆっくりとしかし確実に視覚喪失に至る。栄養サポートの回復（部分的でも）は、RGCの保存につながる。一緒に投与される数種の栄養因子が、軸索切断後のRGCアポトーシスに対する有力な神経保護的防御をもたらし得る。したがって、損傷後数日から数週間で、結合性喪失後のRGCを保存する処置を行うことが役に立つ。

光受容体の生存可能性は、部分的には、たとえば網膜色素上皮（RPE）からの栄養サポート、および内顆粒層（INL）ニューロンとのシナプス接触に依存し得る。光受容体の生存可能性および機能は、RPE光受容体の結合性に依存する。爆風損傷後の網膜剥離は、光受容体外節の変性をもたらす。再付着後に光受容体機能が回復可能な期間は、通常、損傷後数日から数週間である。本明細書に示されるように、光受容体細胞に対する栄養サポートの復活（部分的でも）は、光受容体の長期保存につながる。

爆風眼球損傷に関する視覚の問題の高効率な治療には、爆風損傷により視覚系にもたらされた破損の神経病理学的な理解が必要である。当初の破損はすぐにはわからないかもしれないが、爆風の圧力波による細胞の伸びおよび／または裂け、および波の伝搬方向の軸索の剪断が生じ、それによって網膜および視神経が緩慢に変性する。戦闘による損傷が複数の外傷を伴うという性質上、しばしば治療の優先順位が争われることになる。戦闘地での最大の関心事は失血および蘇生であるが、状態が安定化した後は、損傷全体に関し最良の結果を確保することに注意が向けら得る。眼の治療が開始されるのは、損傷後数時間から数日後が多い。この治療機会は、眼球の閉鎖性損傷の有効な治療オプションを可能にすると考えられている時間枠内に十分入っている。視覚機能に必要な網膜の元の神経構成を保存すること、および爆風損傷後に（神経保護により）網膜変性を予防することは、失明を緩和する実現可能な治療機構である。

したがって、一態様では、hPSC-3D網膜組織から調製された、治療用途に適した細胞組成物（hESC-3D網膜オルガノイド）が得られ、対象の眼内スペースに移植され、該細胞は神経栄養因子、マイトジェン、および／またはエキソソームなどの細胞外構成要素を分泌することができる。いくつかの態様では、細胞組成物は、適切な治療機会の間に栄養因子を（分泌または他の機構により）連続的に送達する。いくつかの態様では、細胞組成物は、数種の栄養因子、マイトジェンおよび／またはエキソソームなどの細胞外構成要素の組み合わせを（分泌または他の機構により）同時に送達する。別の態様では、眼内スペース（たとえば、網膜下または網膜上）に移植されたバイオ補綴網膜グラフトまたはパッチにより生産される栄養因子、マイトジェン、および／またはエキソソームなどの細胞外構成要素は、網膜細胞死に対する有力な神経保護的防御を提供し得る。治療ターゲットは、対象の網膜（たとえば、光受容体、RPE、二次ニューロン、RGC／視神経）の一部または全部の細胞型を含み得る。

いくつかの態様では、治療の影響は、RPE細胞、網膜神経節細胞（RGC）、二次網膜ニューロン（成熟網膜の内顆粒層に相当）、および光受容体（PR）細胞を含む細胞組成物を移植することにより強化される。治療効果は、移植細胞由来の神経保護の組み合わせにより強化され得る。他の態様では、異なる細胞型を分別して単離することができ、それによって特定の細胞型の濃度を高くし、したがって特定の栄養因子の濃度を高くして、特定の疾患、損傷、または状態を治療することができる。

本明細書に記載の幹細胞由来グラフトは、変性中の網膜ニューロンに、長期間持続する栄養サポートを提供することができるので、爆風眼球損傷に広く適用可能な治療モダリティとなり得る。網膜細胞グラフトは、ゾーンIII（網膜−視神経−視覚野）に生じた爆風損傷後の視覚喪失を軽減し得る。

一態様では、幹細胞由来ヒト網膜前駆細胞組成物のグラフトは、CIS 2〜3の爆風損傷により破損したウサギの神経網膜および視神経に強力な神経保護サポートを及ぼすように調製され、それによって視覚喪失が緩和され得る。一部の移植ニューロンの機能的統合は、網膜を変性からさらに守ることができ、視覚保存にとってプラス要因となり得る。

他の態様では、細胞組成物または幹細胞由来グラフトは、変性中の網膜ニューロンに、長期間持続する栄養サポートを提供することができるので、実現可能かつ広く適用可能な治療的介入を提供して、爆風眼球損傷による視覚喪失を弱めることができる。本明細書に記載の細胞療法組成物は、光受容体および網膜神経節細胞（RGC）の保存にプラスの影響を与えることができる。

特定の態様では、本明細書に記載の治療用細胞組成物は、神経栄養因子の混合物を、破損網膜組織に効率よく制御下で連続的にパラクリン送達することを提供する。本明細書に記載の治療用細胞組成物は、爆風損傷後に網膜が概して無傷で残っているが、高次組織構成の破断により徐々に不可逆的変性が生じやすい網膜損傷に特に有効であり得る。

図5Bから図5Dは、ヒト胚性幹細胞（hESC）から分化したヒト網膜前駆細胞の網膜下グラフトが、眼の大きい動物モデル（ウサギ）の眼内スペースに首尾よく移植されることができ、成体哺乳類の網膜の網膜層の厚さを最大3カ月間保存することができ、レシピエント網膜に対し有害な影響がなく、腫瘍形成をもたらさないことを、実証している。これらのグラフトから細胞が遊走し、そしてレシピエント網膜層に統合されて、レシピエント網膜を強化する。そのような細胞はRGCおよびINLのレシピエント網膜細胞と入り交じり、そして周囲のホスト細胞にパラクリンサポートを及ぼすことができる。図4Aは、マウスモデルの網膜上スペースに移植されたhESC由来網膜前駆細胞（hESC-RPC）の網膜との統合および成熟のICH画像を示す。図示のように、ヒト前駆細胞の大半が、早期ニューロンマーカー Tujlについて陰性であり、それらが遊走し、そしてホストの網膜神経節細胞（RGC）層または内顆粒層（INL）に統合されているのがわかる。図4Bは、植え込まれたhESC由来網膜前駆細胞がホスト網膜下部位の大面積へ遊走しているICH画像を示す。図4Cは、植え込まれた網膜上hESC-RPCの細胞がホストの網膜神経節細胞（RGC）層、内網状層、および内顆粒層（INL）に統合されているICH画像を示す。網膜下および網膜上スペース内に付着した細胞は、ホスト網膜内へと遊走することができ、網膜下スペースまたはRGC層上の網膜上膜に膨らみを残すこともない。

本開示の一態様では、爆風損傷を受けた網膜に移植された細胞による神経保護は、細胞生存可能性および／または細胞生存率を、対照網膜の細胞生存可能性と比べて、約10%〜約250%増加させる。

本明細書に記載の細胞組成物は、眼球の閉鎖性創傷または疾患による網膜剥離および視神経の破損後の、網膜、視神経、および視覚野の生存可能性および視覚機能を持続させる治療用途に適している。この技術は自己ドナー細胞ソースを必要としないので、眼の外傷、疾患、および視覚喪失の治療のために必要に応じて治療用細胞を入手可能とすることができる。

いくつかの態様では、移植後3〜6カ月までに、対象の80%で、網膜下／網膜上スペースで網膜細胞が生存している。別の態様では、OCTにより見出された網膜グラフトを有する対象の80%（全対象の約64%）が、バイオ補綴網膜グラフトまたはパッチの眼内移植後1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、または6カ月までに、少なくとも部分的には網膜前駆細胞からの神経保護によって、改善されたVEPおよびERGの結果を有することになる。

一態様では、対象の網膜厚の保存は、移植後約1〜約6カ月で生じる。別の態様では、対象は、たとえばCleaved Caspase-3、γH2AX（早期アポトーシスマーカー）、およびTunnel染色（後期マーカー）により判定すると、グラフトにおいて、またはその付近で、細胞死が減少している。

さらに別の態様では、対象の少なくとも約64%で、（網膜変性の主要な読取値としての）網膜厚の保存が、移植後約1〜約6カ月で生じ、また、（Cleaved Caspase-3、γH2AX（早期アポトーシスマーカー）、およびTunnel染色（後期マーカー）により判定すると、細胞死が減少している。

網膜下グラフトは、光受容体および外網状（シナプス）層に神経保護を提供することができ、一方で網膜上グラフトは、RGC／視神経、二次網膜ニューロン、および内網状（シナプス）層の神経保護ができる。

一態様では、対象は、バイオ補綴グラフトの移植後約6カ月で、約1%〜約15%の網膜厚保存を示した。

特定の態様では、治療用細胞組成物は、免疫抑制剤と一緒に、または免疫抑制剤なしで、適用される。

網膜は、複雑な構造体であり、細胞およびシナプスネットワークの保存は、視覚維持に役立つ。もとの網膜の神経構成の回復は、網膜色素変性およびAMDなどの疾患の寛解に役立つ。

以下の実施例は、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を制限するものではなく、また以下の実験が実施したすべてのまたは唯一の実験というわけではない。

実施例１
視知覚の回復および改善を、眼球の爆風曝露および網膜破損のウサギで実証する。hESC-3D網膜組織のみ（生体材料／足場なし）を含む網膜下グラフトを用いて、ウサギの破損網膜組織を治療する。組織の構造的回復および視覚を、生体動物の光干渉断層撮影（OCT）を用いて、および屠殺後に組織学および免疫組織化学を用いて実証する。機能的回復は、生体動物の視覚誘発電位（VEP）を用いて実証する。

臨床等級のhPSC（BIOTIME, INC.）を用いてヒト網膜組織を作製する。眼の大きい動物モデルの網膜下移植手順を決めるために、ウサギのパイロット移植実験を実施する。衝撃波管を用いて、ウサギの爆風眼球損傷モデルを作製する。次に、複数のhESC-3D網膜組織片（長さ約0.1〜約1 mm）を各動物の網膜下スペースに移植する。

爆風眼球損傷モデルは、たとえばGray, W., Sub-lethal Ocular Trauma (SLOT): Establishing a standardized blast threshold to facilitate diadnostic, early treatment, and recovery studies for blast injuries to the eye and optic nerve. Final report, prepared for: U.S. Army Medical Research and Material Command. Award Number: W81XWH- 12-2-0055, 2015に記載されるようなものを含み得る。

網膜組織の構造的統合はOCTにより評価され、機能的統合／視知覚改善は、手術後1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、および6カ月でVEP測定することにより評価される。各動物の両眼に網膜組織を移植し、もう片方の眼を覆うことにより各眼球のVEPを独立して評価する。

次の対照を用いることができる：対照、1眼球（無治療）、対照2、もう片方の眼球（偽治療、すなわちオルガノイドなしで生体材料のみ移植）。

植え込まれたhESC-3D網膜組織グラフトは、ウサギのRGCおよび／または二次網膜ニューロン上でシナプス形成することができ、それによって手術の約4〜6カ月後には（VEP信号の測定によると）動物の視知覚を回復させることができる。同様の動態が、網膜下スペースにhESC-3D網膜組織移植を受けた盲目ラット動物モデルで観察された。

コホートは、8〜15匹のウサギで構成され得る。したがって、統計学的分析が実施可能である（一元配置ANOVA）。

実施例2
視覚の回復および改善を、眼球の爆風曝露および網膜破損のウサギで実証する。hESC-3D網膜組織ならびに生物分解性および／または非生物分解性の担体または足場を含む網膜下グラフトを用いて、ウサギの破損網膜組織を治療する。網膜下グラフトは、エレクトロスパン・ナノファイバーの薄層生体材料足場に設置されたhESC-3D網膜組織片を含んで、本明細書に記載されるような生物学的網膜パッチを形成することができる。組織の構造的回復および視覚を、生体動物の光干渉断層撮影（OCT）を用いて、ならびに屠殺後に組織学および免疫組織化学を用いて実証する。機能的回復は、生体動物の視覚誘発電位（VEP）を用いて実証する。

臨床等級のhPSC（BIOTIME, INC.）を用いてヒト網膜組織を作製する。眼の大きい動物モデルの網膜下移植手順を決めるために、ウサギのパイロット移植実験を実施する。衝撃波管を用いてウサギの爆風眼球損傷モデルを作製する。次に、複数のhESC-3D網膜組織片（長さ約0.1〜約1 mm）を生物分解性担体または足場と一緒に、各動物の網膜下スペースに移植する。

たとえばヒドロゲル（ヒアルロン酸、アルギン酸塩、その他に由来するものなど）を、生物分解性担体または足場として使用してもよい。ヒドロゲルは、移植後約1分〜約60分で網膜下スペースでインサイチューでゲル化して、移植された網膜片を網膜下スペースで固定し、そうすることで外科的および機能的結果を改善するように、調製することができる。この研究では、hPSC-3D網膜組織片を生物分解性生体材料と一緒に移植することで、手順の外科的および機能的結果を改善することができ、手術後4〜6カ月でより多くの動物にVEP信号の増加が生じることを実証する。

生物学的網膜パッチまたは生物学的網膜補綴デバイスは、爆風眼球損傷を有するウサギの網膜下スペースへの移植をサポートする極薄生体材料（幅およそ3〜5 mm、長さおよそ5〜8 mm）のパッチに設置された数片のhPSC-3D網膜組織で構成されている。

適用中、生物学的網膜パッチは、最大の視覚回復が得られるように網膜組織が位置決めされて、網膜スペースに配置され得る。網膜パッチは、網膜グラフトまたはパッチの適用前に作られた網膜ブレブ内でパッチが安定するように、適用されることができる。該インプラントは、補助材料または手順を用いて取り付けてもよい。

実施例3
眼内注入器を用いて、hPSC-網膜前駆細胞をウサギの眼内スペースに送達した（エクスビボ実験）。ヒト網膜前駆細胞の移植を受けたウサギの眼球の凍結切片を抗ヒト核抗体HNu（赤）および汎核DAPIステイン（青）で染色した。眼内注入器を用いて送達した、ウサギの眼内スペース（青の染色のみ）におけるヒト網膜細胞（赤+青の染色）の存在を実証した。図5Bから図5Dは、ヒト胚性幹細胞（hESC）から分化したヒト網膜前駆細胞の網膜下グラフトが、眼の大きい動物モデル（ウサギ）の眼内スペースに首尾よく移植されることができ、成体哺乳類の網膜の網膜層の厚さを最大3カ月間保存することができ、レシピエント網膜に対し有害な影響がなく、腫瘍形成をもたらさないことを、実証している。これらのグラフトから細胞が遊走し、そしてレシピエント網膜層に統合されて、レシピエント網膜を強化する。そのような細胞はRGCおよびINLにおいてレシピエント網膜細胞と入り交じり、そして周囲のホスト細胞にパラクリンサポートを及ぼすことができる。

実施例4
hPSC-3D網膜組織の細胞は神経栄養因子を分泌する
hPSC-3D網膜組織培養物の条件培地（および対照として未分化hESCの条件培地）を、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、ニューロトロフィン-4（NT4）、神経成長因子-ベータ（βNGF）、および生存促進性マイトジェン塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF=FGF-2）など、いくつかの主要栄養因子の存在について、アッセイした。これらの神経栄養因子の濃度をLuminex技術（RnD Systems）を用いて読み取ると、条件培地ではbFGFに加えて未分化hESC対照のレベルを少なくとも約100倍〜1,000倍上回る高レベルのBDNFおよびGDNFが見られ、ニューロトロフィン濃度は数ピコグラム〜数ナノグラム/mlとなった。

実施例5
ウサギ爆風眼球損傷モデル
Jones, K., et al., Low-Level Primary Blast Causes Acute Ocular Trauma in Rabbits. J Neurotrauma, 2016. 33(13): p. 1194-201に基づきウサギ爆風眼球損傷モデルを設計して、本明細書に記載の細胞調製物が、爆風損傷による網膜変性および視神経破損を緩和して、視覚喪失を軽減または停止させる可能性を評価した。細胞送達の2つのルートは（i）網膜上および（ii）網膜下とし、移植細胞が最も生存率高く、かつ最も高効率に網膜に統合されて、ホスト網膜に有害な副作用を生じさせることなく全体として最大の治療効果を発揮できるルートを探る。細胞移植の治療効果は、眼底撮像およびOCT（肉眼視の網膜の形態）により、網膜電図検査および視覚誘発電位（視覚機能の測定）により、ならびに動物の死後（予定：爆風損傷の6カ月後）の網膜グラフトを含む眼内組織の病理組織学により、評価することができる。ウサギの眼球の死後分析には、組織学、蛍光免疫組織化学、および網膜組織の3D再構築を含む共焦点顕微鏡法が挙げられる。

このモデルでは、図6に示すように、大フレーム衝撃波管を用いて制御可能な一次爆風波を発生させ、二次的または三次的効果は加えなかった（Sherwood, D., et al., Anatomical manifestations of primary blast ocular trauma observed in a postmortem porcine model. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences, 2014. 55(2): p. 1124-1132.）。この衝撃波管により発生した「爆風」は、ピーク静圧がおよそ7〜22パスカル／平方インチ（psi）（48〜152キロパスカル、kPa）の範囲になり、陽圧ピーク持続時間は3.1 msでFriedlander様の波形を送達した。本発明者らのデータは、サバイバル・アイソレーテッド（survivable isolated）一次爆風が、ウサギにおいて急性網膜破損を生じさせることができることを示す（表1に示す累積損傷スケール（CIS）に基づくレベル2〜3）。

（表１）累積損傷スケール

所与のCISの損傷を生じさせる爆風の強度を予測するために、さまざまな爆風強度により生じる損傷の確率に基づき「リスクモデル」を作製した。順序ロジスティック回帰を使って、図7に示すように、所与のレベルの爆風について、網膜および視神経を含む眼球の各組織構成要素に対する所与のCISスコアが得られる確率を見積もった。80%の確率でCIS 3の網膜損傷を生じさせるには、約725 kPa／ミリ秒（ms）（約82 psi）の比推力の爆風を要する。これらのデータを総合して、細胞治療および網膜前駆細胞移植が視覚の保存に及ぼす影響を統計学的に評価するために、重症度が比較的均一な網膜損傷を有するウサギのコホート（ただし視神経破裂はなく、要するに「救済可能な」視覚問題を有する動物）を作製する指針として使用することができる。神経網膜における短距離の軸索破損は、パラクリン栄養因子サポートによる治療ができるが、視神経破断（たとえば、衝撃波管における、より高レベルのCIS 3損傷）は、現在の技術では回復不可能な恒久的な視覚喪失をもたらす。

このモデルには、RSI Robinson Services, Incにより供給された、各約5〜5.9ポンドの約96匹の特定病原体除去（SPF）等級のニュージーランド（NZ）有色素茶色ウサギが含まれる。ウサギは、衝撃波管で爆風眼球損傷を受ける前に、たとえば、眼底撮像、OCTおよびERG、VEP記録による、開始時ベースラインの構造的および機能的判定を受け、そして爆風損傷の直後に構造的および機能判定を受ける。ウサギをISR動物施設で1日休ませてから、UTHSCSA動物施設に移す。網膜オルガノイドを解離して単細胞にし、網膜前駆細胞をウサギの眼球に移植する。作業の質を最大限にするために、各動物に約2時間かけて、1日あたり約4匹のウサギを処置することができる。

爆風を受けたウサギ網膜におけるヒト網膜前駆細胞の生存を評価する。また、ホスト網膜を破損することなく、パラクリン分泌を介し神経保護を頑健に送達する能力も評価する。生体材料は概して、グラフト中の細胞の生存を促進する。網膜上および網膜下グラフトは、哺乳類の網膜で生着するが、細胞統合の力学は、げっ歯類と「眼の大きい」モデルとでは異なり得る。

解離したhPSC-3D網膜組織の細胞を、制御下で爆風による眼球損傷を受けて網膜および／または視神経が破損しているウサギの網膜上および／または網膜下スペースに移植する。次に、網膜電図検査（眼の感光性細胞、網膜の杆体および錐体ならびにそれらを結合する神経節細胞の検査に用いられる機能判定）および視覚誘発電位（光結果に応答しての後頭葉皮質の電気刺激の機能判定）により、神経保護効果を測定する。爆風損傷後に、選択された時点で、眼組織の組織病理学分析を実施してもよい。

サポート的生体材料を含むまたは含まないhPSC由来網膜前駆細胞の網膜下および網膜上の移植が、爆風損傷後の網膜変性を緩和する影響を、ウサギで評価する。眼内スペースに移植された幹細胞の前臨床および臨床試験では、変性中の網膜に対する治療効果が示された。生体材料は、網膜細胞移植をサポートする。網膜下グラフトは光受容体の神経保護ができ、一方網膜上グラフトはRGCをサポートすることができる。初代網膜前駆細胞は、ホスト網膜に、構造的および機能的に統合されることができる。

実験手順（方法）は、以下のウサギ選択基準およびパイロット（P）実験を含み得る。ウサギの眼球のエクスビボのパイロット研究によると、有色素の眼球のほうが、グラフトの場所を突き止めやすい。約5〜5.9ポンド（2.5 kg）、月齢約3カ月のF-l NZウサギを用いて、ERG振幅および潜在時間ならびに／またはVEP振幅／潜時の50%減をもたらすCIS 2〜3の網膜損傷が得られる爆風強度（同サイズのDutch Beltedウサギでは成功した）を確認した。ウサギは、（眼病を排除するため）爆風前に予め選別し、そして（期待通りのCISが得られたかを確認するために）爆風後も、眼底撮像、OCT、ERG、およびVEPなどのアッセイにより選別する。ウサギはCIS 2〜3の網膜損傷を受けていることになる。グラフトは約5万個のhPSC-網膜前駆細胞を含み、両眼に適用され、さらに、3匹の無損傷NZウサギの眼球にも適用される。次に、眼球をたとえばOCTにより（+1日、+1週間、+1カ月の時点で）アッセイして、細胞が移植されたことを明らかにする。網膜の膨らみが観察され得る。移植後+1カ月でウサギを検査（たとえばIHC）して、細胞が生存しているかどうかを決定することができる。必要に応じて、たとえば、-3日から手術後+8週にかけてプレドニゾン（2 mg/kg、局所）+シクロスポリン（12時間おきに経口で5.0 mg/匹）などの免疫抑制レジメンを用いてもよい。

爆風眼球損傷：（上記に記載した）衝撃波管を用いて、ウサギにCIS 2〜3の網膜損傷を生じさせる（表1）。表2に示すように、爆風の1日前および2日後に、撮像（眼底撮影、OCT）および電気生理法（ERG、VEP）を実施することができる。

眼内移植ツール:任意の適切な移植ツールを用いてグラフトを適用することができる。たとえば、Micro-4コントローラー、100 μl Hamiltonシリンジ、およびマイクロキャピラリー［外径1.0 mm、引かれ研磨（pulled polished）開口部あり］と接続したWorld Precision製の眼内細胞送達用UMP-3ポンプのシステムを用いることができる。軽く固定した眼球凍結切片に対し、組織学、蛍光免疫組織化学、ならびに共焦点免疫蛍光顕微鏡法を実施してもよい。

たとえばパパイン約40〜50マイクロリットル（Nasonkin, I., et al., Long-term, stable differentiation of human embryonic stem cell-derived neural precursors grafted into the adult mammalian neostriatum. Stem Cells, 2009. 27(10): p. 2414-26）を用いてhPSC由来網膜組織（オルガノイド）から解離した約5万個のヒト網膜前駆細胞を、グラフトに用いることができる。細胞を、ヒドロゲル様HYSTEM（登録商標）生体材料（ゲル）などの担体または足場とともに移植する場合、各移植前に、細胞を担体または足場と予め混せておいてもよい。本発明者らは、表2に示すように、熱活性化（死）網膜前駆細胞を（担体または足場ありまたはなしで）「対照」（もう片方の）眼球に移植する。

（表２）細胞およびバイオ補綴パッチ（細胞+バイオ補綴材料）の研究デザイン

最初の分析は、爆風の1日前および爆風の2日後に、インビボで眼球を評価することにより実施される（たとえば、OCT=網膜厚、グラフトの存在、ERG、VEP-視機能試験）。次に細胞を移植し、定期的に測定を行う（表2）。本発明者らの予測では、爆風後+1日では、動物は、各自のベースラインレベルと比べて少なくとも50%のERGおよびVEP振幅および／または潜時の減少を有する。機能的回復の基準レベルは、ベースラインの少なくとも約25%、30%、40%、50%、60%、70%、または75%までの電気生理学的応答の増大である。動物がこのレベルの回復に達すると、または爆風曝露後+6カ月で回復しない場合、安楽死させる。眼球を摘出し、凍結IHC分析用に視神経を採取して、グラフトが網膜保存に及ぼす影響を描写する。細胞生存、グラフト保持、ヒト細胞のウサギ網膜との統合、網膜厚の変化、グリアおよび線維の瘢痕形成レベル、網膜再構築、細胞死、網膜構造を、手術後6カ月で測定する。実験は部分的に盲検とする。ウサギにはID番号を割り当てる。実験室技術者は、各ウサギの左右どちらの眼球が生細胞を受けたのか、実験終了まで知らない。こうすることで、神経保護の効力を最大限客観的に判断できる。実験室技術者は、組織学およびIHC分析を行う際、実験終了までウサギのIDを知らない。

検出力分析、統計学的評価、サンプルサイズ、および対照：Okunoらによると、VEP振幅のばらつき（相対標準偏差[RSD]、または変動係数）は約12%であったが、潜時はばらつきがなかった（RSD約3%）。したがって、VEPは視覚機能の頑健な尺度となる。Okunoの式を検出力計算の根拠として、本発明者らは、80%の検出力（l-β、ここでβは第2種過誤の確率）およびp値0.05で平均値の差を検出するのに十分な統計学的検出力のために必要な最小サンプルサイズは7と見積もった。サンプルサイズは10眼球／コホートであってもよく、視覚機能変化（VEP）のANOVA法による統計学的評価にはこれで十分であり、（たとえばグラフトの不良により）群が多少縮小してもよい。

細胞生存率を高めるために、免疫抑制剤を用いることができる。網膜厚およびVEPには大して影響はない。また、栄養因子を含むヒドロゲル（たとえば、HYSTEM（登録商標）生体材料）（BioTime, Inc.）などの担体を用いて（たとえば、ゲルにBDNFを埋め込んで徐放させる）、網膜厚およびVEPに対する影響を増加させることができる。

成体CNSに移植される特定の細胞用量は、細胞の頑健な統合を可能にする。薬物ベースの療法見込み（用量-応答関係）は重要であるが、この研究の一局面は、レシピエント網膜に有害な影響（たとえば、統合されなかった細胞の膨らみが網膜下スペースに残る、または網膜上スペースで網膜上膜が成長するなど）のない細胞用量を見出すことである。

実験手順（方法）:ウサギ網膜に統合されるグラフトの作製に関し、細胞1万個、10万個、および25万個の用量を試験する。この場合、3種の細胞用量の選択は、約5万個を中心にしてもよい（たとえば、3万個;4万5000個;6万5000個の細胞／グラフト）。実験デザインを表3に示す。各用量レベルに10匹のウサギを割り当てることができる。

（表３）担体／足場ありまたはなしの、網膜下vs.網膜上の細胞用量を最適化するための研究デザイン

各動物は片眼にグラフトを有し、もう片方の眼球には死細胞が移植される。適用ルート（網膜下または網膜上、生体材料ありまたはなし）は、最初の結果に基づき選択する。

グラフトにより生じる、最良の神経保護をもたらすパラクリン因子を同定することができ、そしてこれらの分子をグラフトにより過剰発現させるか、または／かつこれらの分子をサポート的生体材料に埋め込むことができる。

本明細書では、ウサギモデルの視覚喪失を緩和するために、網膜の爆風損傷後に網膜細胞療法を送達する時間の判定を提供する。

網膜細胞は、爆風損傷の直後から死滅し始める。RGCおよび光受容体は、最も細胞死しやすい。とはいえ、爆風眼球損傷後の最初の数日間に視力が低下したからといって、必ず視覚を喪失するとは限らない。それが明らかになるのは、およそ3〜4週間後である。細胞死が進むにつれて、視覚は徐々に低下する。この間、少なくともいくらかの視覚を救える場合もある。遅延分析（爆風損傷後+2週間まで）により、治療的介入によりまだ網膜保護が可能かどうかを決定する。その結果は、トリアージ中の負傷兵の視覚保存アプローチの開発にとって有意義である。

細胞の調製、移植、偏りを減じるための無作為化、コホートサイズ、試料採取、操作、および検出力分析について、上記に記載した。表4で概説した研究デザイン、および（記載したような）網膜厚および網膜細胞保存の測定に加えて、爆風後+3日vs.+2週間での、グラフトで治療したウサギ網膜における細胞死の比較および定量化の分析を行う。Cleaved Caspase-3、γH2AX（アポトーシスの早期マーカー）、およびTunnel染色（細胞死の後期マーカー）を用いることができる。第2の読み取りとして、網膜再構築の尺度としての活性化マイクログリア（Iba-1マーカー）の存在ならびに対照および実験コホートの炎症の定量化が実施され得る。また、内網状層と外網状層とのシナプス終末ボタン保存の違いを決定することもできる。

（表４）爆風後の網膜細胞移植の2週間の遅延が網膜および視覚保存に与える影響を試験するための研究デザイン

細胞治療は、より早期に治療される網膜（爆風後+3日）で、網膜厚の保存が改善され、アポトーシスおよび網膜再構築レベルが低下し、シナプス層がより良好に保存されるように計画され得る。

実施例6
野生型ネコの眼球に経扁平部硝子体切除術を実施した後、網膜下スペースにhPSC-3D網膜組織を移植した（n=3眼球）。hPSC-3D網膜組織は、たとえばSeiler, M.J., et al., Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Vet Opthalmol, 2009. 12(3): p. 158-69（参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているような、あらゆる適切な方法により移植することができる。網膜下グラフトの存在による有害作用について、眼底検査およびスペクトルドメイン光干渉断層撮影（OCT）により、眼球を臨床的に検査した。移植後5週間でネコを安楽死させ、ヒト特異性抗体（HNu、Ku80、およびSC121）を用いて網膜切片の免疫組織化学法を実施して、網膜下スペースのグラフトの場所、分化、および積層について判定した。研究中は抗炎症用量の経口プレドニゾンを投与した。

眼底検査では、肉眼視できる網膜の炎症は観察されなかった。移植後3週間でのOCT撮像では、図8に示すように、グラフトが網膜下スペースの正しい場所に存在していることが示された。図9に示すように、網膜凍結切片のHNuおよびKu80抗体による免疫染色でも、ネコ網膜下スペースにおけるヒト由来網膜組織グラフトの存在が明らかになった。グラフトの細胞の大半が、核染色ではなく、細胞質染色を有していた。これらの結果は、hESC由来網膜組織が、重篤な炎症反応なく、ネコ網膜下スペースに成功裏に移植され得ることを実証している。

実施例7
植え込まれたヒト胚性幹細胞由来3D網膜組織（hESC-3D網膜組織）が、グラフト内で積層を生じる能力を有することを実証するために、hESC-3D網膜組織を盲目免疫不全ラット、SD-Foxnl Tg(S334ter) 3 Lav(RDnude)ラットの網膜下に送達して治療した。図10Aは、移植前にシャーレから切り取られたhESC-3D網膜組織（網膜オルガノイド）の画像を示す。図10Bは、移植前にシャーレで成長中の切り取られた網膜オルガノイドの画像を示す。図10Cは、シャーレで成長中の網膜オルガノイドの追加の画像である。植え込みおよびラット安楽死の後、植え込みから10週間後の網膜下スペースに関し組織学的分析を実施した。図10Dおよび図10Eから、グラフトの積層がわかる。図10Fでは、外層において、ラットRPEにすぐ隣接して外節様突起があるのがわかる。

実施例8
2つの異なる条件で（Hibernate-E培地中低温、およびもとの培地中37℃でBDNFありまたはなし）、網膜組織の生存可能性に影響を与えずにhESC-3D網膜組織を一晩輸送できることを実証した。到着してすぐ組織を固定し、Cleaved Caspase-3（アポトーシスマーカー）を用いてIHCを行うと陽性細胞（図11の矢印）が示され、Hib-E中4℃で一晩輸送した後も網膜組織が生存可能性を維持したことがわかった。

hESC由来のすべての網膜層（PR、二次ニューロン、網膜神経節細胞）およびRPEを担持する3Dヒト網膜組織誘導の実現可能性が実証されている（たとえば国際公開公報WO2017/176810を参照。参照により全体が本明細書に組み入れられる）。また、電気生理学により、hESC-3D網膜組織内でシナプス形成の増加が電気活性の増加と同時に生じることが実証されている。

6〜8週齢のhESC-3D網膜組織では、一部のニューロンだけがNa⁺およびK⁺電流を示したが、12〜15週齢のhESC-3D網膜組織凝集体では、試験したほぼすべての網膜ニューロンが電気的に励起されやすく、頑健なNa⁺およびK⁺電流を示した。

実施例9
World Precision Instrument製、外径（OD）1.52 mm、内径（ID）1.12 mmのマイクロキャピラリーを用いることができる。移植前-7日以降の免疫抑制レジメンの全身性シクロスポリン、hESC-3D網膜組織をネコの網膜下スペースへと送達する技術および撮像方法（たとえば、移植直後および動物を殺す直前を含めたいくつかの異なる時点での、スペクトルOCT、RetCam）も、眼の大きい動物の網膜下または網膜上スペースに生存可能なhESC-3D網膜組織を送達するのに用いることができる。

図12Aから図12Cは、手術チームがhESC-3D網膜組織を野生型ネコの網膜下スペースに移植する様子を示す。図12Dは、眼圧調節装置、およびグラフトを撮像するRetCam装置を示す。図12Eは、眼内手術のためにネコの眼内に挿入された2つのポートを示す。図12Fは、網膜下スペースにhESC-3D網膜組織を移植するための、網膜剥離（ブレブ）を示す。図12Gは、hESC-3D網膜組織を注入するためのカニューレを示す。図12Hは、RetCamで撮像した野生型ネコの網膜下スペースのhESC-3D網膜組織を示す。図12Jは、野生型ネコの網膜下スペースに配置された移植後5週間のhESC-3D網膜組織の断面OCT画像を示す。図12Kは、グラフトの全寸法を見積もるためのOCT画像の3D再構築を示す。

実施例10
野生型ネコ眼内の網膜下スペースに移植後5週間のhESC-3D網膜組織グラフトの免疫組織化学的分析により、眼の大きい動物の網膜へのhESC-3D網膜組織の、腫瘍無しでの構造的統合およびシナプス統合が実証された。凍結組織学／IHCのためのグラフトを有するネコ眼杯の保存、網膜特異性、ヒト特異性、シナプス特異性抗体を用いた共焦点IHCは、成功裏に実施された。図13Aは、薄切の準備としてPFA固定され、凍結保護され、OCT飽和された網膜下グラフトを有するネコの眼球を示す。図13Bは、OCT中の凍結されたネコの眼球の断面を示す。図13Cは、OCT中のネコの眼球の厚さ16 μの切片を示し、網膜中心の膨らみとしてグラフトが示されている。図13Dは、hESC-3D網膜組織グラフトの保存を示す凍結切片の部位の拡大画像を示す。

図13Eは、網膜下スペースに移植後5週間のhESC-3D網膜組織グラフトを有するネコ網膜切片のIHCを示す。グラフトは、多数のCALB2（カルレチニン）陽性ニューロンの存在を示しており、矢印はヒトグラフトとネコのONLとを結合しているCALB2[+]軸索を指している。図13Fから図13Hは、HNu、Ku80、およびSC121（ネコではなく）ヒト特異性抗体でそれぞれ染色された、ネコの網膜下スペースのhESC-3D網膜組織グラフトを示す。これらの結果は、実にヒト組織がネコの網膜下スペースの正しい場所に移植されていることを実証する。図13Iは、BRN3A（RGCのマーカー）およびヒト核マーカーによる染色を示す。アステリスクは、メイン画像中のマーカーを有する部分を示し、差し込み図で拡大されている。これらの結果は、グラフト内の細胞が、RGCへと成熟中であることを示す。図13Jから図13Kは、（ネコではなく）ヒト-シナプトフィジン（hSYP）に対し特異的な抗体および軸索マーカーNFL（ネコとヒト両方のニューロンに特異的）での染色を示し、また、点状染色（矢印）の存在が示されているが、それはネコニューロンに統合されているヒトニューロンにより形成されている可能性があるシナプスを示す。ヒト点状染色は、ネコONLとhESC-3D網膜組織グラフトとの境界で観察された。このことは、シナプス結合が開始している可能性を示す。点状染色（赤）の分布パターンは、発達中のヒトシナプスがレシピエント網膜と結合していることも実証している。

野生型ネコの網膜下スペースにおけるhESC-3D網膜組織グラフトとの結合性の免疫組織化学（IHC）的証拠が、移植後5週で実証された。図14Aおよび図14Bは、（ネコではなく）ヒト特異性シナプトフィジン抗体hSYP（赤）、およびネコとヒト両方のニューロンを染色するカルレチニン（緑）を示す。hSYPは、ネコのONL中のヒトの点を染色する（矢印）。図14Cおよび図14Dは、より低倍率の画像を示し、hESC-3D網膜組織グラフトを有する大片のネコ網膜の概略を提供する。hSYP染色は、グラフトを起点として、グラフトおよびグラフトに面したONLの一部を染色するが、グラフトに隣接するネコ網膜は染色しない。

図15Aから図15Cは、ネコINLとグラフト中のカルレチニン[+]ヒト細胞とを結合しているカルレチニン[+]軸索（矢印）を示す。より高倍率下で、これらの軸索はネコ細胞からヒトグラフト内へ、およびヒトカルレチニン[+]細胞からネコINL内へ伸びていることがわかった。図15Dおよび図15Eは、成熟しているように見えるグラフト中のカルレチニン[+]ニューロン、およびグラフト全体に見られたカルレチニン[+]軸索を示す。

図16Aから図16Eは、ネコ網膜下スペースにおけるhESC-3D網膜組織グラフト縁部の染色を示す。SC121ヒト細胞質特異性抗体（赤）およびKu80ヒト核特異性抗体（緑）は、ネコ網膜ではなくヒト網膜グラフトを染色する。この画像から、グラフトとホストとの間に結合性があることがわかる。図16Dは、hESC-3D網膜組織グラフトからの軸索が、グラフトにすぐ隣接する層内のネコPRに巻き付いているのを示し（矢印）、また、一部のSC121+ヒト軸索がネコのONLにかかっているのがわかる（図16B、FIG、16Eの矢印）。

これらの結果は、染色の分布パターンが、グラフト細胞の、腫瘍無しでの生存および成熟に加えて、グラフトに起因するシナプトフィジン染色されたシナプス結合性の現れであることを示す。どのネコ対象でも腫瘍は生じなかった。

実施例11
少なくとも2種の、眼の大きい遺伝的RD動物モデルでの、変性中の網膜に移植されるhESC-3D網膜組織の、組織学およびIHCに基づくシナプス結合性の機構、および電気生理学レベルに基づく機能判定を、さらに実証する。分化の特定の発達時点のhESC-3D網膜組織は、変性中のレシピエント網膜と構造的およびシナプス的に統合できること、そして進行性網膜変性を含む網膜変性、網膜障害、および疾患をもつ対象の視覚を回復させる「生物学的パッチ」として役立つことが、実証されている。さらに、網膜変性をもつ眼の大きい動物モデルに対するhESC-3D網膜組織移植のプラスの治療的影響を実証することで、バイオ補綴材料上の多数のhESC-3D網膜組織片からなるバイオ補綴網膜のさらなる強化が可能になる。2種の眼の大きい動物モデル（Pde6a[-/-]イヌおよびAipl1^-/-ネコ）、そして必要に応じて、追加の2種の眼の大きい動物モデル（Cngb1^-/-イヌおよびCrx^+/-ネコ）を用いることができる。

フルフィールドERGおよびmfERGを実施して、変性中の網膜の機能を評価し、かつグラフトを有する対象のグラフト周囲（網膜中心）と周縁部、そして対照対象とで、網膜機能の変化を比較する。PR変性を有する網膜、特にグラフト上の部位の網膜の個々のRGC細胞の電気活性について、既成のMEA技法を用いて網膜をアッセイする。多電極アレイは、多数の個々のRGCの読み取りを一度に行うことができるので、個々のRGCに面倒なパッチクランプ法を用いる必要がない。パッチクランプ法は、情報量がより少なく、また、hESC-3D網膜組織グラフトとシナプス結合性を有するRGCが示されない可能性がある。記録は、網膜の生存可能性が維持される酸素チャンバで1〜2時間かけて実施することができ、こうして正確な読み取りが可能になる。これらのアッセイは、シナプス結合性と個々の網膜細胞の構造的（ヒトシナプトフィジン、ヒトSC121抗体、およびWGA-HRP経シナプストレーサーを用いる組織学／IHC）レベルおよび機能的（電気生理学的）レベルとの相関関係の分析を可能にする。mfERGは、グラフト周囲のホスト網膜（vs.個々の細胞）の活性を正確に特定するのを可能にする。多電極アレイは、グラフトが、神経保護機構／細胞融合を介してではなく（またはそれに加えて）、細胞置換を介して作用することの実証を可能にする。

MEAの記録には約1〜2時間かかり、網膜構造が徐々に劣化していくので、hESC-3D網膜組織をPde6aイヌおよびAipl-1ネコの両眼に移植してもよく（動物6匹=眼球12個／各モデル）、そうすることで片方の眼球を多電極アレイ読み取りに充て、もう片方の眼球を組織学/IHC読み取りに用いることができる。

インビトロおよびインビボで経シナプストレーサー、コムギ胚芽凝集素-西洋わさびペルオキシダーゼ（WGA-HRP）を発現しているhESC-3D網膜組織をアッセイし、イヌ（Pde 6a[-/-]）とネコ（Aipl-1[-/-]RDモデル、各6匹）両方のhESC-3D網膜組織の移植を分析して、両モデルがグラフトを維持し、そしてシナプス統合を促進する能力を評価する。組織学、IHC、および異種移植特異性抗体も使用することができる。インビトロ電気生理学（MEA）を、高解像度組織学、免疫組織化学、mfERG、およびVEPとともに、移植結果の評価に用いることができる。

本明細書では、動物の3種のコホート（RD発症時、ONL厚さが約50%保存された、部分的に変性している網膜、およびほとんど／完全に変性したPRを有する網膜）に移植したグラフトとレシピエントの変性中の網膜とのシナプス結合性の機構を決定する方法を提供する。インビトロおよびインビボ両方での電気生理学法、ならびに視覚的に案内される行動試験を用いて、視覚障害対象の視覚回復の程度を描写することができる。

バイオ補綴網膜（個々のhESC-3D網膜組織コンストラクトまたはオルガノイドよりもサイズが大きいグラフト）の移植も実施される。バイオ補綴網膜は、複数のhESC-3D網膜組織片がバイオ補綴材料または担体または足場（たとえば、ヒドロゲルベースの、たとえばHYSTEM（登録商標）））に設置されており、数千個のPR（=生物学的画素）を担持し、視覚的に案内される行動の回復を可能にする。このバイオ補綴網膜はまた、具体的な網膜疾患または障害、たとえば黄斑変性を治療するようにカスタマイズすることができ、パッチは、ほぼ錐体からなる黄斑を再建できるように、主として錐体を担持するよう再設計することができる。

コムギ胚芽凝集素・西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（WGA-HRP）を、経シナプストレーサーとして用いることができる。3D網膜組織は、トレーサー[+]およびトレーサー[-]hESCに由来してもよく、それらを2〜3カ月間同時培養し、トレーサー[-]網膜組織中のHRPについて（HRP基質DABを用いて）試験することができ、するとトレーサー[+]網膜組織からの経シナプストレーサーの遊走が示される。トレーサー[+]ヒト網膜組織をイヌおよび／またはネコ胎仔網膜と一緒に2〜3カ月間同時培養したものを用いて、（1）WGA-HRP遊走、または（2）キメラ型ヒト／非ヒトシナプス形成のいずれかについて試験して、シナプス結合性を判定することができる。ヒトシナプトフィジン（hSYP）およびヒト細胞質（SC121）に対し特異的な抗体を用いる後者の方法の実現可能性が示されたが、本発明者らは、キメラ（ヒト-非ヒト）シナプスをより敏感に検出できることからWGA-HRPも試みることにする。次に、トレーサー[+]網膜組織コンストラクトを、若い（4〜5週）Pde6a-/-イヌおよび6匹のAipl-1-/-ネコ（両眼にグラフトを受ける）の網膜下スペースに移植することができる。RetCamおよび光干渉断層撮影（OCT）を用いて動物を撮像することができ、動物をたとえば6カ月時点で屠殺し、試料をDAB、hSYP、およびSC121染色して、グラフト／ホストシナプス結合性（片眼／動物）を判定し、もう片方の眼をエクスビボで多電極アレイ（MEA）により電気生理学的に試験する。

（経シナプストレーサーおよびIHCにより）シナプス統合、グラフト中のPRの外節の伸長を両方実証し、かつ移植後6カ月までに機能的統合（移植部位の周囲／上部でMEAによりRGC活性を見出すこと）をさらに実証することができる。若いhESC由来網膜オルガノイドグラフトによる神経保護効果も実証され得る。MEA信号の観察は、（グラフトから3〜4 mm外側の網膜と比べて）再生または網膜変性の進行の緩慢化が、神経保護だけでなく、特定のPR置換機構によることを示し得る。

一態様では、伸長因子-1アルファ（EF-1α）プロモーターの制御下でコムギ胚芽凝集素-HRP遺伝子トレーサーを発現するhESCを設計し、hESC-3D網膜組織の誘導をスケールアップして生産し、hESCの同定（DNAフィンガープリンティング）を行い、核型分析を実施し、工学的に操作されたhESC-3D網膜組織を6匹のPde6a-/-イヌおよび6匹のAipl-1-/-ネコ（両眼）に移植し、OCT、全眼ERG、mfERG、MEA、およびVEP（対照Pde6a-/-イヌおよび対照Aipl-1-/-ネコを網膜変性の対照読取として用いる）を行い、6カ月間待ち、動物を屠殺し、眼球およびグラフトを有する網膜を摘出し、グラフト上の部位のRD網膜機能の変化を描写し（個々のRGCにパッチクランプ法を用い、MEAも用いる）、次いでグラフトを有する組織を固定し、網膜特異性免疫表現型に対する抗体を用いてグラフトとレシピエントとのシナプス結合性および移植hESC-3D網膜組織の成熟を描写する。

cGMP等級hESCを用いてhESC-3D網膜組織を誘導することができる。分化の動態は、たとえばES Cell International Pte. Ltd.などの企業のいくつかの異なる系統のcGMP-hESCにおいて決定することができる。ES Cell International Pte. Ltd.の細胞は、正常核型を有し、完全に特徴決定されている。

hESC-3D網膜組織内の、および該組織と変性中のレシピエント網膜とのシナプス結合性を利用して機能的な生物学的「網膜パッチ」を作り、それによってグラフトのPRからレシピエント網膜のRGCに視覚情報を送信し、受信させることができる。レシピエント網膜の急速な変性によりグラフトとレシピエント網膜のRGCとが接近することで、グラフトとホストとの結合性が促進され得る。まとまった証拠によると、6〜12週齢hESC-3D網膜組織がRDをもつイヌおよびネコで生着し、分化し、積層し、そしてレシピエント網膜にシナプス結合することが示唆される。hESC-3D網膜組織はRPE層を有するので、グラフト中のPRの生存、成熟、および外節発生に好都合である。

WGA-HRP経シナプストレーサーを用いて、グラフトとホストとのシナプス結合性を実証することができる。WGA-HRPは、強力な偏在性プロモーター、EF1alphaから発現するので、カスタムメイドのレンチウイルスベクター（たとえばGeneCopoeia）中EF1alpha-WGA-HRPコンストラクトをhESC（これからhESC-3D網膜組織が誘導される）に導入することにより工学的に操作することができ、6カ月でシナプス結合性が確立すればヒト／イヌまたはヒト／ネコのシナプスの交雑が可能である。hESC-3D網膜組織は、（i）発生約8週目にはシナプス形成および軸索形成を開始すること、および（ii）移植後2カ月未満でグラフトとレシピエントの野生型ネコ網膜との間に点状シナプスの兆候を示すことがわかっている。高解像度共焦点免疫組織化学法をhSYN抗体（ネコ／イヌシナプスではなくヒトのシナプス前部分に対し特異的）およびHNu（ヒト核）抗体とともに用いて、レシピエントの網膜ニューロン周囲のヒトシナプスを実証することができる。HNu[+]核を持たないレシピエントニューロン上のhSYN[+]終末ボタンを探すこともできるし、それとは別に、hSYN[+]終末ボタンを有するSC121[-]軸索を探すこともできる。

追加の対照として、外科的操作をしていない、網膜変性変異を有する動物があってもよく、同一の網膜部位を単離してMEAにより試験する。その結果を、本発明者らが「目印」とする視神経からさほど遠くはない、グラフトを配置した場所と比較することができる。

エクスビボ電気生理学実験として、多電極アレイ（MEA）をもう片方の眼球に対し実施することができる。MEAの後は網膜組織の完全性が徐々に失われるため、この組織を組織学では使えない。したがって、約6匹のイヌおよび6匹のネコのグラフトを有する眼球から採取した試料のMEAの読み取りを実施する（インビボのmfERGおよびVEPを試みてから動物を殺す）一方で、組織学およびIHCのデータはもう片方の眼球から生成する（同じく6匹のイヌおよび6匹のネコのグラフトを有する眼球）ことができる。各動物の両眼でmfERGを実施してから動物を殺し、グラフト周囲の網膜からの信号と、完全に変性した網膜およびグラフトからずっと離れているPR（陰性対照）からの信号を比較することができる。

mTeSR1培地を用いて、Laminin-521または成長因子減少型（GFR） MATRIGELまたはビトロネクチン上でhPSCを培養することができる。（Genocopoeiaなどの企業による）カスタムメイドのレンチウイルスベクター中経シナプスレポーターをhESCに導入し、薬物選択ピュロマイシンを用いて10 μMのRho-キナーゼ阻害剤（ROCK）中2週間かけて単離し、WGA-HRP発現についてコロニーをアッセイし、増幅させ、液体窒素中で保存することができる。hESC-3D網膜の誘導は、本明細書に記載の方法にしたがい実施することができる。動物を殺した直後に眼球を取り出し（MSUプロトコルまたは他のプロトコル）、氷冷の新鮮な4%パラホルムアルデヒド／PBS pH 7.6〜8.0に浸漬し、前眼房を切除し、組織学、IHC、およびプレエンベディング法用に眼杯を4℃でさらに15分かけて固定することができる。眼杯は、20%〜30%スクロース中で凍結保存し、そしてOCT/スクロース中で瞬間冷凍することができる。各動物の視神経および脳組織も保存することができる（HRP[+]軸索を追跡して、WGA-HRPがグラフトからレシピエントのRGCを経由してRGC軸索を通り上丘まで輸送されているかどうかを判定するため）。ヒトグラフトおよびヒト／ラット、ヒト／ネコシナプスの分析のために、hESC-3D網膜組織グラフトを含む選択切片をヒト特異性HNuおよびα-シナプトフィジン抗体で染色することができる。IHCは、Singh, R.K., et al., Characterization of Three-Dimensional Retinal Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells in Adherent Monolayer Cultures. Stem Cells Dev, 2015. 24(23): p. 2778-95に記載されている抗体／プロトコルを用いて実施しても、別のプロトコルを用いて実施してもよい。

hESC-3D網膜組織グラフトは、（i）網膜変性の発症前、（ii）1〜2の光受容体層がまだ存在している、および（iii）変性の進行後の、シクロスポリン-免疫抑制動物の3種のコホートに移植することができる。イヌ人工多能性幹細胞（iPSC）から網膜組織グラフトを誘導することができ、かつ、イヌレシピエントとの免疫適合性が、バイオ補綴網膜グラフトの生着および機能的統合を強化するかどうか評価することができる。RetCamおよびOCTを用いてグラフトを12カ月間モニターしてもよい。また、網膜電図検査（ERG）、多電極アレイ（MEA）記録、視覚誘発電位（VEP）、瞳孔光反射、および視覚的に案内される迷路ナビゲーションなどの機能的アッセイを、3カ月、6カ月、9カ月、および12カ月で用いて、網膜感光性および視覚機能を試験してもよい。移植後12カ月で動物を屠殺して、シナプス統合を決定することができる。

グラフトとレシピエントの変性中の網膜とのシナプス結合性の機構は、動物のRD発症時に、ONL厚さが50%保存された、部分的に変性している網膜、および／またはほとんど／完全に変性したPRを有する網膜に対し、本明細書に記載の移植手順を実施することにより決定することができる。インビトロおよびインビボ両方での電気生理学法、ならびに視覚的に案内される行動試験を用いて、視覚障害動物の視覚回復の程度を描写することができる。

スペクトルドメイン-OCTおよびRetCam撮像は、手術後2週間、そして3週間での高解像度スペクトルドメイン（SD）-OCT、そして1年後までの追加のSD-OCTスキャン（移植後2カ月、3カ月、6カ月、9カ月、および12カ月）により、「良好な」グラフト（基準の一例は、大きい移植片が網膜中心に生着していること、を含み得る）を選択することにより、実施することができる。過度の手術外傷／眼球出血の動物は、初回のRetCamおよびSD-OCTスキャンで除外してよい。移植を受けたネコおよび偽手術のネコに、手術後1〜2カ月から開始して、2カ月おきに視動性試験を実施することができる。この試験は、ネコが特定の太さの動く細片を見ることができるかどうか（サイクル／程度）、および空間的閾値を決定できるかどうかを評価する。各試験を2回、同日または翌日に実施することができる。動画は、動物の状態を知らない独立した調査者2名によって評価され得る。試験の不均質性により、群のサイズは最低でも6匹とされ得る。

多焦点（mf）ERGは、動物の網膜の異なる部位間でPR機能を比較することができ、かつ移植部位とグラフトの周りの変性PRを有するホスト網膜との細かい電気生理学的違いを正確に特定することができる方法である。全動物および偽手術に対し、手術後約+2週間、そして+3週間、その後は移植後約2カ月、3カ月、6カ月、9カ月、および12カ月と、約1年になるまで瞳孔光反射を実施して、瞳孔測定を記録することができる。VEPの記録は、全動物および偽手術に対し、手術後+2カ月、そして+4カ月、6カ月、9カ月、12カ月と、1年になるまで実施することができる。

組織学／IHCのために、（動物を殺した直後に）眼球を取り出し、氷冷4%パラホルムアルデヒド（PFA）中2時間かけて固定してから氷冷PBSで3回洗い（それぞれ約30分）、スクロースで凍結保護し（最終濃度はPBS中約30%）、グラフトを有する眼球（たとえばSD-OCTにより選択）をCryostat上で薄切して12 μm凍結切片を作製することができる。ヘマトキシリン・エオシン（H-E）またはクレスタル・バイオレット（CV）を用いて各第20切片に対し組織学を実施して、グラフトを有する切片を特定することができる。IHCは、（ネコ／イヌではなく）ヒト組織に対し特異的な抗体（SC-121、Ku-80、またはHNu、NF-70）、多様なネコ/イヌヒト特異性網膜細胞型（杆体および錐体、PR、双極細胞（たとえば、CaBP5、PKCα、SCGN）、アマクリン（たとえばカルレチニン）、RGCマーカー（たとえばBRN3A、BRN3B）、およびシナプス（SYP、SYT、BSN、PCLO、CTBP2、mGluR6、PSD-95その他に特異的な抗体、たとえばネコ/イヌではなくヒトシナプトフィジン特異性のhSYP抗体を用いて実施することができる。

MEAの記録は、動物を殺した直後に眼球を取り出し、取り出した眼球を酸素チャンバへと運んで実施することができ、この酸素チャンバ内でグラフトを有する網膜片を慎重に単離し、記録の手順中ずっと置いておくことができる。免疫EMでは、以下の手順をとることができる：眼球を取り出した直後に眼球を約3%グルタルアルデヒドおよび約2%PFA中で固定、洗浄、ゼラチン-アルブミン混合物に包埋しグルタルアルデヒドで硬化、ビブラトーム切片作製、非蛍光法によるhSYP抗体を用いたIHC（二次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ）、樹脂包埋、および超薄レベルの再薄切。

バイオ補綴網膜グラフトの形態的および機能的判定
移植手順の質、およびグラフトが変性網膜において感光性を誘発するかどうかを判定するために、いくつかの形態的および機能判定を実施することができる。移植後定期的に眼底撮像および光干渉断層撮影を実施して、グラフトの外見および網膜の状態をモニターすることができる。グラフトが誘発する感光性を調査するために、移植直前、ならびに移植後3カ月、6カ月、9カ月、および12カ月で、（1）視覚的に案内される行動; （2）瞳孔光反射のインビボ撮像; （3）インビボ網膜電図検査により網膜光応答を判定; （4）視覚誘発電位の記録により、視覚野への網膜光応答の送信を判定;および（5）インビトロ多電極アレイの記録により、移植を受けた網膜領域内の神経節細胞の光応答を判定、などのさまざまな行動試験および電気生理学的試験を実施することができる。

眼底ビデオカメラ（たとえばRetCam II, Clarity Medical）を用いてワイドフィールド・カラー眼底撮像を実施して、移植直後および定期的にグラフトの配置を記録し、それによってグラフトの外観をモニターすることができ、炎症反応があれば記録することができる。モニタリングは、意識のある動物で、瞳孔散大（トロピカミド）および局所麻酔（プロパラカイン）適用後に実施することができる。

スペクトルドメイン-光干渉断層撮影（OCT）。Spectralis装置（たとえばHeidelberg Engineering製）を用いて、グラフトの走査レーザー検眼（cSLO）および網膜断面画像（OCT）を記録することができる。これは、全身麻酔下（たとえばプロポフォールで誘導、挿管し、酸素中イソフラン吸入により麻酔維持）で、動物をヒーターパッドに載せ、37℃に維持して実施する。開瞼器および結膜の支持縫合により、眼球を第１眼位に維持することができる。赤外および自己蛍光cSLO撮像を両方実施することができる。高解像度の線および体積のスキャンによりグラフトおよびホスト網膜の外見を記録することができ、エンハンスト・デプス・イメージング（enhanced depth imaging）（EDI）プロトコルを必要に応じて使用することができる。撮像を繰り返し実施して、Heidelberg眼球追跡ソフトウェアを用いて以前の画像と揃えることができる。こうすることで、グラフトおよびそれに重なるホスト網膜の両方の網膜形態および網膜層厚さを判定することができる。それによって、網膜の状態、および移植手順後に生じうる網膜剥離、浮腫、または網膜自体の菲薄化などの関連異常の、形態データが提供される。図17は、ネコに植え込まれた網膜組織バイオ補綴物の、網膜下スペースへの移植直後に撮像されたRetCam画像を示す。

機能判定プロトコル
過去に網膜療法実験で用いられた四択視覚試験デバイスを使って、イヌの視覚試験を実施することができる。尺度は、正確な出口の選択および出口タイムであり、暗順応、薄明視および明順応の照明レベルでの視覚の客観的な判定を提供する。この試験では、杆体のみならず錐体が媒介する視覚を特定することができる。不透明のコンタクトレンズで一方の眼をふさいで、片眼ずつ試験することができる。ネコの視覚試験は、いくつかの異なる技法からなり得る。これらには、特別仕様の視動性デバイスを用いる視動性反射（OKR）の判定、およびプラットフォームの特定が含まれる。OKR試験は、ネコの視覚を判定する技法である。動く物体を追いかけるネコの行動も利用できる。すなわち、レーザーポインターの追跡である。最後に、ネコの視力、たとえば視覚刺激により指示されたプラットフォームに飛びつく能力を判定する技法を用いることができる。この技法では、ネコは、指示されたプラットフォームを特定すると報酬が与えられ、不正確なプラットフォームを選ぶと負の強化が与えられる訓練を受ける。

インビボ瞳孔光反射（PLR）撮像を用いて、グラフトが網膜感光性を強化するかどうかを決定することができる。PLRはほぼ完全に天然感光性網膜神経節細胞（ipRGC）に媒介されるが、ipRGCの機能だけでなく杆体／錐体回路の機能の判定にも便利である。その理由は、ipRGCの光応答は、その感光色素メラノプシンを介する直接的なものと、杆体および錐体からのシナプス入力を介する間接的なものと、両方あるためである。PLRは、前述したように全部で5つの時点で測定することができる。各時点で、PLR撮像は、同じ動物のインビボのERG記録が取得される1日前に実施することができる。日内変動を最小限化するために、すべてのPLR撮像がほぼ同じ時刻に実施され得る。

各PLR撮像の前日の夕方、動物を一晩かけて暗順応させることができる。翌朝、薄暗い赤色光の下で、動物に麻酔をかける。赤色光を消し、10分かけて動物を暗順応させた後、RETImapシステム（Roland Consult）を用いて、移植を受けた眼内のグラフトの場所を突き止める。この装置は、共焦点レーザー走査技術に基づくものであり、網膜を光順応させることなく、または視覚応答を生じさせることなく、赤外レーザーを使って網膜をスキャンし、cSLOにより眼底の画像を取得し、移植を受けた領域を特定する。次いで同システムを用いて、移植を受けた眼内のグラフト含有領域を限局的に照射する光の可視波長を生成することができ、そしてアイトラッカー（たとえばSR Research EyeLink 1000 Plus）を用いて赤外照射下で移植を受けていない眼を撮像して、共感性PLRを探すことができる。少なくとも3ログ単位にわたる、4種の異なる強度が提示され得る。対照として、移植を受けていない眼内の相当する領域に焦点照射を送達することができ、他方の眼の共感性PLRを撮像する。アイトラッカーが捉えた瞳孔の画像を、フレームグラバーを介してリアルタイムで別のコンピューターに送信して、瞳孔直径のオフライン分析をすることができる。この測定では、LabVIEWベースの画像処理ルーチンを活用することができる。ネコでは、瞳孔中央の水平方向直径が測定され得る。各記録時にピーク瞳孔収縮が測定され得る。各刺激強度について、マン・ホイットニーのU検定を用いて、移植を受けた眼の照射によるピーク収縮を、移植を受けていない眼の照射によるピーク収縮と比較することができる。グラフトが本当に感光性を強化できるとすれば、移植を受けた眼の光刺激は、移植を受けていない眼の光刺激よりも強い瞳孔収縮をもたらすと予測される。

インビボ電気生理学により、移植されたhESC由来網膜組織バイオ補綴インプラントが、移植を受けた網膜の光誘起性活性をサポートする能力を判定することができる。一連のインビボ電気生理学的判定を用いることができる。ERG技法は、グラフトが機能的であるかどうか、また、網膜機能を改善しているかどうかを示すことができる。VEPは、視覚野への送信があるかどうかを示すことができ、そして視覚試験およびPLR試験とともに、網膜機能を改善する移植技法の総合的な実現可能性を判定することができる。これらの測定は、無傷の動物で実施することができ、また、長期のフォローアップ期間にわたり繰り返し実施することができる。遺伝的または人工の網膜変性を有する動物モデルでは、フルフィールドまたは焦点フラッシュ誘起ERGにより、網膜機能の状態を判定することができる。幹細胞由来の懸濁物またはシート式インプラントの移植後は、ホスト網膜が変性している場合は特に、移植組織のフルフィールド刺激よりも焦点刺激のほうが、より有効にグラフトの光応答を試験できる場合がある。ffERGも実施され得る。焦点および多焦点ERG試験は、RETImapシステムを用いて実施することができる。移植を受けた領域の特定は、PLR撮像に関し上記に記載されたRETImapを用いて実施することができ、この装置はまた、その領域に光刺激を集中させて焦点ERGを引き出すのにも用いることができる。移植を受けた各領域を刺激することができ、また、応答を記録して、移植を受けていない網膜領域および対照（無処置）眼球の同一領域の両方と、比較することができる。あるいは、多焦点ERGを実施することができる。

グラフトが成功裏に光受容体を形成し、かつホスト網膜とのシナプス結合性を形成し、そうすることで光活性化した神経活性を提供すると、視索から中枢への視覚情報の送信が達成され得る。これを実証するために、視覚野（ヒト眼球部位17に相当）の記録を行うことができる。これは、動物の後頭部に皮膚電極または皮下電極を取り付けることにより、ERG記録と同時に行うことができる。グラフトの機能的統合が生じたと想定して、ERG応答の生成に使用され得るものと同じ刺激により、VEPも引き出すことができる。フラッシュ刺激（パターンなし）およびパターン刺激（市松模様または格子）を用いることができ、これらはRETImapシステムにより作成することができる。

動物を一晩かけて暗順応させ、そして薄暗い赤色光の下で記録の準備をすることができる。OCTに関して本明細書に記載されるように、麻酔、瞳孔散大、および眼球位置決めを用いることができる。まず、暗順応試験プロトコルを実施することができ、正常な杆体閾値よりも低い輝度から始めて刺激の強度を徐々に高め、最終的に杆体／錐体の混合応答を記録する。一連の暗順応の後、動物を杆体抑制バックグラウンド光に順応させてから、一連の光順応輝度を実施することができる。機能的ERGの存在を前提としてVEPを記録する場合は、皮下針電極またはゴールドカップ電極を後頭の正中線に沿ってイニオン付近に配置することができる（これらの動物で、どちらの電極スタイルがベストな記録を作成できるか決めることができる）。イニオン付近に記録電極を配置すると、イヌのVEPのERG汚染が最小限化されることがわかっている。ゴールドカップ電極を用いる場合、動物の頭皮を頭蓋骨正中線全体の両側少なくとも1.5 cm剃毛し、70%アルコールで清拭し、完全に風乾することができる。選択した記録場所に導電電極ペーストを塗布し、カップ電極を皮膚にしっかりと取り付け、医療用テープで抑えることができる。頭皮清拭工程の後、電極ペーストを塗布する必要なく、針電極を皮下に挿入してもよい。

電気生理学的データは、定量的に分析することができる。ERGの記録については、a波およびb波の振幅ならびに潜在時間を記録し、データベースに保存することができる。VEPについては、2種類の分析法を用いることができる。フラッシュVEPについては、応答波形のN1およびP1ピークの潜時、ならびに信号ベースラインに対するこれらのピークの振幅を測定することができる。これらのパラメーターをデータベースに保存することができる。パターン逆転VEPを記録できる場合は、刺激パターンの逆相周波数を参照する高速フーリエ変換（FFT）を用いて波形を分析し、定常状態VEP応答の振幅および相コンポーネントを得ることができる。これらのパラメーターは、グラフトの種類、グラフト後持続時間、および任意のほかの関連する治療パラメーターの関数として各動物の全電気生理学的パラメーターを容易に検索できるように、データベースに保管することもできる。分析の主要な終点は、（1）ERGまたはVEPで光誘起性の活性と定義される視覚の回復が網膜グラフト後に生じるかどうか;（2）動物に適用された幹細胞治療（またはその不足）の種類;および（3）光誘起性応答が最初に観察されるまでの時間、であり得る。

インビトロ多電極アレイ（MEA）の記録:インビトロ多電極アレイ（MEA）の記録は、移植を受けた領域から取得することができ、移植組織の下流の網膜神経節細胞の光応答を直接判定する。これらのインビトロの記録は動物の安楽死を要するので、インビボの機能判定が完了した後、移植後12カ月の時点で実施することができる。MEAの記録を行う前夜、動物を一晩かけて暗順応させることができる。翌朝、薄暗い赤色光の下で動物を安楽死させることができ、眼球を半切して両眼の眼杯を採取し、前方半分を廃棄し、ピンセットで硝子体を除去する。眼杯を、Ames培地の入った2本の蓋つき50 mLチューブに移すことができ、携帯型カルボゲン槽を使って95% O₂ 5% CO₂を連続的に補給することができる。蓋つきチューブは、輸送中は遮光性の箱に入れてもよい。

イヌ／ネコ／ウサギの眼杯を新鮮Ames培地に移してもう1時間暗順応させてもよく、その間に移植を受けた網膜を赤外ビュワー下で肉眼視して、移植を受けた領域を突き止める。グラフトを見つけたら、移植組織を含む眼杯片およそ2.5 mm x 2.5 mmをブレードを使って切り出すことができる。この片を神経節細胞側を下にして60電極MEA上に平らに置くことができ、前述のようにして神経節細胞からの活動電位が細胞外で記録される。この処理では、色素上皮、脈絡膜、および強膜への網膜の付着は妨害されないので、移植組織はしっかりと付着し続けることができ、光励起性感光色素の再生を担う視覚サイクルも良好に保存されている。8.6 log〜15.6 log光子cm^-2 s^-1の持続時間1秒のフルフィールド光工程の一連の強度が提示され得る。MEAの記録は、移植を受けた領域に隣接する網膜領域からも、移植を受けていない網膜の相当する領域からも取ることができる。両セット（すなわちグラフト含有網膜および対照網膜）の記録は、たとえばPlexon Offline Sorterソフトウェアを用いてスパイクをソートすることができる。あるいは、各電極の光応答の振幅は、1秒間の光刺激中および刺激開始前1秒間の原記録の分散量を計算し、2つの分散量の差を光応答振幅として用いることで、容易に定量化することができる。

移植を受けた領域から記録された神経節細胞の光応答のほうが対照領域のものよりも有意に大きいかどうかを決定するために、スパイク数または記録分散量における光誘起性変化を、たとえばマン・ホイットニーのU検定により2領域間で比較する。各刺激強度については、以下のカテゴリーのipRGCの光応答について別々に統計学的比較をすることができる: （1）光開始にあたり迅速に励起; （2）光開始にあたり迅速に阻害; （3）光消失にあたり迅速に励起; （4）光消失にあたり迅速に阻害;および（5）メラノプシンベースの光応答に似た不活発な励起。移植組織が杆体／錐体に駆動される網膜回路の感光性を実際に可能にするか強化するならば、対照領域よりも移植を受けた領域のほうが迅速な光応答が有意に強いこと（すなわちカテゴリー1〜4）がわかるかもしれない。他方で、メラノプシンベースの光応答は、グラフトにより有意に影響されない可能性があるため、差が見られないかもしれない。

たとえば、mfERF VEPおよび瞳孔測定によりグラフトを有する眼球の視覚に改善が見られた場合、客観的視覚試験のための行動学的方法（イヌおよびネコ用に設計された障害物コース、およびネコは視動追跡）を実施することができる。

グラフト-ホスト結合性を、たとえば以下の方法を用いて判定することができる：（1）グラフトにより発現するがホスト細胞によっては発現しない、WGA-HRP経シナプストレーサー; （2）レシピエント網膜のヒトグラフトから離れた部位での、（ネコ／イヌではなく）ヒト細胞質特異性抗体SC121および／もしくは（ネコ／イヌではなく）ヒト特異性シナプトフィジン抗体hSYPおよび／もしくは後シナプスマーカーを用いたIHC/免疫EM、または／ならびに（3）hSYP+HNu抗体および網膜細胞質抗体（たとえば、リカバリン、CALB2、または／およびBRN3A/B）を用いたIHCにより、（非ヒト）レシピエントニューロン周囲にヒト終末ボタンがあること示す。また、レシピエント動物の上丘に非ウイルス逆行性トレーサー コレラトキシンB（CtB）を注入して、結合性を実証することもできる。トレーサーは、動物を殺す2週間前に上丘部位に注入することができ、IHCによりヒトグラフト中のCtBの場所を突き止めることができる。

複数のhESC由来網膜組織片を、たとえばヒドロゲル（HYSTEM（登録商標）など）ベースのエレクトロスパン・シートの生体材料（約3 x 5 mm）、またはエレクトロスパン・シルク、または本明細書に記載されるような眼内植え込みに適した他の生体適合性材料を含む、バイオ補綴担体または足場に設置して、バイオ補綴網膜パッチを作ることができる。バイオ補綴網膜パッチは、対象の網膜下に移植される場合があり、該対象を、上記の撮像法ならびにフルフィールドERGまたは／およびmfERG、およびVEPを用いて1年間追うことができる。また、行動学的視覚試験（イヌおよびネコ用の障害物コース、およびネコは視動追跡）を用いることができる。

一片のバイオ補綴網膜（たとえば3 x 5 mm）をモデルの網膜下スペースに移植して、移植後1週間、そして2週間、そして1カ月、2カ月、4カ月、6カ月、9カ月、12カ月で、SD-OCT（およびRetCam）によるインビボの網膜断面撮像によりグラフトを評価することができる。移植後2カ月、4カ月、6カ月、9カ月、12カ月で、網膜機能をmfERGにより（フルフィールドERGでも）インビボで試験することができ、視覚を行動学的試験（イヌおよびネコ用障害物コース、およびネコは視動追跡）、VEP、および瞳孔測定により試験することができる。安楽死後、組織学および共焦点IHCによりシナプス形成およびPR OS伸長を調べて、ホスト網膜とのグラフトの統合および結合性を判定することができる。プレエンベディング免疫EM（ホストに対するグラフトのシナプス結合性）、およびEM（グラフト中のPR外節を示す）も用いることができる。

まず、バイオ補綴網膜を、3匹以上の動物の網膜下スペース（網膜中心）に移植することができる。動物は、手術前約-7日から手術後約8週間まで、プレドニゾン+シクロスポリンで免疫抑制され得る。バイオ補綴網膜を、経硝子体網膜下移植法により、各動物の両眼に移植することができる（n=3グラフト、全部で眼球6個）。少なくとも１匹のRD動物は、無処置対照として、グラフトなしであり得る。本方法は、重度の網膜剥離を起こすことなく数片のhESC由来網膜組織をネコの網膜下スペースに精密に送達することを可能にする。

SD-OCTおよびRetCam撮像を時点=0（パイロットコホートの移植直後）で、そして移植後+1週間、および+2週間で実施して、移植材料の存在を判定することができる。これにより、シート状バイオ補綴グラフトの網膜下スペースへの送達ならびにグラフトの生着が実証され、OCTおよび組織学の結果が生じる。グラフトを1年またはそれ以上モニターして、バイオ補綴網膜パッチ内のhESC-3D網膜組織の成熟に関する、ならびにシナプス統合に関する組織学的およびIHCデータに加えて、PR機能および視覚改善に関する機能的データ（mfERG、障害物コース、VEP）を生成することができる。

OCTによりグラフトをモニターすることができ、mfERGにより移植を受けた部位とグラフトから約3〜4 mm外側の部位との電気活性の変化をモニターすることができる。これは対照セットの役割を果たし得る（たとえば同じ網膜の異なる部位）。移植後6〜12カ月には、眼の大きいRDモデルの大半が、完全に変性したPR層を有しており、mfERGにより検出可能な信号はグラフトから発信されていよう。

（表１）実験デザインの例

組織学/IHCにより、グラフトを有する動物の（グラフトとホストとの）シナプス結合性がわかる（移植後3〜5カ月の間にmfERG読取値の関数として実験中に間接的に評価することができ、そして動物の死後に直接的に評価することができる）。経シナプス追跡およびインビボの方法（mfERG、瞳孔光反射、VEPなどの視機能試験、および迷路などの視覚的に案内される行動学的試験を用いることができる。ヒトグラフトからレシピエント網膜ニューロンへのWGA-HRP追跡または／ならびにSC121、hSYP、HNu、および網膜細胞型特異性抗体を用いたIHCまたは／およびプレエンベディング免疫EMはすべて、ホストシナプスに対し機能的なグラフトを示す方法である。

実施例12
hESC由来網膜組織を含む網膜オルガノイド（網膜組織グラフトまたは網膜組織バイオ補綴グラフトまたはグラフトとしても公知）を、分化約40日目に、本明細書に記載されるようにして、経扁平部硝子体切除術後（n=7眼球）に外径1.52 mm、内径1.12 mmのホウケイ酸ガラスカニューレ（World Precision製）を使って野生型ネコの眼の網膜下スペースに移植した。第1群（n=3）では、本試験の間中（5週間）、抗炎症用量のプレドニゾンを経口投与した。第2群（n=4）では、プレドニゾンに加えてシクロスポリンAを、移植の7日前から開始して本試験の間も引き続き全身投与した。眼底検査およびスペクトルドメイン光干渉断層撮影（OCT）により、網膜下グラフトの存在および手術手順による有害作用について、眼球を検査した。

ネコの網膜は、図18に示すように構造的にヒトの網膜に似ており、hESC由来網膜組織移植の有効性を実証するための眼の大きい動物モデルの代表格である。具体的には、ネコは、ヒトの黄斑に似た中心野と呼ばれる、錐体を多く含む領域を有する。

本明細書に記載されるようにして、異なるモルフォゲンを用いてヒト胚性幹細胞コロニーから網膜組織コンストラクト（オルガノイド）を誘導した。網膜オルガノイドの網膜分化のタイムラインの一例を図19に示す。図20Aから図20Iに示すように、網膜前駆細胞マーカーおよび早期光受容体細胞マーカーに対する抗体を用いた網膜オルガノイドの免疫染色の結果、網膜オルガノイドにおいて網膜前駆細胞マーカーおよび早期光受容体マーカーが8〜10週間で発現したことが決定された。

図21は、経扁平部硝子体切除術後にガラスカニューレを使って野生型ネコの眼球の網膜下スペースに網膜組織グラフトを移植する画像を示す。図22に示すように、網膜組織グラフトが中に移植される網膜下ブレブを形成した。図23は、移植後3週間で撮影したカラー眼底画像およびOCT画像を示す。これらの画像は、網膜下スペースにおけるグラフトの存在および位置を示し、かつ網膜下グラフトまたは手術手順による重篤な有害作用が何ら存在しないことを示す。

グラフトの植え込みから5週間後にネコを安楽死させた。ヒト特異性抗体（たとえば、HNu、Ku80、SC121）、軸索特異性マーカー、シナプス特異性マーカー、網膜細胞型特異性マーカー、およびリンパ細胞マーカー、マイクログリア／マクロファージマーカーを用いて、網膜切片の免疫組織化学（IHC）分析を実施した。

図24は、マイクログリアおよびマクロファージに対し特異的な抗体を用いて染色された、第1群（+プレドニゾン、-シクロスポリンA）の網膜切片の画像を示す。図25は、同じくマイクログリアおよびマクロファージに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）から採取した網膜切片の画像を示す。図24および図25に示すように、シクロスポリンAを加えた結果、マイクログリアおよびマクロファージの蓄積が減った（IBA1特異性染色を用いて示す）。図25では、移植グラフト内の核のHNuヒト特異性マーカー染色が明白であり、グラフトの細胞が移植後少なくとも5週間は生存することを示している。

図26は、第1群（+プレドニゾン、-シクロスポリンA）と第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）の網膜切片中のマイクログリアおよびマクロファージ細胞マーカー陽性細胞数を比較したグラフを示す。

図27Aから図28Cでも、ネコ網膜下のグラフトの位置がわかる。図27Aは、光受容体マーカー CRXに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片を示す。図27Bは、ヒト特異性抗体、HNuを用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片を示す。図27Cは、CRXおよびHNu両方に対する抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片を示す。図示のように、グラフトは、ネコの光受容体細胞に隣接している。図27Cの拡大挿入図では、ネコ光受容体細胞およびヒト細胞を一緒に示している。図28Aは、網膜神経節細胞（RGC）マーカー BRN3Aに対し特異的な抗体を用いて染色された、第2群（+プレドニゾン、+シクロスポリンA）のネコ網膜切片を示す。図28Bは、BRN3Aおよびヒト特異性マーカーKU80の両方で染色された、第2群のネコ網膜切片を示す。図28Cでは細胞の核も染色されている。

移植後約5週間で、移植されたhESC-網膜組織の軸索伸長がレシピエント網膜に結合しているのが示された。図29Aは、網膜を含めてニューロンで発現するカルレチニンマーカー CALB2に対し特異的な抗体を用いて染色されたネコ網膜切片を示す。CALB2発現の陽性細胞が染色されているのが図29A、図29B、および図29Cからわかる。IHC分析は、移植hESC-由来網膜組織グラフトから出ている数本の軸索が、カルレチニン発現陽性であることを実証している。図29Bは、マーカー SC121のIHC染色を示す。SC121に対する抗体は、ヒト細胞の細胞質に対し特異的である。したがって、DAPIを用いた染色により、レシピエント（ネコ）網膜神経節細胞に対するグラフトの軸索伸長の位置がわかる。図29Cに示すIHC分析は、グラフト移植の少なくとも5週間後にグラフトからの軸索が拡張し、そしてレシピエントの眼の外顆粒層（ONL）に、内顆粒層（INL）に、および神経節細胞層（GCL）にも統合されていることを実証している。

また、図30Aから図30Cに示すように、ICH分析により、網膜に統合されることができる移植ヒト網膜組織グラフト（カルレチニン陽性）が、GABA作動性でもあったことが実証された。図30Aは、ネコ網膜に向かって伸びている網膜グラフトの軸索（CALB2マーカーに対し特異的な抗体を用いて染色されている）を示す。図30Bは、ヒト細胞マーカー HNuおよびCALB2に対し特異的な抗体を用いて染色されている網膜グラフトを示し、そうすることでネコ網膜からのグラフトを描写している。図30Cに示すグラフト軸索のGABA陽性染色は、レシピエント網膜に統合されている植込み組織の軸索が、ニューロンとなるように分化していることをさらに示す。これらの結果は、植込みhESC組織とレシピエント網膜との構造的および機能的統合を実証している。

ICH分析はまた、移植hESC由来組織が、少なくとも5週間インビボで、腫瘍無しで生着したことを示した。

実施例13
hESC由来網膜組織を含む網膜オルガノイドを、分化約40日目に、本明細書に記載されるようにして、経扁平部硝子体切除術後に、外径1.52mm、内径1.12mmのホウケイ酸ガラスカニューレ（World Precision製）を使って、網膜変性を有するCRX-変異体ネコの眼の網膜下または網膜上スペースに移植した。抗炎症用量の経口投与プレドニゾンに加えて、シクロスポリンAを、移植の7日前から開始して本試験の間も引き続き全身投与した。グラフトの植え込み後3カ月でOCT画像を撮影した。図31Aから図31Gは、2対象のOCT画像を示し、網膜変性を有する眼の大きい動物モデル（CRX-変異体ネコ）の網膜下または網膜上スペースに移植されたhESC由来網膜組織グラフトが移植後少なくとも3週間生着できることを実証している。

実施例14
図32を参照すると、野生型ネコの網膜下スペースに移植されたhESC由来網膜オルガノイドで、移植後5週間でBDNF発現が見られた。図示のように、ほとんどの細胞がBDNF+である。BDNFは、変性中のまたは破損したニューロンの機能をサポートする主要なニューロトロフィンの1種である。BDNFレベルがより高いと、網膜を疾患または損傷による網膜変性から保護することができる。これらの結果は、hESC由来網膜組織グラフトが、対象の眼の眼内スペースへの植え込み後、破損したまたは変性中の網膜組織に神経栄養サポートを提供できることを示している。

本明細書における記載から、本開示は複数の態様を包含することが理解され、それらの態様としては、限定ではないが、以下が挙げられる。

網膜破損の治療、網膜破損の進行の緩慢化、網膜破損の予防、網膜組織の置換、および破損網膜組織の回復のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜組織を対象に適用することを含む、方法。網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、網膜疾患の安定化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜を対象に適用することを含む、方法。

網膜破損が、爆風曝露、遺伝子障害、網膜疾患、および網膜損傷のうち1つまたは複数を原因とする、先行態様のいずれかの方法。網膜疾患が、網膜変性疾患を含む、先行態様のいずれかの方法。網膜破損が、加齢黄斑変性（AMD）、網膜色素変性（RP）、およびレーバー先天黒内障（LCA）のうち1つまたは複数を原因とする、先行態様のいずれかの方法。

hESC由来網膜組織が、網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、および光受容体（PR）細胞を含む、先行態様のいずれかの方法。網膜色素上皮（RPE）細胞の中心コアがあって、このRPE細胞コアから半径方向外側に向かうように、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層（成熟網膜の内顆粒層に相当）、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層を形成するように、RPE細胞、RGC細胞、およびPR細胞が構成されている、先行態様のいずれかの方法。該層のそれぞれが、相当するヒト網膜組織層内の細胞の特徴である分化細胞を含む、先行態様のいずれかの方法。各層が、実質的に完全に分化した細胞を含む、先行態様のいずれかの方法。

hESC由来網膜組織が、生物学的網膜補綴デバイスを形成するための生体適合性足場をさらに含む、先行態様のいずれかの方法。生物学的網膜補綴デバイスが、約1万個〜10万個の光受容体を含む、先行態様のいずれかの方法。hESC由来網膜組織が、栄養因子および神経栄養因子およびマイトジェンを送達することができる、先行態様のいずれかの方法。栄養因子および神経栄養因子およびマイトジェンが、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、ニューロトロフィン-4（NT4）、神経成長因子-ベータ（βNGF）、および生存促進性マイトジェン塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF=FGF-2）のうち1つまたは複数を含む、先行態様のいずれかの方法。

hESC由来網膜組織を適用すると、網膜層の厚さが約1〜約3カ月間保存される、先行態様のいずれかの方法。免疫抑制剤の投与をさらに含む、先行態様のいずれかの方法。免疫抑制剤が、適用の前、途中、および／または後に投与される、先行態様のいずれかの方法。

方法が、眼圧の調節をさらに含む、先行態様のいずれかの方法。眼圧の調節が、網膜組織の適用の前、途中、および／または後に行われる、先行態様のいずれかの方法。

組織が、眼内移植ツールを用いて適用される、先行態様のいずれかの方法。hESC由来網膜組織が、網膜下または網膜上に適用される、先行態様のいずれかの方法。hESC由来網膜組織を適用すると、hESC由来網膜組織と対象の網膜組織との、腫瘍無しでの統合が得られる、先行態様のいずれかの方法。

統合が、適用後約4〜5週間で生じる、先行態様のいずれかの方法。適用が、網膜の炎症を引き起こさない、先行態様のいずれかの方法。適用後、網膜組織が積層を生じる、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。

適用後、網膜組織ニューロンが、Na⁺および／またはK⁺電流の兆候を示す、先行態様のいずれかの方法。網膜組織と既存組織との結合性を実証することをさらに含む、先行態様のいずれかの方法。結合が、WGA-HRP経シナプストレーサー、組織学、IHC、または電気生理学のうち1つまたは複数により実証される、先行態様のいずれかの方法。機能回復レベルの測定をさらに含む、先行態様のいずれかの方法。機能回復レベルが、少なくともベースラインの75%の電気生理学的応答の増大を含む、先行態様のいずれかの方法。

対象の眼球に移植される網膜組織グラフトであって、網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、二次網膜ニューロン、および光受容体（PR）細胞を含み、これらのRPE細胞、RGC細胞、およびPR細胞が中心コアを形成するように構成されている、網膜組織グラフト。約1万個〜10万個の光受容体がある、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。二次網膜ニューロンが、成熟網膜の内顆粒層に相当する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。細胞が、コアから半径方向外側に向かうように配置され、網膜組織が、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層を含む、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。5,000個〜約25万個の細胞を含む、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。網膜下スペースまたは網膜上スペースに移植される、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。

シナプス形成の増加が電気活性の増加と同時に生じる、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。移植後、ニューロンがグラフトを既存組織と結合させる、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。ニューロンがCALB2陽性である、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。結合性が、WGA-HRP経シナプストレーサーにより実証される、先行態様のいずれかの網膜組織。移植後、軸索がグラフトを既存組織と結合させる、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。軸索がCALB2陽性である、先行態様のいずれかの網膜組織。移植後、グラフトの細胞がRGCへと成熟する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。

移植後、既存ニューロンとシナプスを形成する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。移植後、既存組織と結合を形成する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。結合が、移植後１日〜約5週間で形成する、先行態様のいずれかの網膜組織。移植後、既存組織ONLにかかる軸索を形成する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。

パラクリン因子を生産する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。パラクリン因子が、適用の前および／または後に生産される、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。神経栄養因子を生産する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。神経栄養因子を、適用の前または後に生産する、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。神経栄養因子が、BDNS、GDNF、bNGF、NT4、またはbFGFのうち1つまたは複数を含む、先行態様のいずれかの網膜組織。

移植後、機能回復レベルが、電気生理学的応答の増大として測定される、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。機能回復レベルが、少なくともベースラインの10%までの電気生理学的応答の増大として測定される、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。移植後、グラフトの軸索が既存組織に統合される、先行態様のいずれかの網膜組織グラフト。

請求項では、単数形の要素への言及は、特に断らない限り、「たった1つ」ではなく、「1つまたは複数」を意味するものとする。当業者には公知の、本開示の態様の要素のすべての構造的、化学的、および機能的均等物は、参照により本明細書に明白に組み入れられ、かつ本請求項に包含されるものとする。さらに、本開示の一切の要素、構成要素、または方法工程は、これらの要素、構成要素、または方法工程が請求項で明白に記述されていようと、公衆に献呈する意図はない。本明細書の請求項の一切の要素は、「〜するための手段」という文言により明記されないかぎり、「ミーンズ・プラス・ファンクション」の要素とは解釈されない。本明細書の請求項の一切の要素は、「〜するための工程（ステップ）」という文言により明記されないかぎり、「ステップ・プラス・ファンクション」の要素とは解釈されない。

Claims (64)

1. 網膜破損の治療、網膜破損の進行の緩慢化、網膜破損の予防、網膜組織の置換、および破損網膜組織の回復のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜組織グラフトを対象に適用することを含む、方法。
2. 網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、遺伝性網膜疾患の進行の緩慢化、網膜疾患の安定化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、視覚もしくは視知覚の改善、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療のうち1つまたは複数のための方法であって、hESC由来網膜組織グラフトを対象に適用することを含む、方法。
3. 網膜破損が、爆風曝露、遺伝子障害、網膜疾患、および網膜損傷のうち1つまたは複数を原因とする、請求項１記載の方法。
4. 網膜疾患が、網膜変性疾患を含む、請求項3記載の方法。
5. 網膜破損が、加齢黄斑変性（AMD）、網膜色素変性（RP）、およびレーバー先天黒内障（LCA）のうち1つまたは複数を原因とする、請求項１記載の方法。
6. 前記hESC由来網膜組織が、網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、および光受容体（PR）細胞を含む、請求項1または2記載の方法。
7. 網膜色素上皮（RPE）細胞の中心層があり、かつ該RPE細胞層から半径方向外側に向かうように、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層（成熟網膜の内顆粒層に相当）、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層が存在するように、前記RPE細胞、前記RGC細胞、および前記PR細胞が構成される、請求項6記載の方法。
8. 前記層のそれぞれが、相当するヒト網膜組織層内の細胞の特徴である分化細胞を含む、請求項7記載の方法。
9. 前記層のそれぞれが前駆細胞を含み、適用後、前記前駆細胞の一部または全部が、相当するヒト網膜組織層の成熟細胞へと分化する、請求項7記載の方法。
10. 前記層が、実質的に完全に分化した細胞を含む、請求項7記載の方法。
11. 前記hESC由来網膜組織が、バイオ補綴網膜パッチを形成するための生体適合性足場をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
12. 前記バイオ補綴網膜グラフトが、約1万個〜10万個の光受容体細胞を含む、請求項7記載の方法。
13. いくつかの前記hESC由来網膜組織片が前記生体適合性足場に付加されて、大きなバイオ補綴パッチが形成される、請求項11記載の方法。
14. 前記hESC由来網膜組織グラフト、または前記hESC由来網膜組織グラフトの解離細胞が、神経栄養因子、神経栄養性エキソソーム、およびマイトジェンのうち1つまたは複数を対象に送達することができる、請求項6記載の方法。
15. 前記神経栄養因子および前記マイトジェンが、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、ニューロトロフィン-34（NT34）、ニューロトロフィン4/5、神経成長因子-ベータ（βNGF）、proNGF、PEDF、CNTF、生存促進性マイトジェン塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF=FGF-2）、およびWNTファミリーの生存促進性メンバーのうち1つまたは複数を含む、請求項14記載の方法。
16. 前記hESC由来網膜組織グラフトを適用すると、適用した場所で、網膜層の厚さが約1〜約3カ月間保存される、請求項1または2記載の方法。
17. 免疫抑制剤の投与をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
18. 前記網膜グラフト適用の前、途中、および／または後に、エピネフリン投与をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
19. 前記免疫抑制剤が、前記適用の前、途中、および／または後に投与される、請求項17記載の方法。
20. 眼圧の調節をさらに含む、請求項１記載の方法。
21. 前記眼圧の調節が、前記網膜組織の適用の前、途中、および／または後に行われる、請求項20記載の方法。
22. 前記組織が、眼内移植ツールを用いて適用される、請求項１記載の方法。
23. 前記hESC由来網膜組織が、網膜下または網膜上に適用される、請求項1または2記載の方法。
24. 前記hESC由来網膜組織グラフトを適用すると、前記hESC由来網膜組織と前記対象の網膜組織との、腫瘍無しでの統合が得られる、請求項1または2記載の方法。
25. 網膜グラフトの統合が、適用後約2〜10週間で生じる、請求項24記載の方法。
26. 統合が、構造的統合を含む、請求項25記載の方法。
27. 統合が、構造的統合を含み、適用後約1〜6カ月で生じる、請求項24記載の方法。
28. 適用が、網膜の炎症を引き起こさない、請求項１記載の方法。
29. 適用後、前記網膜組織が積層を生じる、請求項26記載の網膜組織グラフト。
30. 適用後、前記網膜組織ニューロンが、Na⁺、K⁺および／またはCa⁺⁺電流の兆候を示す、請求項１記載の方法。
31. 前記網膜組織と既存組織との結合性を実証することをさらに含む、請求項1記載の方法。
32. 前記結合が、WGA-HRP経シナプストレーサー、組織学、IHC、または電気生理学のうち1つまたは複数により実証される、請求項31記載の方法。
33. 機能回復レベルの測定をさらに含む、請求項1記載の方法。
34. 機能回復レベルが、少なくともベースラインの10%の電気生理学的応答の増大を含む、請求項33記載の方法。
35. 対象の眼球に移植される網膜組織グラフトであって、
    網膜色素上皮（RPE）細胞、網膜神経節細胞（RGC）、二次網膜ニューロン、および光受容体（PR）細胞を含み、前記RPE細胞、前記RGC細胞、および前記PR細胞が中心コアを形成するように構成されている、網膜組織グラフト。
36. 約1,000個〜25万個の光受容体がある、請求項35記載の網膜組織グラフト。
37. 前記二次網膜ニューロンが、成熟網膜の内顆粒層に相当する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
38. 前記細胞が、前記コアから半径方向外側に向かうように配置され、前記網膜組織が、網膜神経節細胞（RGC）層、二次網膜ニューロン層、光受容体（PR）細胞層、およびRPE細胞の外層を含む、請求項35記載の網膜組織グラフト。
39. 1,000個〜約25万個の細胞を含む、請求項35記載の網膜組織グラフト。
40. 網膜下スペースまたは網膜上スペースに移植される、請求項35記載の網膜組織グラフト。
41. 黄斑付近の網膜下スペースまたは網膜上スペースに移植される、請求項40記載の網膜組織グラフト。
42. シナプス形成の増加が電気活性の増加と同時に生じる、請求項35記載の網膜組織グラフト。
43. 移植後、ニューロンが前記グラフトを既存組織と結合させる、請求項35記載の網膜組織グラフト。
44. 前記ニューロンがCALB2陽性である、請求項43記載の網膜組織グラフト。
45. 結合性が、WGA-HRP経シナプストレーサーにより実証される、請求項43記載の網膜組織。
46. 移植後、軸索が前記グラフトを既存組織と結合させる、請求項35記載の網膜組織グラフト。
47. 前記軸索がCALB2陽性である、請求項46記載の網膜組織。
48. 移植後、前記グラフトの細胞がRGCへと成熟する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
49. 移植後、既存ニューロンとシナプスを形成する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
50. 移植後、既存組織と結合を形成する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
51. 前記結合が、移植後１日〜約5週間で形成する、請求項50記載の網膜組織。
52. 移植後、既存組織ONLにかかる軸索を形成する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
53. パラクリン因子を生産する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
54. 前記パラクリン因子が、適用の前および／または後に生産される、請求項53記載の網膜組織グラフト。
55. 神経栄養因子を生産する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
56. 神経栄養因子を、適用の前または後に生産する、請求項55記載の網膜組織グラフト。
57. 前記神経栄養因子が、BDNS、GDNF、bNGF、NT4、bFGF、NT34、NT4/5、CNTF、PEDF、セルピン、またはWNTファミリーメンバーのうち1つまたは複数を含む、請求項55記載の網膜組織。
58. 移植後、機能回復レベルが、電気生理学的応答の増大として測定される、請求項35記載の網膜組織グラフト。
59. 機能回復レベルが、少なくともベースラインの10%までの電気生理学的応答の増大として測定される、請求項58記載の網膜組織グラフト。
60. 移植後、前記グラフトの軸索が、既存組織を穿通してそれに統合される、請求項35記載の網膜組織グラフト。
61. 前記組織が、ヒト多能性幹細胞に由来する、請求項35記載の網膜組織グラフト。
62. 対象の、網膜変性疾患の進行の緩慢化、外傷性損傷後の網膜変性疾患の進行の緩慢化、加齢黄斑変性（AMD）の進行の緩慢化、遺伝性網膜疾患の進行の緩慢化、網膜疾患の安定化、網膜変性疾患の予防、外傷性損傷後の網膜変性疾患の予防、視覚もしくは視知覚の改善、AMDの予防、疾患、損傷、もしくは遺伝子異常により喪失された網膜色素上皮（RPE）、光受容体細胞（PRC）、および網膜神経節細胞（RGC）の回復、RPE、PRC、およびRCGの増加、またはRPE、PRC、およびRCG欠損の治療に有用である、請求項35記載の網膜組織グラフト。
63. レシピエントの眼内スペースへの植え込み後、PR層およびRPE層が積層しかつ発達し、PR外節の伸長、シナプス形成、電気生理学的活性、およびレシピエントの網膜細胞との結合性を含め、少なくとも約6〜24カ月は腫瘍無しで生着することができる、請求項35記載の網膜組織グラフト。
64. レシピエントの眼の眼内スペースへの植え込み後5週間で、前記レシピエントの外顆粒層（ONL）、内顆粒層（INL）、および神経節細胞層（GCL）内に軸索を伸ばすことができ、かつ前記軸索を前記層に統合させることができる、請求項35記載の網膜組織グラフト。

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