CN103710362B - 枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用，枸杞紫黄质脱环氧化酶基因选自以下核苷酸序列之一：1)具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'RACE技术克隆枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，得到完整的基因序列为1413bp。枸杞紫黄质脱环氧化酶LmVDE能够催化紫黄质转化为花药黄质，并进一步转化为玉米黄质。将LmVDE基因转化洋桔梗后得到了阳性转化苗，光胁迫实验结果表明转化LmVDE基因后与野生植株相比抗光胁迫能力得到了显著提高。

Description

枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及在提高植物抗胁迫能力应用，具体为枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及包括该基因的重组载体及应用，包括枸杞（Lycium chinense Miller）紫黄质脱环氧化酶（violaxanthin de-epoxidase）LmVDE基因的克隆，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

紫黄质循环是类胡萝卜素合成途径的一部分。类胡萝卜素广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中，它主要包括胡萝卜素(carotenes)和叶黄素(xanthophylls)两大类。前者有α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。叶黄素则是胡萝卜素的氧化衍生物，它包括V（violaxanthin）、A（antheraxanthin）、Z（zeaxanthin）、新黄素(neoxanthin)、lutein以及loroxanthin等。紫黄质循环，主要由三个组分即 V、A、Z、紫黄质脱环氧化酶（violaxanthin de-epoxidase，VDE）和玉米黄质环氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZE）参与 。紫黄质脱环氧化酶是紫黄质循环的关键酶，在强光下可以迅速将V转化为A和Z，从而增加紫黄质循环中各色素的总含量。

紫黄质循环存在于所有的高等植物中，是植物在长期进化过程中所保存下来的一种代谢过程，它具有多方面的功能，其中依赖于紫黄质循环的热耗散是最主要的功能（Gilmore，1997；Horton，l996；Mu11er，2001）。在正常情况下，PSII 中吸收光能的 10%会形成³Chl*，叶黄素可以消耗³Chl*的能量，在分离的 LHCII中，植物叶片所吸收的光能中大部分是通过热耗散途径使³Chl*去激发转变为热能消耗到体外。高等植物光合机构中，以 NPQ 表示的热耗散强度与 Z+A 的含量成正相关，Z(包括 A)在耗散过多的激发能中起着非常重要的作用（Demmig-Adams，l996；Gi1more，l997）。

此外紫黄质循环还有稳定类囊体膜结构等功能，用紫外线照射使膜脂发生氧化，L 和 Z都能够防止膜脂的氧化，但 Z的保护能力比 L 强，这可能与它们和膜脂的组织状态有关(Sujak et al，1999)。已经有一些实验证明多种叶黄素对活性氧的猝灭作用(Havaux et al，1998)。

紫黄质（V）、花药黄质（A）、玉米黄质（Z）作为类胡萝卜素的重要组成色素，也是某些信号分子的前体物质，对植物的生长、清除体内自由基、延缓机体衰老有重要作用。同时将紫黄质脱环氧化酶基因转入植物中，可提高植物的抗强光、抗紫外等抗逆能力，对改良环境有重要作用。随着对类胡萝卜素代谢途径相关机制及功能研究的深入，其应用前景会越来越广阔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及该基因编码的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供了一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供了一种上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供了一种上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE重组克隆载体pMD18-T-LmVDE。

含有上述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的重组载体，这些重组载体包括质粒。

所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE。

含有上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。

本发明提供了一种含有LmVDE基因工程菌。

上述枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的应用包括该LmVDE基因编码的蛋白在大肠杆菌中的应用；

本发明提供的一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明提供的一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE编码的蛋白，如序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。

本发明的克隆方法由下述步骤组成：

从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞紫黄质脱环氧化酶基因核苷酸序列设计上游引物LmVDEF：5’-CGCGGATCCATGGCTCTCGCCCCTTATTC -3’，然后利用3' RACE方法扩增得到完整的基因序列为1413bp。

本发明构建含枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE，由下述步骤组成：

1）构建含有枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的中间载体pMD18-T-LmVDE：

设计由SEQ ID NO.3所示的上游引物P1，和由SEQ ID NO.4所示的下游引物P2，以枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQ ID NO.1所示的LmVDE基因的中间载体pMD18-T-LmVDE。

2）构建大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE：

提取载体pMD18-T-LmVDE经BamHI和SalI酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经BamHI和SalI酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE。

本发明提供了一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码紫黄质脱环氧化酶的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用体外反应体系验证枸杞LmVDE基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。

本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3' RACE技术克隆了枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，得到完整的基因序列为1413bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE，应用体外反应体系，对克隆的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE编码的酶活性进行了鉴定，紫黄质脱环氧化酶LmVDE能够催化紫黄质转化为花药黄质，并进一步转化为玉米黄质。将LmVDE基因转化植株后，其抗光胁迫能力显著提高。

附图附表说明

图1 pMD18-T-LmVDE载体示意图。

图2 pET28a-LmVDE载体示意图。

图3 pET28a-LmVDE酶切验证结果。

图4 （a）酶促反应的吸收光谱分析；（b）叶黄素色素库的HPLC分析。

图5 转化阳性烟草检测图。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE的克隆：

以RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，German）试剂盒，从0.1g新鲜枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE上游引物（SEQ ID NO.3）为：LmVDEF：5’-CGCGGATCCATGGCTCTCGCCCCTTATTC -3’。利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0 （TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：①以总RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链，反应体系如下：

RNA: 2μl

3' RACE Adaptor: 1μl

5×M-MLV Buffer: 2μl

dNTP Mixture： 1μl

RNase Inhibitor： 0.25μl

Reverse Transcriptase M-MLV： 0.25μl

RNase Free dH₂O： 3.5μl

反应条件：42℃，60min；70℃，15min。

②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物（SEQ ID NO.4）3' RACE out primer: 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以cDNA第一链为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

cDNA第一链： 2μl

dNTP： 8μl

LmVDEF： 2μl

3' RACE out primer： 2μl

10×LA PCR Buffer II： 4μl

MgCl₂： 3μl

TaKaRa LA Taq： 0.25μl

dH₂O： 28.75μl

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。

实施例2

克隆载体pMD18-T-LmVDE的构建过程

将序列表所示的LmVDE基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：

pMD18-T载体： 1μl

目的PCR片段： 4μl

SolutionI： 5μl

反应条件：16℃，30min。连接产物转化E.coli Top10，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因的引物进行菌落PCR（反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。）得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。

实施例3

大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE的构建过程

首先，提取载体pMD18-T-LmVDE经BamHI和SalI酶切， pET28a质粒经BamHI和XhoI双酶切，将二者酶切产物连接：16℃，16hrs，连接（2 μl 10×T₄ buffer，0.5 μl T₄ DNA连接酶，5 μl载体DNA，7.5 μl外源DNA，5 μl ddH2O）。连接产物转化E.coli Top10，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因的引物进行PCR得到1413bp产物，酶切鉴定得到目的条带如图2所示，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmVDE构建正确。

将构建好的大肠表达载体pET28a-LmVDE转化大肠杆菌BL21。

实施例4

LmVDE基因在大肠杆菌中表达的紫黄质脱环氧化酶LmVDE的功能验证

紫黄质的分离：取新鲜枸杞叶片，液氮研磨即时用于实验（或-80℃保存），在暗光处用100%的丙酮提取总色素，接着用展开剂（丙酮：正己烷为1:1）在TLC板上进行色素分离，倒数第二条带为紫黄质，轻轻刮取回收溶于甲醇。

酶促反应分析：原核表达菌株37℃震荡培养，并用IPTG诱导表达8h后，取40mL菌液4℃，4000xg 离心10min，菌体用3ml的1mMEDTA，50mMTris（pH7.4）重悬液重悬。将重悬液放在冰上，超声波细胞破碎仪破碎10个循环（每个循环开30s/关30s）；破碎产物4℃，10000xg，离心10min，收集上清液100uL用于酶促反应，反应体系为：3mL，0.33μM紫黄质、0.9μM MGDG、30mM抗坏血酸钠、0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液、pH 5.1。将3ml的反应体系加入玻璃比色杯中，用UVIKON~943紫外可见双光束分光光度计测定502nm和540nm的吸光值，每隔1min测定一次。此外分别在酶促反应0、4、8、12、16和20min后，加入固体TriS中止酶促反应。用乙醚重复抽提3次，用氮气吹干，并溶于40 μL 100%的丙酮中,经滤膜过滤后用于HPLC分析。

总胡萝卜素的HPLC检测：使用nucleosil 100-3 c250×4.6 mm （MN，Germany）色谱柱，兰博（进口SSI）四元梯度泵。按照Thayer SS（Thayer SS and Björkman O Leaf xanthophyll content and composition in sun and shade determined by HPLC. Photosynth Res 23: 331–343）等（1990）的方法进行高效液相色谱分析。如图4（b）所示，在体外反应体系中，随着反应时间的增加，A502-540um值逐渐增大，而对照组无此变化。该反应体系总色素含量经HPLC分析表明：随着反应时间的增加，V的相对含量由100%逐渐降低，A的含量先上升后下降，Z的含量由0%逐渐上升。

实施例5

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化

本实验用到的培养基如下所示：

培养基名称	组成	pH
			试管苗培养基	MS固体培养基	5.8
侵染培养基	MS液体培养基	5.8
			共培培养基	MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA	5.8
筛选培养基	MS+1mg/L6-BA+.01mg/LNAA+100 mg/L卡那霉素+400mg/l的头孢霉素	5.8
			生根培养基	MS+100mg/卡那霉素+400mg/l的头孢霉素	5.8

侵染菌液的制备：挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养至OD600=0.6-0.9。3500r/min，4℃下离心10min用等量的MS液体培养基重悬，使OD600=0.9-1

外植体浸染及诱导：将植物叶片切成0.5cm×0.5cm，菌液，浸染15-20min。取出叶片接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基诱导抗性芽；将抗性芽接种于生根培养基中。

抗性苗的获得：将根系生长良好的洋桔梗组培苗种植在蛙石和腐殖土的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。

转基因洋桔梗分子检测：（1） CTAB法提取洋桔梗总DNA；（2）以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为基因上游引物SEQ ID NO.3和基因下游引物 SEQ ID NO.5，反应条件: ：94℃，4min； 94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，lmin30 sec；72℃，10min；30个循环。取上述PCR产物5μl进行电泳检测，如图5。

实施例6

光胁迫下野生洋桔梗和阳性洋桔梗类胡萝卜素含量检测

在正常光照条件（200 μmol · m-2 · s-1）下，叶片中类胡萝卜素组成如表3 a所示。检测结果表明，正常光照条件下转基因植株中总类胡萝卜素含量比对照组有所提高。当实验组植物转移至光照强度为1000 μmol · m-2 · s-1条件下时(表3 b)，转基因植株和非转基因植株总类胡萝卜素与在正常光照200 μmol · m-2 · s-1条件下相比都降低了，类胡萝卜素各组分的含量也都有降低。两个转基因品系的植株总的类胡萝卜含量要明显高于非转基因植株，而紫黄质（Violaxanthin）含量明显少于非转基因植株，玉米黄质（Zeaxanthin）的含量明显高于非转基因植株。

* P < 0.05 ** P < 0.01

实施例7

光胁迫下野生洋桔梗和阳性洋桔梗生物量的比较

将各实验组的植株首先在较低光照（80-100 μ mol · m^-2 · s^-1）条件下培养使其处于相同的生长状态（植株高度在15cm 左右，质量15 g左右）。

将实验组在强光（1000 μ mol · m^-2 · s^-1）胁迫下培养样5周后，其生物量产生情况如表2所示，其中FW是指各实验组植株的平均鲜重，DW为各实验组成熟植株的干重。由结果可知，光胁迫对植物生物量形成产生重大影响，这种影响在对照组植株上更加明显，光胁迫下对照组FW和DW分别是正常光照下的53%和57%。而光胁迫下两个品系L1和L2的转基因植株的FW和DW分别为正常光照条件下的86%、81% 和79%、82%。在光胁迫下转基因植株生物量与对照组之间存在显著差别，转基因植株生物量要显著高于非转基因植株。从而进一步验证了LmVDE基因在植物抗光胁迫中的作用。

序列表

<110> 天津大学

<120> 枸杞紫黄质脱环氧化酶基因及提高植物抗胁迫能力的应用

<130> 20131025

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1413)

<400> 1

atggctctcg ccctttattc aaactttctg gccaaccatg aaaccatcag atgtcatgtt 60

gggtcaaagc ttcacagtca taaaagattt aattactttg gtagtatagt catagcgaaa 120

ttttcttcca gtagacagat acctacatac ttgcagaaat ctcctagaat acgctgtggt 180

ttggattcta gaggtctgga actatggaaa cagaagctcc cttccgcaca tagcattaac 240

cagaatgtcc ctaagggaaa tacaatatgc aaatttccag aagatgtagc tttgatggtt 300

cggaagaaat ggggccaatt ggccaaaaca gcaattgtag ctattttcat tttgtcagtt 360

acttcaaagg ctgacgccgt tgatgctctc aaaacttgta catgcttact gaaagagtgc 420

aggttagagc ttgccaagtg cattgcgaac cctgcatgtg cagctaatgt tgcctgtctc 480

cagacttgca acaatagacc tgatgaaacg gaatgtcaga taaaatgtgg tgatttgttt 540

gaaaatagtg ttgtagacga gttcaatgaa tgtgcagtct cccgaaagaa atgcgtacct 600

cgtaaatctg atgtgggtga atttcctgta cctgatccca gtgttcttgt ccaaaagttt 660

gacatgaacg attttagtgg aaaatggtac atcactcgcg gtttaaatcc cacatttgat 720

gcttttgact gtcaattgca tgagttccat acagaagata acaaacttgt gggaaatctg 780

gcttggagaa tacggacacc tgatggagga tttttcaccc gatcagcagt gcaaaaattc 840

gtgcaagatc caaagtatcc agggatactc tataatcatg ataatgagta tcttcactac 900

gaagatgact ggtatatttt gtcatccaaa gtagagaata gtccagatga ctacatattt 960

gtgtactata agggcagaaa tgatgcatgg gatggatatg gcggttctgt actttataca 1020

agaagcgcag ttttgcctga aagcattata cctgagttgc aaaccgcagc tcaaaaagtt 1080

ggtcgtgatt tcaacacatg gataaaaaca gacaatactt gtggccctga acctccgctt 1140

gttgagaggt tggagaagaa agtggaagaa ggagagagga caatcataaa agaagtcgag 1200

gagatagaag aagaagttga gaaggtgaga gataaagaag tcagcttatt cagtagactg 1260

tctgaaggtt tcaaagagct gcaacaagat gaagaaaact taatacgtga gctgagcaaa 1320

gaagaaatgg agattttgga tggacttaaa atggaagcaa ctgaggtaga gaaactcttc 1380

gggaacgcat taccaataag gaaattaagg tag 1413

<210> 2

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工系列

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (1)..(470)

<400> 2

Met Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Asn Phe Leu Ala Asn His Glu Thr Ile

1 5 10 15

Arg Cys His Val Gly Ser Lys Leu His Ser His Lys Arg Phe Asn Tyr

20 25 30

Phe Gly Ser Ile Val Ile Ala Lys Phe Ser Ser Ser Arg Gln Ile Pro

35 40 45

Thr Tyr Leu Gln Lys Ser Pro Arg Ile Arg Cys Gly Leu Asp Ser Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Leu Trp Lys Gln Lys Leu Pro Ser Ala His Ser Ile Asn

65 70 75 80

Gln Asn Val Pro Lys Gly Asn Thr Ile Cys Lys Phe Pro Glu Asp Val

85 90 95

Ala Leu Met Val Arg Lys Lys Trp Gly Gln Leu Ala Lys Thr Ala Ile

100 105 110

Val Ala Ile Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Lys Ala Asp Ala Val Asp

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Cys Thr Cys Leu Leu Lys Glu Cys Arg Leu Glu Leu

130 135 140

Ala Lys Cys Ile Ala Asn Pro Ala Cys Ala Ala Asn Val Ala Cys Leu

145 150 155 160

Gln Thr Cys Asn Asn Arg Pro Asp Glu Thr Glu Cys Gln Ile Lys Cys

165 170 175

Gly Asp Leu Phe Glu Asn Ser Val Val Asp Glu Phe Asn Glu Cys Ala

180 185 190

Val Ser Arg Lys Lys Cys Val Pro Arg Lys Ser Asp Val Gly Glu Phe

195 200 205

Pro Val Pro Asp Pro Ser Val Leu Val Gln Lys Phe Asp Met Asn Asp

210 215 220

Phe Ser Gly Lys Trp Tyr Ile Thr Arg Gly Leu Asn Pro Thr Phe Asp

225 230 235 240

Ala Phe Asp Cys Gln Leu His Glu Phe His Thr Glu Asp Asn Lys Leu

245 250 255

Val Gly Asn Leu Ala Trp Arg Ile Arg Thr Pro Asp Gly Gly Phe Phe

260 265 270

Thr Arg Ser Ala Val Gln Lys Phe Val Gln Asp Pro Lys Tyr Pro Gly

275 280 285

Ile Leu Tyr Asn His Asp Asn Glu Tyr Leu His Tyr Glu Asp Asp Trp

290 295 300

Tyr Ile Leu Ser Ser Lys Val Glu Asn Ser Pro Asp Asp Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Val Tyr Tyr Lys Gly Arg Asn Asp Ala Trp Asp Gly Tyr Gly Gly Ser

325 330 335

Val Leu Tyr Thr Arg Ser Ala Val Leu Pro Glu Ser Ile Ile Pro Glu

340 345 350

Leu Gln Thr Ala Ala Gln Lys Val Gly Arg Asp Phe Asn Thr Trp Ile

355 360 365

Lys Thr Asp Asn Thr Cys Gly Pro Glu Pro Pro Leu Val Glu Arg Leu

370 375 380

Glu Lys Lys Val Glu Glu Gly Glu Arg Thr Ile Ile Lys Glu Val Glu

385 390 395 400

Glu Ile Glu Glu Glu Val Glu Lys Val Arg Asp Lys Glu Val Ser Leu

405 410 415

Phe Ser Arg Leu Ser Glu Gly Phe Lys Glu Leu Gln Gln Asp Glu Glu

420 425 430

Asn Leu Ile Arg Glu Leu Ser Lys Glu Glu Met Glu Ile Leu Asp Gly

435 440 445

Leu Lys Met Glu Ala Thr Glu Val Glu Lys Leu Phe Gly Asn Ala Leu

450 455 460

Pro Ile Arg Lys Leu Arg

465 470

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(29)

<400> 3

cgcggatcca tggctctcgc cccttattc 29

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 4

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

。

Claims (7)

1.一种枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因全序列。

4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE，构建方法如下：

1）克隆载体pMD18-T-LmVDE的构建过程

将序列表所示的LmVDE基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：

pMD18-T载体： 1μl

目的PCR片段： 4μl

SolutionI： 5μl

反应条件：16℃，30min，连接产物转化E.coli Top10，涂布于含氨苄的LB平板；以目的基因的引物进行菌落PCR，反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环，得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因；

2）大肠杆菌表达载体pET28a-LmVDE的构建过程

首先，提取载体pMD18-T-LmVDE经BamHI和SalI酶切， pET28a质粒经BamHI和XhoI双酶切，将二者酶切产物连接：16℃，16hrs，连接：2 μl 10×T₄ buffer，0.5 μl T₄ DNA连接酶，5 μl载体DNA，7.5 μl外源DNA，5 μl ddH2O；连接产物转化E.coli Top10，涂布于含Amp的LB平板；以目的基因的引物进行PCR得到1413bp产物，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmVDE构建正确。

5.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因用于转化生成玉米黄质中的应用。

6.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因在植物抗光胁迫中的应用。

7.权利要求1所述的枸杞紫黄质脱环氧化酶基因的克隆方法，其特征在于经过以下步骤：

以RNeasy Plant Mini Kit试剂盒，从0.1g新鲜枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，枸杞紫黄质脱环氧化酶基因LmVDE上游引物为：LmVDEF：5’-CGCGGATCCATGGCTCTCGCCCCTTATTC -3’；利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0试剂盒扩增得到完整的基因序列；具体步骤：①以总RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链，反应体系如下：

RNA: 2μl

3' RACE Adaptor: 1μl

5×M-MLV Buffer: 2μl

dNTP Mixture： 1μl

RNase Inhibitor： 0.25μl

Reverse Transcriptase M-MLV： 0.25μl

RNase Free dH₂O： 3.5μl

反应条件：42℃，60min；70℃，15min；

②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer: 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以cDNA第一链为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

cDNA第一链： 2μl

dNTP： 8μl

LmVDEF： 2μl

3' RACE out primer： 2μl

10×LA PCR Buffer II： 4μl

MgCl₂： 3μl

TaKaRa LA Taq： 0.25μl

dH₂O： 28.75μl

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。