CN101580838A - 小立碗藓抗低温基因Ppviolaxanthin de-epoxidase及其蛋白和载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因Ppviolaxanthin de－epxidase及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。

Description

小立碗藓抗低温基因Ppviolaxanthin de-epoxidase及其蛋白和载体

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因基因Ppviolaxanthin de-epoxidase及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。

背景技术

低温、干旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此，寻求同时具有忍耐低温、干旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极有必要。

对苔藓植物的基础研究标明：苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一，同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，苔藓植物形成了一套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现(Frank等，2005)，与其他高等植物相比，小立碗藓(Physcomitrella patens)可以忍耐极端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar等，2003)，而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在缓慢的逐渐提高的盐处理条件下，小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后，小立碗藓仍可以幸存。当小立碗藓失水92％时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐渍和渗透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白主要有胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)、甜菜碱(glycine betaine)、三氢吡咯羧酸盐(deltal1-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP kinase)等。在0℃低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复生长(Minami等，2005)，且在冷驯化过程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰冻耐受能力。

因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。

发明内容

为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种高效的抗低温胁迫相关基因。

本发明的另一目的是提供上述基因编码的蛋白质。

本发明的再一目的是提供含有上述基因的载体。

本发明的再一目的是提供表达上述基因的转基因细胞系。

具体地，本发明的发明人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在0℃下经过不同时间的处理与非处理小立碗藓茎叶体组成差异材料，通过cDNA-AFLP技术得到差异表达的EST，随后在分子水平进行表达分析或蛋白质水平的分析，挑选出了一种具有显著抗逆特性的基因-小立碗藓抗逆基因Ppviolaxanthinde-epoxidase，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2。

进一步，本发明还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的完成过程中，还提供了包含上述基因的载体、以及表达该基因的转基因细胞系。

本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。

附图说明

图1为Ppviolaxanthin de-epoxidase基因的cDNA-AFLP图谱，其中，Maker：分子量标记；1、未驯化的24小时的材料；2、未驯化的12小时的材料；3、冷驯化的24小时的材料；4、冷驯化的12小时的材料。

图2为Ppviolaxanthin de-epoxidase基因的Real-time RT-PCR相对表达量变化图。

具体实施方式

1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理

将小立碗藓培养至15叶左右，移入0℃处理0、3、6、12、24、48、72小时，分别取材用于cDNA-AFLP分析。

附：小立碗藓培养基配方及制备：

大量元素：

Ca(NO₃)₂·4H₂O   0.8g/L

FeSO₄·7H₂O      0.0125g/L

MgSO₄·7H₂O      0.25g/L

微量元素：

CuSO₄·5H₂O      0.055mg/L

ZnSO₄·7H₂O      0.055mg/L

H₃BO₃            0.614mg/L

MnCl₂·4H₂O      0.389mg/L

CoCl₂·6H₂O      0.055mg/L

KI               0.028mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O    0.025mg/L

Glucose          5g/L

酒石酸铵         0.5g/L

磷酸盐缓冲液     1ml/L

微量元素配制成1000X母液，4℃存放。

固体基本培养基，加入浓度为0.8％琼脂粉。

磷酸缓冲液的配制：取25g KH₂PO₄溶解于100ml蒸馏水，用4M KOH调整pH7.0，4℃存放。

2、cDNA-AFLP分析

cDNA-AFLP方法参照Christian，1998。

1)小立碗藓RNA提取(TE3D法)和DNase I处理

2)mRNA的分离

mRNA从总RNA中分离，按照Promega公司试剂盒PolyA

mRNAIsolation system介绍的方法进行。

3)cDNA的合成

cDNA按照TaKaRa公司试剂盒cDNA Synthesis Kit(M-MLV Version)介绍的方法进行。

4)双酶切

采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对cDNA进行双酶切。

模板cDNA(200ng/μl)    1.25μl

缓冲液(10X)            2μl

EcoRI    5U/μl        1μl

MseI     5U/μl        1μl

ddH2O                  14.75μl

总体积：               20μl

混匀离心，37℃酶切至少3个小时，最好过夜直至cDNA被完全酶切；

酶切完全后，反应混合物置65℃加热15min，使限制性内切酶失火，之后将反应管置冰上冷却；

1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，呈现均匀弥散为较好酶切效果。

5)接头连接

采用EcoRI adaptor和MseI adaptor两种接头连接，所用接头见表2.1。

酶切反应液            20μl

缓冲液(10X)           2μl

T4-连接酶(10U/μl)    0.1μl

ATP(10mM)             0.2μl

EcoRI接头50pmol/μl   1μl

MseI接头50pmol/μl    1μl

ddH₂O                 5.7μl

总体积：              3O μl

混合离心，37℃至少连接3小时，-20℃可长期保存。

6)预扩增

以E0和M0为引物做预扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中：

模板DNA(连接反应液)    2.0μl

缓冲液(10X)            2.0μl

MgCl2(25mM)            1.2μl

EcoRI 物(E0，50ng/μl) 0.6μl

MseI引物(M0，50ng/μl) 0.6μl

Taq酶(5U/μl)          0.2μl

dNTP(10mM)             0.2μl

H₂O                    13.2μl

总体积：               20μl

PCR反应程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，15个循环；68℃、10min；4℃保存。

取5μl预扩增产物加入95μl TE稀释，其余扩增产物-20℃保存。

表2.1：cDNA-AFLP实验的接头序列和预扩增、选择性扩增引物序列

名称	寡核苷酸序列(5’to 3’)
		EcoRI adaptorMseI adaptor	5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′3′-TACTCAGGACTCAT-5′
EcoRI预扩增引物(E0)MseI预扩增引物(M0)	5′-GACTGCGTACCAATTC-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′
		EcoRI选扩增引物(E1)E2E3E4E5E6E7E8MseI选扩增引物(M1)M2M3M4M5M6M7	GACTGCGTACCAATTCAAGACTGCGTACCAATTCACGACTGCGTACCAATTCAGGACTGCGTACCAATTCATGACTGCGTACCAATTCTAGACTGCGTACCAATTCTCGACTGCGTACCAATTCTGGACTGCGTACCAATTCTTGATGAGTCCTGAGTAACAAGATGAGTCCTGAGTAACACGATGAGTCCTGAGTAACAGGATGAGTCCTGAGTAACATGATGAGTCCTGAGTAACTAGATGAGTCCTGAGTAACTCGATGAGTCCTGAGTAACTG

M8	GATGAGTCCTGAGTAACTT

7)选择性扩增

以E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8和M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8为引物做选择性扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中：

模板DNA(预扩稀释物)        5.0μl

缓冲液(10X)                2.0μl

MgCl₂(25mM)                1.2μl

dNTP(10mM)                 0.2μl

EcoRI引物(Ex，50pmol/μl)  0.6μl

MseI引物(Mx，50pmol/μl)   0.6μl

Taq酶(5U/μl)              0.2μl

H₂O                        10.2μl

总体积：                   20μl

PCR反应采用“touch down”策略。程序如下：

94℃    1min

94℃    30s

65℃    30s    7个循环(每个循环降低0.7℃)

72℃    1min

94℃    30s    20个循环

56℃    30s

72℃    1min

68℃    10min

4℃     保存

8)电泳检测——银染技术

记录试验结果：拍照或扫描，统计检测位点数及其多态性位点。

以冷驯化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未驯化0h的小立碗藓为材料，进行cDNA-AFLP分析。统计200bp-1000bp之间的可读带，结果表明小立碗藓冷驯化和未冷驯化的基因表达存在着明显差异。有些cDNA片段在冷驯化后表达量逐渐增加，有些cDNA片段表现出先增加后降低，有些oDNA片段表达量先降低后增加，还有少数表达量明显降低。

3、Ppviolaxanthin de-epoxidase全长基因的获得

1)RT-PCR分析：

将由cDNA-AFLP分析得到的差异片段与P.patens EST数据库(http://moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)进行BLAST比对后，进行聚类分析和功能分类，显示小立碗藓在冷驯化过程中细胞内的代谢活性和生长状态发生了极大的变化。特别值得一提的是，发现了与膜稳定性相关的转录本，PpCOR213编码Ppviolaxanthin de-epoxidase。该基因的表达分析显示PpCOR213在冷驯化中下调表达，Ppviolaxanthin de-epoxidase是木质素循环中的关键酶，催化紫黄质转变为玉米黄质。violaxanthin de-epoxidase的活性依赖于脂肪酸的不饱和程度，并且受细胞膜流动性的调节(Latowski et al.，2002；Bugos et al.，1998)。通过同源序列设计引物，通过RT-PCR反应扩增得到Ppviolaxanthin de-epoxidase。Ppviolaxanthin de-epoxidase基因的上游引物序列为：CTATTACCGAGGCAAGAATG；下游引物序列为：CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。

PCR反应体系如下：

cDNA            3μl

10×LA PCR缓冲液2μl

dNTP(2.5mM)     1.6μl

primerF(50pmol/μl)    0.15μl

primerF(50pmol/μl)    0.15μl

LA Polymerase          0.1μl

ddH₂O                  13μl

总体积                 20μl

PCR反应程序：

95℃    1min

95℃    45s

65℃    45s    32个循环

68℃    2min

72℃    10min

4℃     保存

2)纯化后的差异片段与pGEM-T easy(Promega)载体连接

3)连接产物的转化

5)阳性克隆的测序

以载体两端的T7或SP6引物进行序列测定。测序仪为ABI 3100(AppliedBiosystems)。

该基因的基因组序列如下：

CTAAACCTGCGCACCTCGTGATCCTGGATGGTAGAGGGAATGGGGGGGGGGGGGGGCCTTGTGGATGACGACTCAAAAGCACTGGAGCTCGCAGTGCCTCCATTTGTGGAGTGAGTTAGAGCGAAAGAGAGCTTGCAGGGAGCTGAATCCAGTAGAGTTTTAGCTATTGCAGTGTGGATTGGCATTGGCATTGGCATTGGCTCAATGCGGGATTTGGTGGTGGTTTTTGTGGTATTGCGTGGTTCTTTGTTGCTGAGGCGCGGGCTTTCGCTCTTGTAGAATGAGGAGGAAGAGGAGGAGCTTGACTTGATGCTGCTATACCCTCTCTAGCCACCACACATTCTCGATTCTCTGTTATCTTGTTCCGAATCTAGTTTGGGTTTTGGAGCGTTTGTAATTTTTAGGCTTGCGTTGAGCTGCAGAGGCGGATTTAGTTAGTCATGGCTGTGGTACATGCTTTACTGTCTCTGCCGCATCCTGCTGCTGGTAAATTTATTCAATCCTGGTGTGGTTTTTGAGTTTTGGATTGTTGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTGTAGTGCCGGGATTTTGAGGGTGAAGCGTTGGGTGGTGATGCTGGATTGGGATTCGAATTAAGGGTTTTTGAGGATCTAGTCTTGGTTGTTGCAGGAAATCCTTTGCAGCTATCTGTACAGAGTAATTCAAGGAATACGTCGGCGTCAGCTGGACGCCTGTCGTCTTTATCCAGTAGGCCTTGCTTAGGAGGCTTGGTATCTAGGTCTTCAAAAACTAAATGGATTTCGACTAGAGGCGGTTGCAGAAGGGCTTGTGTAGTAAATATGCGATTATCGAAGTCGCAGTGTAAAGAGCAAGGACAAACCGAGTGTAGTAATGGGGAAATTGCGTCTACTTCAGCTATCGTGGCAAGAGAAGCTAGTAGCGTTCAATCCCCGCGGTGGAGACTTCAAATTCTTCCTAGAAACGTTGCGCAGGTGGGTGTGAAGGTGCCCATGTATTTGATTTTGAGGTTTTGAAGGAATATTATGGTGGATAGCTTTATATTTAATGAAACTTTAGCTTCGAAATTGGATGTTCTGCATCAGTTGATAGCCAGAGGTTTTGGTTACACTTCTTGAAATAGGCATTTTTCTTCATTAATTCAGCATCCATTGAAAGCCACAACAGCTCTATTAGCTGCCAGCTTCTCAAGTGATTGGCTAATGTTTTGTCAATGTCGATTTGCGACATTCAGACAACTTTGGTTGGGCACTCGAGCTGGATGCGCATTTTTTGTTTTTTGTGTTTTTTCGGTTACCGTTTCTACTCCTACTTGATGATGTGACGTACCTACAATCTTGTACGCAGGGATTTGCATTGCAAGCTGCGGCAGCTGTTGCAACGGGGTTTTTGCTATGGGGTGGATCAAGCGCGTTGGCTGCTGACCCTCTAAAAACATGCTCATGTCTTCTTAAGGAATGCCGGTACGTATAATGTGTCTGCAGTAACCTTCAGATTATTGGAAATACTTGCATCTAGAAATTGTTTGAAAACTGTTTAGGATGGAAAATATTTGCTCAGCGCCAATTAGTGGGATTTTACGCAGGCCTCTATGAATCGATGCGTGAATATGTGTCATGGAATCTTGGTTGAGGTTATTTTTGCAGCTCTTCATTTGGTTGATTGGTTGCGTAGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGGTCTGGCAATTCACCAGCTTTCTCTTGTTGTTGCTCAGTGTTGCGCAAATTGATTATTGTTCCTGGTGGTTCTGTTCTGTGAAGTCTGATCATTTTTGTTGTGTGATTTAATGTTGAAACCACACATACCTGTCGTTAGTAACAGATGAACCGTTATTATTTTAGAGGAGATTTTGTGGGAGTTTATGAGAATGATGCGCATGTTTAGTCTCAACTTGCGTAAGGATAAAAGATAAAGTGCAGGAAAGTTTTGAACAAAGATTACATCTTACACGTAGGCACACTTGGCTATATCTCTGGAAATCTGACGGTGAAAATGTCTTGCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGAGAACAAAGTTGTCGATGAATTCAACGAATGTGCTGTAACAAGAAAAGGCTGCGTCCCTCAGAAGGCTGATGAAGGTCGCTTCCCGGTGCCCGCTCCATCCAGCTTAGTGCAAGACTTTGACACTACACGCTTCACAGGGACATGGTACATCACCAGTGGTTTGAACAAAACTTTTGACACTTTCGACTGTCAAAAGCATGAGTTCACAGCAGAGCCCGCAAAATTATCAGGTGTGTGGTGAATTGATTTGTTTCTGTTTACTGGCTCTGAAGCTAAGAACAGTTGTACAGTACGAGAACTCAGCATCGAGGTTTTTTCTGGTATTTGATCAGTTTTCGATTCAATGACCAAGAGGTGGTAGTTTTTAGCTTTTACACTGATTGAAGTTGGGGTCTTTAATTGTGAACTTTGTCCGATTCCGGTTCACATGTTTATCAATTGTGCTGAACTAGCTTTCATAATGTGTTGCAGGAAATCTGAGCTGGCGAATTGCTACTCCAGATGGAGGCTTCTTCACTCGTTCTACTGTGCAGAACTTCGTACAAGACGAAAAGCAACCAGGAATCTTATTAAACCACGGAAACGAGTTCCTCCACTATCAGGATGATTGGTATAAACTGCTGTCCTTGTTTTACCTTTAGGCTTAAGATCCCTATTTCTTACCATCTATTTTCGCAGTACTGGAGATTGCTTTATTCCTGAGGGAGAAATTGTAACAGGCTCACTTGTTCATTGTGTCGTACACACTGATTAAGGTGAGGTCTTTTGCATTGAGGTTGTCTGATGAAGTTAGGGTCTTGGAGGAAATTTCCTTTTCACAATTTCGTGATGTAGTTGTGGCTCCAGAAAATAAAATATATCACTCCAGTCAATGAAAGAGTTGTCTTAAATCAGAATATCATCTGAGTGATGCATTGAGCTGCATGGATAATACCGGAGGTTGATCACCTACCTAATGCAAATGGAAACTGCATGCGAGTCTTGAATTTGTACACATCGCAACCTCTTTCAGGTACATTCTCGCATCAAGGATAGAGAACAAGCCGGATGACTATGTGTTTATCTATTACCGAGGCAAGAATGACGCCTGGGATGGATATGGAGGAGCAGTCGTTTACACCAAGAGCTCAACACTGCCAACCAGTATCATCCCCGAGCTGGGGGCAGCAGCGAAGAAAGTAAATCTGGATTTCAAGAAGTTCACCACAACTGACAACACATGTGGACCGGAACCGCCATTGCTTGCCAGACTGGAAAAGAAGGTAACGTCCCACAAACCAGTTGCAGTGCTTTCATTGTCACTGAAGTGCCAACATCCTAGTGAGATGGCAGTAAAAGCTCCAGCATTGGCTGCAGCAGTGAATTGTTGACAAGCTTAGCTTTGGAAAACTTGCAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGAGAGAGCTTCTTTGTAAAGGAGGCACAAGAGGTGGAGCAAGGTGGCGAGAAGATTATCCAGAAGCTGGGACGACTGTGGGCTCAGCTGACCAAAGGCGCTGAAGAGGTGCGGCGTGACGAGGAGCAGCTCCTCAAGGAGCTTGGAGAGTTCGGAAAGAGTGCTCAAATGAACGAGGAGGAGTTCATGCAATCTTTGGGAGATGAAGAGAAGAAATTGCTTGAAGACTTGGGGATGCAACCATCTGACGTTGGAAAGCTATTTGGAAACTCCGTTCCACTACGCAAGCTTCGGTAGAAATCCCTCAGTATGTGGTCCAGGAATTGTGTGTTTCTTCCCATTTGAGAACTTATGTACTTGACTACCATCAAGCACATCAGATTTTGGCTCGTCAGAAAAAGCCCAGCAGCTTGTGAATTCACGTTAAAAAGAGAGGTTTTCTTCAAACCTGTTGTCTGTTGTTGGCTCTAGAGACGAGATAATTGTACTGAACATGGATGAGTTCCGAACGAAGCTCTGGAAATCACTGCAATTTGCTAGTTCTGCTTACTTTGCACGAATTTTTGGACCTCATGTTTGCCCTGAAATCCGAACCCAACTGCCCCAACTTGAAGAAATCGAAGTGATGTGTATTTTGGGAAGGAAGGTCACATCCGCTTTCACTGGTATGGAAGATTGTGCCAAAAGAATCATTTTATTACTTATAATTATTCTTCGACTTCATGAATTTAGGAATGAACTGAATTAATGGTATTTTTGCAATACTAATATCAAATTTCGGTAGTTGTCACATATTGTTGAATTTGTACTTTCCTTAACTGCATAGAGATGACATCTATTCAATATCTT

CDS Sequence(1596bp)

TCAATGCGGGATTTGGTGGTGGTTTTTGTGGTATTGCGTGGTTCTTTGTTGCTGAGGCGCGGGCTTTCGCTCTTGTAGAATGAGGAGGAAGAGGAGGAGCTTGACTTGATGCTGCTATACCCTCTCTAGCCACCACACATTCTCGATTCTCTGTTATCTTGTTCCGAATCTAGTTTGGGTTTTGGAGCGTTTGTAATTTTTAGGCTTGCGTTGAGCTGCAGAGGCGGATTTAGTTAGTCATGGCTGTGGTACATGCTTTACTGTCTCTGCCGCATCCTGCTGCTGGAAATCCTTTGCAGCTATCTGTACAGAGTAATTCAAGGAATACGTCGGCGTCAGCTGGACGCCTGTCGTCTTTATCCAGTAGGCCTTGCTTAGGAGGCTTGGTATCTAGGTCTTCAAAAACTAAATGGATTTCGACTAGAGGCGGTTGCAGAAGGGCTTGTGTAGTAAATATGCGATTATCGAAGTCGCAGTGTAAAGAGCAAGGACAAACCGAGTGTAGTAATGGGGAAATTGCGTCTACTTCAGCTATCGTGGCAAGAGAAGCTAGTAGCGTTCAATCCCCGCGGTGGAGACTTCAAATTCTTCCTAGAAACGTTGCGCAGGGATTTGCATTGCAAGCTGCGGCAGCTGTTGCAACGGGGTTTTTGCTATGGGGTGGATCAAGCGCGTTGGCTGCTGACCCTCTAAAAACATGCTCATGTCTTCTTAAGGAATGCCGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGAGAACAAAGTTGTCGATGAATTCAACGAATGTGCTGTAACAAGAAAAGGCTGCGTCCCTCAGAAGGCTGATGAAGGTCGCTTCCCGGTGCCCGCTCCATCCAGCTTAGTGCAAGACTTTGACACTACACGCTTCACAGGGACATGGTACATCACCAGTGGTTTGAACAAAACTTTTGACACTTTCGACTGTCAAAAGCATGAGTTCACAGCAGAGCCCGCAAAATTATCAGGAAATCTGAGCTGGCGAATTGCTACTCCAGATGGAGGCTTCTTCACTCGTTCTACTGTGCAGAACTTCGTACAAGACGAAAAGCAACCAGGAATCTTATTAAACCACGGAAACGAGTTCCTCCACTATCAGGATGATTGGTACATTCTCGCATCAAGGATAGAGAACAAGCCGGATGACTATGTGTTTATCTATTACCGAGGCAAGAATGACGCCTGGGATGGATATGGAGGAGCAGTCGTTTACACCAAGAGCTCAACACTGCCAACCAGTATCATCCCCGAGCTGGGGGCAGCAGCGAAGAAAGTAAATCTGGATTTCAAGAAGTTCACCACAACTGACAACACATGTGGACCGGAACCGCCATTGCTTGCCAGACTGGAAAAGAAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGAGAGAGCTTCTTTGTAAAGGAGGCACAAGAGGTGGAGCAAGGTGGCGAGAAGATTATCCAGAAGCTGGGACGACTGTGGGCTCAGCTGACCAAAGGCGCTGAAGAGGTGCGGCGTGACGAGGAGCAGCTCCTCAAGGAGCTTGGAGAGTTCGGAAAGAGTGCTCAAATGAACGAGGAGGAGTTCATGCAATCTTTGGGAGATGAAGAGAAGAAATTGCTTGAAGACTTGGGGATGCAACCATCTGACGTTGGAAAGCTATTTGGAAACTCCGTTCCACTACGCAAGCTTCGGTAGAAATCCCTCAGTATGTGGTCCAGGAATTGTGTGTTTCTTCCCATTTGAGAACTTATGTACTTGACTACCATCAAGCACATCAGATTTTGGCTCGTCAGAAAAAGCCCAGCAGCTTGTGAATTCACGTTAAAAAGAGAGGTTTTCTTCAAACCTGTTGTCTGTTGTTGGCTCTAGAGACGAGATAATTGTACTGAACATGGATGAGTTCCGAACGAAGCTCTGGAAATCACTGCAATTTGCTAGTTCTGCTTACTTTGCACGAATTTTTGGACCTCATGTTTGCCCTGAAATCCGAACCCAACTGCCCCAACTTGAAGAAATCGAAGTGATGTGTATTTTGGGAAGGAAGGTC

氨基酸序列：

MAVVHALLSLPHPAAGNPLQLSVQSNSRNTSASAGRLSSLSSRPCLGGLVSRSSKTKWISTRGGCRRACVVNMRLSKSQCKEQGQTECSNGEIASTSAIVAREASSVQSPRWRLQILPRNVAQGFALQAAAAVATGFLLWGGSSALAADPLKTCSCLLKECRVELAKCIADPKCAANVACLQTCNGRPDETECQIGCGDLFENKVVDEFNECAVTRKGCVPQKADEGRFPVPAPSSLVQDFDTTRFTGTWYITSGLNKTFDTFDCQKHEFTAEPAKLSGNLSWRIATPDGGFFTRSTVQNFVQDEKQPGILLNHGNEFLHYQDDWYILASRIENKPDDYVFIYYRGKNDAWDGYGGAVVYTKSSTLPTSIIPELGAAAKKVNLDFKKFTTTDNTCGPEPPLLARLEKKAEEGEKFLEKEVVEGEKFVEKEVEEGESFFVKEAQEVEQGGEKIIQKLGRLWAQLTKGAEEVRRDEEQLLKELGEFGKSAQMNEEEFMQSLGDEEKKLLEDLGMQPSDVGKLFGNSVPLRKLR

4、Ppviolaxanthin de-epoxidase基因的Real-time RT-PCR分析

利用real-time RT-PCR方法研究了Ppviolaxanthin de-epoxidase基因在冷驯化过程中的表达变化。

1)RNA提取和反转录

利用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录。试剂盒使用TaKaRa公司的RNA PCRkit，参照试剂盒的说明书，以试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。

2)预实验：

反转录产物稀释10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用HS Ex Taq DNApolymerase，进行PCR反应。PCR反应条件如下：

94℃   2min

94℃   30s

61℃   30s

72℃   20s    30个循环

20℃   5min

PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反应产物专一，没有二聚体等杂带的样品进行下一步定量PCR反应。

3)定量PCR反应

利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit进行荧光定量PCR反应，引物序列见表2.2。PCR仪使用Corbet Research公司的Rotor Gene3000Real-Time Thermal Cycler。实验结果利用软件Rotor-Gene 6.0(Donald etal.，2005)以及Excel 7.0进行数据分析处理。采用Pp-actin3基因作对照，Ppviolaxanthin de-epoxidase基因的上游引物序列为：CTATTACCGAGGCAAGAATG；下游引物序列为：CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。

4)标准曲线的生成

将预试验的PCR产物按照10倍浓度梯度进行稀释，选择1/1,000，1/10,000，1/100,000，1/1,000,000浓度的稀释产物作为标准品模版，进行荧光定量PCR反应。通过这四个标准品生成的反应数据，软件Rotor-Gene 5.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线(参见图2，转录本7)。

实验结果证明基因Ppviolaxanthin de-epoxidase在冷驯化中下调表达，其是木质素循环中的关键酶，催化紫黄质转变为玉米黄质。violaxanthinde-epoxidase的活性依赖于脂肪酸的不饱和程度，并且受细胞膜流动性的调节(Latowski et al.，2002；Bugos et al.，1998)，表明膜的稳定性机制可能是小立碗藓冷驯化机制中的一项重要策略，低温诱导表达特性说明了Ppviolaxanthinde-epoxidase基因与小立碗藓的低温抗性密切相关。

序列表.txt

<110>首都师范大学

<120>小立碗藓抗低温胁迫基因Ppviolaxanthin de-epoxidase及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和细胞系

<160>3

<210>1

<211>4464

<212>DNA

<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)

<400>1

ctaaacctgc gcacctcgtg atcctggatg gtagagggaa tggggggggg ggggggcctt      60

gtggatgacg actcaaaagc actggagctc gcagtgcctc catttgtgga gtgagttaga     120

gcgaaagaga gcttgcaggg agctgaatcc agtagagttt tagctattgc agtgtggatt     180

ggcattggca ttggcattgg ctcaatgcgg gatttggtgg tggtttttgt ggtattgcgt     240

ggttctttgt tgctgaggcg cgggctttcg ctcttgtaga atgaggagga agaggaggag     300

cttgacttga tgctgctata ccctctctag ccaccacaca ttctcgattc tctgttatct     360

tgttccgaat ctagtttggg ttttggagcg tttgtaattt ttaggcttgc gttgagctgc     420

agaggcggat ttagttagtc atggctgtgg tacatgcttt actgtctctg ccgcatcctg     480

ctgctggtaa atttattcaa tcctggtgtg gtttttgagt tttggattgt tgagtttttt     540

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttgtgtattg tagtgccggg attttgaggg     600

tgaagcgttg ggtggtgatg ctggattggg attcgaatta agggtttttg aggatctagt     660

cttggttgtt gcaggaaatc ctttgcagct atctgtacag agtaattcaa ggaatacgtc     720

ggcgtcagct ggacgcctgt cgtctttatc cagtaggcct tgcttaggag gcttggtatc     780

taggtcttca aaaactaaat ggatttcgac tagaggcggt tgcagaaggg cttgtgtagt     840

aaatatgcga ttatcgaagt cgcagtgtaa agagcaagga caaaccgagt gtagtaatgg     900

ggaaattgcg tctacttcag ctatcgtggc aagagaagct agtagcgttc aatccccgcg     960

gtggagactt caaattcttc ctagaaacgt tgcgcaggtg ggtgtgaagg tgcccatgta    1020

tttgattttg aggttttgaa ggaatattat ggtggatagc tttatattta atgaaacttt    1080

agcttcgaaa ttggatgttc tgcatcagtt gatagccaga ggttttggtt acacttcttg    1140

aaataggcat ttttcttcat taattcagca tccattgaaa gccacaacag ctctattagc    1200

tgccagcttc tcaagtgatt ggctaatgtt ttgtcaatgt cgatttgcga cattcagaca    1260

actttggttg ggcactcgag ctggatgcgc attttttgtt ttttgtgttt tttcggttac    1320

cgtttctact cctacttgat gatgtgacgt acctacaatc ttgtacgcag ggatttgcat    1380

tgcaagctgc ggcagctgtt gcaacggggt ttttgctatg gggtggatca agcgcgttgg    1440

ctgctgaccc tctaaaaaca tgctcatgtc ttcttaagga atgccggtac gtataatgtg    1500

tctgcagtaa ccttcagatt attggaaata cttgcatcta gaaattgttt gaaaactgtt    1560

taggatggaa aatatttgct cagcgccaat tagtgggatt ttacgcaggc ctctatgaat    1620

cgatgcgtga atatgtgtca tggaatcttg gttgaggtta tttttgcagc tcttcatttg    1680

gttgattggt tgcgtagggt ggaattagcg aaatgcattg cagacccgaa gtgtgcagct    1740

aatgtagcat gtttacaaac ctgtaatgga cgacctgacg agaccgagtg tcaggtctgg    1800

caattcacca gctttctctt gttgttgctc agtgttgcgc aaattgatta ttgttcctgg    1860

tggttctgtt ctgtgaagtc tgatcatttt tgttgtgtga tttaatgttg aaaccacaca    1920

tacctgtcgt tagtaacaga tgaaccgtta ttattttaga ggagattttg tgggagttta    1980

tgagaatgat gcgcatgttt agtctcaact tgcgtaagga taaaagataa agtgcaggaa    2040

agttttgaac aaagattaca tcttacacgt aggcacactt ggctatatct ctggaaatct    2100

gacggtgaaa atgtcttgca gattggttgt ggtgatttat tcgagaacaa agttgtcgat    2160

gaattcaacg aatgtgctgt aacaagaaaa ggctgcgtcc ctcagaaggc tgatgaaggt    2220

cgcttcccgg tgcccgctcc atccagctta gtgcaagact ttgacactac acgcttcaca    2280

gggacatggt acatcaccag tggtttgaac aaaacttttg acactttcga ctgtcaaaag    2340

catgagttca cagcagagcc cgcaaaatta tcaggtgtgt ggtgaattga tttgtttctg    2400

tttactggct ctgaagctaa gaacagttgt acagtacgag aactcagcat cgaggttttt    2460

tctggtattt gatcagtttt cgattcaatg accaagaggt ggtagttttt agcttttaca    2520

ctgattgaag ttggggtctt taattgtgaa ctttgtccga ttccggttca catgtttatc    2580

aattgtgctg aactagcttt cataatgtgt tgcaggaaat ctgagctggc gaattgctac    2640

tccagatgga ggcttcttca ctcgttctac tgtgcagaac ttcgtacaag acgaaaagca    2700

accaggaatc ttattaaacc acggaaacga gttcctccac tatcaggatg attggtataa    2760

actgctgtcc ttgttttacc tttaggctta agatccctat ttcttaccat ctattttcgc    2820

agtactggag attgctttat tcctgaggga gaaattgtaa caggctcact tgttcattgt    2880

gtcgtacaca ctgattaagg tgaggtcttt tgcattgagg ttgtctgatg aagttagggt    2940

cttggaggaa atttcctttt cacaatttcg tgatgtagtt gtggctccag aaaataaaat    3000

atatcactcc agtcaatgaa agagttgtct taaatcagaa tatcatctga gtgatgcatt    3060

gagctgcatg gataataccg gaggttgatc acctacctaa tgcaaatgga aactgcatgc    3120

gagtcttgaa tttgtacaca tcgcaacctc tttcaggtac attctcgcat caaggataga    3180

gaacaagccg gatgactatg tgtttatcta ttaccgaggc aagaatgacg cctgggatgg    3240

atatggagga gcagtcgttt acaccaagag ctcaacactg ccaaccagta tcatccccga    3300

gctgggggca gcagcgaaga aagtaaatct ggatttcaag aagttcacca caactgacaa    3360

cacatgtgga ccggaaccgc cattgcttgc cagactggaa aagaaggtaa cgtcccacaa    3420

accagttgca gtgctttcat tgtcactgaa gtgccaacat cctagtgaga tggcagtaaa    3480

agctccagca ttggctgcag cagtgaattg ttgacaagct tagctttgga aaacttgcag    3540

gcggaggaag gagagaaatt cctggagaag gaggtggtgg aaggggagaa gtttgtggag    3600

aaagaagtgg aggaaggaga gagcttcttt gtaaaggagg cacaagaggt ggagcaaggt    3660

ggcgagaaga ttatccagaa gctgggacga ctgtgggctc agctgaccaa aggcgctgaa    3720

gaggtgcggc gtgacgagga gcagctcctc aaggagcttg gagagttcgg aaagagtgct    3780

caaatgaacg aggaggagtt catgcaatct ttgggagatg aagagaagaa attgcttgaa    3840

gacttgggga tgcaaccatc tgacgttgga aagctatttg gaaactccgt tccactacgc    3900

aagcttcggt agaaatccct cagtatgtgg tccaggaatt gtgtgtttct tcccatttga    3960

gaacttatgt acttgactac catcaagcac atcagatttt ggctcgtcag aaaaagccca    4020

gcagcttgtg aattcacgtt aaaaagagag gttttcttca aacctgttgt ctgttgttgg    4080

ctctagagac gagataattg tactgaacat ggatgagttc cgaacgaagc tctggaaatc    4140

actgcaattt gctagttctg cttactttgc acgaattttt ggacctcatg tttgccctga    4200

aatccgaacc caactgcccc aacttgaaga aatcgaagtg atgtgtattt tgggaaggaa    4260

ggtcacatcc gctttcactg gtatggaaga ttgtgccaaa agaatcattt tattacttat    4320

aattattctt cgacttcatg aatttaggaa tgaactgaat taatggtatt tttgcaatac    4380

taatatcaaa tttcggtagt tgtcacatat tgttgaattt gtactttcct taactgcata    4440

gagatgacat ctattcaata tctt                                           4464

<210>2

<211>2187

<212>DNA

<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)

<400>2：

tcaatgcggg atttggtggt ggtttttgtg gtattgcgtg gttctttgtt gctgaggcgc      60

gggctttcgc tcttgtagaa tgaggaggaa gaggaggagc ttgacttgat gctgctatac     120

cctctctagc caccacacat tctcgattct ctgttatctt gttccgaatc tagtttgggt     180

tttggagcgt ttgtaatttt taggcttgcg ttgagctgca gaggcggatt tagttagtca     240

tggctgtggt acatgcttta ctgtctctgc cgcatcctgc tgctggaaat cctttgcagc     300

tatctgtaca gagtaattca aggaatacgt cggcgtcagc tggacgcctg tcgtctttat     360

ccagtaggcc ttgcttagga ggcttggtat ctaggtcttc aaaaactaaa tggatttcga     420

ctagaggcgg ttgcagaagg gcttgtgtag taaatatgcg attatcgaag tcgcagtgta     480

aagagcaagg acaaaccgag tgtagtaatg gggaaattgc gtctacttca gctatcgtgg     540

caagagaagc tagtagcgtt caatccccgc ggtggagact tcaaattctt cctagaaacg     600

ttgcgcaggg atttgcattg caagctgcgg cagctgttgc aacggggttt ttgctatggg     660

gtggatcaag cgcgttggct gctgaccctc taaaaacatg ctcatgtctt cttaaggaat     720

gccgggtgga attagcgaaa tgcattgcag acccgaagtg tgcagctaat gtagcatgtt     780

tacaaacctg taatggacga cctgacgaga ccgagtgtca gattggttgt ggtgatttat     840

tcgagaacaa agttgtcgat gaattcaacg aatgtgctgt aacaagaaaa ggctgcgtcc     900

ctcagaaggc tgatgaaggt cgcttcccgg tgcccgctcc atccagctta gtgcaagact     960

ttgacactac acgcttcaca gggacatggt acatcaccag tggtttgaac aaaacttttg    1020

acactttcga ctgtcaaaag catgagttca cagcagagcc cgcaaaatta tcaggaaatc    1080

tgagctggcg aattgctact ccagatggag gcttcttcac tcgttctact gtgcagaact    1140

tcgtacaaga cgaaaagcaa ccaggaatct tattaaacca cggaaacgag ttcctccact    1200

atcaggatga ttggtacatt ctcgcatcaa ggatagagaa caagccggat gactatgtgt    1260

ttatctatta ccgaggcaag aatgacgcct gggatggata tggaggagca gtcgtttaca    1320

ccaagagctc aacactgcca accagtatca tccccgagct gggggcagca gcgaagaaag    1380

taaatctgga tttcaagaag ttcaccacaa ctgacaacac atgtggaccg gaaccgccat    1440

tgcttgccag actggaaaag aaggcggagg aaggagagaa attcctggag aaggaggtgg    1500

tggaagggga gaagtttgtg gagaaagaag tggaggaagg agagagcttc tttgtaaagg    1560

aggcacaaga ggtggagcaa ggtggcgaga agattatcca gaagctggga cgactgtggg    1620

ctcagctgac caaaggcgct gaagaggtgc ggcgtgacga ggagcagctc ctcaaggagc    1680

ttggagagtt cggaaagagt gctcaaatga acgaggagga gttcatgcaa tctttgggag    1740

atgaagagaa gaaattgctt gaagacttgg ggatgcaacc atctgacgtt ggaaagctat    1800

ttggaaactc cgttccacta cgcaagcttc ggtagaaatc cctcagtatg tggtccagga    1860

attgtgtgtt tcttcccatt tgagaactta tgtacttgac taccatcaag cacatcagat    1920

tttggctcgt cagaaaaagc ccagcagctt gtgaattcac gttaaaaaga gaggttttct    1980

tcaaacctgt tgtctgttgt tggctctaga gacgagataa ttgtactgaa catggatgag    2040

ttccgaacga agctctggaa atcactgcaa tttgctagtt ctgcttactt tgcacgaatt    2100

tttggacctc atgtttgccc tgaaatccga acccaactgc cccaacttga agaaatcgaa    2160

gtgatgtgta ttttgggaag gaaggtc                                        2187

<210>3

<211>575

<212>PRT

<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)

<400>3

MAVVHALLSL PHPAAGNPLQ LSVQSNSRNT SASAGRLSSL SSRPCLGGLV SRSSKTKWIS     60

TRGGCRRACV VNMRLSKSQC KEQGQTECSN GEIASTSAIV AREASSVQSP RWRLQILPRN    120

VAQGFALQAA AAVATGFLLW GGSSALAADP LKTCSCLLKE CRVELAKCIA DPKCAANVAC    180

LQTCNGRPDE TECQIGCGDL FENKVVDEFN ECAVTRKGCV PQKADEGRFP VPAPSSLVQD    240

FDTTRFTGTW YITSGLNKTF DTFDCQKHEF TAEPAKLSGN LSWRIATPDG GFFTRSTVQN    300

FVQDEKQPGI LLNHGNEFLH YQDDWYILAS RIENKPDDYV FIYYRGKNDA WDGYGGAVVY    360

TKSSTLPTSI IPELGAAAKK VNLDFKKFTT TDNTCGPEPP LLARLEKKAE EGEKFLEKEV    420

VEGEKFVEKE VEEGESFFVK EAQEVEQGGE KIIQKLGRLW AQLTKGAEEV RRDEEQLLKE    480

LGEFGKSAQM NEEEFMQSLG DEEKKLLEDL GMQPSDVGKL FGNSVPLRKL RTYPEPRTLE    540

NGTHSEQUEN CENAMESEQU ENCEDESCRI PTION                               575

Claims (5)

1、一种小立碗藓抗低温胁迫基因Ppviolaxanthin de-epoxidase，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2、一种小立碗藓抗低温胁迫基因Ppviolaxanthin de-epoxidase，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3、权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4、含有权利要求1所述基因的载体。

5、表达权利要求1所述基因的转基因细胞系。

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