CN117947073A - 一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台的方法 - Google Patents

一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种积累α‑carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台的方法，本发明通过大肠杆菌原核表达系统，可用于胡萝卜素羟化酶的鉴定。克服了原核表达中羟化酶鉴定难题，本方法具有更加简便、直接的优势，可以明确而有针对性地对基因功能进行验证。

Description

一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌 平台的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台的方法
背景技术：
类胡萝卜素在自然界中广泛分布，不仅在光合作用中参与捕光，而且起着重要的光保护作用。尤其是叶黄素和玉米黄素等叶黄素类色素(xanthophylls)结合在捕光复合体上参与光保护，其中依赖于叶黄素类色素以及相关的叶黄素循环(xanthophyll cycle)诱导产生的非光化学猝灭(nonphotochemical quenching，NPQ)，是最为迅速且高效的一种途径，NPQ过程几乎存在于所有的光合植物和藻类，通过将多余的吸收光能作为热量耗散，以减少光合器官的抑制程度以及降低光氧化对光合组织的破坏。如果能够鉴定催化这些类胡萝卜素合成的酶，将有利于通过基因工程和合成生物学的策略来对其进行大量合成。
发明内容：
本发明需要解决的问题是提供一种通过大肠杆菌平台生产α-/β-胡萝卜素鉴定胡萝卜素羟化酶的方法。主要内容包括紫菜番茄红素环化酶基因的克隆，融合6×His和S-Tag结合蛋白标签(6×His-PyLCYE和PuLCYB-S-Tag)的原核表达载体的构建，载体的共转化以及紫菜番茄红素环化酶在大肠杆菌体内的表达，产生α-胡萝卜素和β-胡萝卜素用于鉴定胡萝卜素羟化酶。
本发明的技术方案包含如下步骤：(1)从紫菜叶状体中提取总RNA并通过逆转录反应合成第一链；(2)根据NCBI提供的紫菜番茄红素环化酶基因的编码区序列设计去除叶绿体转运肽的扩增引物；(3)以步骤(1)中逆转录得到的第一链为模板，通过PCR的方法扩增获得目的基因并克隆至双表达载体pCDF-Deut-1中，测序正确后获得重组质粒pCDF/PyLCYE-PuLCYB；(4)通过热激法将步骤(3)获得的重组质粒转入大肠杆菌pAC-LYC的Top10感受态中，利用相应抗性筛选获得积累色素的大肠杆菌。
附图说明：
Seq ID NO：1为PyLCYE-ΔcTP的核苷酸序列。Seq ID NO：2为PyLCYE-ΔcTP的推断的氨基酸序列。Seq ID NO：3为PuLCYB-ΔcTP的核苷酸序列。Seq ID NO：4为PuLCYB-ΔcTP推断的氨基酸序列。
图1为重组质粒pCDF/PyLCYE-PuLCYB的结构示意图
图2为pCDF-Deut/PuLCYB-PyLCYE与pAC-LYC共转化进大肠杆菌的HPLC分析图；其中pAC-LYC携带有一系列噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因CrtE(GGPS)、CrtB(PSY)和CrtI(PDS/ZDS)。
具体实施方式：
本实施例的一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台的方法获得过程如下：
1)pCDF-Deut/PuLCYB-PyLCYE重组表达载体的构建
提取紫菜叶状体总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度，于-80℃保存。用1μg总RNA作为反转录的模板，用the PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit(Takara)试剂盒经反转录合成cDNA第一链之后，用高保真酶PrimeSTAR DNA polymerase(Takara)进行PCR扩增，PCR反应程序如下：98℃预变性2min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，根据ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)试剂盒的操作说明与线性化后的pCDF-Deut-1进行同源重组。连接产物转化大肠杆菌(Top10)，筛选获得阳性克隆，得到pCDF-Deut/PuLCYB-PyLCYE的重组载体。
2)重组表达载体的原核表达
构建好的pCDF-Deut/PuLCYB-PyLCYE双表达载体转化入含有pAC-LYC的Top10大肠杆菌细胞中，在含有氯霉素(34μg·mL-1)和盐酸大观霉素(50μg·mL-1)的LB固体培养基上过夜筛选。挑取单菌落转入氯霉素(34μg·mL-1)和盐酸大观霉素(50μg·mL-1)的LB的5mLLB液体培养基28℃，200rpm震荡培养过夜。
3)色素提取及HPLC分析
将含有pCDF-Deut/PuLCYB-PyLCYE和pAC-LYC的Top10大肠杆菌菌体经8，000g离心2min收集5mL后，加入400μL80％的丙酮，剧烈振荡30min以彻底提取材料中所含色素，然后依次加入250μL乙酸乙酯和ddH20，分别剧烈振荡15sec，静置5min后，10，000g离心10min。吸取上清，并将提取物用0.22μm有机系的滤膜进行过滤。所提取的色素用反相高效液相色谱(reverse-phase HPLC)方法，在Spherisorb ODS2C18色谱柱(Waters)上分离，色谱柱为4.6×250mm，流动相为在乙腈∶水∶三乙胺(9∶1∶0.01)中线性展开乙酸乙酯(0-100％)。展开时间为35min，流速为1mL·min-1，柱温30℃。检测器的检测波长为440nm。类胡萝卜素的鉴定根据峰形及出峰时问来确定。所有的化学试剂均为色谱纯。分析结构表明样品中积累了α-胡萝卜素和少量的β-胡萝卜素，作为胡萝卜素羟化酶的底物，可用于产生叶黄素和玉米黄素等羟基化产物。

Claims (5)

1.一种积累α-carotene用于鉴定叶黄素和玉米黄素的大肠杆菌平台和应用的方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)克隆紫菜番茄红素环化酶基因PyLCYE、PuLCYB；
(2)构建含有重组紫菜番茄红素环化酶基因的载体；
(3)通过共同转化的方法在大肠杆菌体内表达重组紫菜番茄红素环化酶基因；
(4)通过连续培养的方法让大肠杆菌积累α-胡萝卜素和少量的β-胡萝卜素。
2.根据权利要求1所述一种能积累α-carotene的大肠杆菌的方法，其特征在于使用以下序列的引物扩增紫菜番茄红素环化酶基因：
pCDF-PyLCYE-F
CATCACCACAGCCAGGATCCGacctatgacgtgacggtc
pCDF-PyLCYE-R
CCTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTctactgctggttctccccc
pCDF-PuLCYB-F
CATATGGCAGATCTCAATTGGATggccgcggcggccgcc
pCDF-PuLCYB-R
CAGCGATCGCGTGGCCGGCCGAcgccccctcctcgg。
3.根据权利要求1所述一种能积累α-carotene的大肠杆菌的方法，其特征在于将权利要求2中扩增得到的片段依次克隆至pCDF-Deut-1载体，获得的重组质粒命名为pCDF/PyLCYE-PuLCYB。
4.根据权利要求1所述一种能积累α-carotene的大肠杆菌的方法，其特征在于将携带权利要求3所述重组质粒的大肠杆菌Top10菌株于28℃条件下，震荡培养48h，离心收集的菌体呈黄色。
5.根据权利要求1所述一种能积累α-carotene的大肠杆菌的方法，在食品工业、保健品行业或作为高纯度的化合物标准品在科研领域的应用。
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