CN117947151A - 一种导致abo血型系统a亚型的snp位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统A亚型变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点,为新的A亚型等位基因编码区域位于起始密码子起第6外显子第248位碱基。本发明提供了A亚型基因的新的用途,从而提供了一种有效的对能够引发的急性血管内溶血性输血反应的快速基因诊断、基因筛查及遗传咨询的途径,应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行新的A亚型基因突变位点的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断服务技术领域,一种导致ABO血型系统A亚型的SNP位点及其应用。
背景技术
ABO血型系统是人类最重要也是最早发现的血型系统,由人类红细胞表面上的抗原决定。根据ABO血型系统,人类的血型可以分为A型、B型、AB型和O型四种主要类型:
①A型血:A型血的红细胞表面上有A抗原,血浆中含有抗B抗体。A型血可以接受来自A型和O型的血液,而只能捐献给A型和AB型。
②B型血:B型血的红细胞表面上有B抗原,血浆中含有抗A抗体。B型血可以接受来自B型和O型的血液,而只能捐献给B型和AB型。
③AB型血:AB型血的红细胞表面上同时有A和B抗原,血浆中不含抗A或抗B抗体。AB型血可以接受来自A型、B型、AB型和O型的血液,但只能捐献给AB型。
④O型血:O型血的红细胞表面上没有A或B抗原,血浆中含有抗A和抗B抗体。O型血可以接受来自任何血型,但只能捐献给O型。
ABO血型系统的抗原是决定输血和器官移植的重要基础,因为不同血型之间的配型规则是不同的,了解个体的ABO血型有助于医疗工作中的输血安全和成功率。
溶血性输血反应(Hemolytic Transfusion Reaction;HTR)分为急性与迟发性溶血性输血反应,ABO系统不相合的输血一般为急性溶血性输血反应,危害极大。一般在输血后24h内发生,多于输血后立即发生,是最严重的输血副反应,一旦发生需立即抢救,否则致死率很高。只要输入5~10ml ABO不相容血液即可出现明显症状;输血量超过200ml,将会造成严重后果。临床上常表现为血管内溶血,患者有发热、寒战、恶心、背痛,随后出现血红蛋白尿,血红蛋白血症,低血压休克,均应考虑为急性血管内溶血性输血反应,应迅速停止输血并进行各项检查。同时这一过程会引起补体激活,启动凝血系统,释放缓激肽和儿茶酚胺,诱发DIC;甚至发生循环与肾功能衰竭;因此通常把低血压休克、DIC、急性肾衰竭称为急性血管内溶血三联症。
ABO血型系统中广泛存在多态性和遗传变异,从而形成ABO亚型;由于ABO基因上的基因多态性,导致相应的抗原结构发生变异或突变。ABO亚型对于临床输血和器官移植具有重要影响。例如,A2亚型的人可能含有较少的A抗原,需要在输血前进行特殊的鉴定;A亚型的人在输血中应该准确鉴定,因为A亚型的个体既有A抗原也有A抗体,相比其他亚型A亚型个体输血存在更大隐患。原因是无论是A亚型的献血者捐献的血液输给正常A型患者,还是A亚型的患者接受正常A型血液都会发生急性输血性溶血反应而造成比较严重的后果,针对此种情况,必须强调准确鉴定A亚型的重要性。
发明内容
本发明的目的是提供一种导致ABO血型系统A亚型的SNP位点及其应用,通过检测该从而弥补现有技术的不足。
本发明提供一种导致ABO血型系统A亚型的SNP位点,所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的114位,为AT的杂合突变;
本发明还提供所述的SNP位点的一种用途,是作为检测ABO血型系统A亚型的分子标记的应用;
本发明还提供用于检测所述的SNP位点的制剂的一种用途,所述的用途是在制备用于检测ABO血型系统A亚型的制品中的应用;
所述的制品,其一种为PCR扩增测序试剂盒;
所述的检测SNP位点的制剂,为PCR扩增测序引物对或检测探针;
其中用于检测上述SNP位点的直接扩增及测序引物信息如下:ABO-E6F:5'-CAGAAGCTGAGTGGAGTTTCCA-3'SEQ ID NO:2、ABO-E6R:5'-TGCATGAATGACCTTTCCCAT-3'SEQID NO:3;
用于检测上述SNP位点单倍型扩增引物信息如下,测序引物使用高效克隆PCR产物专用载体(pMD18-Tvector)对应引物:ABO-E6Fmo:5'-CCCGGTATTCCGCATCAC-3'SEQ ID NO:4、ABO-E6mo:5'-CGGTGTAGCCTCCTGTCCAT-3'SEQ ID NO:5。
本发明提供了ABO血型A型变异型基因检测的新用途,从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径,应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型A型变异型基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1:ABO血型正常ABO*A1.02等位基因参考序列,参比序列来源于BGMUT(国际血型基因突变库);
图2:先证者A亚型变异型基因突变位点直接测序图;
图3:先证者克隆测序图,先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第248位碱基发生了突变c.248A>T。(ABO*A1.02作为参比序列)
具体实施方式
申请人在一个ABO血型A亚型等位基因家系中发现致病性SNP位点,并证实该基因的突变是导致A型血型发生变异导致红细胞A抗原比正常A型人红细胞A抗原要弱,并且血浆中产生同种抗-A1抗体。该献血者捐献的血液一旦输给正常A型患者,很可能引发急性溶血性输血反应。先证者为青岛市一名女性无偿献血者,捐献血液后在申请人单位进行血型检测,使用传统的抗原抗体血型学方法,发现该献血者血型既有A抗原又有A抗体,ABO血型鉴定正反定型不符(见表1)。
表1先证者血清学血型鉴定
-A | -B | Ac | Bc | Oc | 自身细胞 |
4+ | 4+ | 2+ | 0 | 0 | 0 |
对先证者的呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的A亚型变异型等位基因的家系成员进行了测序,找到了该家系成员A亚型基因存在遗传上的致病突变SNP位点,该SNP位点造成了A抗原数量和质量的改变,并且可通过免疫刺激或天然产生抗-A抗体,此位献血者捐献的血液一旦发生错误血型的输注,输给A型血的患者,其血浆中的抗-A抗体很有可能发生致命的危害。
A亚型基因位于染色体9q34.1-9q34.2,可转录成大约1065bp的mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2),直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。
所发现的SNP位点位于ABO血型的A亚型基因的编码区域由起始密码子起Exon6第248位碱基,为AT杂合序列,即位于序列为SEQ ID NO:1的114位。
CAGAAGCTGAGTGGAGTTTCCAGGTGGGGGCGGCCGTGTGCCAGAGGCGCATGTGGGTGGCACCCTGCCAGCTCCATGTGACCGCACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGAAGGATGTCCTCGTGGTACCCCTTGGCTGGCTCCCATTGTCTGGGAGGGCACATTCAACATCGACATCCTCAACGAGCAGTTCAGGCTCCAGAACACCACCATTGGGTTAACTGTGTTTGCCATCAAGAAGTAAGTCAGTGAGGTGGCCGAGGGTAGAGACCCAGGCAGTGGCGAGTGACTGTGGACATTGAGGTCTCTCCTTGTGTTCAAGACAGAGTGGGGTGGCGGCCAGCCTTGTCCTCCCAGAGGGTAGATGGGAAAGGTCATTCATGCA(SEQ ID NO:1)。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1:从先证者ABO血型基因检测确认A亚型变异型的突变位点。
1、提取外周血基因组DNA:
在符合国家相关政策规定,并在取样对象同意的基础上,抽取ABO血型A型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml,放入EDTA-Na2抗凝管内,-80℃冻存备用;DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒,具体操作流程如下:
冻存的EDTA抗凝血在室温融化后,取500ul放于离心管,加入等体积的红细胞裂解液(pH8.0),涡旋混匀5分钟,12000rpm离心5分钟,弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟,12000rpm离心5分钟,弃上清。
沉淀物涡旋混匀5分钟,加入核裂解液50ul,涡旋混匀5分钟,置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品,加入蛋白清除液135ul。涡旋充分混匀,至于4℃30分钟。
室温下12000rpm离心5分钟,吸取上清液(约200ul)至一新离心管中。加入冰乙醇500ul,反复震荡离心管,直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟,弃上清。向DNA沉淀加入75%乙醇,漂洗一次,室温12000rpm离心3分钟,弃上清,置于室温中挥发剩余乙醇,最后加入50μLTE(pH8.0),4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳,并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色,检测DNA纯度及浓度。
2、直接测序法寻找先证者A变异型基因的突变位点
PCR扩增目的片段:反应条件与反应体系:
(1)PCR反应条件:95℃预变性10分钟;94℃60秒,63℃90秒,72℃60秒,10个循环;94℃60秒,61℃90秒,72℃60秒,25个循环;72℃延伸10min,扩增产物10℃保温。
(2)反应体系:(TAKARAEx-Taq polymerase)
应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E6F、ABO-E6R引物的扩增反应。
PCR产物测序:应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序, 其中应用引物对ABO-E6F:5'-CAGAAGCTGAGTGGAGTTTCCA-3' ; ABO-E6R:5'-TGCATGAATGACCTTTCCCAT-3',以中国人最常见的ABO*A1.02等位基因作为参比序列,在先证者发现ABO血型A基因编码区域由起始密码子起Exon6第248位碱基发生了突变,第248位碱基出现AT杂合序列。以ABO-E6F作为正向测序引物、ABO-E6R作为反向测序引物,采用正反向多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变,并不是因为扩增或测序错误引进的(图2)。
实施例2SNP位点的验证
对ABO基因第6外显子进行单倍型测序,确定先证者A变异型基因的突变位点
PCR扩增目的片段引物:
ABO-E6F:5'-CAGAAGCTGAGTGGAGTTTCCA-3';
ABO-E6R:5'-TGCATGAATGACCTTTCCCAT-3'。
PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。
PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系:
(1)PCR反应条件:95℃预变性5分钟;95℃30秒,60℃30秒,72℃50秒,40个循环;72℃延伸5min,扩增产物10℃保温。
(2)反应体系:(TAKARALA-Taq polymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体,挑取多个菌落进行单倍型序列测定,单倍型测序引物使用单倍型测序引物使用
ABO-E6Fmo:5'-CCCGGTATTCCGCATCAC-3',
ABO-E6Rmo:5'-CGGTGTAGCCTCCTGTCCAT-3'确定样本的单倍型序列(图3)。该突变为一新发现的突变。该突变不存在于下面的三个数据库中:单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/),血型基因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/systems_info&system=abo),表明该突变非常罕见,该突变导致了编码A抗原的蛋白组成的核苷酸发生改变,A基因编码区域由起始密码子起第248位碱基由A>T,该突变会导致第83号氨基酸由天冬氨酸突变成缬氨酸;氨基酸的突变从而引起了此A亚型的个体A抗原表位发生缺失,导致这种个体通过免疫刺激或天然免疫就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗体,该献血者捐献的血液输注给正常A型患者时,血液中抗-A1抗体就会和受血者A抗原发生抗原抗体反应,发生急性溶血性输血反应,从而危及患者生命。而在近400余例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。
在申请人收集的先证者家系成员,提取他们的外周血基因组DNA,应用上述DNA作为模板与ABO-E6F、ABO-E6R引物进行PCR目的片段的扩增,常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接测序,发现该先证者的一位家系成员(先证者亲生姐姐)的ABO血型A基因存在本发明中发现的SNP突变,即编码区域由起始密码子起第248位碱基发生了AT杂合突变。继续对发现SNP突变的这位家系成员进行ABO基因第6外显子单倍型测序,应用上述提取的这名家系成员的基因组DNA作为模板与ABO-E6F、ABO-E6R引物进行PCR目的片段的扩增,将PCR产物克隆入T载体,挑取多个菌落进行单倍型序列测定,单倍型测序引物使用ABO-E6Fmo、ABO-E6Rmo,确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现,这位家系成员A基因编码区域第248位碱基由A>T,第83号氨基酸由天冬氨酸突变成缬氨酸,与先证者完全一致,而且这一名家系个体血浆中都存在同种抗-A1抗体。
通过上述的分析,证明发明者设计的引物可以用来检测个体ABO血型基因是否发生上述A基因突变造成的A亚型等位基因,从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。
Claims (7)
1.一种导致ABO血型系统A亚型的SNP位点,其特征在于,所述的SNP位点位于序列为SEQID NO:1的114位,为AT的杂合突变。
2.权利要求1所述的SNP位点作为检测ABO血型系统A亚型的分子标记的应用。
3.检测权利要求1所述的SNP位点的制剂在制备用于检测ABO血型系统A亚型的制品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的制品为PCR扩增测序试剂盒。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的检测SNP位点的制剂,为PCR扩增测序引物对或检测探针。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的PCR扩增测序引物对的序列信息为SEQID NO:2、SEQ ID NO:3。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的PCR扩增测序引物对的序列信息为SEQID NO:4、SEQ ID NO:5。
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